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Biofilme
A chave para compreender e controlar o crescimento bacterial
em Sistemas de gua Potvel Automatizados
Segunda Edio por Paula H. Dreeszen Junho 2003




Definies

Adsoro processo fsico que ocorre quando uma substncia adere superfcie de uma outra.
Adsoro um processo fsico que ocorre sem reao qumica.
Aerbico requere ar ou oxignio livre para se desenvolver.
Anaerbico se desenvolve sem ar ou oxignio livre.
AWS Automated Watering System sistema de gua automatizado.
Camada limtrofe a zona laminar ou quieta na parede da tubulao onde a velocidade de vazo
cai para zero.
Carga de superfcie o balano entre os nmeros de cargas positivas e negativas expostas a uma
superfcie slida.
Chemotaxis movimento de organismos em resposta ao gradiente qumico.
Energia livre de superfcie o grau de hidrofobia ou hidrofilia de uma superfcie.
Flagella plural de flagellum. Algumas bactrias possuem mais que um flagellum.
Flagellum anexo filamentoso longo que impulsiona a bactria; significado literal chicote; veja
Figura 3.
Glycocalyx substncias polimricas extracelulares (polmeros pegajosos) que a bactria excreta
para aderir s superfcies slidas e alojar nutrientes.
Hidroflico tem a caracterstica de absorver gua.
Hidrofbico tem a caracterstica de repelir a gua (exemplo: Teflon um material hidrofbico.)
Motil movimento independente da gua.
Oligotrophs bactrias e outros organismos capazes de se desenvolver em ambientes com
limitao de nutrientes.
Plantnica microrganismos de livre flutuao cujos movimentos so controlados pelo movimento
da gua (no agregados s superfcies).
RA Roughness Average media de rugosidade ou o desvio da mdia aritmtica da linha de
centro de uma superfcie.
RDS Room Distribution System sistema de distribuio de sala, parte de um sistema de gua
automatizado.
RMS Root Mean Square a raz quadrada mdia dos desvios da linha de centro de uma
superfcie.
Sssil agregada s superfcies slidas (oposto de plantnicas).
Vazo laminar movimento de fluido em camadas paralelas suaves, contnuas, no tubulentas que
no se misturam entre si.

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Introduo

O que so biofilmes?

Mais propriamente conhecida como biofilme, colnias de lama prosperam em todo lugar que h
gua na cozinha, nas lentes de contato, revestimento de tripas animais. Quando a propagao
urbana extensiva, biofilmes podem ser vistos a olho nu, cobrindo o interior de tubulaes de gua
ou deslizamento oscilante e o verde do chumbo. (Coghlan, 1996).

Simplesmente colocado, biofilmes so uma coleo de microorganismos cercados pela lama que
secretam, agregados tanto em uma superfcie inerte como viva. Voc j est familiarizado com
alguns biofilmes: a placa em seu dente, o lodo escorregadio em pedras de rios, e o filme como gel
dentro de vasos de flores que ficaram durante uma semana. O biofilme existe em todo lugar que a
superfcie entra em contato com gua.

Mais que 99 por cento de toda bactria viva em comunidades de biofilme. Algumas so benficas.
Plantas de tratamento de esgoto, por exemplo, confiam no biofilme para remover contaminantes da
gua. Mas biofilmes podem tambm causar problemas corroendo tubulaes, obstruindo filtros de
gua, causando rejeio de implantes mdicos, e bactrias perigosas que contaminam gua potvel.



Por que aprender sobre biofilmes?

Microbiologistas tradicionalmente focaram no crescimento de bactria flutuante em culturas de
laboratrio; ainda eles recentemente perceberam que no mundo natural a maioria das bactrias se
agregam como biofilmes, uma forma na qual elas se comportam de maneira bem diferente. Como
resultado, biofilmes so atualmente um dos tpicos mais quentes na microbiologia (Potera, 1996).


Como em qualquer sistema de gua, 99 por cento das bactrias em um sistema automatizado de
gua so provveis de estar em biofilmes agregados s superfcies internas. Biofilmes so a fonte de
muitas bactrias de livre flutuao em gua potvel, algumas das quais podem causar infeco e
doena em animais de laboratrio.

Uma bactria comum de biofilme, Pseudomonas aeruginosa, um patognico secundrio que pode
infectar animais com sistema imunolgico diminudo. Alm de ser um reservatrio de bactrias que
podem afetar a sade animal, os biofilmes podem tambm causar corroso em sistemas de
tubulao de ao inoxidvel. Para projetar e operar sistemas de gua automatizados que entreguem
a qualidade bacterial exigida pelos nossos clientes, ns temos que compreender como biofilmes se
desenvolvem, alguns dos problemas que eles podem causar, e como eles podem ser controlados.

Compreender a bactria em biofilmes um dos passos em direo para o futuro. Estamos
atualmente obedecendo as maiores exigncias de qualidade de gua na demanda microbiolgica de
nossos clientes fornecendo gua clorada de osmose reversa e mantendo a qualidade da gua por
lavagem e sanitizao. (Refere a Estudo Microbiolgico de Sistemas de gua Automatizados -
Microbiological Survey of Automated Watering Systems, D209, Dreeszen 1996.) Mas o que fazer se
o uso de cloro em gua potvel de animais proibido? Ou o que fazer se as exigncias de qualidade
da gua tornam se cada vez mais restritas com o uso de novos animais especializados?

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claro, voc deve apenas querer aprender sobre biofilmes para admirar a capacidade da bactria de
se adaptar ao seu ambiente e escapar s tentativas de elimina-la.





Fases no Desenvolvimento do Biofilme

No instante que uma tubulao preenchida com gua, um biofilme j comea a se formar. O
desenvolvimento do biofilme ocorre nas seguintes fases.



Condio da superfcie

As primeiras substncias associadas com a superfcie no so bactrias mas traos orgnicos. Quase
imediatamente aps a superfcie da tubulao limpa entrar em contato com gua, uma camada
orgnica se deposita na interface gua/slido (Mittelman 1985). Estes orgnicos so ditos formarem
uma camada de condicionamento que neutraliza excessiva carga de superfcie e energia livre de
superfcie que pode prevenir uma clula de bactria de se aproximar o bastante para comear a
agregar. Alm disso, as molculas orgnicas adsorvidas sempre servem como uma fonte de
nutrientes para bactria.



Adeso da bactria pioneira

Em uma tubulao de vazo de gua, algumas das bactrias plantnicas (livre flutuao) abordaro
a parede da tubulao e se entranham dentro da camada limtrofe, a zona inativa da parede do tubo
onde a velocidade de vazo baixa para zero. Algumas destas clulas se lanaro e adsorvero
superfcie por algum tempo, e ento se desorvero. Isto chamado adsoro reversvel. Esta
agregao inicial baseada em atrao eletrosttica e foras fsicas, sem qualquer agregao
qumica. Algumas das clulas adsorvidas reversivelmente comeam a fazer preparaes para uma
estadia prolongada formando estruturas que podem aderir permanentemente a clula superfcie.
Estas clulas se tornam irreversivelmente adsorvidas.



Glicoclix ou formao de lodo

As bactrias do biofilme excretam substncias polimricas extracelulares, ou polmeros aderentes,
que mantm o biofilme junto a si e consolida-se na parede da tubulao. Alm disso, estes
polmeros alojam nutrientes escassos e protegem as bactrias dos biocidas. De acordo com
Mittelman (1985), Agregao mediada por polmeros extracelulares que se estendem para fora
da parede da clula bacterial (bem parecido com a estrutura de uma teia de aranha). Este material
polimrico, ou glicoclix, consiste de grupos polissacardeos neutros e alterados que no s
facilitam agregao mas tambm agem como um sistema de troca inica para alojar e concentrar

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traos de nutrientes da gua externa. O glicoclix tambm age como um revestimento protetivo
para as clulas agregadas que abranda os efeitos de biocidas e outras substncias txicas.

















































Fig. 1
Adsoro de molculas orgnicas em uma superfcie limpa
forma um filme de condicionamento (Characklis 1990)

Fig. 2
Transporte de clulas de bactria para a superfcie condicionada,
adsoro, dessoro, e adsoro irreversvel (Characklis 1990)
TRANSPORTE
ADVETIVO
ADSORO
REVERSIVEL DESSORO
ADSORO
IRREVERSIVEL

Membrana
celular
Estruturas da
parede celular
Contedo
intracelular
Material
polimrico
extracelular
Flagelo
Fig. 3
Bactrias selvagens so clulas peludas com polmeros extracelulares que
aderem superfcies (Mittelman 1985)

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Quando se acumulam os nutrientes, as clulas pioneiras comeam a se reproduzir. As clulas irms
produzem ento seu prprio glicoclix, aumentando largamente o volume da superfcie de troca
inica. Logo uma prspera colnia de bactrias estabelecida (Mayette 1992).

Em um biofilme maduro, a maior parte do volume ocupado pela matriz de glicoclix livremente
organizada (75-95%) do que por clulas bacteriais (5-25%) (Geesey 1994). Porque a matriz de
glicoclix retm muita gua, uma superfcie coberta por biofilme gelatinosa e escorregadia. O
biofilme construdo de micrbios e uma teia de polmeros extracelulares.



Colonizadores Secundrios

Assim como molculas de nutrientes alojadas, a rede de glicoclix tambm armazena outros tipos
de clulas microbiais atravs de restrio fsica e interao eletrosttica. Estes colonizadores
secundrios metabolizam resduos dos colonizadores primrios bem como produzem seus prprios
resduos que outras clulas ento utilizam na verdade. De acordo com Borenstein (1994), estas
outras bactrias e fungos se associam superfcie seguindo a colonizao pelas espcies
pioneiras por uma questo de dias.



Biofilme de funes completas

O biofilme maduro, de funes completas como um tecido vivo na superfcie da tubulao. uma
comunidade metabolicamente cooperativa e complexa composta de diferentes espcies cada uma
vivendo em um micronicho caracterstico. Os biofilmes so ainda considerados possuidores de
sistemas circulatrios primitivos. Biofilmes maduros so imaginariamente descritos no artigo
Cidade de Lodo:
Espcies diferentes vivem lado a lado em cidades de lodo, ajudando umas s outras para utilizar
suprimentos de alimento e para resistir contra antibiticos atravs de interaes vizinhas. Resduo
txico produzido por uma espcie pode ser devorada com fome por seu vizinho. E por associao
de suas reservas bioqumicas para construir uma cidade de lodo comum, vrias espcies de
bactrias, cada uma munida com diferentes enzimas, podem quebrar o suprimento de alimento que
nenhuma espcie isolada poderia digerir sozinha. Os biofilmes so permeados em todos os nveis
por uma rede de canais atravs dos quais gua, resduos bacteriais, nutrientes, enzimas,
metablitos e oxignio viajam de uma lado para outro. Gradientes de reagentes e ons entre
microzonas oferecem a fora para manobrar as substncias em volta do biofilme. (Coghlan 1996)



Biofilmes crescem e se espalham

Um biofilme pode se espalhar em sua prpria velocidade pela diviso normal de clula e tambm
liberar periodicamente novas clulas pioneiras para colonizar sees mais baixas da tubulao.
Ao filme crescer para uma espessura que permita se estender atravs das camadas limtrofes nas
zonas de velocidade maior e vazo mais turbulenta, algumas clulas sero descartadas. De acordo
com Mayette (1992), Estas clulas pioneiras posteriores tem uma vida maior do que aquelas
precedentes j que o filme inicial liberar resduos no fluxo que podem servir tanto como

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revestimento orgnico inicial para sees no colonizadas de tubulao no fluxo de baixo como
substncias nutrientes para outros tipos de clulas.





















Qual a velocidade do biofilme se desenvolver?

De acordo com Mittelman (1985), o desenvolvimento de um biofilme maduro pode levar algumas
horas at algumas semanas, dependendo do sistema. Pseudomonas aeruginosa uma bactria
pioneira comum e usada em uma srie de pesquisas de biofilme. Em um experimento
(Vanhaecke 1990, veja resumo do teste pg 5), pesquisas verificaram que clulas Pseudomonas
aderem ao ao inoxidvel, mesmo em superfcies eletropolidas, dentro de 30 segundos de
exposio.





















Fig. 4
Bactrias e outros microrganismos desenvolvem colnias
cooperativas ou consrcio dentro do biofilme. Um biofilme
anaerbico pode se desenvolver embaixo da camada aerbica. A
espessura do biofilme alcanar um equilbrio quando a gua
corrente destacar clulas se estendendo no fluxo turbulento.
(Borenstein 1994)

FLUIDO PRINCIPAL
BIOFILME AERBICO
PAREDE DA TUBULAO
BIOFILME ANAERBICO
microcolnia
Fig. 5
Biofilme periodicamente libera
clulas pioneiras

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Benefcios Bactria: alimento e proteo

A associao de bactrias com a superfcie e o desenvolvimento de um biofilme pode ser visto
como um mecanismo de sobrevivncia. A obteno de nutrientes e a proteo contra biocidas
beneficiam as bactrias.



Alimento

gua potvel, especialmente sistemas de gua de alta pureza, so ambientes limitadores de
nutrientes, mas mesmo concentraes muito baixas de nutrientes so suficientes para permitir
crescimento microbial e reproduo. Bactrias e outros organismos capazes de se desenvolver em
ambientes limitadores de nutrientes so chamados oligotrophs. Bactrias desenvolveram meios de
achar e aderir a superfcies para aumentar as chances de encontrar nutrientes.

Que vantagens so oferecidas pela adeso s superfcies e desenvolvimento de biofilme?
1. Traos orgnicos se concentraro nas superfcies.
2. Alm disso, polmeros extracelulares concentraro nutrientes do volume de gua.
3. Colonizadores secundrios utilizam os produtos de descarte de seus vizinhos.
4. Juntando seus recursos bioqumicos, vrias espcies de bactrias, cada uma com diferentes
enzimas, podem quebrar o suprimento de alimento que nenhuma espcie simples pode
digerir sozinha.

Que meios as bactrias desenvolveram para encontrar e aderir s superfcies?

1. Motilidade e Chemotaxis
Bactrias motis podem nadar ao longo de um gradiente de concentrao qumica em direo
a uma maior concentrao de um nutriente. O movimento de organismos em resposta ao
gradiente qumico (nutriente) chamado chemotaxis. Pseudomonas aueruginosa uma das
bactrias motis que usa um flagellum para se mover em direo a maiores concentraes de
nutrientes na aprede da tubulao. No estudo da adeso de Pseudomonas s superfcies de
ao inoxidvel (Stanley 1983), pesquisadores colocaram clulas em um misturador para
remover a flagella. Eles descobriram que a velocidade de adeso da clula diminuiu ao
menos 90% quando as flagellas foram removidas.

2. Parede de clula hidrofbica
Muitos organismos ao se depararem com as condies de inanio encontradas em sistemas
de gua purificada, respondem alterando sua estrutura de parede celular para aumentar sua
afinidade superfcie. Alterando a composio da protena e lipdio da membrana externa, a
carga e a hidrofobicidade pode ser mudada. A parede da clula se torna hidrofbica. Tais
clulas hidrofbicas querem nada mais que encontrar seu caminho de sada da coluna de
gua. Uma vez na camada limtrofe (a zona morta na parede da tubulao onde a velocidade
de vazo cai para zero), elas so atradas pela superfcie da tubulao(Mayette 1992).


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3. Produo de polmero extracelular
Uma vez ba superfcie, as clulas de bactria se ancoram na superfcie com seus polmeros
aderentes. Corte simples (fluxo) no mais adequado para remover estas clulas (Veja
seo de velocidade de vazo, pgina 8).


Proteo dos desinfetantes

Uma vez os microorganismos agregados, eles devem ser capazes de resistir a processos de
desinfeco normais. Bactrias de biofilme demonstram uma resistncia a biocidas que pode ser
considerada chocante. (LeChevallier 1988).

Este pesquisador demonstrou que a bactria associada ao biofilme pode ser 150-3000 vezes mais
resistente ao cloro livre e 2-100 vezes mais resistente monocloramina do que bactrias de livre
flutuao.

Um trabalho de outro pesquisador (Anderson 1990, veja resumo abaixo) sugere que Pseudomonas
tem um inteligente modo de iludir seus atacantes: Ela secreta um lodo aderente que cresce no
interior da tubulao. Um germicida passado atravs do sistema de distribuio de gua mata
micrbios de livre flutuao, mas no pode tocar na bactria embutida no biofilme viscoso.

Quando a bactria est dentro de um filme, elas so muito resistentes aos biocidas. Na verdade,
elas sempre produzem mais exopolmeros aps o tratamento com biocidas para se protegerem
(Borenstein 1994).





















Como o biofilme fornece proteo contra os desinfetantes?

1. Escudo protetivo
Com o objetivo de destruir a clula responsvel pela formao do biofilme, o desinfetante
deve primeiro reagir com a rede de polissacardeos circundante. As clulas sozinhas no so
Resumo do Teste: Pseudomonas
Desinfeco e Redesenvolvimento em Tubulaes

Roger Anderson e seus colegas do Centro de Controle de
Doenas com base em Atlanta pegaram tubulaes de plstico e
preencheram-nas com gua contaminada com dois tipos de
Pseudomonas. Aps a incubao da bactria por oito semanas,
os cientistas retiraram a gua infestada e mergulharam as
tubulaes em reagentes eliminadores de germes, incluindo
cloro, por sete dias. Eles ento preencheram novamente as
tubulaes com gua esterilizada e periodicamente retiraram
amostras da gua limpa. A equipe relatou que ambos os tipos
sobreviveram nas tubulaes quimicamente tratadas e l
restabeleceram colnias.

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realmente mais resistentes, apenas esto circundadas com um escudo protetivo. O poder
oxidante do desinfetante usado antes dele poder alcanar a clula.

2. Limitaes de difuso
Quando clulas so agregadas a uma parede de tubulao, o fornecimento de desinfetante
limitado pela proporo de difuso do composto ao longo da camada limtrofe e atravs do
filme. Necessita-se uma concentrao maior alm de um perodo de contato mais longo para
o desinfetante atingir as clulas de bactrias em um biofilme se comparado aos organismos
de livre flutuao.





Novas descobertas

Pesquisa recente do Centro para Engenharia do Biofilme derrubou algumas suposies antigas
sobre bactrias e biofilmes.















Estrutura do biofilme

No passado, microbiologistas assumiram que biofilmes continham grumos desordenados de
bactrias localizadas em nenhuma estrutura ou modelo particular. Novas tcnicas para aumentar
biofilmes sem destruir a estrutura gelatinosa permitiram aos pesquisadores descobrir a complexa
estrutura de biofilmes como se visse uma cidade de um satlite. Esta estrutura descrita no artigo
recente Slime City (Cidade de Lodo Coghlan 1996):

Na maioria dos casos, a base do biofilme uma camada densa e opaca de lodo de 5 a 10
micrometros (197-394 micropolegadas) de espessura. uma mistura pegajosa de polissacardeos,
outras substncias polimricas e gua, todos produzidos pelas bactrias. Subindo muito 100 a 200
micrometros (3940-7840 micropolegadas) esto colnias de bactrias em formato de cogumelos ou
cones. Acima nvel de rua torna-se mais lodoso, desta vez de uma consistncia varivel e mais
mascarada com gua com uma rede de canais atravs do qual gua, lixo bacterial, nutrientes,
enzimas, metablitos, e oxignio viajam.


Centro para Engenharia do Biofilme
O Centro para Engenharia do Biofilme foi estabelecida na Universidade do Estado de
Montana, Bozeman, MT, em 1990 pelo programa dos Centros de Pesquisa de
Engenharia da Fundao de Cincia Nacional (National Science Foundation
Engineering Research Centers). Sua misso avanar o conhecimento bsico e
educao exigida para compreender, controlar e explorar os processos de biofilme.
Visite seu site em: www.erc.montana.edu

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NOTA: Em um sistema de gua potvel automatizado que se passa o fluxo regularmente, a
espessura do biofilme deve ser menos que 200 microns. Veja seo na espessura do biofilme e
velocidade de vazo, pgina 11.



Bioqumica das bactrias do biofilme

Pesquisadores do passado assumiram que bactrias de biofilme comportavam-se muito como
microrganismos de livre flutuao e solitrios. Agora, esto descobrindo que enquanto verdade
que a bactria de biofilme tem exatamente a mesma mscara gentica que suas primas de livre
flutuao, sua bioqumica muito diferente porque se ajustam usando um grupo diferente de genes.

Por exemplo, o Centro para Engenharia do Biofilme estudou como Pseudomonas aeruginosa forma
biofilmes. No instante que as bactrias se instalam no vidro, elas se ajustam em certos genes
envolvidos na sntese de alginate (uma forma pegajosa no usual de lodo), sendo novamente
liberadas uma vez que as bactrias so engolidas no alginate.

Pesquisadores agora estimam que 30 a 40 por cento das protenas presentes nas paredes das clulas
bacteriais diferem entre bactrias ssseis e plantnicas (chamadas moradores de cidade e livre-
flutuadores por Coghlan 1996). Algumas das metas para antibiticos so no estar mais l, assim
as bactrias se tornam difceis de matar. Este principalmente um problema com biofilmes dentro
de humanos e animais.


Sinais Qumicos
Pesquisadores esto estudando as composies qumicas (chamadas fatores sigma) o que sinaliza a
bactria para mudar sua bioqumica para a vida em um biofilme (Costerton 1995). Se eles podem
descobrir um fator sigma reverso que mudaria as bactrias do biofilme em livre flutuadores
plantnicos, pode ser possvel dissolver biofilmes enviando o equivalente de um sinal de
evacuao. (Coghlan 1996)
Fig. 6
Modelo conceitual da arquitetura de um biofilme de espcie
isolada baseado em observaes diretas usando um microscpio
confocal. Algumas microcolnias so estruturas cnicas simples,
enquanto outras tem o formato de cogumelos. gua corrente
(setas) fluem em canais entre as colnias carregando nutrientes e
resduo. (Costerton 1995)



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Implicaes para sanitizao
Testes de desinfetantes tradicionais foram feitos com culturas de laboratrio de livre flutuao de
espcie isolada. A constante CT para um desinfetante o produto da (concentrao) x (tempo)
exigido para matar uma bactria particular. Entretanto, valores CT no devem ser extrapolados para
bactrias em biofilmes.

O que isto significa para sistemas de gua potvel automatizados? Para uma coisa, explica como as
contagens de bactrias podem ser medidas mesmo quando a gua contm baixos nveis de cloro.
Tpicos nveis de cloro em gua drenada ficam entre 0.5-2.0 ppm. Esta quantidade de cloro
demonstrou matar bactrias de livre flutuao, mas pode no ser suficiente para matar bactrias de
biofilme. Nacos de biofilme descartados podem conter bactrias viveis que aparecem nas
contagens de placa. Este um problema particular com Pseudomonas que um grande produto de
lodo, e tambm mais resistente ao cloro. Uma instalao animal determinou atravs de seus
prprios testes que eles necessitavam aproximadamente 3 ppm de cloro em gua OR (Osmose
Reversa) para alcanar baixas contagens de Pseudomonas.




Fatores que afetam a agregao e
crescimento do biofilme

Material de superfcie

O material de superfcie tem pouco ou nenhum efeito no desenvolvimento do biofilme. Ao
inoxidvel to suscetvel quanto tubulao de plstico. De acordo com Mayette (1992), material
de tubulao em que os microorganismos no possam aderir ainda precisa ser descoberto. Estudos
mostraram que micrbios aderem ao ao inoxidvel, Teflon, PVC e PVDF (Kynar) com quase o
mesmo entusiasmo.

Um artigo fala sobre incorporao de um aditivo antimicrobial no plstico para retardar ou reduzir a
agregao de biofilme (Hamilton 1988). Entretanto, o reagente que usam no seguro para
fornecimento de gua potvel. Algumas resinas de troca inica so revestidas de prata para prevenir
o crescimento microbial. Porm, populaes bacteriais tolerantes prata podem se desenvolver
(Flemming & Geesey 1990, pg 67). No h exemplos prticos de revestimentos de superfcie
txicos para gua potvel.













Resumo do Teste:
Superfcies de Ao Inoxidvel vs. PVC

Pesquisadores na Sucia (Pedersen 1990) compararam o desenvolvimento de biofilme em
superfcies de ao inoxidvel e PVC expostas ao fluxo de gua potvel municipal. Aps 167
dias, eles mediram o nmero de microrganismos desenvolvidos nas superfcies. No havia
diferena na quantidade das clulas no ao inoxidvel eletropolido hidroflico e o PVC
hidrofbico. Entretanto, eles descobriram que um acabamento rugoso opaco de ao
inoxidvel teve 1.4 vezes mais microrganismos que o ao eletropolido. As duas razes
propostas para a diferena na rugosidade da superfcie foram
1. Superfcies rugosas tem mais rea de superfcie.
2. Superfcies rugosas fornecem mais proteo das foras de corte (fluxo).

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rea de superfcie

O fator que mais influencia o desenvolvimento do biofilme em sistemas de gua purificada a rea
de superfcie. Sistemas de gua industriais, ao contrrio da maioria dos ambientes naturais (lagos e
rios), oferecem uma quantidade tremenda de rea de superfcie para agregao. Membranas RO,
resinas DI, tanques de estocagem, filtros cartuchos, e sistemas de tubulao todos oferecem
superfcies adequadas para agregao e crescimento bacterial (Mittelman 1985).



Nivelamento da superfcie

Embora superfcies mais lisas retardam o surgimento de bactrias agregadas, o nivelamento no
afeta significativamente a quantidade total de biofilme que ir se agregar superfcie. De acordo
com Meltzer (1993), nunca foi encontrada uma superfcie que seja isenta de bioresduos. A
estrutura da superfcie aparece para influenciar a proporo de resduo, mas apenas inicialmente
durante as primeiras poucas horas de exposio. Em geral, superfcies lisas se sujam a uma
velocidade inicial menor do que superfcies rugosas, mas a formao de biofilme aps um perodo
de dias inevitvel. Esta concluso baseada em pesquisa da aderncia da Pseudomonas ao ao
inoxidvel (veja o resumo do teste abaixo).
























Um estudo da limpeza do ao inoxidvel usado para superfcies de contato com alimentos
(Milledge), concluiu que se o acabamento de superfcie tem um efeito sobre o poder de limpeza,
provavelmente pequeno em relao a outros fatores durante a limpeza (temperatura, concentrao
de detergente, etc.). At agora, nenhuma pesquisa conseguiu comparar a capacidade de sanitizar as
superfcies com diferentes acabamentos em sistemas de gua.
Resumo: Aderncia da Pseudomonas e Rugosidade de Superfcie
Pesquisadores na Blgica (Vanhaecke 1990) compararam a
proporo de agregao da Pseudomonas aeruginosa ao ao
inoxidvel 304 e 316-L como valores de rugosidade de grana 120,
grana 320, grana 400, e eletropolida. Eles encontraram:

1. O nmero mximo de bactrias aderidas por centmetro
quadrado era independente do tipo de ao inoxidvel ou da
rugosidade da superfcie.
2. Adeso mensurvel, mesmo nas superfcies eletropolidas,
ocorreu dentro de 30 segundos.
3. Esforo com paredes de clula hidrofbica agrega na mesma
velocidade independente da rugosidade de superfcie
testada. Esforo hidroflico agregou mais rpido para a
superfcie mais rugosa grana 120 e teve mnima adeso nas
superfcies eletropolidas. (Lembre-se, em gua pura as
bactrias alteraro sua parede celular e se tornaro
hidrofbicas).


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Pode haver algumas vantagens em superfcies lisas.

1. Tubulao lisa deve suportar menos biofilme porque tem menos rea total de superfcie
do que tubulao rugosa. Isto foi visto no teste realizado por Pedersen (veja resumo do
teste, pagina 10) mas no foi visto no teste realizado por Vanhaecke (veja resumo do teste
acima).
2. Superfcies lisas (especialmente eletropolidas) devem ter menos biocorroso. Uma das
causas da biocorroso a corrente que passa entre os picos e vales de uma superfcie
rugosa.



Velocidade de vazo

Alta vazo de gua pode alterar o crescimento do biofilme mas no prevenir a agregao das
bactrias nas superfcies da tubulao. Esta concluso defendida por Mittelman (Parte 1 1985),
Patterson (1991) e Meltzer (1994). Alta vazo no previne contra aglomerao de bactrias nem
remove biofilmes existentes pelas seguintes razes:

1. Baixa vazo na camada limtrofe
Apesar da velocidade de gua, ela flui mais lenta nas camadas adjacentes das superfcies da
tubulao. Mesmo quando a vazo de gua no centro da tubulao turbulenta, a
velocidade de vazo cai para zero na parede da tubulao. A distncia fora da parede da
tubulao no qual a razo de fluxo no turbulenta chamada de camada limtrofe ou
subcamada laminar. A espessura da subcamada laminar foi calculada por Pittner (1988)
para vrias velocidades de vazo e para 3 tamanhos de tubulao (veja a tabela a seguir)
Pittner calculou que as foras de cisalhamento dentro da subcamada laminar so muito
menores que aquelas exigidas para deslocar uma clula de bactria.

2. Forte adeso por exopolmeros
Nos sistemas de gua com vazo de alta velocidade contnua, a bactria que acumula no
biofilme tende a ser de variedade filamentosa (como Pseudomonas) especialmente
apropriado para aderncia por filamentos. A bactria se ancora superfcie com seus
aderentes exopolmeros.



Tabela 1: Espessura da Subcamada Laminar (microns)
(Pittner 1988)

Tamanho da tubulao Velocidade (ps/seg)
0.2 1.0 2.0 5.0 8.0 12.0
E.I. RDS
0.428 ID * * 125 55 37 26
1/2" Sch.80 * * 136 60 40 28
1" Sch.80 * 265 146 65 43 30
2" Sch.80 537 291 158 69 46 32
3 Sch.80 563 305 165 74 48 33
4 Sch.80 582 312 170 75 50 34
* O fluxo pode ser ou no turbulento nestas condies
Velocidade de vazo E.I. RDS atual aproximadamente 3-4 ps/seg.

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Embora a alta velocidade de vazo no previna a adeso de bactrias s superfcies da tubulao,
ela tem os seguintes efeitos na estrutura do biofilme.

1. Biofilme mais denso
De acordo com Mittelman (1985) a maiores velocidades de vazo, um biofilme mais denso
e mais tenaz formado. Como resultado, estas superfcies sempre aparecem livres de
incrustantes, j que no so viscosos ao toque.

2. Espessura de biofilme limitada
A espessura mxima do biofilme pode ser considerada a espessura da camada de vazo
laminar (veja Tabela 1). Em um sistema de fluxo constante, uma espessura de equilbrio
alcanada que depende da velocidade da gua e nutrientes. O crescimento do biofilme
alm da camada laminar resultar na liberao de clulas plantonicas pioneiras que, em
condies favorveis, estabelecer o biofilme em uma outra seo da tubulao.
(Patterson 1991). Em sistemas que possuem fluxo de gua flutuante, tais como sistemas de
gua automatizados com fluxo peridico, as bactrias se desprendero durante o fluxo. Isto
resulta em chuveiro de partculas aleatrias de bactrias que podem explicar dia a dia
flutuaes vistas em resultados de contagem total de bactrias.



Nutrientes limitados

Tabela 2: Nutrientes para crescimento bacterial encontrado em sistemas de gua pura
(Mittleman 1985)

Nutriente Origens
Carbono Orgnico cidos hmico e fulvico (origem gua)
Plastificantes e solventes de tubulao
Plsticos reforados de fibra de vidro (FRPs)
Lubrificantes de bitola e bomba
Subprodutos microbiais
Pessoal
P do ar
Nitrognio cidos hmico e flvico (origem gua)
Nitratos e nitritos (origem gua)
Subprodutos microbiais
P do ar
Fsforo Fosfatos (origem gua)
Subprodutos microbiais
P do ar
Enxofre Sulfatos (origem gua)
cido sulfrico (pr-tratamento de RO)
Surfactantes de membrana
P do ar
Traos de metais e sais Origem gua
Tubulao do processo
plsticos reforados (FRPs)
Componentes de sistema de ao inoxidvel
Reagentes do pr-tratamento de RO
Pessoal
P do ar


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Como outras criaturas vivas, as bactrias necessitam de certos nutrientes para crescerem e se
reproduzirem. Limitando estes nutrientes pode se limitar o crescimento da bactria, porm os
nveis de nutrientes em sistemas de alta pureza so inequivocamente suficientes para permitir a
reproduo e crescimento microbial para uma extenso problemtica (Husted 1994). A Tabela 2
lista algumas fontes de nutrientes em sistemas de gua purificada.


Nutrio do substrato

A bactria pode obter alguns de seus nutrientes da tubulao e juntas em um sistema de gua? Sim,
de acordo com Flemming & Geesey (p. 67, 1990). A maioria dos plsticos no so biodegradveis,
mas cementadores e plastificantes de tubulao que derivam de resinas epxi, tubulao de PVC e
tubulao de poliamida podem ser fontes de carbono orgnico para bactrias. Membranas de RO a
base de celulose tambm pode ser uma fonte de nutriente. Esta a razo porque devemos clorar o
alimentador de gua de RO. Alm disso, bactrias podem obter nutrientes de traos de metais do
ao inoxidvel e outros componentes de metal.



gua purificada

Sob perfeitas condies de crescimento, uma clula bacterial se divide em duas clulas irms a cada
20 minutos (Harfst 1992). Isto significa que uma clula simples e seus descendentes crescero
exponencialmente para mais de 2 milhes de clulas em oito horas ou para 4.000.000 de libras de
bactrias em 24 horas! claro que esta proporo de crescimento nunca realmente realizada
(especialmente em gua potvel limpa) porque so limitadas pelo espao e nutrientes disponveis.

As bactrias podem morrer de fome ou ao menos ser inibidas em seu crescimento privando elas
de nutrientes orgnicos e oxignio? Infelizmente, mesmo mnimas quantidades de material orgnico
sustentam muitas bactrias. Isto explicado no seguinte exemplo por Pittner (1988):

Se apenas uma parte por bilho de material orgnico em uma amostra de 1 mililitro de gua for
convertida a corpos bacteriais (assumindo que a bactria 20% de material orgnico e a
gravidade especfica da bactria sendo a da gua), aproximadamente 9.500 bactrias, a cada 1.0
micron de dimetro, estaria presente em 1 mililitro de amostra. ou 9.500 bactrias/ml em 1 ppb de
material orgnico.

Tecnologia disponvel atual no pode reduzir os nveis de nutrientes completamente, por isso o
controle total de bactrias no alcanvel simplesmente pelo controle de nutrientes. Da mesma
forma, quantidades muito pequenas de oxignio sustentaro adequadamente luxuoso crescimento
bacterial mesmo que a bactria no se reverta a respirao anaerbica,que a maioria das
bactrias so capazes de fazer. Por estas razes, uma farta populao bacterial pode existir mesmo
em sistemas de gua de alta pureza.. (Pittner 1988).

Ambientes limitadores de nutrientes podem realmente promover o agregamento de bactrias s
superfcies porque onde os traos orgnicos se acumulam e polmeros extracelulares no biofilme
capturam traos de nutrientes.

Embora no podemos matar completamente a bactria de fome, gua de osmose reversa pobre em
nutrientes sustenta menos biofilme que suprimentos de gua tamponada regulares.

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Propores de Biofilme e Sistemas de gua

At aqui, este artigo descreveu como uma camada de biofilme se desenvolve no interior de
tubulaes de gua e como esta camada alcana um certo equilbrio na espessura dependendo da
velocidade de vazo e nveis de nutrientes. E discutiu como o nivelamento da superfcie no fator
significativo na agregao do biofilme. Agora, voc pode estar querendo saber...

1. Como o tamanho da clula de bactrias se compara com a profundidade de ranhuras e
impactos na superfcie de tpicas tubulaes de ao inoxidvel? H uma ou um milho de
clulas nestas ranhuras?
2. Se a espessura do biofilme limitada a 100 ou 50 microns pela vazo, quantas clulas de
bactrias espessas se tem? espessa o suficiente para esperar uma zona de bactrias
anaerbicas na parede da tubulao ou dentro das ranhuras da superfcie da tubulao?
3. Qual a espessura do biofilme comparado ao dimetro interno de da tubulao de ao
inoxidvel? Ele pode ser visto?

Esta seo mostrar graficamente como o tamanho e a proporo de uma clula de bactrias
individual se compara rugosidade de superfcie, espessura de biofilme, e dimetro de tubulao.


Converso de Unidades de Medio
1 polegada = 1.000.000 ou 1 x 10
6
micro-polegadas ( pol. ou )
1 metro = 1.000.000 ou 1 x 10
6
micrometros (m)
1 metro = 39,37 polegadas
1 micrometro (m) = 1 micron = 39,37 micro-polegadas ( pol.)



Acabamento de superfcie e tamanho de clula

Por muitos anos, o acabamento fornecido nas superfcies de ao inoxidvel foi um padro laticnio
definido pelo Nmero ou Grana tais como #4 ou grana 150. O Acabamento de Grana usado com
polimento mecnico e se refere ao nmero de linhas de grade por polegada de abrasivo. Quanto
maior o nmero mais lisa a superfcie. Embora as indstrias de laticnios e farmacutica ainda
usam cdigos de grana para acabamentos, elas esto sendo levadas a um sistema onde a rugosidade
da superfcie pode ser medida mais precisamente.

A rugosidade de superfcie pode ser medida por um perfilmetro, um dispositivo de estilo usado
para traar ao longo do perfil de superfcie. Os resultados so expressos tanto como RA, que o
desvio mdio aritmtico da linha de centro da superfcie, ou como RMS, que a raiz quadrada dos
desvios da linha de centro. Valores de RA ou RMS so dados tanto em microns (o mesmo que
micrometros ou ) ou micro-polegadas (). Nos desenhos das Indstrias Edstrom, a rugosidade da
superfcie especificada como RMS em micro-polegadas. RMS ser aproximadamente 11 por
cento mais alta que o nmero de RA para uma dada superfcie. [RA x 1.11 = RMS].



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Acabamento de Tubulao de gua Farmacutica em Ao Inoxidvel
De acordo com Meltzer (1993), no h uma norma universalmente aceita para acabamento de
superfcie de ao inoxidvel. Tubos dos EUA tem geralmente acabamento interno de grana 150 a
180. Das quatro grandes fabricantes farmacuticas em Chicago, duas confiam em acabamentos
grana 150, uma em um acabamento grana 180, e uma em uma em um acabamento grana 180
seguido de eletropolimento. gua para Injeo (Water-For-Injection) tem geralmente fluxo em
acabamento de tubulao grana 240 a grana 320


Nivelamento de Tubulao de Plstico
De acordo com Gillis (1996), tubulaes de PVDF e polipropileno extrudados so to lisos quanto
ao inoxidvel eletropolido. No h irregularidades de significativas propores na faixa de
tamanho de uma clula bacterial.


Acabamento de Conexes e Vlvulas das Indstrias Edstrom
Para conexes e vlvulas de bebidas usinadas, o acabamento padro especificado no bloco de ttulo
de nossos desenhos 64 micropolegadas RMS. Quando um acabamento mais liso necessrio, para
superfcies de vedao o-ring por exemplo, um acabamento mais liso de 32 ou 16 micropolegadas
pode ser especificado. Se as peas usinadas forem eletropolidas, a rugosidade deve ser reduzida em
30-40%.


Acabamento em Tubos RDS em Ao Inoxidvel E.I.
O tubo de ao inoxidvel usado nas tubulaes de sala e manifolds da Edstrom tem uma costura
soldada, mas no tem um nivelamento de superfcie interior definido. um acabamento laminado
que aparece liso mas pode ter fendas formadas por metal achatado durante a laminao. Assume
que no mais liso que um acabamento grana 180.



Tabela 3. Comparaes de Medidas de Superfcie (Meltzer 1993)
RMS
(micropolegada)
RMS
(m)
RA
(micropolegada)
RA
(m)
Tamanho
da grana
80
58
47
34
17
14
2.03
1.47
1.2
0.6
0.43
71
52
42
30
15
12
1.90
1.32
1.06
0.76
0.38
0.30
80
120
150
180
240
320
Estes valores so os dados mdios de vrios testes. Por causa das muitas variveis que derivam
estes dados, desvios de 5% sero considerados dentro dos parmetros de boas medidas. Tirado
do Boletim de Finalizadores e Soldas de Materiais por DCI, Inc. (Meltzer 1993)



Altura do perfil
Na maioria das superfcies a altura total do perfil da rugosidade da superfcie, ou altura do pico-
para-vale ser aproximadamente quatro vezes o valor de RA. Sabendo a rugosidade medida, um
perfil aproximado da superfcie pode ser desenhado (veja Figura 7).



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Tamanho Tpico de Clulas de Bactrias de Biofilme
Uma bactria de biofilme comum a Pseudomonas aeruginosa. Clulas de Pseudomonas tem
formato de basto e aproximadamente 0.3-0.8 microns de largura por 1.0-1.2 microns de
comprimento. Isto equivale a 12-31 micropolegadas de largura x 40-47 micropolegadas de
comprimento.


Comparando Perfil de Superfcie ao Tamanho de Clulas de Bactria
O perfil de rugosidade de vrios acabamentos de ao inoxidvel usados em sistemas de gua
mostrado esquematicamente na Figura 7. Note que um acabamento de 34 RMS ou grana 180 (que
considerada sanitria para usos laticnios, alimentcios, e farmacuticos) tem riscos grandes
suficientes para armazenar bactrias. Um acabamento de 14 RMS (grana 320), que tpica de
aplicaes de gua para Injeo (WFI Water-for-Injection), tem riscos com profundidade de
aproximadamente apenas uma clula de bactrias. Uma superfcie grana 320 seguida de
eletropolimento tem apenas mnimas variaes de superfcie relativas ao tamanho da clula.


































Figura 7
Perfil de rugosidade de variados acabamentos em ao inoxidvel.


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As figuras 8 e 9 mostram fotografias reais de clulas Pseudomonas em uma superfcie em ao
inoxidvel grana 180. Os tamanhos relativos de clulas de bactrias e riscos de superfcie mostradas
nestas fotos so semelhantes ao perfil grana 180 da Figura 7.







































Espessura do biofilme e velocidade de vazo

Os biofilmes podem consistir de uma monocamada de clulas ou podem ser to espessos quanto
300-400 mm, como em esteiras algceas. (Characklis 1990)
O fluxo ir limitar a espessura do biofilme em sistemas de gua automatizados. Como discutido
anteriormente (pginas 11-13), foras de corte causadas por fluxo desprender biofilme que se
estende no fluxo turbulento no centro de uma tubulao. Por isso, a espessura mxima do biofilme
ser aproximadamente a mesma da camada laminar para uma particular velocidade de vazo.


Fig. 8
Micrografia de varredura eletrnica com ampliao de
400x de uma superfcie de ao inoxidvel 316L polida
mecanicamente na grana 180 aps incubao de 180
minutos com Pseudomonas aeruginosa. Note que as
clulas tendem a congregar marcas longas de
polimento. (Gillis 1996).

Fig. 9
Mesma superfcie grana 180 como na Figura 8, mas
com ampliao de 500x. Note que os riscos so
grandes o suficiente para armazenar bactrias.


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A Tabela 1 (pgina 8) mostra a espessura aproximada da camada laminar em microns para
tubulao RDS 1/2" em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom para variadas velocidades de vazo.
Nos sistemas de gua automatizados atuais, a tubulao RDS tem fluxo de aproximadamente 1.5-
1.75 gpm. Esta uma velocidade mdia de vazo de 3-4 ps/seg. A 3-4 ps/seg., a espessura deve
ser limitada a aproximadamente 70-90 microns.

A Figura 10 mostra a mxima espessura de biofilme para variadas velocidades de vazo na
tubulao RDS em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom. Lembre-se que a espessura do biofilme
tambm limitada pelos nutrientes disponveis, assim a espessura de equilbrio pode ser menor que
aquela limitada apenas pela velocidade de vazo.

Compare a espessura do biofilme com uma clula individual de Pseudomonas e note que o biofilme
pode ter muitas camadas de bactrias. Tambm, note que irregularidades no acabamento de
superfcie so pequenas comparadas a espessura mxima de biofilme possvel. Isto explica o que
pesquisadores descobriram (Vanhaecke 1990): o nmero mximo de bactrias aderentes
superfcie independente da rugosidade da superfcie.



Condies de Superfcie Anaerbica
Bactrias aerbicas perto da superfcie externa de um biofilme consomem oxignio. Se o biofilme
espesso o suficiente, o oxignio se esgotar na superfcie da tubulao criando um ambiente
anaerbico. Condies de superfcie anaerbicas so indesejveis porque pode haver mais
problemas de corroso (veja pgina 13).

O biofilme em sistemas de gua automatizados pode ser espesso o suficiente para ter zonas
anaerbicas? Uma fonte (abaixo) indica que o oxignio pode ser esgotado dentro de 30-40 microns
da interface gua/biofilme. A profundidade do gradiente de oxignio no biofilme variar
dependendo do oxignio contido no volume da gua, temperatura da gua, e vazo de gua, mas
isso fornece uma idia grosseira de quo longe o oxignio pode se difundir.

Biofilmes Aerbicos de P. aeruginosa cresceram 30-40 m em profundidade como monoculturas,
mas aumentaram em profundidade para 130 m quando a cultura foi compensada com bactrias
anaerbicas. Esta evidncia indireta sugere que o esgotamento de oxignio no de nutrientes
limitou o desenvolvimento vertical do biofilme de P. aeruginosa. (Costerton 1995).

Se a espessura de biofilme em um sistema de gua automatizado apenas limitada por fluxo, ela
pode ter espessura de 50-125 microns e ter algumas zonas anaerbicas. claro, fendas como juntas
de tubulao o-ring e conexes roscadas podem ter biofilmes muito mais profundos e so os
favorveis a ter zonas anaerbicas.












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Fig. 10

















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Espessura do Biofilme Comparada ao Dimetro da Tubulao
A ltima comparao proporcional olhar a espessura mxima de biofilme na parede da tubulao
RDS e comparar ao dimetro interno global da tubulao. Esta comparao mostrada na Figura 11
que mostra o dimetro interno do tubo OD 1/2" em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom (dimetro
interno = 0.428) e a seo transversal de uma junta o-ring. A espessura do biofilme pequena
comparada ao dimetro global da tubulao e comparada profundidade do biofilme que pode se
desenvolver em uma fenda de junta o-ring.






Corroso Influenciada Microbiologicamente

A presena fsica de clulas microbiais em uma superfcie metlica, tanto quanto suas atividades
metablicas, podem causar Corroso Influenciada Microbiologicamente (MIC Microbiologically
Influenced Corrosion) ou biocorroso. As formas de corroso causadas por bactrias no so
nicas. A biocorroso resulta em pits, corroso por pontos, desligamento seletivo, fratura por fadiga
de corroso, e corroso sob depsitos. Os seguintes mecanismos so algumas causas da biocorroso.



Esgotamento de oxignio ou clulas de aerao diferenciadas
Colonizao no uniforme (irregularidade) por bactrias resulta em clulas de aerao
diferenciadas. Este esquema mostra a iniciao do pit devido ao esgotamento de oxignio sob um
biofilme (Borenstein 1994).


Filme protetivo de ao inoxidvel
O esgotamento de oxignio na superfcie do ao inoxidvel pode destruir o filme passivo protetivo.
Lembre-se que o ao inoxidvel confia no filme de xido estvel para oferecer resistncia
corroso. A corroso ocorre quando o filme de xido danificado ou o oxignio preso na
superfcie do metal por microorganismos em um biofilme.


Bactria de reduo de sulfato
O esgotamento de oxignio na superfcie tambm oferece uma condio favorvel ao crescimento
de organismos anaerbicos como bactria de reduo de sulfato (SRB Sulfate-Reducing Bacteria).
Este grupo de bactria uma das mais freqentes causas de biocorroso. Elas reduzem o sulfato
para sulfeto de hidrognio que reage com metais para produzir sulfetos de metal como produtos de
corroso. Bactria aerbica perto da superfcie externa do biofilme consome oxignio e cria um
habitat favorvel para a bactria de reduo de sulfato na superfcie do metal. SRBs podem se
desenvolver em gua parada nas reas estagnadas, como pernas mortas de tubulao. Sintomas de
corroso influenciada por SRB so o cheiro de sulfeto de hidrognio (ovo podre), escurecimento de
guas, e depsitos pretos. O depsito preto principalmente sulfeto de ferro. (Borenstein 1994 e
Geesey 1994)


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Uma forma de limitar a atividade da SRB reduzir a concentrao de seus nutrientes essenciais:
fsforo, nitrognio, e sulfato. Alm disso, guas purificadas (RO ou DI) teriam menos problemas
com SRBs. Tambm, qualquer prtica que minimize a espessura do biofilme (fluxo, sanitizao,
eliminao de fendas de extremidade morta) minimizar as reas anaerbicas no biofilme que as
SRBs necessitam. (Geesey 1994).



Subprodutos de metabolismo bacterial

Um outro mecanismo de corroso baseado em subprodutos de metabolismo bacterial.



















Colnias no uniformes (irregularidades) de biofilme resultam na formao de clulas de aerao
onde reas sob colnias que respiram so esgotadas de oxignio relativo a reas no colonizadas
circundantes. Tendo diferentes concentraes de oxignio em dois locais em um metal obtm-se
uma diferena no potencial eltrico e conseqentemente a corroso ocorre. Sob condies
aerbicas, as reas sob colnias que respiram se tornam andicas e as reas circundantes se
tornam catdicas.


Bactria produtora de cido
As bactrias pem produzir metabolismos, tais como cidos orgnicos e inorgnicos. Por exemplo,
Thiobacillus thiooxidans produz cido sulfrico e Clostridium aceticum produz cido actico.
cidos produzidos por bactrias aceleram a corroso dissolvendo xidos (filme passivo) da
superfcie do metal e acelerando a velocidade de reao catdica (Borestein 1994).


Bactria produtora de hidrognio
Muitos microorganismos produzem gs hidrognio como um produto da fermentao do
carboidrato. O gs hidrognio pode se difundir nos metais e causar fragilizao por hidrognio.




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Bactria de Ferro
Bactria oxidante de ferro, como Gallionella, Sphaerotilus, Leptothrix, e Crenothrix, so bactrias
aerbicas e filamentosas que oxidam o ferro da forma ferrosa solvel (Fe2+) para uma forma frrica
insolvel (Fe3+). O ferro ferroso dissolvido pode ser proveniente tanto da alimentao de gua
como da superfcie do metal. Este ferro frrico que estas bactrias produzem pode atrair ons cloreto
e produzir depsitos de cloreto frrico que pode atacar ao inoxidvel austentico, os depsitos so
geralmente marrons ou marrons avermelhados.





Mtodos de Sanitizao para Biofilmes

Biofilme pode ser removido e/ou destrudo por tratamentos qumicos e fsicos. Biocidas qumicos
podem ser divididos em dois maiores grupos: oxidantes e no oxidantes. Tratamentos fsicos
incluem esfregamento mecnico e gua quente. Um artigo por Mittelman (1986) tem o mais
compreensiva informao no tratamento de bioincrustao nos sistemas de gua purificada.



Biocidas oxidantes

Mittelman diz que a efetividade dos biocidas oxidantes em sistemas de gua purificada baseada
numa dosagem igual a miligramas por litro decresce na seguinte ordem: oznio > dixido de cloro >
cloro > iodo > perxido de hidrognio



Cloro
De acordo com Mittelman (1986), Cloro provavelmente o mais efetivo e menos caro de todos os
biocidas oxidantes e no oxidantes. A atividade do cloro contra biofilmes agregados
particularmente alta; no apenas mata bactrias plantnicas e biofilme, mas o cloro tambm reage e
destri rede de polissacardeos e suas agregaes superfcie. Destruindo os polmeros
extracelulares, o cloro quebra a integridade fsica do biofilme.

Characklis (1990) recomenda a melhora de um programa de tratamento com cloro tomando as
seguintes medidas:



1. Aumento da Concentrao de Cloro na Interface gua-Biofilme
Quando o cloro se difunde no biofilme, ele usado nas reaes com clulas de bactria e materiais
extracelulares. baixos nveis de cloro, as bactrias do biofilme podem produzir material
extracelular mais rpido que a velocidade do cloro difundir atravs dele assim elas ficam protegidas
no lodo. Aumentando a concentrao, o cloro difundir mais profundamente no biofilme. Ao
realizar a desinfeco de biofilmes, alta concentrao de cloro com curta durao mais efetiva que
baixa concentrao por maiores duraes.



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2. Aumento da Fadiga por Corte de Fluido na Interface gua-Biofilme
Simultnea sanitizao por cloro e circulao resulta em uma maior tomada de cloro pelo biofilme e
em maior desagregao de biofilme devido a:
Maior transferncia de massa de cloro da gua principal para o biofilme.
Ruptura do biofilme durante a clorao expe novas superfcies de biofilme ao ataque de
cloro.
Espessura menor de subcamada viscosa ou laminar.



3. Uso do Controle de pH
O alto pH favorece a desagregao de on hipoclorito promovido de biofilmes maduros, e baixo pH
melhora a desinfeco por cido hipocloroso de filmes finos. Characklis props um procedimento
interessante que seria alterar entre clorao contnua pH 6.5 e clorao de choque pH 8. Ele no
indicou que isto tenha sido testado.



Dixido de cloro
Dixido de cloro tem atividades biocidas similares quelas do cloro. Por ser instvel, ele deve ser
misturado e preparado no local. Como o cloro, o dixido de cloro corrosivo aos metais e deve ser
manuseado com cuidado.



Oznio
Como um oxidante, oznio aproximadamente duas vezes mais poderoso que o cloro nas mesmas
concentraes. Como dixido de cloro, oznio deve ser gerado no local por causa de sua alta
reatividade e relativa instabilidade. Os sistemas devem ser projetados com materiais apropriados
resistentes ao oznio.

Oznio geralmente dosado em uma base contnua a 1-2 mg/l. O sucesso no emprego de dosagens
mais altas em uma base descontnua tem sido limitado, possivelmente por causa da limitada
solubilidade do oznio em gua purificada, difcil produzir altas concentraes de oznio na
soluo. (Mittelman 1986). Embora o cloro no seja to poderoso como oznio quando voc
compara 1-2 mg/l de cada, o cloro pode ser usado em concentraes sanitizantes mais altas com
igual fora desinfetante.



Perxido de hidrognio
Perxido de hidrognio freqentemente usado como um biocida em sistemas de gua purificada
com grau microeletrnico porque no produz subprodutos; ele rapidamente se degrada em gua e
oxignio. Uma soluo a 10% em volume em gua purificada parece efetiva para matar bactrias
plantnicas, mas so necessrios mais estudos na efetividade contra biofilmes agregados.
(Mittelman 1986).



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Biocidas no oxidantes

Compostos Quaternrios de Amnio
Em adio a sua atividade biocida, quats so surfactantes/detergentes efetivos, que podem ser um
fator importante em seu uso para desativao de biofilme remoo das superfcies. A capacidade de
enxge pode ser um problema j que a remoo de um sistema de gua purificada sempre exige
enxge exaustivo.



Formaldedo
Formaldedo tem sido aplicado em sistemas de grau farmacutico. Ele relativamente no corrosivo
ao ao inoxidvel. Sua efetividade contra o biofilme questionvel e um carcinognico txico.



Agentes Aninicos e Noninicos de Ativao da Superfcie
Estes compostos surfactantes ou detergentes tem atividade biocida limitada contras as bactrias em
sistemas de gua purificada. Aplicaes podem ser encontradas para estes detergentes em conjunto
com outros biocidas para melhorar a remoo de biofilme e outro particulado.



Tratamentos Fsicos

Aquecimento
Sistemas Farmacuticos de gua para Injeo (WFI Water For Injection) usam loops de
recirculao de gua quente (maior que 80C) para matar bactrias. De acordo com Mittleman
(1986), quando estes sistemas so usados continuamente, bactrias plantnicas so mortas e o
desenvolvimento de biofilme reduzido. Biofilmes so ainda encontrados em gua quente (80C).
Sanitizao com gua quente peridica pode tambm ser usada para destruir bactrias no biofilme,
mas de acordo com Collentro (1995) isto requere uma temperatura de 95C por um perodo em
excesso de 100 minutos. Isto no seria prtico em um sistema de gua potvel animal!



Remoo mecnica
De Mittelman: Biofilmes pesados no podem ser removidos das paredes do tanque de estocagem
pelo uso apenas de reagentes; raspagem ou esfregamento mecnico, spray de alta presso, ou uma
combinao tambm exigida. A remoo mecnica do biofilme dos sistemas de distribuio no
vivel. Para manuteno de sistemas OR (Osmose Reversa), ns no esfregamos rotineiramente
tanques de estocagem, mas geralmente h um baixo nvel de cloro contnuo na gua estocada, assim
biofilmes pesados no se desenvolvem.







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Resistncia ao biocida

Diferente dos antibiticos usados para combater bactrias associadas s doenas humana, animal e
vegetal, as bactrias no desenvolvem o mesmo tipo de resistncia aos biocidas industriais. A
diferena entre antibiticos e biocidas industriais que enquanto um antibitico pode ter um
pequeno nmero de locais de alvo provvel ou clula bacterial, todos os biocidas oxidantes tem uma
grande quantidade de locais de alvo em potencial. Cloro, por exemplo, capaz de ter mais que uma
centena de locais de alvo provvel ou microorganismos. virtualmente impossvel os
microorganismos desenvolverem uma resistncia geral a tais compostos (Mittelman 1986).
Entretanto, bactrias em um biofilme podem resistir aos biocidas porque so protegidos no lodo.



Recuperao de biofilme (Redesenvolvimento)

As bactrias associadas aos biofilmes so muito mais difceis de matar e remover das superfcies do
que organismos plantnicos. De acordo com Characklis (1990), vrios investigadores e operadores
de fbrica observaram uma rpida retomada de resduo biolgico imediatamente aps o tratamento
com cloro. A remoo incompleta do biofilme permitir o rpido retorno ao seu estado de
equilbrio, causando ressalto na contagem de placa total aps a sanitizao.























A figura 13 (Mittelman 1986), mostra um tpico redesenvolvimento aps a sanitizao.
Inicialmente, a contagem de bactrias no volume de gua cai para zero aps a sanitizao, mas foi
seguida por um aumento gradual em nmeros at nveis ou abaixo dos nveis de pr-tratamento.
Neste exemplo, o redesenvolvimento comeou aps 2 dias e voltou aos nveis de equilbrio aps 20
dias. Este um resultado semelhante aos resultados vistos no teste de sanitizao em laboratrio
nas Indstrias Edstrom.

A figura 13 (Mittelman 1986), mostra um tpico redesenvolvimento
aps a sanitizao. Inicialmente, a contagem de bactrias no volume
de gua cai para zero aps a sanitizao, mas foi seguida por um
aumento gradual em nmeros at nveis ou abaixo dos nveis de pr-
tratamento. Neste exemplo, o redesenvolvimento comeou aps 2 dias
e voltou aos nveis de equilbrio aps 20 dias. Este um resultado
semelhante aos resultados vistos no teste de sanitizao em
laboratrio nas Indstrias Edstrom.


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De acordo com Characklis (1990), a recuperao de biofilme pode ser devido a um ou a todos os
seguintes fatores:
1. O biofilme remanescente contm suficientes organismos viveis que no tem fase de
retardamento no redesenvolvimento. Alm disso, a recuperao de biofilme aps clorao
por choque mais rpida que o acmulo inicial em uma tubulao limpa.
2. O biofilme residual na superfcie torna-a mais rugosa que a tubulao limpa. A rugosidade
do depsito pode oferecer uma superfcie mais aderente a qual adsorve mais clulas
microbiais e outros compostos da gua.
3. O cloro preferencialmente remove polmeros extracelulares e no clulas de biofilme, alm
disso deixa as clulas de biofilme mais expostas aos nutrientes quando cessa a clorao.
4. Organismos sobreviventes rapidamente criam mais lodo (polmeros extracelulares) como
uma resposta protetiva irritao por cloro.
5. H seleo para organismos menos suscetveis aos reagentes de sanitizao. Estes so
geralmente os organismos que produzem excessivas quantidades de lodo como
Pseudomonas.


Estudo de Caso: Seleo de Sanitizao para Pseudomonas
Quando vrios ratos em estudos a longo prazo morreram em 1996, esta instalao de laboratrio
animal suspeitou que a causa foi Pseudomonas aeruginosa que foi encontrada em tubulaes rack
manifold. Eles nunca tinham identificado Pseudomonas at aps eles sanitizarem com cloro seu
sistema de recirculao de gua automatizado (AWS) pela primeira vez desde que o sistema foi
instalado em 1982.


Descrio do Sistema: OR com nenhum pr-tratamento seguido por um filtro de carbono e tanques
de deionizao antes de encher 3 tanques de estocagem. Filtros DI e de Carbono mais
provavelmente adicionam um monte de bactrias para gua OR. Nenhum cloro permitido na gua
potvel animal devido aos estudos nutricionais conduzidos. Um tanque no recirculante e mantm
por mais de 2 semanas o suprimento de gua para fluxo rack manifold no clorado. Os outros 2
tanques esto nos loops de recirculao alimentando o AWS. No h fluxo RDS e baixa virada de
gua de tanque.


Teste de Bactrias: A instalao faz testes regulares de gua potvel para bactrias. Eles
regularmente obtm contagens totais de 10.000-50.000 cfu/ml dos tanques de estocagem OR e
nunca tiveram qualquer problema de sade animal. Quando as contagens excederam 100.000
cfu/ml, eles decidiram fazer a primeira sanitizao do sistema.


Sanitizao: 20 ppm de cloro por 4 horas de imerso com todos os racks animais removidos. As
contagens de bactrias foram muito baixas por duas semanas, mas depois aumentaram (tpico
redesenvolvimento seguinte a sanitizao).


Especulao: A sanitizao por cloro seletivamente promoveu mais organismos resistentes ao cloro
como Pseudomonas. Ele provavelmente esteve presente todo o tempo, embutido no biofilme
agregado s paredes do tanque e tubulao. Uma sanitizao de uma vez com uma baixa
concentrao como 20 ppm no matar 100% de Pseudomonas.

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Deteco e Enumerao de Bactrias

O monitoramento de rotina de nveis bacteriais uma parte essencial do monitoramento da
qualidade de gua potvel animal de laboratrio. O modo clssico para enumerar bactrias em gua
fazer uma contagem de placa que espalhar um volume conhecido de amostra na superfcie de
um meio de laboratrio e contar o nmero de colnias visveis que se desenvolvem aps um perodo
de tempo. Entretanto, deve ser reconhecido que a contagem de placa pode subestimar o nmero
total de bactrias presentes em um sistema de gua.



A maioria das bactrias esto em biofilmes

Amostras de gua apenas coletam bactrias plantnicas ou de livre flutuao. Bactrias de livre
flutuao em gua potvel animal so tambm descartadas do biofilme ou passam atravs da
entrada da alimentao de gua. Se um teste de contagem de placa baixo, no se deve assumir que
as bactrias no esto presentes no sistema de gua. Mais que 99% das bactrias nos sistemas de
gua esto em biofilmes agregados s superfcies de tubulao. Se a integridade de um biofilme
maduro no tiver sido rompido por recente fluxo ou sanitizao, ele pode no descartar muitas
clulas na gua potvel, porm ainda est l. Como Smith (1987) coloca, Quando voc pega uma
amostra de gua voc est apenas fazendo amostragem dos ocasionais e no o principal
rebanho de bactrias no sistema.



Contagem de placa no detecta todas as bactrias viveis
Contagens de placa so baseadas na capacidade das bactrias em uma amostra de se desenvolverem
em um meio nutriente definido. Quando as bactrias crescem em um meio nutriente, elas formam
colnias distintas. Teoricamente, uma colnia derivada de uma simples clula de bactria. Alguma
subestimao de bactrias causada por grumos de bactrias que forma apenas uma colnia.

Uma outra razo das contagens viveis serem muito baixas em gua purificada pobre em nutrientes
que as bactrias esto em um estado de inanio e no podem se desenvolver em meio rico em
nutriente. Meio rico em laboratrio so txicos para bactrias adaptadas a viver em sistemas de
gua de alta pureza. Para conseguir recuperaes bacteriais mais altas de guas purificadas, meio
especial (R2A Agar), temperaturas de incubao menores, e tempos de incubao maiores so s
vezes utilizados.



Compreendendo mostradores de partculas
Algumas vezes os resultados do teste de contagem de placa bacterial parecem muito errados.
Amostras tomadas de um ponto no sistema podem variar de menos que 10 cfu/ml para TNTC (too-
numerous-to-count muito numerosos para contar). Ou talvez as contagens so geralmente baixas,
mas ocasionalmente uma contagem alta aprece. Algumas destas variaes podem ser explicadas
compreendendo que biofilmes periodicamente proliferam causando contagens bacteriais
altssimas. De acordo com Patterson (1991), Falha repentina da integridade do biofilme em locais
especficos resultaro em bactrias e chuveiro de partculas que ocorrem randomicamente de
tempos em tempos.


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Concluses

A situao, ento, que nem o nivelamento da superfcie, materiais de construo, nem longos
atrasos nas velocidades de vazo evitam a formao de biofilme. (Meltzer 1994)

As bactrias constituem uma muito bem sucedida forma de vida. Em sua evoluo, elas
desenvolveram estratgias bem sucedidas para sobrevivncia que inclui agregao s superfcies e
desenvolvimento de biofilmes protetivos onde elas se comportam muito diferentes das bactrias de
livre flutuao. Suas estratgias bem sucedidas torna difcil o controle do desenvolvimento de
biofilme em sistemas de gua automatizados.


























Ento qual a soluo?

Purificar mesmo assim!
De alguma forma ir limitar os nutrientes, especialmente nutrientes para micrbios como bactrias
redutoras de sulfato que causam problemas de corroso. gua RO pobre em nutrientes suportam
menos bactrias do que gua tamponada. Isto significa um biofilme mais fino. Alm disso, os
animais tero melhor qualidade de gua potvel.


Lavar mesmo assim!
Lavagem peridica com fluxo minimizar a espessura do biofilme. Biofilme mais fino tem menos
zonas anaerbicas e reagentes sanitizantes tero uma distncia menor para se difundir para alcanar
a superfcie da tubulao.

Como bactrias de biofilme escapam s nossas tentativas de elimin-las:

Ns purificamos a gua para remover nutrientes e perguntamos Como algo
poderia viver assim?
Elas usam sua rede de polmeros para concentrar nutrientes. Elas vivem em nveis
de nutrientes que no conseguimos nem medir.
Ns lavamos as linhas de gua tentando limpar as tubulaes.
Elas se agregam s superfcies com seus polmeros aderentes embaixo da
camada laminar onde foras de corte so muito fracas para remove-las.
Ns nivelamos as superfcies internas de conexes para que no possam se
armazenar em fendas e fissuras.
No importa. Elas se agregaro rapidamente e inevitavelmente mesmo assim.
Ns sanitizamos a tubulao com cloro.
Elas se protegem no lodo.



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Minimizar fendas mesmo assim!

Talvez o acabamento de superfcie no importa tanto quanto o acmulo total de biofilme, mas ao
eliminar grandes fendas (como juntas o-ring) se elimina bolsas profundas de biofilme que so mais
difceis de sanitizar e so mais corrosivas. Tambm, o eletropolimento ajudar na resistncia
corroso.



Sanitizar mesmo assim!

Se dito que o biofilme redesenvolve 3 dias aps a sanitizao, retenha-o sanitizando a cada 1-2
dias. Isto pode ser feito por sanitizao automtica por cloro ou oznio.

No h uma resposta fcil. A menos que um nvel de cloro contnuo seja permitido em um
fornecimento de gua, ter que ser feita uma estratgia combinada. Porm, se usarmos cada arma
que temos, isso deve resultar em uma qualidade de gua bacterial que satisfaa as necessidades de
nossos clientes e os animais pesquisados.
































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Referncias:

Artigo traduzido da literatura Biofilme - The key to understanding and controlling bacterial growth
in Automated DrinkingWater Systems, Second Edition, by Paula H.Dreeszen - June 2003, Edstrom
Industries, Inc.