REVISÃO BIBLIOGRÁFICA:

Modelos isotérmicos para inativação de Corynebacterium glutamicum

Método de BIGELOW(1921)
Resumo:
O principal objetivo consiste na modelação de dados cinéticos de primeira
ordem, em condições isotérmicas para a inativação de Corynebacterium glutamicum.
Para tal, procedeu-se à análise de dados cinéticos por método de um passo por
regressão linear (SANTOS, 2011), no qual o estudo dos dados cinéticos prendeu-se com
a estimação dos parâmetros cinéticos, z e Dref para o modelo de Bigelow, com a
variação da temperatura de referência considerada em cada conjunto de dados, o valor z
é o modelo do coeficiente de temperatura que é usado em todo o mundo no projeto e
monitoramento de alimentos e produtos farmacêuticos em seus processos de
esterilização. O método é simples, direto e preciso como qualquer outro método
disponível hoje, embora seja empírico.
Bigelow ( 1921) relatou que o método é baseado no fato de que se o logaritmo
dos tempos de destruição (valor F ou D) são plotados vs. temperatura em uma escala
aritmética (DAOUST, 1960), o resultado na faixa usual de temperaturas de interesse
pode ser representado por uma linha reta. A falta de uma teoria sobre o porquê os dados
de destruição térmica devem formar linhas retas quando plotados dessa maneira fez com
que muitos pesquisadores procurassem uma teoria que pudesse ser usada para reforçar
este método de análise ou encontrar outro método de análise que foi baseado na teoria
do coeficiente de temperatura.
Confirmando a aplicação do método de BIGELOW (1921) por DAOUST
(1960), temos os valores de D e Z para uma espécie de Corynebacterium em diferentes
condições e temperaturas utilizadas nos derivados de leite.
 1 Modelo de cinética química
A cinética química estuda as velocidades com que ocorrem as reações químicas
e todos os fatores que as influenciam e procura explicar o comportamento macroscópico
dos sistemas químicos em termos de modelos microscópicos, isto é, através da
visualização teórica do comportamento das moléculas, comportamento esse que não é
observável experimentalmente.
A cinética química é um dos critérios de avaliação da reatividade dos sistemas
químicos, complementar do critério termodinâmico que avalia a reatividade em termos
de constantes de equilíbrio.
O estudo termodinâmico e cinético de qualquer reação é essencial para a análise
da sua importância em química e a nível industrial, uma vez que, não é útil que uma
reação tenha uma elevada constante de equilíbrio se for muito lenta, mas também não
tem viabilidade uma reação muito rápida que praticamente não transforme reagentes em
produtos.
É de notar que o interesse da cinética química não se restringe aos domínios da
química e da tecnologia química, uma vez que, a metodologia adotada em cinética
química pode também ser aplicável em bioquímica.

1.1 Cinéticas de primeira ordem

A lei cinética de um processo de primeira ordem é um processo cuja velocidade
depende da concentração do reagente elevada à potência unitária.
Exemplificando, para uma reação genérica de primeira ordem,
(1) 𝐴 → 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜𝑠
a velocidade é dada por
−𝑑𝐴
(2) 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 𝑑𝑡 e (3) 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 𝑘𝐴
Rearranjando as equações (2) e (3), por integração simples obtém-se, (5):

𝑑𝐴 𝑑𝐴 𝑑𝐴 𝐴
− = 𝑘𝐴 ∴ = −𝑘𝑑𝑡 ∴ ∫ = − ∫ 𝑘𝑑𝑡 ∴ ln 𝐴 = ln 𝐴0 − 𝑘𝑡 ∴ ln = −𝑘𝑡 ∴
𝑑𝑡 𝐴 𝐴 𝐴0
onde ln representa o logaritmo natural e A0 e A são as concentrações do reagente A no
instante inicial e em determinado instante t, respetivamente. Esta equação pode ser
expressa de forma exponencial por:
𝐴
(5) = 𝑒 −𝑘𝑡
𝐴0
A partir desta expressão, nota-se que numa reação de primeira ordem, quanto
maior for a constante de velocidade, mais rápido é o decréscimo exponencial do
reagente A.
Na área da ciência alimentar e processamento de alimentos, em vez da utilização
do valor da constante de velocidade (k), é mais usual a utilização do valor D, valor que
representa o tempo de redução decimal, definido como o tempo necessário para reduzir
90% da população inicial de micro-organismos e expresso geralmente em minutos.
Alternativamente, também pode ser interpretado como o tempo necessário para a
redução de um ciclo logarítmico na população microbiana. A relação entre o valor de k
e de D é dada pela seguinte equação,
ln 10
(6) 𝐷 = 𝑘
Substituindo a equação 6, na equação 5, obtém-se,
𝑡
𝐴
(7) = 10−𝐷
𝐴0
 Para populações microbianas utiliza-se o modelo de Bigelow para descrever a
influência da temperatura no tempo de redução decimal.
O fator z, constante de resistência térmica, é usado na área do processamento
alimentar para quantificar o efeito da temperatura na destruição de micro-organismos, à
semelhança da energia de ativação para reações químicas e bioquímicas.
A constante de resistência térmica, z, é definida como o aumento da temperatura
necessário para causar uma redução de 90% no tempo de redução decimal e geralmente
é expressa em ͦC.
Segundo o modelo de Bigelow o efeito da temperatura na destruição dos micro-
organismos é expresso por,
𝑇𝑟𝑒𝑓 −𝑇
(8) 𝐷 = 𝐷𝑟𝑒𝑓 10 𝑧
Sendo, Dref o valor de D à temperatura de referência, Tref ( ͦC), e z vem expresso
em minutos.
Com a equação 8, encontramos a relação de D e Z, porém, necessitando de uma
referência na qual dificilmente teremos os dados para o Corynebacterium glutamicum
especificamente.
Para a abordagem em dois passos por regressão não linear, inicialmente estima-
se o tempo de redução decimal (D) individualmente para cada temperatura estudada,
segundo a cinética de primeira ordem, equação 9.
𝑡
𝑋
(9) 𝑋 = 10−𝐷
0

Linearizando,
𝑋 𝑡
(10) log(𝑋 ) = − 𝐷
0

O mesmo procedimento faremos na equação 8 e temos o modelo abaixo:

𝑇 −𝑇
(11) log (𝐷) = log (𝐷𝑟𝑒𝑓 ) + 𝑟𝑒𝑓𝑧

Ao adicionar o modelo cinético da equação 9, a dependência com a temperatura

permite a estimação do valor de Z e de Dref.
𝑡
− 𝑇𝑟𝑒𝑓 −𝑇
𝑋 𝐷𝑟𝑒𝑓 10 𝑧
(12) 𝑋 = 10
0

Aplicando duas vezes logaritmo resultado o método um passo por regressão

linear.
𝑋𝑜
(13)log( log 𝑋 ) − log 𝑡 = − log 𝐷𝑟𝑒𝑓 − (𝑇𝑟𝑒𝑓 − 𝑇)/𝑧
Igualmente é de referir que, para a metodologia abordada no modelo de
Bigelow, o método de ajuste utilizado foi o método dos mínimos quadrados, também
designado por método da minimização da soma dos quadrados dos resíduos.
Na procura por um método temos o desenvolvimento teórico citado acima e
valores aplicados por procedimentos experimentais temos em testes realizados com
Corynebacterium, um ensaio completo com a Corynebacterium diphtheriae (DAOUST,
1960) e a descrição do modelo de Bigelow de PFLUG (1987), no qual iremos avaliar o
método gráfico a seguir.
2 Modelo de resolução gráfica
 2.1 MODELO BIGELOW OU z-VALUE
Conforme descrito em PFLUG (1987), BIGELOW (1921) relatou que o método
é baseado no fato de que se o logaritmo dos tempos de destruição (valor F ou D) são
plotados versus temperatura em uma escala aritmética, o resultado na faixa usual de
temperaturas de interesse pode ser representado por uma linha reta. A falta de uma
teoria sobre o porquê os dados de destruição térmica devem formar linhas retas quando
plotados dessa maneira fez com que muitos pesquisadores procurassem uma teoria que
pudesse ser usada para reforçar este método de análise ou encontrar outro método de
análise que foi baseado na teoria do coeficiente de temperatura.
Uso direto do modelo z-Value Bigelow e Esty (1920) descreveram um método
de avaliação da temperatura destruição de microorganismos que eles chamaram de
método do "tempo de morte térmica" (TDT). Neste método, os resultados de vários
testes de unidades replicadas (FN) em várias temperaturas foram plotadas em um
gráfico de tempo de morte térmica (logaritmo do valor F vs. Temperatura). Um círculo
aberto indicava uma condição de aquecimento; um fechado ou círculo sólido indicou
uma condição de aquecimento onde qualquer uma das unidades replicadas foi positivo
para o crescimento. O TDT foi considerado entre o aquecimento mais longo momento
em que todas as unidades foram negativas. Inicialmente, uma única unidade foi testada
em cada condição tempo-temperatura. Esty e Williams (1924) chamaram a atenção para
o fato que um "salto" (sobrevivência de organismos em um tempo além daquele em que
a esterilidade é indicada) muitas vezes ocorreu quando tubos únicos foram usados e
sugeriu que, se várias unidades foram testadas em cada condição de tempo-temperatura,
esta fonte de erro ou incerteza seriam reduzidos ou eliminados.
Suas convenções, listadas abaixo, foram amplamente adotadas pelos
trabalhadores desta área.
1. Um ponto de sobrevivência é considerado como um bit de dados positivo; a
curva TDT deve estar acima de todos os pontos de sobrevivência (maior em temperatura
ou mais Tempo).
2. Os pontos de destruição são indicativos, mas não positivos, devido à
fenômeno dos saltos. Em geral, a curva TDT deve estar abaixo dos pontos de destruição
quanto possível e ainda estar acima dos pontos de sobrevivência.
3. A direção da curva TDT deve ser paralela à direção geral tendência dos
pontos de sobrevivência e destruição.
Townsend, et al. (1938) também apontou que se os dados são obtidos em apenas
duas temperaturas, a curva resultante terá amplos limites de confiança por causa da
variabilidade nos resultados microbianos. Os testes de sobrevivência devem ser
realizados em três ou mais condições tempo-temperatura. Em geral, a precisão da curva
de valor z aumentará com o aumento dos dados.
Tratamentos de dados conforme recomendado por Townsend et al. (1938) para
desenvolver uma curva TDT são mostradas na figura 1 como uma linha ideal, pois a
linha reta pode ser desenhada acima de cada ponto de sobrevivência e abaixo ou através
de cada ponto de destruição.
A plotagem direta de resultados em um gráfico TDT foi substituída por em
grande parte pelos métodos de valor D descrito anteriormente. Um método de análise
que usa a plotagem direta de análise de resultados não considera nem o efeito do
número inicial de organismos ou o número de unidades replicadas em o sistema de
teste. Ambos os fatores são considerados nos métodos do valor D (Figura 2).
 Figura 1: Crescimento temperatura versus tempo.

Figura 2: Resultado de um teste TDT para esporo em diferentes temperaturas

Fonte: Textbook for na introductory course in the microbiology na engineering of
sterilization process, 6th Edition, 1987, 9.5 e 9.6.

2.2 Gráfico de valores z e valores D

 A aceitação geral do valor D como uma medida da taxa de destruição
microbiológica na década de 1950 levou ao método para preparar o gráfico do valor z
que está em uso atualmente.
Neste método, o logaritmo do valor D é plotado vs temperatura.
O gráfico de log D vs. temperatura é chamado de curva da resistência térmica
(TR).
Na figura da página 9.6, são mostradas as curvas de sobrevivência em várias
temperaturas; os valores D são indicados no gráfico. Para preparar o gráfico do valor z,
os valores D foram plotados em papel dilog versus temperatura.
Convencionalmente, uma linha reta é traçada através dos pontos de dados e o
valor z são os graus de temperatura para o valor D mudar por um fator muitas vezes.
Uma estimativa mais precisa do valor z é obtida se ajustarmos a uma simples regressão
de mínimos quadrados para os dados, log D vs. temperatura. O valor z estimado é o
recíproco negativo da inclinação da linha ajustada. As unidades de o valor z são graus
de temperatura; é importante sempre incluir identificação da escala de temperatura
como ͦC ou ͦF ao apresentar um valor z.

Figura 3: Resultado de um teste TR para esporo em diferentes temperaturas

2.3 O valor z
O valor z é baseado em dados experimentais que podem vir de qualquer um dos
dois tipos de experimentos:
1) experimentos realizados para determinar TDTs em várias temperaturas, ou
2) experimentos realizados para determinar valores D em várias temperaturas.
Como o valor z é sempre o resultado de uma série de experimentos em um
mínimo de duas temperaturas e, mais desejavelmente, três ou quatro temperaturas, o
experimento deve validar o sistema de teste para garantir que os dados do valor D
gerados nos experimentos das diversas temperaturas podem ser combinadas, se os dados
nas várias temperaturas são para diferentes condições de teste, eles não podem ser
combinados para produzir um valor z significativo.
No gráfico TDT ou TR onde os valores de log F (ou log D) são plotados como
uma função da temperatura, o resultado é uma linha reta como originalmente descrito
por Bigelow (1921). O valor z é o grau de mudança de temperatura para a linha reta
percorrer um ciclo logarítmico; também, são os graus de temperatura alterados (ΔT)
para que o valor F ou D mude por um fator de dez.
(Desnecessário dizer que, ao lidar com sistemas biológicos, haverá exceções,
mas do ponto de vista da engenharia de esterilização, vamos supor que uma linha reta
relacionamento existe.)

2.4 CURVAS DE RESISTÊNCIA TÉRMICA (TR) E TEMPO DE MORTE

TÉRMICA (TDT)
A curva TR é um gráfico dilog de D vs. T; a curva TDT é um gráfico dilog de F
vs. T.
A curva TR difere da curva TDT em que uma curva TR é, por definição, o
tempo (valor D em uma faixa de temperaturas, necessário para destruir 90% dos
organismos em uma microbiota homogênea população, enquanto a curva TDT é o
tempo (valor F), em uma faixa de temperaturas, necessárias para produzir algum nível
determinado ou especificado de destruição (preservação).
Para a mesma população de esporos microbianos homogêneos e substrato, a
curva TDT semilogarítmica e a curva TA serão paralelas.
Curva de Resistência Térmica (TR):
D (em escala logarítmica) vs. Temperatura;
O valor D é o tempo à temperatura T para reduzir o número de microorganismos
_ em uma população homogênea em 90%.
Curva de Tempo de morte térmica (Thermal-Death-Time - TDT):
F (em escala logarítmica) vs. Temperatura;
O valor F é o tempo em temperatura T para reduzir o número de microrganismos
em uma população homogênea por uma quantidade:
Yn x DT
Do modelo semilogarítmico:
log N = -FT/DT + log No
A mudança em uma população microbiana devido a uma preservação processo
FT é:
FT = DT(log No - log NF).
Podemos expressar a mudança na população microbiana como uma mudança
logarítmica; chamamos isso de redução logarítmica de esporos (Yn)
Y = log NO - log NF
portanto, o tempo de morte térmica FT é:
FT = DTYn
É necessário ter uma expressão matemática para descrever e tratar as curvas TR
e TDT que estão localizadas no segundo quadrante de x-y sistema de eixos da
coordenada; log D (ou log F) aumentam à medida que a temperatura diminui. Uma vez
que nem os gráficos TA ou TDT estão na origem do eixo de coordenadas, não há valor
de interceptação y. Portanto, a forma de dois pontos da equação de uma reta linha deve
ser usada. As equações das curvas TR e TDT em termos de valor z, os valores
desconhecidos D e F desconhecidos na temperatura T e a referência D e F na
temperatura Tref são mostrados abaixo:

Curva de resistência térmica (TR) normalmente mostrada como log D vs. T

log DT = -1/z (T - Tref) + log DTref
Curva TDT de Tempo de Morte Térmica normalmente mostrada como logF vs T
Log FT=-1/z(T-Tref)+log FTref
A equação da curva TDT na forma exponencial (arranjo de taxa letal) é:
F(Tref,z)/F(T,z)=10^(T-Tref)/z

"FO" é o símbolo acordado para representar um valor de esterilização a 250°F

(121.1 ͦC) com um valor z de 18°F (10°C); se Tref for 250°F e z for 18°F a equação
TDT se torna:
FO/F(T,18°F)=10^(T-250°F)/18°F
Como afirmado anteriormente, as linhas de valor z dos gráficos TR e TDT para a
mesma população de microrganismos homogêneos e seus substratos, são paralelas.
O D(T,z) e F(T, z) estão relacionados no modelo de destruição microbiana
semilogarítmica.
FT=DT(log No – log NF)
O termo "Yn" é o número de logs de redução da população bacteriana e às vezes
é referido como a redução de log de esporos (SLR).
Yn=log No-log NF
O valor F é o valor D vezes Yn como um multiplicador:
F(T, z) = Yn D(T, z)
Um gráfico contendo as curvas TR e TDT é mostrado na figura 4.

Figura 4: Gráfico de valor z mostrando a curva de resistência térmica (log D vs. T) e a

curva de tempo de morte térmica (log F vs. T)
 2.5 VALORES DE D E Z EXPERIMENTAIS

Conforme citação de DAOUST (1960), em seus ensaios encontramos valores

para uma espécie de Corynebcaterium, seus ensaios apresentam reduzidos tempos nos
proporcionando um valor base para aplicação em processo de inativação, lembrando que
os meios são referentes a derivados do leite e seu método experimental deve ser
desenvolvido a outros meios que irão sofrer o tratamento térmico.
Corynebacterium diphtheriae Nº 296
Mostrou ter valores D médios de 6,65, 1,68, 0,00547, 0,00314, 0,00140 e
0,00084 min. no leite a temperaturas de 120, 125, 154, 156, 158 e 160°F
(aproximadamente 49, 52, 68, 69, 70 e 71°F) respectivamente.
Os valores médios de D para o organismo em leite achocolatado foram 5,60,
1,18, 0,00758, 0,00556, 0,00407 e 0,00230 min. nas respectivas temperaturas de 120,
125, 148, 150, 152 e 154°F.
Valores D médios de 5,06, 0,72, 0,00309, 0,00238 e 0,00175 min. foram
encontrados em creme para as respectivas temperaturas de 120, 125, 136, 138 e 140°F.
Na mistura de sorvete, o organismo apresentou valores médios de D de 15,0, 6,0,
0,00083, 0,00038, 0,00037 e 0,00027 min. para temperaturas de 120, 125, 162, 164, 166
e 168°F., respectivamente.

3 Resultados e discussões
Conforme as informações citadas nos capítulos anteriores, utilizamos os valores
de temperaturas em 70, 75, 80, 85, 87,5, 90 e 95°C para verificarmos a inativação de
Corynebacterium glutamicum em efluente industrial.
Como primeira etapa temos o gráfico do teste TDT para o microrganismo
abaixo, representado pela figura 5.

Figura 5: Resultado de um teste TDT para Corynebacterium glutamicum em

diferentes temperaturas
Os valores médios para D nas temperaturas apresentadas são os seguintes:
D=2,34 min (70°C)
D=0,94 min (75°C)
D=0,78 min (80°C)
D=0,63 min (85°C)
D=0,47 min (87,5°C)
D=0,16 min (90°C)
D=0,08 min (95°C)
 Aplicando os D valor em relação à temperatura, obtivemos dois perfis do
decaimento decimal, sendo assim, recomendada a utilização de temperaturas superiores
a 85°C.
No quadro abaixo, temos o valor teórico de D=0,7min demonstrando a inflexão
na reta demonstrando dois comportamentos diferentes de Z valor com o decaimento da
temperatura.

Z (°C)
2,0 min 0,7 min 0,7 min 0,01 min
63 °C 84 °C 84 °C 102 °C
Z = 10 °C Z = 9 °C

4 Conclusões
Como apresentado, fica recomentado o procedimento de inativação com os
parâmetros D=0,7 min (84°C) e Z=9°C.
Citado em procedimento operacional, utilizamos 85°C como temperatura padrão
de aquecimento para inativação, combinada com um sistema de tubulação apresentando
um possível tempo de residência mínimo em 2,32 minutos (Vazão 300kL/h por Volume
11,6 kL).

Bibliografia

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processos de esterilização em autoclaves a vapor desaeradas por água, Brazilian
Journal of Food Technology, v. 16, n. 3, p. 243-252, jul./set. 2013, Campinas.
2. DAOUST, D. R.; READ, R.B. JR.; LITSKY, W.; Thermal inactivation studies on pathogenic
bactéria in milk adn various milk products. I. Corynebacterium diphtheriae ATCC No.
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Amherst, 1960.
3. PFLUG, I. J.; Textbook for na introductory course in the microbiology na engineering of
sterilization process, 6th Edition, 1987, Department of food Science and nutrition,
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4. SANTOS, A. C. G.; Análise de dados cinéticos por novas metodologias, Departamento
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