A produo de insulina humana por

Pesquisa

ENGENHARIA GENTICA
Bactria transgnica produz insulina humana

Beatriz Dolabela de Lima

Professora Adjunta - Departamento de

Biologia Celular Universidade de Braslia
bdlima@unb.br

A engenharia gentica e a
biotecnologia moderna
A tecnologia do DNA recombinante
possibilita a obteno de organismos
com caractersticas novas ou no encontradas na natureza, o que permite uma
nova alternativa para o melhoramento
gentico de espcies de valor
biotecnolgico. Desse modo, clulas de
bactrias, leveduras e mesmo eucariontes
superiores como plantas podem ser programadas com genes exgenos, abrindo
a perspectiva de produo nestes organismos de polipeptdeos de interesse,
como o interferon, o hormnio de crescimento, a insulina entre outros. A utilizao
de
microrganismos
engenheirados, capazes de sintetizar
protenas em grande quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econmico,

uma vantagem considervel em relao

aos processos clssicos de produo.
A extrao de protenas eucariticas,
como a insulina, requer grandes quantidades de matria-prima (pncreas suno
e bovino), que nem sempre esto disponveis e so, geralmente, de elevado
custo. Isso torna o processo extrativo
cada vez mais oneroso. Nesse contexto,
o emprego de tcnicas mais eficientes,
como a do DNA recombinante, abriu
novas perspectivas de produo.
Diabetes mellitus

O diabetes mellitus um grupo de

doenas causadas pela deficincia na
secreo ou na ao do hormnio pancretico insulina, o que produz profundas anormalidades no metabolismo. H
duas classes principais de diabetes: o
juvenil e o adulto. No
primeiro, a doena
comea cedo, tornando-se severa e, no
ltimo, lento para
se desenvolver, moderado
e,
freqentemente, no
reconhecido.
Os sintomas caractersticos do diabetes so sede excessiva e frequente mico, levando
injesto de grandes
volumes de gua. Essas alteraes so devidas excreo de
grandes quantidades
Figura 1: Estrutura da insulina humana: pr-insulina
de glicose na urina
(cadeias B, C e A) e insulina (cadeias B e A). Setas
(glicosria). O granpretas indicam o ponto de clivagem para a retirada da
de volume de urina
cadeia C da pr-insulina, originando a insulina ativa.
no diabetes reflete a
Cadeia B, em rosa, cadeia C, em azul, e cadeia A, em
necessidade do rim
de excretar uma ceramarelo
ta quantidade de
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gua junto com a glicose, pois a capacidade do rim de concentrar os solutos na urina
tem um limite mximo. Outro sintoma o
nvel da glicose sangunea e como a
resposta ingesto da glicose. Quando a
concentrao da glicose no sangue significativamente alta chamada de
hiperglicemia.
O pH do plasma sanguneo de pessoas
severamente diabticas freqentemente
menor que o valor normal 7,4, condio
esta chamada de acidose. causada pela
superproduo de cidos metablicos e o
pH do sangue pode cair a 6,8 ou abaixo, e
levar a leses irreparveis nos tecidos, e
morte. Esse aumento da acidez um
indicativo de alteraes profundas no balano cido-base do organismo. A acidez
aumentada devido extensa formao de
corpos cetnicos no fgado e sua liberao no sangue. Como os tecidos no conseguem utilizar a glicose sangunea, o
fgado tenta compensar essa deficincia
aumentando a utilizao dos cidos graxos
como combustvel, mas isso provoca a
superproduo de corpos cetnicos, alm
da capacidade dos tecidos em oxid-los. A
atividade de glicoquinase est diminuda
no diabetes j que a insulina que estimula
a biossntese dessa enzima. Como conseqncia, forma-se pouco glicognio. Como
os carboidratos no esto sendo utilizados,
as protenas do organismo so usadas
como combustveis. Os aminocidos sofrem perda dos seus grupos amino e os
acetocidos formados podem sofrer oxidao em dixido de carbono e gua, em
parte pela via do ciclo do cido ctrico.
A administrao de insulina para corrigir a deficincia endcrina e a administrao de bicarbonato de sdio para corrigir a
perda, tanto do sdio como da capacidade
do tampo bicarbonato, podem trazer toda
a qumica do organismo de volta para um
balano quase normal dentro de 12 a 24
horas. Para seguir o curso de tal tratamento,
as dosagens de glicose, pH e CO2 sangu-

neos so realizadas frequentemente. Desse modo,

o diabetes juvenil requer
terapia com insulina e um
cuidadoso controle, por
toda a vida, do balano
entre a ingesto de glicose
e a dose de insulina injetada (Lehninger, 1984).

indesejada nos mRNAs

transcritos a serem produzidos a partir destes genes,
o que poderia afetar sua
expresso.
Para
facilitar
a
clonagem, esse gene sinttico para a pr-insulina
humana foi predito contendo um stio para a
Insulina humana
enzima de restrio Eco RI
no incio do gene, seguido
A insulina humana
de um cdon para
produzida nas clulas
metionina (ATG), da repancreticas, localizadas
gio codante para a cadeia
dentro dos conjuntos de
B, cadeia C e cadeia A,
Figura 2: Comparao entre a seqncia nucleotdica do
clulas de 100 a 200 m
nesta ordem, do cdon de
conhecidos como Ilhotas
trmino (TAA), e finalmengene sinttico (Ec gene) e do cDNA para a pr-insulina
de Langerhans. Essas esto
te, de um stio para a enzima
humana (Hs cDNA). Protein: seqncia protica da prdispersas pelo pncreas de
de restrio Bam HI. Ouinsulina
muitos vertebrados superitros stios para enzimas de
ores, constituindo cerca de
restrio foram adiciona1% da massa do orgo (Steiner et al.,
Construo do gene sinttico
dos internamente no gene de modo a
1985). A insulina tem sido isolada de
para a insulina humana
facilitar modificaes posteriores.
uma grande variedade de espcies de
Aps a definio da estrutura do gene
vertebrados, sendo que, em todas elas, a
Dentre as vrias maneiras pelas quais
sinttico, foi realizada a sua montagem
molcula composta de duas cadeias
um gene eucaritico pode ser obtido
conforme a estratgia mostrada na figura
polipeptdicas (A e B) ligadas por pontes
para a expresso em procariotos, a sn3. Quatro oligonucleotdeos foram sintetidissulfdricas.
tese qumica oferece as seguintes vantazados para a cadeia B, quatro para a
A insulina humana, como muitos
gens: fornece diretamente a seqncia
cadeia C e dois para a cadeia A. Esses
hormnios proticos, sintetizada como
exata desejada; as seqncias
oligos foram anelados em pares para a
uma protena precursora maior, seguida
codificadoras e no codificadoras poformao da fita dupla de DNA e foram
de uma clivagem proteoltica, para gerar
dem ser desenhadas para a expresso
ligados entre si, em duas etapas. Na
o hormnio ativo (Wang & Tsou, 1991).
procaritica; stios de restrio podem
primeira, foram montadas as cadeias B e
Desse modo, a insulina produzida sob
ser removidos ou adicionados, ntrons
C e, na segunda, montado o gene da pra forma de um nico polipeptdeo, a prretirados; no h necessidade da etapa
insulina, sendo que nesta ordem: cadeia
pr-insulina, com uma cadeia de 110
de isolamento do mRNA ou DNA
B, C e A. Esse gene foi clonado em um
aminocidos. Os vinte e quatro primeigenmico e permite a alterao do gene
vetor para a realizao do seqenciamento
ros aminocidos formam o peptdeo
de forma mais simples.
de DNA e a confirmao da seqncia
sinal ou seqncia pr da protena e tm
Desse modo, a construo do gene
nucleotdica correta do gene.
a funo de facilitar a entrada da mesma
sinttico para a pr-insulina humana foi
no retculo endoperiplasmtico. Durante
iniciada a partir da seqncia de
Construo de um vetor de
esse processo, o peptdeo sinal separaaminocidos dessa protena descrita por
hiper-expresso para E. coli
do da protena, resultando na formao
Sures et al. (1980). Utilizando-se os
da pr-insulina (figura 1). Essa molcula
cdons genticos preferenciais para
Nos ltimos anos, muitos vetores para
resultante, na qual as cadeias A (21
Escherichia coli (De Boer & Katelein,
E. coli tm sido construdos com diversas
aminocidos) e B (30 aminocidos) es1986) para a otimizao da expresso do
finalidades, entre essas, a clonagem de
to ligadas pelo peptdeo conectante C
gene nessa bactria, foi montado um
cDNAs, de fragmentos de DNA amplifica(35 aminocidos), a precursora da
gene codificando a protena humana. A
dos por PCR, transcrio in vitro e para a
insulina. Ela adquire sua conformao
figura 2 mostra a comparao da seexpresso e produo de protenas
com a formao de duas pontes
qncia de bases na fase de leitura do
heterlogas. Para cada finalidade, o vetor
dissulfdricas e transportada para o
cDNA da pr-insulina humana (Bell et
ter que apresentar determinadas caracteaparelho de Golgi, onde vai ser empacoal., 1979; Sures et al., 1980) com o gene
rsticas para otimizar sua utilizao. Desse
tada em grnulos de estoque. Durante a
sinttico montado nesse trabalho. Esse
modo, para a construo de um sistema
formao e maturao dos grnulos
gene contm 18,6 % de bases substitude expresso de protenas em E. coli, seis
secretrios, a pr-insulina clivada por
das, sendo 16,27 %, na terceira base, 1,16
elementos bsicos so necessrios:
enzimas proteolticas do tipo da tripsina,
%, na segunda base, e 1,16 %, na primei- uma regio necessria para replicao
resultando na liberao do peptdeo C.
ra base dos cdons. Nenhuma das moestvel e controle do nmero de cpias;
Desse modo, as duas cadeias A e B esto
dificaes feitas nos cdons alterou o
- um marcador seletivo, como um
ligadas entre si por pontes dissulfdricas,
aminocido de correspondncia. Aps
gene conferindo resistncia a antibitico
tendo uma outra ponte interna na cadeia
anlise computacional, a presena de
para a hospedeira;
A, formando a molcula de insulina
seqncias repetitivas, diretas ou inver- um promotor para iniciao da trans(figura 1) (Steiner et al., 1985).
sas, maiores do que oito nucleotdeos
crio e seu controle;
no foi encontrada, evitando assim uma
- uma regio terminadora da transcripossvel estrutura secundria local
o;
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Figura 3: Estratgia utilizada para a construo dos genes para a prinsulina humana para a expresso na bactria E. coli
- um stio de ligao de ribossomas
para a iniciao da traduo em uma
trinca ATG apropriada;
- e uma regio de stios apropriados
para enzimas de restrio, para utilizao nas clonagens dos genes a serem
expressos.
Seguindo esses requisitos para a construo do vetor de expresso pLMT8.5
(figura 4), utilizamos a origem de
replicao do plasmdeo pUC8, o gene
de resistncia tetraciclina do plasmdeo
RP4, o promotor pL isolado do fago
Lambda, a regio Shine Dalgarno sinttica do fago T7, terminador de transcrio Rho-independente sinttico, e uma
regio de mltiplos stios nicos para
enzimas de restrio (figura 4).
Para a regio de replicao estvel e
de controle do nmero de cpias do
plasmdeo foi escolhida a origem de
replicao do plasmdeo pUC8. Essa
origem derivada do plasmdeo pMB1

(ou ColE1) onde mutaes e delees

foram introduzidas de modo a aumentar
o nmero de cpias do plasmdeo dentro da clula. Esses plasmdeos podem
estar presentes em mais de 500 cpias
por clula.
O gene de resistncia tetraciclina
foi escolhido e utilizado porque este
permite que, alm da seleo das bactrias recombinantes, o antibitico
tetraciclina estar constantemente fazendo presso seletiva durante a fermentao. A resistncia tetraciclina consiste
de uma protena que bombeia o antibitico para fora da clula, no permitindo
sua atuao na inibio da sntese protica
no interior da bactria. Isso tem como
conseqncia, em uma fermentao industrial, que se utilizem menores quantidades do antibitico, pois este no ser
inativado pela bactria resistente e estar
constantemente presente na fermentao. Assim, a produtividade no bioreator

Figura 4: Mapa do
vetor de expresso
pLMT8.5 contrudo
para a produo da
pr-insulina humana
em E. coli.
TetR: gene de
resistncia a
tetraciclina; ori:
origem de
replicao; MCS:
regio de stios
nicos para enzimas
de restrio; pL:
promotor pL; SD:
seqncia ShineDalgarno; e TT:
regio de
terminao de
transcrio

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no ser afetada devido ao acmulo de

bactrias sem plasmdeos. Esse fenmeno de acmulo de bactrias sem
plasmdeos foi observado por muitos
pesquisadores e responsvel por dificuldades no escalonamento requerido
para a comercializao de produtos
recombinantes (Kumar et al., 1991).
Para a iniciao da transcrio foi
escolhido o promotor pL do bacterifago
Lambda. Este um promotor forte e
regulado negativamente pelo repressor
codificado pelo gene cI. A mutao
cI857 tornou o repressor sensvel temperatura, funcional a 28oC e no funcional a 42oC. Assim, a expresso de
seqncias codantes sob o controle desses promotores e pelo repressor cI857
pode ser ativada simplesmente por uma
mudana na temperatura da cultura, o
que, principalmente em escala industrial, simplifica e barateia o processo.
A partir de um promotor e de um
incio de transcrio, a RNA polimerase
transcreve o RNA at o reconhecimento
de um stio de terminao, que funciona
como um sinal para o trmino da transcrio. Dois tipos diferentes de
terminadores so encontrados:
terminadores simples ou Rho-independentes e terminadores Rho-dependentes
(dependentes da protena Rho). Os
terminadores Rho-independentes possuem duas caractersticas: uma estrutura
em forma de grampo, gerada por
pareamento entre repeties invertidas,
contendo uma regio rica em pares G-C
na base do grampo, separadas por uma
curta distncia, e outra, subseqente da
primeira, que contm uma regio de,
aproximadamente, seis resduos de
uridina no final da unidade. Esses
terminadores parecem ter alguma funo na proteo do mRNA, pela sua
capacidade de formar uma estrutura em
grampo, provavelmente fornecendo uma
barreira contra a ao de uma exonuclease
3' (Brawerman, 1987), e no dependem
de um fator protico, proporcionando
uma efetiva finalizao da transcrio no
vetor de expresso.
A etapa mais limitante na sntese
protica a ligao dos ribossomas s
molculas de mRNA. Desde que o nmero de ribosomas na clula exceda a
classe de mensageiros, uma maneira de
aumentar a expresso de um gene
clonado aumentar o nmero dos transcritos correspondentes. Para tal, a maneira mais simples clonar o gene de
interesse em um plasmdeo com grande
nmero de cpias.
As duas caractersticas dos mRNAs
de E. coli , que determinam onde e qual
a eficincia do processo de reconheci-

Figura 5: Anlise da expresso

em diferentes tempos de induo
da pr-insulina em E. coli. Gel
desnaturante (SDS-PAGE) a 15%
dos lisados proticos totais das
culturas, contendo o plasmdeo
pLMT8.5 e o plasmdeo pPTA1
(pLMT8.5 + gene da pr-insulina)

mento ribosoma-mRNA, so o cdon de

iniciao, geralmente AUG ou GUG, e a
regio Shine Dalgarno (SD), ou stio de
ligao de ribossomas (RBS). Essa regio
complementar ao final 3' do RNA
ribosomal 16S (Shine & Dalgarno, 1974;
Shultzaberger et al., 2001). O SD tem
tipicamente de trs a seis nucleotdeos
de tamanho e est localizado quatro a
quinze nucleotdeos antes do cdon de
iniciao. Essa regio tem a funo de
guiar o ribossoma para o ponto de incio
correto (Dreyfus, 1988). Olins et al. (1988)
descreveram uma regio SD a montante
do gene 10 do bacterifago T7 (g 10-L).
Esse gene codifica para a protena da
capa, que a protena mais sintetizada
aps a infeco do fago T7. Essa regio
SD possui um grande potencial para
otimizar a eficincia da traduo de
genes homlogos e heterlogos clonados
em E. coli.
Para facilitar a clonagem de genes
para a expresso no vetor, uma regio
apropriada de stios nicos para enzimas
de restrio foi adicionada entre a regio
promotora e o SD, e a regio terminadora
da transcrio, onde temos o stio para a
enzima de restrio NcoI contendo o
cdon ATG de incio de traduo (figura
4).
Produo da
pr-insulina humana
Para a produo da pr-insulina, o
gene sinttico da pr-insulina foi
subclonado no vetor de expresso
pLMT8.5 e o plasmdeo recombinante foi
denominado de pPTA1. Esse plasmdeo
foi utilizado para a transformao da
cepa E. coli N4830-1, pois essa possui o
repressor cI termossensvel.
A cepa E. coli N4830-1 transformada

com o plasmdeo pPTA1, foi utilizada

para a induo trmica da Pr-insulina.
Como controle, foi utilizadas cultura da
cepa contendo o plasmdeo pLMT8.5
sem o gene clonado. As protenas
induzidas esto mostradas na figura 5.
Verifica-se a induo de uma protena
de, aproximadamente, 10.000 dltons,
que corresponde Pr-insulina na cultura do recombinante pPTA1. Essa protena corresponde a 20% das protenas
totais da bactria. Nas amostras com o
plasmdeo pLMT8.5, no observamos
essa protena induzida. Podemos concluir portanto, que ocorreu uma hiperexpresso da Pr-insulina a partir do
gene clonado no plasmdeo pLMT8.5
construdo.
Verificou-se tambm que ocorreu
formao de corpos de incluso da protena recombinante produzida, o que
auxilia a proteo contra protelise e
facilita sua purificao. Eles so formados como agregados citoplasmticos que
podem ser purificados aps a lise da
clula, centrifugao e solubilizao das
protenas com, por exemplo, uria ou
guanidina.
A perspectiva de produo a partir
dessas bactrias recombinantes, obtidas
nesse trabalho, nas condies de cultura
utilizadas, de 1 g de pr-insulina para
cada 17 litros de cultura, com uma densidade celular de 109 clulas por ml.
Consideraes finais
Esse trabalho foi realizado dentro do
Projeto Produo de insulina humana
atravs de precursores recombinantes
em Escherichia coli, coordenado pelo
Prof. Spartaco Astolfi Filho, com financiamento da Biobrs e PADCT/FINEP,
dentro do Convnio UnB/Biobrs. Esse

sistema de produo de insulina est

patenteado nos Estados Unidos (patentes nos. 6068993, 30/05/2000, e
6281329B1, 28/08/2001) e com pedido
de patente no INPI, Brasil.
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