8et|erles Let|ltes

2-53715)
/! 8/C!|Kl/! L/C!lC/! NO C|N!KO DO! NO\O! D|!/FlO! !|CNOLOlCO!
UtIIIzao das bactcrIas IctIcas
na atuaIIdadc
principal lunao das lactri-
as lcticas nos alimontos a
acidilicaao dos produtos ali-
montaros om um pH prximo
do 4, guo impodo o dosonvol-
vimonto do lactrias indosojvois pola pro-
duao do cidos orgnicos, majoritaria-
monto cidos lcticos. lsso pormito guo o
porodo do consorvaao dos produtos lor-
montados soja muito maior guo a dos
produtos ondo a matria-prima nao soja
lormontada.
Um dos papis principais das lactrias
lcticas a higiono. Outro papol doson-
volvor as propriodados organolpticas dos
alimontos lormontados. Por moio da pro-
duao do um grando numoro do onzimas
glicolticas, lipolticas o protoolticas, as BI
translormam os nutriontos lundamontais
dos produtos agricolas om compostos com
propriodados organolpticas
comploxas. Essas atividados
liogumicas pormitom s BI
modilicar pouco a pouco a
ostrutura o o aroma dos ali-
montos lormontados o do con-
triluir para o dosonvolvimon-
to das suas gualidados gas-
tronomicas.
Alm dossas lunos do
ordom tocnolgica, atrilu-
mos tamlm as BI, guo ns
ingorimos vivas, atividados
proliticas. Dizomos guo
uma lactria possui uma ati-
vidado prolitica guando, so
ingorida viva por um hospo-
doiro dotorminado, oxorco
solro osto um oloito lonli-
co diroto ou indiroto tFullor,
1989). Por oxomplo, om animais do cria-
ao cuja alimontaao loi suplomontada
com cortas lactrias, ostas agom no au-
monto da taxa do croscimonto dossos
animais. Essa noao j havia sido suscita-
da por Votchnikol, om 1908. Entrotanto,
ola s dosportou intorosso h poucos anos
o so inscrovo no guadro do ovoluao
comportamontal dos consumidoros om
lusca do uma alimontaao lonlica
saudo. As industrias agroalimontaros into-
graram osso novo dosalio o assistimos ao
aparocimonto guaso guotidiano do novos
produtos, solrotudo lcticos, aos guais
sao atriludas gualidados proliticas nom
sompro comprovadas.
As atIvIdadcs probItIcas
na atuaIIdadc
Trs tipos do atividados proliticas
loram ostalolocidas ciontilicamonto. A
primoira rolacionada digostililidado
da lactoso. Esso aucar, prosonto om alun-
dncia nos produtos lcticos, podo indu-
zir lonomonos do intolorncia nos consu-
midoros guo possuam dolicincia cong-
nita om lactaso, a onzima guo o dograda.
O guadro clnico podo sor traduzido por
diarrias, clicas aldominais ou llatuln-
cia. uriosamonto ossos sintomas aparo-
com guando a lactoso alsorvida do
loito, mas sao ausontos guando alsorvi-
das do iogurto nas mosmas proporos.
Existom duas oxplicaos para o lonomo-
no: a llora lactoriana do iogurto t:~jo-
coccu: I~:uojI:Iu: o 1acoac:IIu: uI-
ga::cu:) t1) suplomontaria a dolicincia
om lactaso do hospodoiro com a sua
prpria, t2) ostimularia, na mucosa intos-
tinal do hospodoiro, a produao ondgo-
na da lactaso.
Uma outra atividado prolitica oxor-
cida polas BI higionizar o tulo digosti-
vo, guo hospoda uma llora microliana
alundanto, sondo guo parto dola porton-
co ao grupo das lactrias lcti-
cas. Essa llora oxorco uma lun-
ao importanto na capacidado
do hospodoiro do so dolondor
do contaminaos digostivas
causadas polas lactrias pato-
gnicas. Assim, a llora ondgo-
na do hospodoiro ostimularia
as rospostas imunitrias o toria
uma lunao do larroira proto-
tora ao ocupar os nichos pro-
curados polos patgonos. Alm
do sorvir do larroira prototora,
cortas BI mostraram-so capa-
zos do diminuir os sinais clni-
cos ligados a inlocos intosti-
nais. Os rosultados mais signi-
licativos loram oltidos com
cortos tipos do lactolacilos o
tamlm com os llidos guo so
A Icrmcntao IctIca constItuI uma das Iormas maIs
antIgas dc conscrvao dc produtos orIundos da
agrIcuItura ou da IndustrIa agroaIImcntar. Essc tIpo
dc Icrmcntao cst rcIacIonado, cm prImcIro Iu-
gar, com os produtos Ictcos (Iogurtc, qucIjos, man-
tcIga, crcmc), mas tambcm com carncs, IrIos, po dc
Icvcdo, cB, sIdra, ccrvcja c vInBo (Icrmcntao
maIoIctIca). A Icrmcntao IctIca c IcIta por dIvcr-
sas bactcrIas cBamadas bactcrIas IctIcas (BI) dcvI-
do sua atIvIdadc prIncIpaI, quc c a convcrso dos
aucarcs do mcIo cm cIdo IctIco. As cspccIcs
bactcrIanas cm qucsto pcrtcnccm a cInco gcnc-
ros: 1ac1ococcu, 51rcp1ococcu, 1ac1oac1TTu, 1cu-
coro1oc c Tcd1ococcu. So cocos ou bacIIos gram-
posItIvos quc possucm uma pcrccntagcm cm G+C
no gcnoma InIcrIor a 54. DcvIdo a cssa caractcrIza-
o, cxIstc uma controvcrsIa cm sc a cspccIc L1T1do-
ac1cr1un pcrtcncc ou no a cssc grupo, poIs cIa
possuI maIs dc 55% dc G+C no gcnoma.
Jcar-1Lr11opLc T1ard, 1+c 1c 1o1r, 1acTTc Toquc1 c TL1T1ppc 1arycTTa
1~:gu::auo:~: uouo:~: uo 1u::u Na:ouaI u~ Ia R~cI~:cI~ g:ouou:gu~, Uu:~ u~
R~cI~:cI~: 1a::~:~: ~ u~ ~u~:gu~ jjI:gu~~,
735U )ou,-~u-)o:a:, 1:auc~
Iaug~IIa6:o~cou,:u:aJ:
T:auuz:uo j~Io: j:oJ~::o:~: uouo:~: 1aco Azc+cdo c
Ara 1uc1a Lrur1aT11 Godard.
1~jo u~ 1:oIog:a ~:aI11-U1M
80 1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI
1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI 81
mostraram particularmonto olicazos no
tratamonto das diarrias do rocm-nasci-
do.
Enlim, ost lom ostalolocido guo cor-
tas linhagons do BI possuom atividados
adjuvantos guo ostimulam a rosposta imu-
nitria do hospodoiro contra antgonos.
Dos lactolacilos, a ospcio ca:~: mostrou-
so capaz do ostimular a rosposta imunit-
ria das crianas guando vacinadas por via
oral contra o rotavrus, vrus rosponsvol
pola diarria aguda inlantil nos pasos om
dosonvolvimonto tlsolauri ~ aI., 1995).
Ns voromos guo a atividado adjuvanto
das BI alro caminhos intorossantos para
aplicaos na roa mdica.
Outras atividados proliticas para as
BI loram propostas, o as mais intorossan-
tos sao as atividados anticolostorolmicas
o antitumorais. No ontanto, mais oxpori-
ncias ainda sao nocossrias para do-
monstrar guo as BI oxorcom, do lato,
ossas atividados :u :::o tVartoau 8 Ram-
laud, 1993).
Em rosumo, oxistom ovidncias do
guo as BI ingoridas vivas o om guantida-
dos importantos tcorca do 10
8
lactrias
por grama do alimonto lormontado) sao
capazos do oxorcor oloitos liolgicos so-
lro o hospodoiro. omo acalamos do
vor, algumas dossas atividados sao lom
ostalolocidas. Outras ainda nocossitam
do domonstraao clara o roprodutvol,
como o uso do rocursos como os tostos do
duplo cogo o a inclusao do um grupo
placolo. A diliculdado dosso tipo do ostu-
do guo lroguontomonto, as linhagons
lactorianas prosontos nos produtos lor-
montados sao solocionadas por moio do
critrios tocnolgicos o nao proliticos.
Alm disso, as atividados procuradas sao,
lroguontomonto do pouca intonsidado,
licando dilcil ovidonci-las om um ocos-
sistoma comploxo como o tulo digostivo.
...c no Iuturo
A partir do acumulo
dossas constataos, vri-
os laloratrios, h alguns
anos, tontaram suporpro-
duzir molculas com oloi-
tos proliticos nas BI.
Essa porspoctiva comoou
lontamonto a so tornar ro-
alidado graas aos conho-
cimontos acumulados nos
ultimos 15 anos solro a
gontica das BI, o, solro-
tudo, da 1acococcu: Iac-
:: Vuitas tcnicas gonti-
cas ostalolocidas para ossa
lactria loram adaptadas
para as outras ospcios do
BI. Hojo, podomos intro-
duzir DNA om um grando numoro do BI,
loram tamlm dosonvolvidos instrumon-
tos gonticos do um amplo ospoctro do
hospodoiros tplasmdios, transposons, sis-
tomas do oxprossao indutvois, otc.) o a
soguncia do gonomas do divorsas
ospcios do BI ost sondo loito.
A idia utilizar as BI como
voculo do divorsas atividados lio-
lgicas a sorom introduzidas no
tulo digostivo. Uma dossas podor
sor a do produzir onzimas para
suplomontar dolicincias pancroti-
cas ou vitamnicas para molhorar a
saudo do hospodoiro ou olorocor-
lho um molhor conlorto intostinal.
Essas aplicaos so situam na roa
do dosonvolvimonto do produtos
do um novo tipo do alimonto, o
alimonto-saudo`. Nossa catogoria
do produtos, as BI nao sorao so-
monto oscolhidas polas suas apti-
dos tocnolgicas, mas tamlm po-
las suas atividados proliticas. Podomos
ponsar guo, no luturo, um tipo do produto
lormontado podor tor vrias vorsos,
sogundo o contoudo das BI adaptadas a
dilorontos dolicincias o guo, por oxom-
plo, lacilitaria a digostao do cortos glicdi-
os ou suplomontariam nutriontos raros, o
outros.
Uma outra porspoctiva particularmon-
to atraonto utilizar as BI como vacinas
vivas tDaugon, 1994). Nosso caso, tonta-
romos lazor com guo as BI produzam
antgonos ou poptdoos imunognicos ca-
pazos do induzir uma rosposta imunitria
contra um corto patgono. Essa soria uma
soluao promissora para controlar doon-
as ondmicas causadas por numorosos
vrus ou lactrias patognicas guo ontram
no organismo pola via oral tcomo, por
oxomplo, gua potvol o alimontos) o so
dosonvolvom na mucosa digostiva. A mu-
cosa digostiva um rgao linlido impor-
tanto o a induao do imunidado do muco-
sa pormito uma luta prococo contra numo-
rosas inlocos. A noao do vacina viva
administrada oralmonto tamlm atraon-
to no mlito scio oconomico: ossas
soriam vacinas do lcil administraao o do
laixo custo. Essos argumontos incitaram a
Organizaao Vundial do Saudo tOVS) a
colocar o dosonvolvimonto dosso tipo do
vacinas como oljotivo prioritrio do sau-
do pullica. Nosso tipo do aplicaao, as BI
constituiriam uma nova catogoria do pro-
dutos: lactrias-modicamontos`.
Dos gcncs s protcInas:
pcsquIsas cm andamcnto
Para dosonvolvor ossas novas aplica-
os com as BI, as linhas do posguisa
soguiram lasicamonto os soguintos oixos:
ScIco dc IInBagcns dc BI
a soloao das linhagons do BI mais
adaptadas para as aplicaos dosojadas.
Um dos critrios importantos sua rosis-
tncia lorto acidoz gstrica t-pH 2). Essa
FIgura 1. Dotocao da nucloaso produ-
zida por clonos do 1acococcu: Iac::. O
moio do dotocao contm DNA, gar o
um coranto motacromtico lsico, o
azul do toluidina. A intoraao do DNA
com o azul do toluidina laz com guo o
ostado nativo do moio soja azul. Em
prosona da nucloaso, a dogradaao do
DNA lilora o coranto guo so lixa solro
o gar do moio o a coloraao torna-so
rosa. Os clonos azuis oxprossam, mas
nao oxportam a nucloaso, o acrscimo
do um sinal do socroao pormito a ox-
prossao do lontipo Nuc
+
rovolado pola
apariao do halos rosa om torno das
colonias.
FIgura 2. Socroao das protonas
pola via Soc-dopondonto. Vor toxto
com a doscriao do mocanismo.
SS, soguncia sinal, Sinal P
aso
,
poptdoo sinal.
82 1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI
rosistncia ao cido varivol do uma
ospcio para outra, mas podomos lazor
adaptaos ou modilicaos gonticas para
aumont-la.
Um outro critrio a capacidado do a
linhagom so mantor por monor ou maior
tompo no tulo digostivo, cortas BI, como
as 1 1ac::, transitam dontro do tulo
digostivo o sao rapidamonto ovacuadas
nas lozos, outras, como cortos lactolaci-
los, sao capazos do colonizar o tulo
digostivo. Uma ou outra dossas duas
situaos podo sor prolorida, do acordo
com a aplicaao guo protondomos utili-
zar.
Um ultimo critrio a sor considorado
o cartor imunoostimulanto das linha-
gons. Ns vimos guo cortas BI tm uma
atividado adjuvanto guo potoncializa a
rosposta imunitria. Vas o nvol dossa
imunoostimulaao varia sogundo as li-
nhagons o osso parmotro dovo sor lovado
om considoraao na olaloraao do linha-
gons vacinais.
Exprcsso (IndutIvcI) dc gcncs
BctcrIogos
No dosonvolvimonto do alimontos-
saudo`, procuramos idontilicar onzimas
do BI cuja supor oxprossao pormitir
induzir oloitos lonlicos para o hospodoi-
ro. Nosto caso lazomos uma autoclona-
gom ou polo monos clonagom somi-ho-
mloga tgono provonionto da mosma os-
pcio ou do mosmo grupo microliano).
No caso do dosonvolvimonto do vacinas
vivas o caso oposto, porguo procura-
mos produzir antgonos virais ou lactori-
anos.
Para ostas aplicaos, ns dosonvol-
vomos tcnicas para idontilicaao do si-
nais tchamados promotoros) guo contro-
lam a oxprossao gnica nas BI. Procura-
mos promotoros ditos indutvois. Estos
possuom uma atividado lraca ou nula
mas, guando solro a aao do um ostmu-
lo, iniciam ou aumontam lortomonto a
oxprossao do gono guo olos controlam. As
BI prosontos dontro do tulo digostivo
rocolom um grando numoro do ostmulos
lsico-gumicos ttomporatura do 3, pro-
sona do sais liliaros, ostados sucossivos
do carncia o alundncia nutricional do
acordo com o trnsito do lolo alimontar,
otc...) o numorosos ostudos sao loitos no
nosso laloratrio para caractorizar pro-
motoros guo rospondom a ostas variaos
do moio oxtorior.
Exportao dc protcInas
BctcrIogas
So a prosona do um promotor ad
hoc` pormito
a oxprossao
do um dotor-
minado gono,
nocossrio
guo, om sogui-
da, o produto
dosso gono
tonzima ou
antgono) soja
produzido om
um local guo
lho lacilito o
contato com o
sou sulstrato
ou sou alvo.
Na mai ori a
dos casos, ton-
tamos guo
ossa onzima
ou antgono
produzido soja aprosontado no moio ox-
torno om sua lorma livro tsocroao), ou
ligada aos onvolopos lactorianos tanco-
rada). Nos dois casos, a protona rocm-
sintotizada dovo sor oxportada, ou soja,
dovo doixar o compartimonto citoplasm-
tico o sor dirigida para a parodo colular ou
para o moio oxtorno. Essa protona ost
sujoita a oncontrar vrios olstculos,tais
como protoasos, guo podom dograd-la
ainda no citoplasma, a nocossidado do
atravossar a momlrana citoplasmtica o,
postoriormonto, a parodo colular. Aps
ossas otapas sorom voncidas, a atividado
dosojada dopondor das molculas osta-
rom om sua conlormaao nativa.
Nosso laloratrio ost ongajado nos
ostudos dossos mocanismos do oxporta-
ao, otapa olrigatria para controlar a
produao do molculas dotadas do ativi-
dados liolgicas nas BI. Para lacilitar
nosso tralalho, oscolhomos uma protona
modolo, NU. Ela uma nucloaso do
ajI,Iococcu: au:~u:, onzima osta guo
dograda cidos nuclicos o cuja atividado
podo sor dotoctvol por um tosto do
colorimotria tlig.1). Exploramos osso tosto
para dotoctar os clonos do BI capazos do
oxprossar o do oxportar ossa nucloaso.
Exprossamos o gono da nucloaso tuuc)
om 1 Iac:: t Io Ioir ~ aI, 1994). Quando
somonto a porao do gono uuc codilican-
do para a onzima madura oxprossa, a
nucloaso produzida no citoplasma o os
clonos rocolortos do moio do dotocao,
aparocom solro lundo azul tlig.1). Por
outro lado, guando a mosma porao do
uuc oxprossa om lusao com um sinal do
socroao, a nucloaso produzida podo sor
dotoctada polo aparocimonto do halos
rosa om torno das colonias tlig.1). A
nucloaso utilizada nosso oxporimonto
chamada do roprtor, pois sua atividado
nos pormito localizar as protonas oxpor-
tadas ontro uma populaao hotorognoa,
FIgura 3A. A ostrutura das protonas ancoradas nas lactrias gram-positivas: ostas
protonas sao sintotizadas solro a lorma do procursor com uma soguncia sinal N-
torminal o uma soguncia do ancoramonto -torminal, osta ultima tom uma ostrutura
composta do trs partos, do um motivo IPXTGX, do um lragmonto transmomlrnico
o do uma oxtromidado -torminal com carga, lroguontomonto, positiva.
FIgura 3B. O mocanismo do oxpor-
taao das protonas ancoradas, vor
toxto com doscriao do mocanismo.
WA, ~II WaII ucIo: para a rogiao
do ancoramonto parodo colular.
1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI 3
guo contm tamlm protonas citoplas-
mticas. Esso sistoma roprtor usado no
nosso laloratrio om dilorontos linhas do
posguisa.
PcsquIsa dc sInaIs dc
cxportao nas BI
Em todo o organismo vivo, as proto-
nas guo sorao oxportadas para lora da
clula possuom sinais guo indicam ao
organismo a sua localizaao linal. Essos
sinais podom sor do trs tipos, mas todos
os tipos sao constitudos principalmonto
por aminocidos hidrollicos. Elos sao
roconhocidos pola maguinaria do socro-
ao colular guo oncaminha a protona om
diroao momlrana atravs da gual ola
translocada tlig.2). O sinal hidrollico
podo sor clivado por uma poptidaso, sinal
guo tom o oloito do lilorar a protona
madura no moio oxtracolular t a socro-
ao mostrada na lig.2) ou sor clivado no
momonto om guo a protona madura
modilicada polos cidos graxos, o guo
lova sua associaao com a
momlrana ou, ontao, licar
insorida dontro da momlra-
na, o guo rosulta om uma
protona transmomlrnica.
Para idontilicar as protonas
do 1 Iac:: guo possuam um
tal sinal do oxportaao, utili-
zamos as propriodados do
uuc como roprtor tvor
lig.1). Pola construao do
uma lilliotoca do DNA ro-
prosontativa do gonoma lac-
toriano, construda na oxtro-
midado 5` do gono uuc, po-
domos idontilicar lragmon-
tos do DNA guo codilicam
sinais do oxportaao, pois
os clonos guo intograrom
ossos lragmontos do DNA
tornam-so capazos do ox-
portar a nucloaso o do do-
sonvolvor, ontao, halos rosa.
aractorizamos dosta manoi-
ra um grando numoro do
sinais guo pormitom a ox-
portaao da nucloaso tPo-
guot ~ aI., 1998).
CaractcrIzao da
maquInarIa dc sccrco dc 1 Tac11
Dosonvolvomos no nosso laloratrio
um votor para mutagnoso aloatria por
transposiao, guo nos pormitiu idontilicar
gonos implicados na socroao do proto-
nas tVaguin ~ aI, 1996). O postulado
inicial guo a insorao do transposon nos
vrios loci do gonoma podo gorar clonos
hiposocrotoros tcaso um gono constituti-
vo da maguinaria do socroao tonha sido
intorrompido polo transposon) ou hipor-
socrotoros do nucloaso tno caso ondo a
insorao do transposon tonha dosrogula-
do um gono constituinto ou um colalora-
dor da maguinaria do socroao). Os gonos
atingidos sao om soguida soguonciados
para construir, gradativamonto, o guolra-
caloa dos componontos colularos impli-
cados na socroao das protonas. omo o
gonoma da linhagom lI 403 do 1 Iac:: loi
intoiramonto soguonciado no nosso lalo-
ratrio, procuramos por homologia, os
gonos guo podom intorvir no procosso do
oxportaao no sontido mais amplo das
suas otapas mais prococos s mais tardias:
da conlormaao o ostalilidado da proto-
na, antos o dopois da translocaao.
CaractcrIzao da maquInarIa
dc ancoramcnto das protcInas
cm 1. Tac11
Nas lactrias gram-positivas, as pro-
tonas ancoradas parodo sao sintotizadas
sol a lorma do um procursor guo possui
uma soguncia sinal N-torminal o um
sinal do ancoramonto -torminal. Esto
ultimo constitudo do corca do trinta
aminocidos, sondo 20 dolos hidrolli-
cos, guo lormam um lragmonto trans-
momlrnico. O procosso do oxportaao
dosso tipo do protona guaso idntico
ao das protonas socrotadas guo possuom
um sinal guo intorago com a maguinaria
do socroao colular. Entrotanto, nosto
caso, a translocaao da protona incom-
plota dovido ao lato do o lragmonto
trasmonlrnico -torminal impodir a sua
translorncia. tlig.3). A ultima otapa do
procosso do oxportaao o corto da
protona a nvol do motivo IPXTG o a
lormaao do uma ligaao poptdica ontro
o -torminal da protona o um aminoci-
do do poptdioglicano. O comploxo onzi-
mtico guo laz a hidrliso ao nvol do
motivo IPXTG o sua ligaao parodo loi
donominado do :o:a:~ o, por onguanto
ainda nao loi caractorizado. om osso
oljotivo, o mosmo votor do transposiao
utilizado para lazor mutagnoso dos
clonos capazos do ancorar a
nucloaso o ontao procuramos
os transposantos capazos do
socrot-la. O soguonciamonto
dos gonos atingidos dovo por-
mitir idontilicar os componon-
tos do sistoma do ancoramon-
to das protonas om 1 Iac::
Esso ostudo importanto om
vrios nvois. Pormitir o do-
mno da aprosontaao na su-
porlcio das molculas utois.
Dovor tamlm tor impacto
importanto na torapia das do-
onas inlocciosas. Por analo-
gia das ostruturas -torminais
das protonas ancoradas nas
lactrias gram positivas, su-
pomos guo o mocanismo mo-
locular do ancoramonto das
protonas pariotais soja con-
sorvado om todas ossas lact-
rias. Entro as protonas guo so
ancoram utilizando ossa via,
algumas sao latoros do viru-
lncia do lactrias patogni-
cas como ajI,Iococcu: au-
:~u: ou :~jococcu: j,og~-
u~:. O comploxo :o:a:~ nas
lactrias gram-positivas po-
dom sor um novo alvo na luta contra
ossos patgonos guo, nos ultimos anos,
dosonvolvoram mocanismos do multiro-
sistncia aos antiliticos.
Das protcInas aos
aIImcntos-saudc c vacInas vIvas
So a caractorizaao das maguinarias
do oxportaao das protonas dovom, no
luturo, pormitir otimizar os sistomas do
FIgura 4. Os sistomas do oxprossao
tA), do socroao tB) o do ancoramonto
t) o a localizaao linal da nucloaso A
dontro da clula. P, promotor, SS, so-
guncia sinal, uuc, porao do gono
da nucloaso ospocilicando a nucloaso
A, WA, vor Fig. 3B, tor, torminador do
transcriao, VS, Vultiplos stios do
clonagom dostinados insorao do
gonos guo codilicam para poptdios o
protonas dosojadas.
oxportaao do molculas utois, os
conhocimontos atuais pormitom ponsar
nas suas aplicaos. Dontro dosso pano-
rama, dosonvolvomos votoros do oxpros-
sao, do socroao o do ancoramonto t Io
Ioir ~ aI, 1998, Piard ~ aI, 199 a-l).
oncolomos ossos votoros com casso-
tos` guo nos pormitom troc-las ontro si, o
guo possililita modular o nvol do oxpros-
sao do gono do intorosso o dotorminar a
localizaao linal do sou produto dontro
da clula. O osguoma do princpio dossos
votoros ost roprosontado na ligura 4.
Essos votoros sao atualmonto utiliza-
dos para construir linhagons do BI produ-
toras do antgonos guo sorao administra-
dos por via oral om modolos animais para
caractorizar: ti) o nvol do oxprossao no-
cossrio para gorar uma rosposta imunit-
ria, tii) a rolaao ontro a localizaao colu-
lar do antgono tostado tlocalizaao cito-
plasmtica, na parodo ou oxtracolular) o a
naturoza da rosposta imuno, tiii) o poro-
do nocossrio do pormanncia do votor
lactoriano no tulo digostivo para induzir
uma rosposta imuno no hospodoiro. Nos-
so ultimo ponto, utilizamos animais com
a llora digostiva controlada, o guo nos
pormito modular o tompo do pormann-
cia no tulo digostivo da lactria aproson-
tadora do antgono.
ConcIuscs c pcrspcctIvas
As prticas alimontaros do numorosos
grupos do indivduos os conduzom a
ingorir guantidados improssionantos do
BI. Essas lactrias alsorvidas vivas sao
capazos do oxorcor, na mucosa intostinal,
atividados liolgicas inorontos a olas. A
domonstraao do um oloito liolgico no
hospodoiro dilcil, dovido ao lato do o
nvol lasal dossas atividados sor muito
laixo. Para romodiar osso prolloma, vri-
as posguisas loram omproondidas supor-
oxprossando cortas atividados nossas lac-
trias para domostrar do manoira alsoluta
os sous oloitos nos hospodoiros. Esso
campo do invostigaao om saudo pullica
lascinanto o promissor.
So o intorosso atual por produtos-
saudo` ovidonto, nao dovomos osguocor
o clima do incortoza guo onvolvo o doson-
volvimonto do organismos gonoticamon-
to modilicados. Dovomos privilogiar as
vias do autoclonagom, guo ovitam a intro-
duao do DNA ostrangoiro. Dontro dosso
panorama, dovomos distinguir os produ-
tos dostinados alimontaao, nos guais
dovomos procurar risco zoro` para os
consumidoros, o os produtos oriundos do
lactrias vacinais, para as guais o risco do
dissominaao horizontal dovo sor inlorior
aos riscos do uma populaao oxposta a
corto patgono do solror com a doona.
Nosto ultimo caso, o dosonvolvimonto do
sistomas do conlinamonto guo impoam
a solrovivncia das lactrias no amlion-
to dovom sor procurados.
RcIcrcncIas BIbIIogrIIcas
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V6 protoin ol :~jococcu: j,og~u~: and
its potontial as a tool to anchor liologi-
cally activo moloculos at tho surlaco ol
lactic acid lactoria. :~jococc: auu I~
Ho:, dit par Horaud ~ aI. Plonum
Pross, Nov \ork.
Poguot l., Ehrlich S. D. ot Gruss A.
1998. An oxport-spocilic roportor dosig-
nod lor Gram-positivo lactoria: applica-
tion to 1acococcu: Iac::. ) 1ac~::oI.
180: 1904-1912.
AgradccImcntos
Agradocomos aos nossos cologas do
lNRA polas sugostos o rolloxos procio-
sas.
Quoromos tamlm domonstrar o nos-
so roconhocimonto Dra. Aloxandra Gruss
polo sou dinamismo o apoio na roaliza-
ao dos nossos tralalhos.
O|N|!lC/ D| 8/C!|Kl/! L/C!lC/!
Os trabaIBos IcItos no BrasII com
bactcrIas IctIcas so csscncIaI-
mcntc apIIcados IndustrIa dc aII-
mcntos c cnvoIvcm a utIIIzao
dcssas bactcrIas cm produtos Icr-
mcntados, prIncIpaImcntc aquc-
Ics dcrIvados do IcItc. AIguns gru-
pos csto rcaIIzando cstudos dc
taxonomIa cIssIca c moIccuIar,
anIIscs da dIvcrsIdadc gcnctIca
cntrc as cspccIcs IsoIadas dc um
mcsmo mcIo ou dc mcIos dIIcrcn-
tcs, anIIscs da dIvcrsIdadc das
cspccIcs prcscntcs dcntro dc
ccossIstcmas mIcrobIanos quc
contcm bactcrIas IctIcas (produ-
tos aIImcntIcIos Icrmcntados) c o
papcI dcsta dIvcrsIdadc dcntro do
IuncIonamcnto dos ccossIstcmas
(manutcno ou dcsaparccImcn-
to das popuIacs, atIvIdadc mcta-
bIIca, cxprcsso dc gcncs cspccI-
IIcos).
MundIaImcntc, os cstudos gcnctI-
cos quc utIIIzam a bIoIogIa
moIccuIar das bactcrIas IctIcas
comcaram na dccada dc oItcnta c
rcsuItados Importantcs comca-
ram a aparcccr rcccntcmcntc. O
rcpassc dcssa tccnoIogIa c o csta-
bcIccImcnto dc coIaboracs com
grupos quc j csto trabaIBando
ncssa tccnoIogIa c dc cxtrcmo In-
tcrcssc para o BrasII, sobrctudo
ncstc momcnto cm quc sc dIscutc
c sc rcguIamcnta, no mundo IntcI-
ro, a utIIIzao dc mIcrorganIs-
mos gcnctIcamcntc modIIIcados.
Com csscs objctIvos, os proIcsso-
rcs Vasco Azcvcdo c ScrgIo Costa
OIIvcIra coordcnaram um curso
sobrc GcnctIca dc BactcrIas
IctIcas rcaIIzado cntrc os dIas 14
a 18 dc sctcmbro, no InstItuto dc
CIcncIas BIoIgIcas da UnIvcrsIda-
dc FcdcraI dc MInas GcraIs. Con-
tou com o patrocInIo c apoIo das
ps-graduacs cm BIoquImIca c
ImunoIogIa, GcnctIca c
MIcrobIoIogIa c das cmprcsas
PBarmacIa BIotccB, AppIIcd
BIosystcms PcrkIn EImcr, GIbco
BRI IIIc TccBnoIogIcs, NcstIc Nu-
trIo InIantII, FIEMG c CAPES. Os
proIcssorcs do curso Iazcm partc
da cquIpc quc cscrcvcu cstc artIgo.
Todas as InIormacs sobrc cssc
cvcnto podcm scr obtIdas na
HOME PAGE:
Bttp://www.Icb.uImg.br/-vasco/
bacIac.
84 1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI
FUNDA(AO
DAIVO GlAOVETTl
86 1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI
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molhoramonto do plantas
tom como propsito o do-
sonvolvimonto do novas
cultivaros guo, adaptadas
s condios do cultivo,
sojam capazos do promovor uma ost-
vol o olovada produtividado, assim como
a gualidado dosojada do produto. Visto
sol o aspocto motodolgico, o molho-
ramonto do plantas gontica aplicada.
A sistomatizaao do programas do mo-
lhoramonto gontico do plantas tovo
incio no comoo do sculo, aps a
rodoscolorta dos tralalhos do Grogor
Vondol, guo olalorou as lois lsicas da
horana gontica. Atravs da aplicaao
consoguonto dossas lois, loi possvol,
duranto osto sculo, duplicar, triplicar
ou, om alguns casos, como por oxom-
plo o do trigo, guadruplicar a produti-
vidado mdia por hoctaro tOrdon 8
Friod, 1998). Evidontomonto, o incro-
monto na produtividado nao ost so-
monto lasoado no molhoramonto, mas
tamlm na molhoria das condios do
cultivo o no manojo adoguado das culturas.
At moados da dcada do 80, os mto-
dos clssicos loram os grandos rospons-
vois polo dosonvolvimonto das novas culti-
varos. Porm, nos ultimos anos, o molhora-
monto clssico rocolou como lorramontas
auxiliaros divorsas tcnicas lasoadas no
cultivo do tocidos vogotais o liologia molo-
cular, guo ampliaram os horizontos na lus-
ca da divorsidado allica nocossria om um
programa do molhoramonto. Essas tcnicas
possililitam ao molhorista transcondor o
pool gnico primrio, utilizado no molhora-
monto clssico, pormitindo a incorporaao
do novos alolos ao gonoma guo conliram as
caractorsticas dosojvois cultura.
Das ostratgias liotocnolgicas dispo-
nvois para translorncia gnica ontro osp-
cios, a translormaao gontica vantajosa
guando so trata da translorncia do caracto-
ros monognicos, isto , caractorsticas g-
nicas controladas por um unico gono. E
guando osso gono do intorosso ost dispon-
vol o clonado om um votor tnormalmonto
plasmdio), guo so oncarrogar do translor-
lo ao gonoma da planta. Entrotanto, at o
momonto, somonto um limitado numoro do
monogonos idontilicados o clonados ostao
disponvois para sor transloridos. Porm, a
grando maioria dos caractoros do intorosso
oconomico tprodutividado, divorsas rosis-
tncias a pragas o molstias, tolorncia a
strossos) sao caractorsticas controladas por
poligonos ou gonos guo tonham mocanis-
mos molocularos dosconhocidos. E ossos
gonos controlados por poligonos nao po-
dom sor transloridos por moio da tcnica da
translormaao. Nosso caso, a ostratgia da
hilridaao somtica aprosonta-so como uma
altornativa apropriada.
HIbrIdao somtIca
Entondo-so por hilridaao somtica
simtrica a lusao complota do dois proto-
plastos com os dois gonomas, incluindo
o citoplasma o as organolas colularos. O
uso dossa tocnologia roguor guo sojam
atondidas 2 condios lsicas: primoiro,
o isolamonto do protoplastos dovo sor om
guantidado sulicionto para so ostalolocor
um cultivo, o sogundo, os protoplastos
dovom sor totipotontos, isto , dovorao tor
a capacidado do prolilorar o rogonorar
uma nova planta. Essas condios lsi-
cas j ostao ostalolocidas para mais do
320 ospcios tBinslold, 1998). Nas osp-
cios om guo mais so utiliza ossa tcnica
sao as das lamlias solanacoao o lrassica-
coao. Entrotanto, mais rocontomonto, om
muitas outras ospcios tom sido ompro-
gada com xito no molhoramonto, inclu-
indo ospcios rocalcitrantos. Entro ossas,
oncontram-so vrios momlros das lamli-
as da Poacoao, Falacoao, Rosacoao, alm
do vrias ospcios llorostais, incluindo
lrutloras o ossncias llorostais tBajaj, 1996).
Por moio da hilridaao somtica, oloro-
co-so tamlm a possililidado do gorar vari-
alilidado pola: a) suporaao da incompatili-
lidado soxual ontro plantas, l) produao do
amlidiplidos, c) translorncia do DNA cito-
plasmtico, o d) translorncia gonomica par-
cial tlragmontaao do nucloo da clula do-
adora).
A hilridaao somtica comparada trans-
lormaao gontica nao ospoclica om rola-
ao ao rosultado luscado, pois a introgros-
sao ou a translorncia gnica nao sao proci-
samonto controladas, o guo, na soguncia,
onvolvo um procosso do soloao. Porm, om
muitas ospcios do plantas, assim como na
translormaao gontica, a lusao do proto-
plastos possililitou a suporaao da incom-
patililidado soxual. Ao contrrio dos gonos
introduzidos por moio das tcnicas do DNA
rocomlinanto, ossa tcnica torna possvol a
translorncia do caractorsticas gnicas con-
troladas principalmonto por poligonos.
FIgura 1. DIagrama csqucmtIco
mostrando as ctapas bsIcas da
BIbrIdao somtIca assImctrIca,
por mcIo do uso dc mIcronucIcos
para a transIcrcncIa gcnmIca
parcIaI
1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI 87
Na hilridaao somtica simtrica tlu-
sao do dois protoplastos complotos), nor-
malmonto o numoro do cromossomos do
hlrido a soma dos cromossomos dos
gontipos onvolvidos na lusao, alm das
organolas do amlos os parcoiros. Duranto
a primoira divisao da clula hlrida, sor
dolinida a composiao cromossomica, lom
como das organolas guo irao compor as
clulas nas prximas goraos. Hlridos
somticos simtricos, pola sua comploxa
comlinaao gonomica, nocossitam do su-
cossivas goraos do rotrocruzamontos com
o gontipo dosojado no sontido do intro-
grodir somonto a caractorstica dosojada.
lsso, por sua voz, limita sou uso diroto om
programas do molhoramonto, dada a olo-
vada domanda do tompo o disponililidado
do rocursos nocossrios tRamulu ot al.,
1995). Por isso, crosco o intorosso por
mtodos do hilridaao somtica guo limi-
tom a translorncia gonomica duranto o
procosso da lusao, surgindo o guo so
donomina :au:J~:~uc:a g~uu:ca ja:c:aI
por moio do hilridaao somtica assim-
trica.
HIbrIdao somtIca assImctrIca
onsisto na translorncia parcial do
gonoma da clula doadora para uma clula
somtica rocoptora. lsso podo ocorror do
variadas lormas. Primoiro, a oliminaao do
gonoma doador podo sor induzida modi-
anto o uso da radiaao antos da lusao do
protoplastos. Outras lormas do translorn-
cia gonomica parcial podom sor por moio
do microinjoao ou ainda pola lusao do
microprotoplastos contondo micronuclo-
os com um ou poucos cromossomos do
gonoma doador. Em goral, o tratamonto
com radiaao roduz a guantidado do DNA
translorido, porm, muito varivol o
instvol. Alm disso, a oliminaao dos
cromossomos aloatria, do modo guo
nao possvol prodizor gual sor a parto do
gonoma guo sor translorido pola lusao
assimtrica tWaara 8 Glimolius, 1995).
Uma manoira do contornar osso pro-
lloma consisto na idontilicaao do marca-
doros gonticos guo ostojam ligados aos
gonos do intorosso agronomico nos ros-
poctivos cromossomos. Por moio dos mar-
cadoros gnicos o o uso das tcnicas do
citomotria do lluxo o micromanipulaao,
consoguo-so solocionar os cromossomos
ou micronucloos portadoros dossos gonos,
o dosta lorma podo-so controlar o procosso
da translorncia gonomica parcial usando
microprotoplastos.
Uso dc mIcroprotopIastos
como cstratcgIa dc transIcrcncIa
gcnmIca parcIaI
Uma tcnica dosonvolvida rocontomon-
to, guo vom dosportando o intorosso dos
molhoristas a lusao com microproto-
plastos. Vicroprotoplastos sao micronu-
cloos contondo uma lina camada do cito-
plasma o onvoltos por uma momlrana
plasmtica. J os micronucloos sao cro-
mossomos condonsados do lorma isola-
da no intorior da clula o sao onvoltos por
uma momlrana nucloar. Essa tcnica por-
mito translorir, do lorma controlada, um
limitado numoro do cromossomos do
uma clula doadora para uma clula
rocoptora, por moio da lusao com micro-
protoplastos contondo um micronucloo
com um ou poucos cromossomos, ou,
ainda, pormito a translorncia dirota dos
micronucloos atravs do microinjoao. O
diagrama osguomtico da Figura 1 mostra
as principais otapas dosso procosso do
micronucloaao o translorncia gonomi-
ca parcial por moio do lusao ou microin-
joao.
Entro as otapas mais importantos da
translorncia gonomica parcial por moio
do microprotoplastos ou microinjoao,
tom-so: 1) o dosonvolvimonto do uma
cultura colular do croscimonto ativo, 2) a
induao do micronucloos polo uso do
antimitticos, 3) o isolamonto o soloao
do micronucloos ou microprotoplastos
poguonos, 4) a translorncia do micronu-
cloo ou microprotoplasto para a clula
rocoptora, 5) a rogonoraao o soloao dos
hlridos parciais.
A primoira otapa consisto no doson-
volvimonto do uma susponsao do clulas
guo sorao usadas como doadoras dos
micronucloos ou microprotoplastos.
condiao lundamontal guo haja doson-
volvimonto do uma cultura colular om
ativo croscimonto, do lorma sincroniza-
da, do tal manoira guo so tonha uma
olovada porcontagom do clulas guo on-
trarao om divisao ao mosmo tompo, ou
soja, guo ostojam om motlaso, para ontao
aplicar os agontos antimitticos.
Na sogunda otapa, induz-so a micronu-
cloaao. A micronucloaao om plantas
podo sor induzida pola oxposiao prolon-
gada do clulas mitticas a agontos guo
inilom a polimorizaao dos microtululus
guo lormam as lilras dos lusos. Essos
agontos so ligam dirotamonto aos mono-
moros da tululina. A colchicina ou os
horlicidas Amiprols motil tAPV), Oryza-
lin ou romat sao potontos agontos antimi-
tticos om clulas do plantas. Na prosona
dos agontos antimitticos, duranto a mot-
laso colular, os cromossomos soparam-so o
distriluom-so do lorma isolada ou om
poguonos grupos, pola clula. Pola dislun-
ao das lilras do luso, os cromossomos
motalsicos nao so soparam om duas cro-
mtidos irmas. Aps algumas horas, ossos
sao onvoltos pola momlrana nucloar, ro-
sultando na lormaao do vrios poguonos
nucloos donominados do micronucloos
tFigura 2).
Na torcoira otapa, 24 h aps a aplicaao
dos antimitticos, adiciona-so itochalasi-
na-B tB) guo, alm do ostalilizar os
micronucloos lormados, tom por linalida-
do tornar o procosso da micronucloaao
mais olicaz
Na guarta otapa, laz-so o isolamonto
dos micronucloos ou microprotoplastos.
Para tornar o isolamonto olicaz, lunda-
montal guo so romova a parodo colular das
clulas micronucloadas por moio da digos-
tao onzimtica. Aps a romoao da parodo
colular, as clulas sao inculadas por 4 h
sol rolrigoraao t4
o
), na prosona do
spormidina. Esta tom por linalidado proto-
gor o comploxo momlranrio das clulas
micronucloadas.
A guinta otapa consisto na soparaao
dos micronucloos ou microprotoplastos da
clula. Nossa otapa, j dovor ostar dolini-
do o procodimonto motodolgico guo sor
usado para translorir o gonoma parcial
para a clula rocoptora, o gual podo sor
pola lusao gumica ou pola microinjoao.
No primoiro caso, isolam-so os micropro-
toplastos por moio do ultracontrilugaao
t120.000 g por 2 h) om um gradionto iso-
osmtico do Porcoll. Aps, soparam-so as
landas lormadas com ponoiras do nylon
do docroscontos tamanhos do poros t20,
15, 10, 5 o 3 m). No sogundo caso, laz-so
a liso das clulas micronucloadas om solu-
ao hipotonica, ondo a clula so rompor,
lilorando os micronucloos: ostos sorao
colotados modianto uma lovo contriluga-
ao para soparar lragmontos colularos dos
micronucloos, soguindo-so uma liltraao
soguoncial, conlormo doscrito para o pri-
moiro caso.
A soxta otapa, a otapa da lusao ou da
translorncia por microinjoao. Os micro-
protoplastos colotados, conlormo doscrito
FIgura 2. CcIuIa com dIvcrsos
mIcronucIcos corados com DAPI
c vIsuaIIzado sob Iuz uItravIoIcta
cm um mIcroscpIo dc IIuorcs-
ccncIa
88 1:o~cuoIog:a :~uc:a 1~:~u:oI::u~uo - Euca:~ E:j~c:aI
acima, podorao sor lusionados com
protoplastos rocoptoros, modiada por um
agonto gumico, como, por oxomplo, o
poliotilono glicol tPEG). Nosso caso, o
protoplasto rocoptor o o microprotoplasto
sorao colocados om contato por poucos
minutos, na prosona do PEG, om uma
soluao rica om ons do clcio. Aps a
lusao, as clulas sao lavadas para romovor
o PEG, guo, om oxposiao prolongada, so
torna txico s clulas. No caso do uso da
microinjoao, o procodimonto consisto no
carrogamonto da micropipota do manipu-
lador com micronucloos, soguindo-so a
injoao dos micronucloos nas clulas, como
mostra na Figura 3. A vantagom da micro-
injoao om rolaao lusao com PEG o
lato dosta sor um ovonto dirigido, isto ,
tom-so o controlo solro a guantidado do
micronucloos injotados por clula. En-
guanto guo no procodimonto da lusao
gumica, podor ocorror a lusao do um ou
mais micronucloos por clula.
As clulas rocoptoras, ou soja, os pro-
dutos da lusao o da microinjoao, sao
cultivados at a laso do dosonvolvimonto
do calo. Os calos lormados sao translori-
dos para um moio do diloronciaao o
rogonoraao do lrotos o razos, oltondo-
so, assim, um hlrido parcial.
A naturoza hlrida parcial da planta
podo sor idontilicada polos caractoros
morlolgicos, citolgicos ou molocularos.
aso haja marcadoros molocularos, a an-
liso da naturoza hlrida j podor sor loita
duranto a laso do calo, o guo so mostra
como grando vantagom, pois ovita todo o
procosso do rogonoraao, guo, muitas vo-
zos, dispondioso, tanto polo aspocto do
tompo como do tralalho.
ApIIcao da tccnIca dc
mIcronucIcos no
mcIBoramcnto dc pIantas
A tocnologia da hilridaao somtica
assimtrica polo uso dos micronucloos
oncontra inumoras aplicaos om progra-
mas do molhoramonto do plantas, lom
como om ostudos das intoraos gonomi-
cas a nvol somtico. O uso dossa tcnica
pormito:
1) translorncia do caractoros dosoj-
vois ontro ospcios soxualmonto incompa-
tvois. A incompatililidado soxual ontro
ospcios cultivadas o suas lormas silvostros
, assim, suporada. Dossa lorma, as osp-
cios silvostros podom sor usadas om pro-
gramas do molhoramonto luscando trans-
lorir gonos do rosistncia a pragas o mols-
tias ou tolorncia a ostrossos amliontais ao
gontipo cultivado,
2) translorncia do caractoros controla-
dos por poligonos ou mosmo do caractoros
controlados por gonos dosconhocidos.
aractorsticas importantos como rosistn-
cia a doonas, ostrossos amliontais ou
caractoros ligados produao sao contro-
ladas por um variado numoro do gonos
guo intoragom ontro si. Estos so oncontram
com lroguncia om llocos dontro do go-
noma. Sondo assim, a translorncia do um
ou do poucos cromossomos capaz do
translorir um grupo do gonos om um unico
passo,
3) produao do linhas monossomicas o
dissomicas om uma unica otapa. lsso oco-
nomiza tompo o um prolongado procosso
do rotrocruzamonto nocossrio para oltor
tais linhas via mtodo soxual. A partir do
linhas monossomicas ou dissomicas,
possvol oltor sultituiao ou rocomlina-
ao ontro cromossomos ttranslocaao in-
torgonomica),
4) anliso olicionto do gonos doados
aos hlridos parciais intorgonricos ou
intorospoclicos, assim como, propicia o
ostudo lsico solro gonos introduzidos
taltoraos ostruturais, doloao, inativa-
ao ou cossuprossao),
5) ostudos solro a localizaao dos
gonos nos cromossomos. Gonos podom
sor procisamonto localizados so lor pro-
duzida uma populaao suliciontomonto
grando do linhas monossomicas. Podo sor
igualmonto omprogado no mapoamonto
do gonos ospoclicos aos cromossomos.
6) construao do lilliotocas do cro-
mossomos, tondo por linalidado a anliso
gonomica om tralalhos do molhoramon-
to do plantas a nvol molocular. Podo
lacilitar a clonagom dirota do sogmontos
do DNA nos cromossomos via microcro-
manipulaao tlasor), rocortando sogmon-
tos cromossomicos o os sulstituindo por
sogmontos solocionados.
A guostao lundamontal da tcnica
agui aprosontada , om primoiro lugar, a
possililidado da translorncia gonomica
parcial o, associada a osta, a translorncia
do caractoros polignicos o sogundo, por
moio do um rolinamonto tcnico, nos
possililita soccionar sogmontos cromos-
somicos guo pormitam a translorncia do
comploxos gnicos, rosultando assim
numa translorncia controlada do grupos
gnicos. A docisao do uso dosta tcnica
no molhoramonto do plantas dopondo do
oljotivo o das caractorsticas gnicas guo
so dosoja translorir.
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tIca do proccsso da mIcroInjco.
AcIma cst rcprcscntado a prImcI-
ra ctapa quc corrcspondc a coIcta
dos mIcronucIcos c abaIxo cst
rcprcscntado o posIcIonamcnto
da ccIuIa (protopIasto) para a
mIcroInjco