ANEXO MTODOS ANALTICOS OFICIAIS PARA ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA CAPTULO I CONTAGEM

PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padro de mesfilos aerbios estritos e facultativos viveis. Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos. microrganismos

2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Agar padro para contagem (PCA); Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos.

bsicos

obrigatrios

em

laboratrios

de

microbiologia

de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Semear 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis. Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C. Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em superfcie plana. 5.3 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas. 5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura selecionando as placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes: Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias; Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.

6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA FRANK, J.F. Microbial spoilage of foods: Milk and dairy products. In: Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. Michael P. Doyle, Beuchat, L.R.; Montville, T.J. (Eds.). ASM Press Washington D.C., p. 101-116. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67. CAPTULO II CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C. A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar batata glicose 2%; L(+) cido tartrico 10%; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo das placas Fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C. Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 mL de soluo de cido tartrico 10% para cada 100 mL de meio. Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

cima em estufa a 50C por cerca de 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem. 5.2 Pesagem e preparo da amostra Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de glicose. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.3 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.4 Inoculao em placas Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1. 5.5 Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D. 5.6 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R. Yeasts, molds and mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov CAPTULO III CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesfilos

aerbios viveis em produtos UHT, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas do produto. Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis. Aplica-se a amostras de produtos lcteos lquidos, tratados pelo processo UHT. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto. 2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em gar crebro-corao e em gar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e posterior identificao dos microrganismos presentes. 2.3 Limitaes do Mtodo: Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias na diluio 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluies subseqentes, o que pode resultar em dados finais estimados. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; gar uria; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis); Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Corantes para colorao de Gram; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e aps com etanol 70% ou etanol 70 GL.

Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias. As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de soluo salina peptonada 0,1% at 10-2. Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluies preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata. Adicionar cerca de 20 mL de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de gar nutriente isento de extrato de levedura. Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas. 5.4 Incubao: Incubar as placas a 30 1C por 72 horas. 5.5 Leitura: Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e observando suas caractersticas. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da contagem. Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si, proceder conforme Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI. Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes, de colorao entre branco e bege. Esta diferenciao necessria porque as colnias de B.sporothermodurans no devem ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao no produto. Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que segue: Repicar 3 a 5 colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72h. Realizar os testes confirmatrios. 5.6 Colorao de Gram Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues

constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de bastonetes Gram positivos, reportar o nmero encontrado como a contagem total de microrganismos aerbios mesfilos. 5.7 Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresentam reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrlise da esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato e produo de urease, conforme abaixo descrito. 5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico, descartveis e estreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de uma reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva. 5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose. 5.10 Hidrlise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo gar esculina inclinado. Incubar a 36 1C por 72h. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina. 5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose. 5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo

BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nessa situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato a nitrito. 5.13 Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas contendo gar uria. Incubar a 36 1C por 72h. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. O nmero de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans no dever ser reportado como resultado da contagem de mesfilos aerbios. Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo OBS do Certificado Oficial de Anlise (COA): Presena de Bacillus sporothermodurans. Somente ser reportado o nmero de unidades formadoras de colnias de outros mesfilos encontrados. Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando identificado(s). Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT a 30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/mL. Para todos os produtos UHT, o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias a 36 1C deve ser expresso como alterado ou sem alterao. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. p. 759-764. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 53-62. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.

CAPTULO IV CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfito redutores e de Clostridium perfringens em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferro III, formando um precipitado negro. 2.2 Fermentao tempestuosa: Baseia-se na verificao da fermentao tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, caracterstica do Clostridium perfringens.p. Essa fermentao caracteriza-se por formao de cogulo bem definido, com grande formao de gs, durante incubao temperatura seletiva de 46 1C. 2.3 Testes confirmativos: A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade, reduo de nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose, fermentao da rafinose e liquefao da gelatina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%; gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP) -base; gar estoque; gar motilidade - nitrato tamponado; Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina; Caldo vermelho de fenol-base; Soluo de rafinose 10% ; Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi); Meio tioglicolato; Alfa naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Soluo de cicloserina 5%; Polimixina B; Kanamicina; Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida; Gerador de anaerobiose; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao em Placas A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar cerca de 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio. Deixar solidificar em superfcie plana. 5.4 Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.5 Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC e no gar SFP. Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colnias tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito redutores presentes por grama da amostra em anlise. Escolher 5 colnias negras e repicar para tubos com gar estoque. Incubar em anaerobiose a 36 1C por no mnimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estril de vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral). 5.6 Testes confirmativos para Clostridium perfringens 5.6.1 Colorao de Gram: A partir de cultura pura em gar estoque ou dos meios usados paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando for verificada a presena de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova de fermentao tempestuosa. 5.6.2 Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estril e incubar a 46 1C em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo no apresentar reao claramente positiva). Alternativamente, pode ser utilizada uma suspenso da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfcie do gar estoque com soluo salina peptonada 0,1%, transferindo 1 mL desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at 6 horas a 46C, com formao de cogulo firme e grande quantidade de gs (fermentao tempestuosa). A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na colorao de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa, realizar as seguintes provas: 5.6.3 Prova da motilidade Inocular a cultura, com agulha, em gar motilidade-

nitrato tamponado. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas. O Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculao. 5.6.4 Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao gar 0,5 a 1 mL de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito. Para confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p de zinco. O aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato, enquanto que a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo do nitrato. O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito. 5.6.5 Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em vrios pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a sua preparao, regener-lo por aquecimento a 50C por 2 horas em banhomaria, antes da inoculao. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao, manter os tubos em geladeira por 1 hora. Observar a fermentao da lactose pela produo de bolhas de gs e pela mudana da cor do meio de vermelho para amarelo e tambm a liquefao da gelatina por meio da permanncia do estado lquido aps o resfriamento por cerca de 1 hora em geladeira. O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a 36 1C. 5.6.6 Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentao da rafinose. Aps inoculao, adicionar 1 a 2 mL de selo estril: vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h. Verificar a fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para amarelo. As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens. O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 2h. CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS Meio motilidade nitrato Motilidade Nitrato + + + + + + + Meio lactose-gelatina cido/ gs Liquefao.gelatina AG/T + (48h) AG/T + (48/72h) AG/CS -* AG/CS AG/CS AG/CS AG/CS -*

Espcies de Clostridium C. perfringens A C.perfringens B C. absonum C. baratii C. celatum C. paraperfringens C. sardiniense

A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - = negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina

6. RESULTADOS 6.1 Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutores presentes na amostra: Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes do Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. 6.2 Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentao tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 2h, da rafinose em at 72 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 2h. A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes, de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330. MacFADDIN, J.F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1985. 928p. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. CAPTULO V CONTAGEM DE Staphylococcus aureus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus aureus. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. Para os produtos destinados ao comrcio no MERCOSUL, a contagem final se referir apenas a Staphylococcus coagulase positiva. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em combinao com 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de potssio, produzindo colnias negras. O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a verificao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus , por meio do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da colnia, respectivamente. 2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.

2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de que algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Baird-Parker - base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila; gar estoque; Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas

de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular, sobre a superfcie seca do gar Baird-Parker, 0,1 mL de cada diluio selecionada. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10o), o que corresponder diluio 10-1. 5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas. 5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias. Contar as colnias tpicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio. Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de colnias tpicas e atpicas. Selecionar 3 a 5 colnias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colnia em tubos contendo BHI, para confirmao. Incubar a 36 1C, por 24 horas. Observao: para a obteno do nmero final de UFC/mL ou g, utilizar, de preferncia, apenas uma diluio, pois, uma colnia atpica pode tornar-se tpica na diluio subseqente em funo da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competio bacteriana. 5.6 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 1C por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a realizao dos testes complementares. 5.7 Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: 5.7.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares. 5.7.2 Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm de dimetro no gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina -

DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva. 5.7.3 Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva. 6. RESULTADOS Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em considerao a diluio utilizada. Quando o nmero de colnias confirmadas for diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas. Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912. HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256. LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403.

MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clinica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60. MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. PAHO. Organizacin Panamericana de la Salud. Contaminacin microbiana de los alimentos vendidos en la va pblica en ciudades de Amrica Latina y caractersticas socio-economicas de sus vendedores y consumidores. Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al. (Eds.). 1996, 176p. SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne Toxinoses caused by Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, and Clostridium perfringens. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. Washington: ASM, 1994, p. 130-140. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens Na illustrated text. London: Wolf Publishing Ltd, 1991.p. 235-265. CAPTULO VI CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colnias suspeitas. O gar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composio sais biliares e cristal violeta, responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentao da lactose pelos microrganismos presentes. A adio de sobrecamada visa a preveno do crescimento e do espraiamento de colnias na superfcie do gar. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo EC e posterior incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C, em banho-maria com agitao ou circulao de gua. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificao.

A seletividade devido a presena de sais biliares responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios microbiologia de alimentos; gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%. em laboratrios de

4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).

de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1 % de acordo com as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio desejada em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 1.5mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46C 48C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso at total solidificao do meio. Adicionar, sobre cada placa, cerca de 10mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46C - 48C em banho-maria, formando uma segunda camada de meio. Deixar solidificar. 5.3.2 Incubao Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio invertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas. 5.3.3 Leitura Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias que apresentarem morfologia tpica de coliformes, ou seja. colnias rseas; com 0,5 a 2 mm de dimetro rodeadas ou no por uma zona de precipitao da bile presente no meio. Anotar os resultados de contagem. Contar separadamente colnias tpicas e atpicas e submeter 3 a 5 colnias, de cada uma. s provas confirmativas. 5.4 Provas confirmativas 5.4.1 Coliformes totais 5.4.1.1 Inoculao

Inocular cada uma das colnias tpicas e atpicas selecionadas em tubos contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colnia, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitao. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformes totais se referem determinao contagem de coliformes a 35C e os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem determinao coliformes a 45C. Para o clculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes, proceder de acordo com as indicaes contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p. ICMSF. Microorganismos de los Alimentos - Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia, Zaragoza, Espanha. HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO VII CONTAGEM DE Bacillus cereus

1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus. Aplica-se a matrias primas e alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA). Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo de lecitinase pelo B.cereus . No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdio evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio. A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento, poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/mL) como agente seletivo. Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus . No MYP, o indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol. 2.2 Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento em superfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina. <!ID720419-2> 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%; gar nutriente; gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA); gar estoque; gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado; gar tirosina; gar motilidade - nitrato; cido sulfanlico soluo 0,8%; Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5%; Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/mL; Emulso de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado; cido actico 5N; Zinco em P; Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

Adicionar 225 mL da soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas conforme o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 mL de cada diluio selecionada. Com auxilio de ala de Drigalski ou basto tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro. Utilizar, no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra. 5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas. 5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de dimetro e rodeadas por halo de precipitao de lecitina hidrolizada, no gar PEMBA. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou sub-terminais. Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as seguintes provas: 5.6 Identificao Bioqumica 5.6.1 Motilidade e reduo de nitrato Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito. 5.6.2 -hemlise em gar sangue de carneiro. Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro.

Incubar a 36 1C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise. 5.6.3 Decomposio da tirosina: Inocular por estrias a superfcie de gar tirosina (inclinado em tubo ou distribudo em placas). Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao, observar o aparecimento de uma zona clara prxima ao crescimento produzida pela decomposio da tirosina. Nos casos em que houver dvidas, reincubar por at 7 dias a 36 1C. O Bacillus cereus decompe a tirosina. 5.6.4 Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositando o inculo no ponto central da placa. Incubar a 36 1C por 48 a 72 horas. Aps incubao verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizide se caracteriza pelo aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia. 5.6.5 Teste para verificao da presena de corpsculos de incluso cristalina. A partir das culturas suspeitas repicadas em gar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presena de corpsculos de incluso cristalina procedendo conforme item 7 do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que so liberados somente aps a lise do esporngio. Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres. O Bacillus cereus no produz corpsculos de incluso cristalina. PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GNERO Bacillus Bacillus Bacillus cereus Bacillus Bacillus megaterium thuringiensis mycoides de + +a + + + de -d em de da + b + + + + + + + + -c + + +

Colorao Gram Catalase Motilidade Reduo nitrato Hemlise sangue carneiro Decomp. tirosina Corpsc.de incluso cristalina Crescimento rizide

Bacillus anthracis + + + -d -d -

a: 90 a 100% so positivos b: 50 a 90% so positivos c: 90 a 100% so negativos d: a maioria negativa 6.RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na

amostra em anlise seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes no Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.). 4.ed. Washington DC: American Public Health Association, 2001, p.311-316 MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275p. RHODEHAMEL, E.J. and HARMON, S.M. Bacillus cereus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. CAPTULO VIII CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Enterobactrias. Aplica-se a amostras de produtos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadas em gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia a habilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicada por uma viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias. A seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG); gar estoque; Soluo salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase; Reativos para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL

da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose previamente fundido e mantido a 46C-48C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente o inculo com o meio e deixar em repouso at total solidificao. Aps adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar solidificar. 5.4 Incubao: Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio invertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas. 5.5 Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias de colorao vermelha, rodeadas ou no por halo de precipitao da bile presente no meio, com 0,5 a 2 mm de dimetro e anotar os resultados de contagem. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. Realizar a prova da oxidase conforme o item 5.6. 5.6 Prova da oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira estreis, ou de plstico descartveis estreis, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova da oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. Todas as enterobactrias apresentam reao de oxidase negativa. 5.7 Colorao de Gram: Das colnias oxidase negativas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, seguindo as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Todas as enterobactrias apresentam-se como bastonetes Gram negativos. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.

Expressar o resultado em UFC/g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL, V.R.; JANDA, W.M.; SOMMERS, H.M.; WINN, W.C. Enterobacteriaceae . In: Diagnstico micro-biolgico. Texto y Atlas Color. 3ed. Mxico, D.F.: Editorial Medica Panamericana. 1997, p.203-267. MAC FADDIN , J.F. Pruebas Bioquimicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275 p. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens-Na illustrated text. London: Wolf Publishing Ltd. 1991, 557p. CAPTULO IX NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM GUA E GELO 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostras de gua e gelo. Aplica-se a amostras de gua e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose, na prova presuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos;

Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao). de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixar descongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Antes do incio da anlise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro de outro saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo da amostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no analisar a amostra. Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em descongelamento devero ser descartadas. Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no continha perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder anlise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de gua. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla. Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 mL da diluio 10-1 na terceira srie de 3 tubos contendo o mesmo meio. Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies, proceder de acordo com as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual. Neste caso, inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar sries de 5 tubos. Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar sries de 10 tubos. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo

devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/100 mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20 ed. Washington DC. Clesceri, L.S.; Greenberg, A.E.; Eaton, A.D.; Franson, M.A.H. (Ed.), 1998. p. 9.47-9.55. HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO X NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do Nmero Mais Provvel de

coliformes totais e termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldo verde brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile lactose 2%; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao) de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Produtos slidos e pastosos: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.

Esta a diluio 10-1. <!ID720419-3> 5.1.2 Produtos lquidos: Preparar as amostras de acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao 5.3.1.1 Produtos slidos, pastosos e creme de leite pasteurizado: A partir da diluio inicial (10-1), inocular volumes de 10 mL em srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla (corresponde diluio 10). A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio inicial (10-1) em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. A partir da diluio 10-1, preparar a diluio 10-2 em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podem ser inoculadas em sries de 3 tubos. 5.3.1.2 Produtos lquidos: Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 mL em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Transferir tambm 1 mL da amostra para tubo contendo soluo salina peptonada 0,1% de forma a obter a diluio 10-1. A partir da diluio10-1, efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podero ser inoculadas em sries de 3 tubos. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero

vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes Termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http:// www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO XI NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos. Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitao determinados pela legislao encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Determinao do NMP: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10%- piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker. No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se desenvolver nesta condio. O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no gar Baird-Parker. O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a

evidenciao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitao e um de transparncia ao redor da colnia. Prova da coagulase Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase. 2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Baird-Parker-base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila; gar estoque; Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC); Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%; Soluo de azul de toluidina 1%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Grm. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. 5. PROCEDIMENTOS bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Alimentos slidos: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Esta a diluio10-1. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio selecionada em trs sries de trs tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP. Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos). 5.1.2 Alimentos lquidos: Pipetar 1 mL diretamente da amostra e tranferir para cada um dos trs tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP. Transferir tambm 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de soluo salina peptonada 0,1% (diluio 10-1). A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL das duas diluies subseqentes em sries de trs tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP. Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Incubao: Incubar a 36 1C por 48 horas. 5.4. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento: do meio ou precipitado negro em caldo GC e turvao em: caldo TSBNP. 5.5. Provas confirmatrias: Com pipetas de Pasteur estreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e coloc-la sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker, junto borda da placa, estriando posteriormente com ala, de forma a obter colnias isoladas. A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker. Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas. Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada colnia para um tubo contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase. 5.5.1 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 1C, por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado;

Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se desprender quando o tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus; Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao dos testes complementares. 5.6 Testes complementares: A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: 5.6.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares. 5.6.2 Pesquisa da termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes, com cerca de 2 mm de dimetro, no gar para ensaio da termonuclease ou no gar azul de toluidina DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva. 5.6.3 Prova da catalase Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se de que a tabela de NMP em uso a indicada para cada caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AOAC Official Method 987.09 Staphylococcus aureus in Foods: most probable number method for isolation and enumeration. In: Microbiological Methods. 17 ed., AOAC, Andrews, W.H. (Ed.), cap. 17.5.01, 1998. BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos

de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie regulamentao tcnica de identidade e qualidade de produtos de origem animal; n.2. 1997, 77p. GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912. HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256. LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403. MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bactrias de importncia clinica. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60. MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. CAPTULO XII NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do nmero mais provvel de Vibrio parahaemolyticus. Aplica-se a amostras de pescado e derivados. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Provas presuntivas 2.1.1 Enriquecimento em caldo seletivo Inoculao em meio de cultura de enriquecimento seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presena de Vibrio parahaemolyticus evidenciada pela turvao do meio aps a incubao. Em sua composio, o meio GSTB apresenta teepol, soluo aquosa de sulfatos de sdio alcalinos primrios que atuam na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus halfilo obrigatrio, os dois meios contm 3% de cloreto de sdio. 2.1.2 Isolamento em gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS) Isolamento se realiza em gar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contm elevada concentrao de tiossulfato e citrato de sdio, responsveis pela inibio do crescimento das enterobactrias presentes. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formao de cido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio. 2.2 Provas de identificao: A identificao de Vibrio parahaemolyticus feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas, morfolgicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Meller-Hinton sal 3%;

gar nutriente sal 3%; gar gelatina sal 3%; gar soja triptona sal 3%; gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS); gar ferro trs acares (TSI) sal 3% ou gar Kligler sal 3%; gar motilidade sal 3%; Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB); Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo peptonado sal 8%; Caldo peptonado sal 10%; Caldo ONPG sal 3%; Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%; Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%; Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%; Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%; Soluo salina peptonada 0,1% sal 3%; Soluo fisiolgica (NaCl 0,85%); Agente vibriosttico O 129 10g ; Agente vibriosttico O 129 150 g; Arabinose; L-arginina; L-lisina; Manitol; Sacarose; leo mineral ou parafina lquida estreis; Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'tetrametil-parafenileno-diamina); Teepol; O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo; Etanol 96%; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Provas presuntivas

5.3.1 Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies) de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas. 5.3.3 Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao. 5.3.4 Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS) 5.3.4.1 Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS). 5.3.4.2 Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem. 5.4 Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.4.1 Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao de Gram de acordo com as instrues descritas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste manual. O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos. 5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal. 5.4.3 Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo N'N'N'N'-tetrametilparafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. OBS: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.

O Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva 5.4.4 Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estreis. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio pois no capaz de fermentar a sacarose. 5.4.5. gar ferro trs acares sal 3% (TSI) ou gar Kligler ferro sal 3% A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriando a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S e bisel alcalino (vermelho). 5.4.6 Teste ONPG: A partir da cultura em TSI, inocular uma alada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a 36 1C, durante 2 horas. Examinar os tubos , verificando o aparecimento ou no de cor amarela, indicativa de reao positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reao negativa. O Vibrio parahaemolyticus ONPG negativo. 5.5 Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticus As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas provas preliminares, devero ser submetidas s provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9. 5.5.1 Teste do crescimento a 42C: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a 42 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios. O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C. 5.5.2 gar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor). Incubar as placas a 36 1C por 18 a 24 horas. Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita a vizualizao do halo. O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase. O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva. 5.5.3 Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um tubo contendo gar motilidade sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva. 5.5.4 Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em gar

nutriente sal 3% , inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de bolhas de gs nos meios. A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos devem apresentar colorao amarela. 5.5.5 Descarboxilao da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina. 5.5.6 Hidrlise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina. 5.5.7 Prova da fermentao do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para amarelo, devido fermentao dos acares e conseqente produo de cido. 99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose. 5.5.8 Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos

contendo caldo peptonado sal 6% e 10%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal. 5.5.9 Sensibilidade do agente vibriosttico O/129 Esta prova utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus. Embeber um swab previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo gar Meller-Hinton sal 3% ou agar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inculo, de forma a obter um crescimento o mais homogneo possvel. Deixar as placas absorverem o inculo. Colocar um disco do agente vibriosttico O/129 com concentrao de 10g e um disco de concentrao de 150g. Incubar as placas a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus resistente concentrao de 10g de agente vibriosttico O/129 enquanto o V. vulnificus sensvel. Todos os vbrios so sensveis concentrao de 150g do agente O/129. 6. RESULTADOS Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao: Motilidade - positiva Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo Descarboxilao da lisina - positivo Hidrlise da arginina - negativo Crescimento a 42C - positivo Fermentao do manitol - positivo Fermentao da arabinose - positivo Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 10g - resistente Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 150g - sensvel gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo Halofilismo (6% sal) - positivo Halofilismo (8% sal) - positivo Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, Procedimentos Bsicos de Contagem, deste Manual. Expressar o valor obtido em NMP/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others vbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http: www.cfsan.fda.gov. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169. CAPTULO XIII NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS UHT E ESTERILIZADOS,

PASTOSOS E VISCOSOS 1.OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas em produtos lcteos pastosos e viscosos. Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis. Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto. 2.2 Determinao do NMP: Baseia-se na semeadura de diluies seriadas da amostra em tubos contendo caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, com posterior repique em gar crebro-corao (BHI) e gar nutriente isento de extrato de levedura e a subseqente identificao da flora presente. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; gar uria; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE); Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentrao dupla (BHI-SE2); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. <!ID720419-4> 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Aps pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e posteriormente com etanol

70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: Inocular 10 mL da diluio 10-1, 1 mL da diluio 10-1 e 1 mL da diluio 102, separadamente, em trs sries de trs tubos contendo 10 mL de BHI-SE. Na primeira srie de tubos, que foram inoculados com 10 mL da diluio 10-1, usar o meio com concentrao dupla (BHI-SE2). Incubar a 30 1C por 72 horas. 5.4 Confirmao do crescimento: Finalizado o perodo de incubao, repicar todos os tubos sobre a superfcie seca de ABHI e de gar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colnias isoladas. Incubar a 30 1C por at 72 horas. 5.5 Leitura: O crescimento nas placas ser indicativo de presena de mesfilos aerbios no tubo de origem, porm ser necessria a diferenciao entre Bacillus sporothermodurans (que no patognico nem produz alterao do produto) e outros mesfilos aerbios capazes de alterar o alimento. Registrar o nmero de tubos que apresentaram crescimento de colnias nas placas correspondentes, registrando em separado as colnias suspeitas de Bacillus sporothermodurans. Quando o crescimento bacteriano for devido presena de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado crescimento abundante de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis, nas placas com ABHI. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes de colorao entre branco e bege. Selecionar de 2 a 3 colnias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72 horas e realizar os seguintes testes confirmatrios: 5.6 Colorao de Gram: Preparar esfregao das colnias suspeitas e corar pelo mtodo de Gram . Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme o item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para presena de aerbios mesfilos. 5.7 Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao

de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresenta reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder confirmao da presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrlise da esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato, produo de urease e crescimento em anaerobiose, conforme abaixo descrito. 5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico descartveis, estreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva. 5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose. 5.10 Hidrlise da esculinaInocular a cultura, com agulha, em tubos contendo agar esculina inclinado. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina. 5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose. 5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato nitrito. 5.13 Prova da urease: Inocular com ala a superfcie de placas ou tubos com agar uria previamente preparadas.

Incubar a 36 1C por at 72 horas. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease. 6. RESULTADOS Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactrias diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando no for observado crescimento de colnias nas placas e quando o crescimento observado for confirmado como sendo somente de Bacillus sporothermodurans. A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada e seguindo as instrues contidas no Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual, calcular o nmero mais provvel de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em anlise. Quando for confirmada a presena de Bacillus sporothermodurans juntamente com outros mesfilos na amostra, devero ser excludos os tubos que continham apenas Bacillus sporothermodurans para o clculo final do NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis. Quando for observada somente a presena de colnias de Bacillus sporothermodurans na amostra, reportar o resultado de mesfilos aerbios viveis como <0,3 NMP/mL. Sempre que for observada a presena de Bacillus sporothermodurans, fazer constar no Certificado Oficial de Anlise (COA), no campo OBS., a expresso: Presena de Bacillus sporothermodurans. Devero ainda acompanhar o resultado de anlise informaes adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando identificado(s). Os resultados da anlise de NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C por 72 horas em produtos lcteos UHT e esterilizados, pastosos e viscosos, devem ser expressos em: NMP/g. O resultado da anlise de pr-incubao a 36C por 7 dias deve ser expresso como alterado ou sem alterao. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. P. 759-764. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67. CAPTULO XIV PESQUISA DE Listeria monocytogenes 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer mtodo analtico para a deteco de Listeria monocytogenes em alimentos de origem animal. A metodologia aplica-se a todos os alimentos crneos e lcteos.

2. FUNDAMENTOS 2.1 Enriquecimento Seletivo: O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo UVM, e a segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de inibir a flora acompanhante, permitindo a recuperao de baixos nmeros de clulas de Listeria sp. O efeito seletivo no caldo UVM exercido pela associao de cido nalidxico e acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de ltio, cido nalidxico e acriflavina. 2.2 Seleo e Isolamento: Nos produtos crneos, a seleo se realiza em dois meios slidos: gar triptose com cido nalidxico (ATN) e gar Palcam (AP), enquanto que nos produtos lcteos esta se realiza em agar Oxford (AO), gar Palcam (AP) e gar triptose com cido nalidxico (ATN). As substncias impedientes presentes nos meios slidos so cido nalidxico no ATN, sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de ltio e ceftazidina no AP, e cloreto de ltio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO. A seleo no ATN baseia-se nas caractersticas das colnias, quando observadas sob luz oblqua, em estereoscpio. No AP, observa-se a no fermentao do manitol e a formao de esculetina pela hidrlise da esculina, reao revelada pela presena de ferro trivalente. No AO, as colnias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por halo negro devido hidrlise da esculina. 2.3 Confirmao da presena de Listeria sp: A confirmao bioqumica de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de catalase, observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais, verificao do crescimento tpico em meio semi-slido e, adicionalmente, por meio da verificao da incapacidade de reduo de nitrato e verificao da positividade nas reaes de Vermelho de Metila e Voges Proskauer (VM-VP). 2.4 Identificao de Listeria monocytogenes: A diferenciao das espcies de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de -hemlise em gar sangue de cobaio ou gar sangue de carneiro, verificao da capacidade de produzir reao de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente tambm com Rodococcus equi), e verificao da capacidade de fermentao dos carbohidratos ramnose, xilose e manitol. A utilizao concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste til para a diferenciao de L. ivanovii, que apresenta reao de CAMP forte com R. equi (em forma de flecha). Quando se julgar conveniente, a identificao poder ser realizada por meio de um sistema comercialmente disponvel de testes bioqumicos miniaturizados padronizados, conjuntamente com a prova de -hemlise ou CAMP teste. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Caldo Fraser - base; Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente Caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB); Caldo VM-VP; Caldo vermelho de fenol - base ou gar para fermentao de carbohidratos base; gar Palcam (AP); gar Columbia com cido nalidxico - base; gar triptose com cido nalidxico (ATN); gar Oxford (AO) - base;

gar motilidade; S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste; Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional); Sistema miniaturizado para identificao bioqumica de Listeria (opcional); cido nalidxico 1%; Acriflavina cloridrato 1%; Perxido de hidrognio 3%; Vermelho de metila 0,06%; Alfa-naftol 5%; Hidrxido de potssio 40%; cido sulfanlico 0,8%; Alfa-naftilamina 0,5%; Suplemento para caldo UVM (cido nalidxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L); Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L); Suplemento para gar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina 10,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Cefotetan 1,0mg/0,5L; fosfomicina 5,0mg/0,5L); Suplemento para gar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Ceftazidime 10,0mg/0,5L); Suplemento para caldo Fraser (citrato de amnio e ferro III 250mg/0,5L; acriflavina 12,5mg/0,5L; cido nalidxico 10mg/0,5L); P de Zinco; Xilose soluo aquosa 5%; Manitol soluo aquosa10%; Ramnose soluo aquosa 5%; Sangue desfibrinado de carneiro; Sangue desfibrinado de cobaio . OBS: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente disponvel), necessitando apenas a suspenso em diluente antes de seu uso. Verificar sempre a composio, comparando com aquela indicada nesta metodologia. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios alimentos. Estereoscpio com iluminao em ngulo de 45. de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da Amostra: Acrescentar alquota de 25 0,2 g ou mL da amostra preparada conforme Anexo V, 225 mL de caldo UVM adicionado de seu suplemento. OBS: Verificar a formulao do Caldo UVM ou LEB. Algumas marcas de caldo UVM j contm em sua formulao cido nalidxico e acriflavina. O caldo LEB j contm cido nalidxico, bastando a suplementao com 0,25 mL de soluo 1% de acriflavina. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Primeiro enriquecimento seletivo: Homogeneizar as alquotas preparadas conforme item 5.1 e incubar a 30 1C por 24 horas. 5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Aps a incubao, transferir 0,1 mL da cultura para tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessrio, com 0,1 mL do vial diludo conforme a indicao do fabricante.

OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio j pronto para o uso; outros fornecem o meio adicionado de cido nalidxico e de acriflavina, bastando a suplementao com citrato de amnio e ferro III (0,1 mL de soluo a 5% equivalente a 250 mg/0,5L de meio). Incubar a 30 1C por 24 a 48 horas. 5.5 Isolamento 5.5.1 Amostras de produtos crneos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno de colnias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios ATN e AP. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.5.2 Amostras de produtos lcteos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno de colnias isoladas. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.6 Seleo; Com auxlio de lupa ou estereoscpio com iluminao angular de 45, selecionar 3 a 5 colnias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal, colnias pretas rodeadas por halo escuro em AO. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal, colnias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colnias verdeacinzentadas, em AP. 5.7 Confirmao da presena de Listeria sp: Repicar o mesmo inculo para tubos com gar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 1C por 24 horas. Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do gar estoque para a realizao das provas de confirmao e identificao. 5.7.1 Prova da catalase Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de perxido de hidrognio 3%. Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presena de catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxignio (catalase positiva). Das culturas catalase positivas, fazer um esfregao para colorao de Gram. 5.7.2 Colorao de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de cocobacilo, Gram positivo. 5.7.3 Prova da motilidade tpica: Inocular uma alquota da cultura em gar motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biolgica de Oxignio) a 22-25C por 2 a 5 dias. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento. A Listeria sp apresenta crescimento mvel caracterstico em forma de guardachuva. 5.7.4 Prova de Reduo de Nitrato: Aps a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a 3 gotas de alfa-naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico a 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao meio alguns miligramas de p de zinco. Nesse caso, o aparecimento de colorao rosa indica reao

negativa e a no alterao de cor indica positividade. As culturas de Listeria sp no reduzem o nitrato. 5.7.5 Prova de VM-VP: Inocular tubos com caldo VM-VP e incubar a 36 1C, por 5 dias. Aps a incubao, pipetar alquotas de 5 e 1 mL da cultura para dois tubos estreis. No tubo contendo 5 mL adicionar 2 a 3 gotas de soluo de vermelho de metila a 0,06%. O aparecimento da cor vermelha indica reao VM positiva. No tubo contendo 1 mL, adicionar 0,6 mL de alfa-naftol soluo alcolica 5% e 0,2 mL de hidrxido de potssio soluo aquosa 40% (nesta ordem) e agitar. Deixar em repouso por 1 a 2 horas. O aparecimento da cor vermelha escura indica reao VP positiva. As culturas de Listeria sp apresentam reaes VM e VP positivas. 5.8 Identificao de Listeria monocytogenes: As culturas que tenham confirmado as caractersticas do gnero Listeria devero ser testadas para diferenciao entre Listeria monocytogenes e outras espcies por meio das seguintes provas bioqumicas: 5.8.1 Produo de -hemlise: Sobre a superfcie seca de gar sangue desfibrinado de cobaio ou carneiro (ACNS), estriar o inculo com ala ou semear com agulha, por picada. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. A reao positiva se traduz pelo aparecimento de zona clara transparente (hemlise) ao redor das colnias. As culturas de Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii e Listeria seeligeri so -hemolticas. OBS: A utilizao de sangue de cobaio desfibrinado nesta prova oferece a vantagem de zonas de hemlise mais claras, especialmente com culturas de L.monocytogenes fracamente hemolticas. 5.8.2 CAMP teste: Em gar Columbia com cido nalidxico adicionado de 5% de sangue de carneiro desfibrinado (CNAS), com auxlio de agulha ou ala de 1 L, traar uma linha perpendicular linha previamente semeada com S. aureus. Tomar o cuidado para que as linhas no se toquem. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dixido de carbono (CO2). As culturas de Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri produzem zona clara de hemlise total acentuada prximo linha de crescimento do Staphylococcus aureus. Opcionalmente, este teste pode ser feito com S. aureus e R. equi. Nesse caso, traar na placa de CNAS uma linha vertical com inculo de S. aureus e outra com R. equi, distantes alguns centmetros entre si. Semear as culturas teste em linhas horizontais entre as linhas de S. aureus e R. equi, mantendo distncia de cerca de 1,5 cm entre as linhas e cuidando que estas no toquem as linhas de S. aureus e R. equi. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dixido de carbono (CO2). Aps a incubao, examinar as placas para verificao de hemlise na zona de interao, prximo s linhas verticais. A atividade hemoltica de L. monocytogenes e L. seeligeri se apresenta aumentada prximo a linha de crescimento do S. aureus. As demais listerias apresentam reao de CAMP negativa com o S. aureus. A reao de CAMP produzida pela L. ivanovii com R. equi se caracteriza por ser mais intensa e se apresentar em forma de flecha. As L. innocua, L. welshimeri e L. grayi so nohemolticas e no apresentam reao de CAMP positiva com o S. aureus nem com o R. equi.

O CAMP teste diferencia L. ivanovii de L. seeligeri e pode diferenciar uma L. seeligeri, fracamente hemoltica, de L. welshimeri. Isolados que do reaes tpicas para L. monocytogenes, exceto para a produo de hemolisina, devem ser testadas para CAMP antes de serem identificadas como L. innocua (no hemoltica). A maioria dos isolados de L. monocytogenes produz tambm uma zona de intensificao da hemlise junto linha de crescimento do R. equi. 5.8.3 Fermentao de carbohidratos: Inocular 3 tubos com caldo vermelho de fenol-base, adicionados respectivamente, de xilose, manitol e ramnose. Incubar a 30 1C por 36 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. Alternativamente, esta prova pode ser realizada inoculando as culturas com agulha (em apenas um ponto) em 3 placas de gar para fermentao de carbohidratos adicionado de xilose, manitol e ramnose, respectivamente. A viragem de cor do indicador prpura de bromocresol (azul) para amarelo indica a fermentao do acar presente. As reaes tpicas das diversas Listeria sp esto representadas no quadro abaixo: LM + + V + + + LIVA + + + + + LINN V + + LW V + + + LS + + + + + LG + + +

-hemlise Red-NO3 CAMP Teste-SA CAMP Teste-RE Manitol Ramnose Xilose VM Gram

V= varivel AS = S.aureus RE = R.equi LM = L. monocytogenes; LIVA = L. ivanovii; LINN = L. innocua; LW = L.welshimeri; LS = L.seeligeri; LG = L. grayi 6. RESULTADOS 6.1 Interpretao: Considerar como Listeria monocytogenes as culturas que apresentarem reaes tpicas nas provas bioqumicas. 6.2 Expresso dos resultados: Expressar o resultado como: Pesquisa de Listeria monocytogenes: Presena/25 g ou mL; ou Pesquisa de Listeria monocytogenes: Ausncia/25 g ou mL Nota: sempre que as anlises laboratoriais demonstrarem a presena de outras espcies de Listeria, da rea reservada a observaes, do Certificado Oficial de Anlise, dever constar: Presena de Listeria, seguida do nome da espcie encontrada. Por exemplo: Presena de Listeria innocua, Presena de Listeria welshimeri ou outra. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT , R.W.; WEAVER, R.E. Seradiagnosis of Listeria monocytogenes. In: AOAC International. Bacterial Analytical Manual. 8. ed. Gaithersburg. Food and Drug Administration, 1995. p.11.01-11.08. RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),

Washington: American Public Health Association, 2001. p.63-67. HITCHINS A.D. Listeria monocytogenes . In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov MacFADDIN, J.F. Media for isolation - Cultivation - Identification-Maintenance of Medical Bacteria. John Buttler (Ed.) William & Wilkins. Baltimore. 1985. CAPTULO XV PESQUISA DE Salmonella 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Salmonella sp em amostras de alimentos, raes e ingredientes. Aplica-se a amostras de alimentos de origem animal, raes e ingredientes. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na incubao, a 36 1C por 16 a 20 horas, de 25 0,2 g ou 25 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente especfico para cada caso, estabelecido no item 5.1. Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos alimentos, capaz de promover estresse nas clulas de Salmonella, sem inativ-las biologicamente. Quando utilizada soluo salina peptonada tamponada, esta avorece a manuteno do pH, evitando que as bactrias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a recuperao das clulas de Salmonella. Para leite em p, segundo o FDA, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas. 2.2 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na utilizao de meios que contm substncias de ao impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes e na incubao em temperatura seletiva. O enriquecimento seletivo de Salmonella se faz obrigatoriamente nos meios lquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina. Adicionalmente, utiliza-se o caldo tetrationato. No caldo Rappaport Vassiliadis, a presena de verde malaquita e de cloreto de magnsio, associada temperatura de 41 0,5C por 24 a 30 horas, atua como agentes seletivos da microbiota acompanhante, enquanto a presena de peptona de farinha de soja estimula o crescimento de Salmonella. No caldo selenito-cistina, o agente inibidor selenito de sdio atua inibindo os coliformes e enterococos. Esse meio incubado a 41 0,5C por 24 a 30 horas. No caldo tetrationato, a seletividade conferida pelo tetrationato e pelo verde brilhante. 2.3 Isolamento e seleo: Baseia-se na seleo de colnias de Salmonella em, pelo menos, dois meios slidos: o gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) obrigatoriamente e outro gar de maior impedincia escolhido pelo laboratrio. No gar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente a inibio de Proteus sp. Esse meio apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. Como meio de maior impedincia, utilizar MLCB ou Rambach ou XLD ou XLT4 ou outro. No gar Rambach, a diferenciao entre Salmonella e outros microrganismos

promovida pela presena de propilenoglicol, e tambm de um cromgeno que evidencia a hidrlise da beta-galactosidase. No gar MLCB, a concentrao de ons Magnsio promove o crescimento de Salmonella. A presena de verde-brilhante inibe a flora acompanhante. Esse gar no utiliza a fermentao da lactose como sistema de identificao, o que possibilita a deteco de cepas de comportamento atpico no BPLS. A produo de H2S evidenciada pelo enegrecimento do centro da colnia. Cepas de Salmonella H2S negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella Pullorum e Salmonella Seftenberg, podem produzir colnias azuis. um meio que, associado ao caldo de enriquecimento Rappaport Vassiliadis, tem sua seletividade substancialmente aumentada. A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi no crescem nesse meio devido presena de verde-brilhante. 2.4 Identificao bioqumica: Baseia-se na evidenciao das propriedades fisiolgicas e metablicas das culturas suspeitas: por meio da verificao da presena de citocromo oxidase; deteco de pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett et. al (1999); produo de urease; fermentao da glicose, sacarose e lactose no meio TSI; deteco de beta-galactosidase; descarboxilao da lisina; produo de H2S; motilidade e produo de indol. Para confirmao final, em casos de dvida, realizam-se outras provas complementares, baseadas na inoculao das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos contendo substratos desidratados para cada teste so reidratados pela adio da suspenso do microrganismo teste em diluente especfico para esta finalidade. 2.5. Prova de soroaglutinao: Baseia-se na reao antgeno-anticorpo, com conseqente aglutinao do antgeno frente ao anti-soro para Salmonella polivalente O. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS); gar Rambach ou gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) ou gar XLD ou gar; XLT4 ou outro; gar ferro trs acares (TSI) ou gar Kligler (KIA); gar estoque; Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro - (LIA); Caldo uria ou gar uria; gar fenilalanina; Caldo selenito cistina; Caldo Rappaport Vassiliadis; Caldo tetrationato (adicional); Caldo VM/VP; Meio SIM; Sistema miniaturizado de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias; Soluo salina 0,85%; Soluo salina 2%; gua destilada estril; Soluo salina peptonada 1% tamponada; Soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% Tween 80; Soluo de -naphtol 5%;

Soluo de hidrxido de potssio 40%; Soluo de uria 40% estril; Soluo de iodo-iodeto; Reativo de Kovac's (opcional: reativo de Ehrlich); Verde brilhante soluo aquosa 0,1%; Cloreto frrico soluo aquosa 10%; Novobiocina soluo aquosa 4%; Soro anti Salmonella polivalente O; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; leo mineral, parafina lquida ou vaspar estreis; Reativos para prova da PYRase - cido L-piroglutmico 7- amino 4-metil cumarina (7 AMC) e Dimetilaminocinamaldedo; Tween 80. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao). de

5. PROCEDIMENTOS 5.1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada (ver excees na observao abaixo). Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Deixar 1 hora em temperatura ambiente. OBS: Para leite em p e soro de leite em p, utilizar como diluente gua destilada e adicionar 5 mL de verde brilhante soluo aquosa 0,1%. Para produtos gordurosos (creme e manteiga) utilizar como diluente soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80. Para os demais alimentos, utilizar soluo salina peptonada 1% tamponada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Pr-enriquecimento: O pr-enriquecimento se realiza por meio da incubao das alquotas das amostras preparadas conforme item 5.1, a 36 1C por, no mnimo, 16 horas e no mais que 20 horas. 5.4 Enriquecimento seletivo: A partir do procedimento de pr-enriquecimento estabelecido em 5.3, inocular, simultaneamente, nos meios lquidos seletivos conforme abaixo: 5.4.1 Inoculao em caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetar alquotas de 0,1 mL das amostras pr-enriquecidas para tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.4.2 Inoculao em caldo selenito cistina: Pipetar alquotas de 1 mL das amostras pr-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo selenito cistina. Incubar os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas.

5.4.3 Inoculao em caldo tetrationato (adicional): Pipetar alquotas de 1 mL das amostras pr-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo tetrationato. Incubar os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.5 Isolamento: A partir dos caldos seletivos de enriquecimento, repicar sobre a superfcie previamente seca de placas com cada meio slido seletivo, estriando de forma a se obter colnias isoladas. Dessa forma sero obtidas 2 placas de BPLS, uma originria do caldo Rappaport Vassiliadis e outra originria do caldo selenito cistina e 2 placas do segundo meio seletivo utilizado pelo laboratrio, obtidas do mesmo modo. Incubar todas as placas, invertidas, a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.6 Seleo: Selecionar de 3 a 10 colnias suspeitas por amostra, conforme caractersticas descritas em 5.6.1. 5.6.1 Caractersticas das colnias tpicas ou suspeitas de Salmonella nos diferentes meios slidos. Em gar BPLS, as colnias apresentam-se incolores ou de cor rosada, entre translcidas a ligeiramente opacas. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose, podem apresentar-se de cor verde-amarelada. Em gar Rambach, apresentam-se de cor vermelha. Alguns sorovares podem se apresentar com colorao rosa claro, de cor pssego ou amarelas (cor de gema). Em gar MLCB, apresentam-se negras, convexas, lisas e brilhantes, com bordas regulares. As colnias de Salmonella Pullorum e de Salmonella Gallinarum apresentam-se de tamanho pequeno (cerca de 1 mm), de cor azul intensa ou violeta. 5.7 Provas Bioqumicas: As colnias selecionadas devem ser repicadas em gar no seletivo e incubadas a 36 1C por 18 a 24 horas, a fim de verificar sua pureza. 5.7.1 Provas bioqumicas preliminares: Como bateria mnima para identificao de Salmonella, devem ser realizadas as seguintes provas bioqumicas: 5.7.1.1 Produo de urease: Semear maciamente em caldo ou gar uria. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Observar a colorao do meio. A manuteno da cor inicial do meio indica que no ocorreu hidrlise da uria. A alterao para rosa intenso indicativa de alcalinizao do meio devido ao da urease sobre a uria. Salmonella no produz urease. 5.7.1.2 Reaes em gar TSI ou gar Kligler (KIA): Inocular o gar atravs de picada profunda e estriamento na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. No gar TSI, esto presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose (10,0 g/L). Como a glicose um monossacardeo e est em baixa concentrao, ser rapidamente fermentada anaerobiamente, formando cido no fundo do tubo, o que torna o meio amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol (todos os membros da famlia Enterobacteriaceae fermentam a glicose com produo de cido). A fermentao aerbia da glicose, que ocorre na superfcie do bisel, resulta em cido pirvico, que posteriormente degradado a CO2 e gua. A grande maioria das salmonelas no fermenta a sacarose e a lactose, no provocando alteraes no meio TSI (que contm esses dois acares; j no KIA, a sacarose no est presente). Como a fonte de carbono utilizvel (glicose) rapidamente esgotada, a Salmonella passa a degradar aerobiamente o substrato protico do meio, produzindo amonaco (NH3), o que confere ao meio um pH alcalino, modificando a colorao do bisel para rosa intenso. A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reaes:

cido na base, com ou sem produo de gs. Alcalino ou inalterado no bisel. Com produo de H2S. 5.7.1.3 Descarboxilao da lisina: Utilizar caldo lisina ou gar LIA. Inocular o caldo lisina e adicionar selo estril (vaspar, vaselina, parafina), visando evitar o contato do meio com o ar e o conseqente aparecimento de uma falsa alcalinizao na superfcie do meio por degradao aerbia do substrato protico. Quando usar o gar, inocular atravs de picada profunda, estriando na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Observar se ocorreu descarboxilao da lisina pela alcalinizao do meio, o que demonstrado pela no alterao de cor do indicador presente. A atividade da enzima lisina descarboxilase dependente do pH, sendo mais ativa em pH abaixo de 5,5. A acidificao do meio obtida pela fermentao da glicose presente. Nessa etapa do processo, ocorre a viragem do indicador prpura de bromocresol, de violeta para amarelo. recomendvel a inoculao de um tubo controle de caldo base para descarboxilao sem lisina, para comprovao da acidificao pela fermentao da glicose. Esse tubo deve permanecer amarelo at o final do perodo de incubao. Na condio anaerbia, obtida pelo uso da camada de selo (no caldo lisina) ou na base (do LIA), todo o oxignio no combinado consumido pelo microrganismo presente, na fase inicial de crescimento. A descarboxilao da lisina, que ocorre posteriormente, resulta na produo de uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio caractersticas de alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para violeta. A diamina cadaverina estvel quando produzida em condies anaerbias. A maioria das salmonelas capaz de produzir lisina descarboxilase. Quatro por cento das cepas de Salmonella no descarboxilam a lisina. A Salmonella paratyphi A e alguns outros sorovares no produzem lisina descarboxilase. 5.7.1.4 Meio SIM: Inocular com picada o meio de cultura. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. A motilidade caracterizada pela difuso do crescimento por todo o meio. Se for restrito linha de semeadura, indica que o microrganismo imvel. A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella Gallinarum e a Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa. O meio SIM o meio mais indicado para a verificao da produo de H2S. O H2S um gs incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela reduo do tiosulfato presente no meio. A revelao da presena de H2S se realiza por meio da reao do H2S com o citrato de ferro e amnio (presente no meio), formando um precipitado negro insolvel. Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de Salmonella Paratyphi A no produzem H2S. A maioria das salmonelas produz H2S . Quatorze por cento das cepas de Salmonella so H2S negativo. Aps a leitura da motilidade e da produo de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de Kovacs (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para verificar se houve produo de indol. A oxidao do triptofano presente no meio SIM leva formao de trs principais compostos: indol, escatol e indolacetato. A adio do reativo de Kovacs resulta na formao de um anel vermelho, resultante da reao entre o indol e o dimetilaminobenzaldedo contido nesse reativo.

Quase a totalidade das salmonelas no produz indol. Segundo Weissfeld et al (1994), cerca de 1% das salmonelas produzem indol. 5.7.1.5 Prova da Oxidase: Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur, estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de Oxidase, disponveis comercialmente. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. Todas as salmonelas apresentam reao de oxidase negativa. 5.7.2 Provas bioqumicas complementares opcionais 5.7.2.1 Desaminao da fenilalanina Inocular a superfcie do gar fenilalanina por estriamento. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Adicionar 2 a 3 gotas de soluo de cloreto frrico 10%. A alterao da colorao da cultura na superfcie do bisel para verde indica reao de desaminao da fenilalanina. Salmonella no desamina a fenilalanina. 5.7.2.2 Reao de Voges-Proskauer Inocular o caldo VM-VP em duplicata. Incubar um dos tubos a 36 1C por, pelo menos, 24 horas. O outro tubo deve ser incubado a 22 1C, por 96 horas. Adicionar primeiramente 0,6 mL de soluo de -naphtol 5% e, em seguida, 0,2 mL de soluo de hidrxido de potssio 40%. Agitar os tubos para que haja oxigenao do meio. Aguardar de 10 a 15 minutos. A alterao da cor para rosa intenso indica reao de VP positiva. Hafnia alvei apresenta reao positiva a 22 1C e resultado varivel a 36 1C. Salmonella apresenta reao negativa para VP nas duas temperaturas. 5.7.2.3 Deteco da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase) A partir das culturas em gar estoque que apresentaram resultados compatveis com Salmonella, realizar o teste da presena da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita sobre carto impregnado com cido Lpiroglutmico, substrato que ser hidrolisado pela PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste. Para revelar a hidrlise do cido L-piroglutmico, adicionar sobre o carto algumas gotas de para-dimetilaminocinamaldedo, o que, nos casos positivos, resultar no desenvolvimento de colorao vermelha. Esta prova destina-se diferenciao entre Citrobacter e Salmonella. Todas as cepas de Citrobacter sp produzem a enzima pirrolidonil peptidase (reao positiva). Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella no produzem essa enzima (reao negativa). 5.7.3 Comportamentos atpicos de Salmonella Algumas cepas de Salmonella podem apresentar as seguintes reaes atpicas: fermentao da lactose (bisel do TSI e KIA cido); fermentao da sacarose (bisel do TSI cido); no produo de H2S (SIM sem H2S, TSI/KIA sem H2S);

no descarboxilao da lisina (meio cido); produo de indol (reao positiva no SIM). 5.8 Reao sorolgica frente ao anti-soro polivalente O Ressuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de soluo salina 0,85%. Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de soluo salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos. Classificar a reao do seguinte modo: Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + anti-soro; Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas; No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas). As culturas que apresentarem resultados compatveis com Salmonella, porm incapazes de assegurar sua identificao por meio da sorologia, devero ser reisoladas em gar no-seletivo e serem novamente submetidas reao sorolgica. 5.9 Provas opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 6. RESULTADOS 6.1 Interpretao: Emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as culturas apresentarem reaes tpicas nas provas bioqumicas e reao sorolgica positiva frente ao anti-soro polivalente O. As culturas que apresentarem perfil bioqumico compatvel com Salmonella e que no reagirem frente ao anti-soro polivalente O ou apresentarem reao inespecfica devem ser identificadas por mtodo molecular ou remetidas para uma Instituio de Referncia, para concluso do resultado. 6.2 Sorotipificao: Remeter as culturas identificadas como Salmonella a uma Instituio de Referncia no pas, designada pela Coordenao de Laboratrio Animal (CLA) para sorotipificao. Manter no laboratrio as culturas isoladas de Salmonella, adequadamente identificadas. Manter registro de todas as confirmaes sorolgicas realizadas pela Instituio de Referncia. 6.3 Expresso dos resultados Expressar o resultado como: Pesquisa de Salmonella : PRESENA/25 g ou mL; ou Pesquisa de Salmonella : AUSNCIA/25 g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ANDREWS, W.H.; FLOWERS, R.S.; SILLIKER, J.; BAILEY, J.S. Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.357-380. ANDREWS, W.H.; HAMMACK, T.S. Salmonella. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. BENNETT, A.R.; MaCPHEE, S.; BETTS, R.; POST, D. 1999. Use of pyrrolidonyl

peptidase to distinguish Citrobacter from Salmonella. Letters in Applied Microbiology, Oxford. 28: 175-178. ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993. CAPTILO XVI PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAO IMUNOMAGNTICA (IMS) 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Salmonella sp., pelo mtodo de separao imunomagntica. Aplica-se em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou 25 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente especfico para cada caso, a 36 1C por 16 a 20 horas. Este procedimento visa minimizar os efeitos do processo tecnolgico capaz de promover injria celular fisiolgica, sem inativar biologicamente a clula. Quando utilizada soluo salina peptonada 1% tamponada, o tampo utilizado favorece a manuteno do pH, o que assegura melhor recuperao das clulas de Salmonella. Para leite em p, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas. 2.2 Separao imunomagntica: Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao por ao de foras magnticas. A aplicao destas duas aes leva obteno de efeitos de concentrao e purificao do microrganismo alvo. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsorso ou acoplamento de vrias molculas, onde esto ligados anticorpos monoclonais especficos para Salmonella.. 2.2.1 Lavagem das microesferas (beads): Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados s partculas imunomagnticas. 2.3 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada em meio que contm substncias de ao impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes, e incubao em temperatura seletiva de 41 0,5C por 18 a 24h. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Partculas imunomagnticas de 280 nm cobertas com anticorpo anti-Salmonella (beads); gar Rambach; gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS); gar ferro trs acares (TSI) ou gar ferro dois acares Kligler (KIA); gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB);

gar estoque; Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro (LIA); Caldo uria ou gar uria; Caldo Rappaport Vassiliadis (RV); Meio SIM; Soluo salina 0,85%; Soluo salina 2%; Soluo salina peptonada tamponada, pH 7,2 (PBS); gua destilada estril; Soluo salina peptonada 1% tamponada; cido clordrico 0,1N; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Reativo de Kovacs (ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich); Verde brilhante soluo aquosa 0,1%; Cloreto frrico soluo aquosa 10%; Novobiocina soluo aquosa 4%; Soro anti-Salmonella polivalente O; Soluo salina peptonada 1% tamponada adicionada de 0,02% de tween 20; leo mineral, vaspar ou parafina lquida estreis. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia; Misturador de amostras; Separador imunomagntico; Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e respectivas ponteiras com barreira. 5. PROCEDIMENTO 5.1 Preparo da amostra: Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 5.2 Pr-enriquecimento; Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 5.3 Separao imunomagntica; De cada amostra pr-enriquecida, transferir uma alquota de 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada, com capacidade de 1,5 mL. Adicionar a cada eppendorf 20 microlitros de partculas imunomagnticas de 280nm cobertas com anticorpo especfico para Salmonella (beads). Aps homogeneizao por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos, em baixa velocidade. Em seguida colocar os tubos no separador com a barra magntica j acoplada no suporte, onde devem permanecer por 10 minutos. Sem retirar os tubos do separador magntico, retirar todo o lquido dos tubos eppendorf com o auxlio de pipetas Pasteur, ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante testado e aprovado. Retirar a barra magntica do suporte do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada, adicionada de 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses.

Recolocar a barra magntica no suporte do separador e deixar por mais 5 minutos. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante aprovado. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS. 5.4 Enriquecimento seletivo e pr-isolamento: Inocular a FIS, obtida conforme item 5.3, em tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.5 Isolamento, seleo e identificao bioqumica e sorolgica Proceder conforme Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 6. RESULTADOS Proceder conforme Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA DYNAL. Cell separation and protein purification technical handbook. 2 ed. Oslo: DYNAL, 1996. 165p. ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993. OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOV, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. CAPTULO XVII PESQUISA DE Vibrio cholerae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a pesquisa de Vibrio cholerae em alimentos; A metodologia para deteco de Vibrio cholerae destina-se verificao da presena deste patgeno em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na recuperao das clulas, fisiologicamente lesadas ou no, e crescimento em meio no seletivo. 2.2 Etapa presuntiva: Baseia-se no isolamento das colnias em meio slido seletivo, gar TCBS, e em meio no seletivo, gar gelatina, e posterior incubao a 36 1C, sendo as colnias tpicas submetidas identificao bioqumica. O gar TCBS apresenta, em sua composio, elevada concentrao de tiosulfato e citrato de sdio, alm de ser altamente alcalino, inibindo assim o crescimento das enterobactrias. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol, que provocam a mudana de colorao do meio para amarelo quando da fermentao da sacarose presente no meio, com conseqente formao de cido. 2.3 Provas de identificao: A identificao de Vibrio cholerae feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas e tintoriais.

3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar sal triptona (T1N1); gar ferro dois acares (gar Kligler); gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (gar TCBS); gar soja triptona (TSA); gar gelatina (AG); gua peptonada alcalina pH 8,5 0,1; Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo vermelho de fenol base; Caldo gelatina fosfato sal (GPS); Caldo vermelho de fenol manitol; Caldo vermelho de fenol sacarose; Meio O/F Hugh-Leifson; Bacto Vibrio cholerae - anti-soro polivalente; Arabinose; Desoxicolato de sdio; L-arginina; L-inositol; L-lisina; L-ornitina; Manitol; Manose; Reativo para oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou tiras para teste de oxidase; Etanol 96%; Reagentes para colorao de Gram; leo mineral estril. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Enriquecimento: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar, separadamente, 25 0,2 g da amostra em dois recipientes estreis. Adicionar 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5 a um dos recipientes e 225 mL de caldo gelatina fosfato sal (GPS) ao outro. Homogeneizar, no mximo por 60 segundos em stomacher. Incubar os caldos a 36 1C por 6 a 8 horas. Para amostras de ostras, inocular um terceiro recipiente com 25 0,2 g de amostra e 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5, que dever ser incubado por 6 a 8 horas a 42 0,2C. No agitar os frascos aps a incubao. 5.2 Procedimentos de controle; Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Inoculao; Aps a incubao, com auxlio de ala de nquel-cromo descartvel, estril ou de platina, transferir uma alada de 3 mm de dimetro, retirada da superfcie de cada cultivo, para placas de gar tiosulfato citrato sais biliares sacarose (TCBS) e de gar gelatina (AG). Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 5.4 Leitura; Verificar o aparecimento de colnias tpicas. No gar TCBS, as colnias de Vibrio cholerae apresentam-se com colorao amarela, ligeiramente elevadas no centro, com bordas translcidas e 2 a 3 mm de dimetro. Algumas cepas lento-fermentadoras da sacarose se apresentam verdes no TCBS, aps 24 horas de incubao. No gar gelatina, as colnias de Vibrio cholerae apresentamse como colnias transparentes com uma zona opaca ao seu redor que, geralmente, torna-se mais ntida aps alguns minutos sob refrigerao. 5.5 Provas preliminares para a identificao do Vibrio cholerae 5.5.1 Preparo do inculo: Selecionar 3 ou mais colnias de cada placa dos diversos meios. Repicar cada colnia para um tubo com gar sal triptona (T1N1) inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. 5.5.2 String Test; Colocar uma gota (grande) de soluo de desoxicolato de sdio 0,5 % sobre uma lmina. Retirar uma alada da cultura mantida em T1N1 inclinado (5.5.1) e suspend-la na gota. O aparecimento, em cerca de um minuto, de uma massa mucide, que forma um filamento quando a ala suspensa a uma altura de 2 a 3 cm da lmina (string test positivo), presuntivo da presena de Vibrio cholerae. 5.5.3 Prova da oxidase. Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur, estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. O Vibrio cholerae oxidase positiva. 5.5.4 Colorao de Gram: A partir da cultura mantida em T1N1, fazer um esfregao e corar pelo mtodo de Gram, de acordo com as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. O Vibrio cholerae apresenta-se como bastonete Gram negativo, reto ou curvo. 5.5.5 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que forem oxidase positiva, "String Test" positivo e se mostrarem ao microscpio como bastonetes Gram negativos, retos ou curvos. 5.6 Provas para a identificao de Vibrio cholerae 5.6.1 Teste do halofilismo: A partir da cultura mantida em T1N1, com auxlio de

agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular tubos contendo caldo peptonado sem sal, tubos contendo caldo peptonado sal 3% e caldo peptonado sal 6%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio cholerae cresce na ausncia e na presena de 3% de sal e no cresce na presena de 6% de sal. Esta prova permite a diferenciao entre Vibrio cholerae e Vibrio alginolyticus, pois o primeiro cresce na ausncia de sal, o que no acontece com o segundo. Observao: Reservar o tubo com o caldo peptonado sal 3%, que servir de inculo para outras provas de identificao. 5.6.2 gar ferro dois acares (Kligler): A partir das culturas mantidas em T1N1, com auxlio de uma agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular o gar Kligler mediante picada central profunda, estriando na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Neste meio, o Vibrio cholerae fermenta a glicose presente, produzindo a acidificao da base (amarela), sem produo de gs (sem bolhas) nem de H2S (sem enegrecimento). Por no metabolizar a lactose, produz uma alcalinizao no bisel (vermelho). 5.6.3 Fermentao da sacarose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol-sacarose. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio cholerae fermenta a sacarose. 5.6.4 Descarboxilao da lisina: A partir do inculo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, inocular um tubo contendo caldo lisina. Inocular tambm um tubo de meio base (sem lisina), que servir de controle para a produo de cido a partir da glicose contida no meio. Cobrir os tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo lisina, no inoculado e coberto por leo, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae descarboxila a lisina. 5.6.5 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio de provas adicionais. Kligler - Bisel vermelho (alcalino) Kligler - Base amarela sem gs (cida) Kligler - Sem enegrecimento (H2S negativo) Sacarose - Positiva Lisina descarboxilase - Positiva Caldo peptonado sem sal - Crescimento Caldo peptonado sal 3% - Crescimento Caldo peptonado sal 6% - Sem crescimento 5.7 Provas adicionais para a identificao do Vibrio cholerae

5.7.1 Prova de Hugh-Leifson glicose (Meio O/F): A partir do inculo mantido em T1N1, com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular dois tubos contendo meio de Hugh-Leifson glicose. Cobrir um dos tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de gs nos tubos de Durhan. A cor amarela em ambos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio cholerae fermenta a glicose sem produo de gs, por isto ambos os tubos devem apresentar colorao amarela, sem gs. 5.7.2 Prova da fermentao do manitol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao do manitol. O Vibrio cholerae fermenta o manitol. 5.7.3 Prova da fermentao da arabinose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao da arabinose. O Vibrio cholerae no fermenta a arabinose, portanto o meio deve permanecer vermelho. 5.7.4 Prova da fermentao da manose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manose. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao da manose. O Vibrio cholerae fermenta a manose. 5.7.5 Prova da fermentao do inositol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol inositol. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao do inositol. O Vibrio cholerae no fermenta o inositol, portanto o meio deve permanecer vermelho. 5.7.6 Prova da descarboxilao da ornitina: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo ornitina. Semear tambm um tubo de meio base (sem ornitina) para controle. Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo ornitina no inoculado e com leo, que servir de controle negativo.

Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da ornitina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae descarboxila a ornitina. 5.7.7 Prova da hidrlise da arginina: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo arginina. Semear tambm um tubo de meio base (sem arginina) para controle. Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina no inoculado e leo, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae no hidrolisa a arginina, portanto ambos os tubos devem permanecer amarelos. 5.7.8 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio do teste sorolgico. Hugh-Leifson (Meio O/F) glicose - Fermentativo Fermentao do manitol - Positivo Fermentao da arabinose - Negativo Fermentao da manose - Positivo Fermentao do inositol - Negativo Descarboxilao da ornitina - Positivo Hidrlise da arginina - Negativo 5.8 Teste sorolgico: Marcar duas sees de aproximadamente 1 x 2 cm no interior de uma placa de Petri ou em uma lmina de vidro de 2 x 3 polegadas ou em uma placa Huddleson. Colocar uma pequena quantidade da cultura, crescida em gar T1N1 inclinado, diretamente sobre a placa ou lmina, na regio marcada. Adicionar uma gota de soluo salina 0,85% na parte inferior de cada uma das regies marcadas. Com auxlio de uma ala ou agulha de nquel-cromo ou de platina, suspender a cultura com soluo salina em cada seo. Adicionar uma gota do anti-soro polivalente de Vibrio cholerae a uma das sees com a suspenso da cultura e misturar com a ala. A outra seo contendo antgeno somente um controle de autoaglutinao. Observar a reao em 1 minuto contra um fundo escuro. Uma reao positiva indicada por uma aglutinao rpida e forte. Enviar as culturas que se comportem como Vibrio cholerae, em gar estoque, para tipificao Instituio de Referncia designada pela CLA. 6. RESULTADO Sero consideradas como positivas para Vibrio cholerae as culturas que apresentarem os resultados esperados tanto nas provas adicionais de identificao quanto no teste sorolgico. Expressar o resultado como: Pesquisa de Vibrio cholerae: Presena/25g ou mL; ou

Pesquisa de Vibrio cholerae: Ausncia/25g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ICMSF. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microorganismos de los Alimentos Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. V.1. 2.ed. Acribia, Zaragoza - Espanha. ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others vbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KAYSNER, C.A.; DePAOLA, A. Vibrio . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001, p. 405 - 420. CAPTULO XVIII PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento analtico para a pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em alimentos e gua. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou mL da amostra em soluo salina peptonada tamponada adicionada de vancomicina, cefixime e cefsulodin (SPT-VCC), por 6 horas em temperatura de 36 1C. O efeito seletivo exercido pela associao de vancomicina, cefixime e cefsulodin, que visa inibio da flora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp. 2.2 Separao imunomagntica: Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao por ao de foras magnticas. A aplicao dessas duas aes leva obteno de efeitos de concentrao e purificao do microrganismo-alvo. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsorso ou acoplamento de vrias molculas onde esto ligados anticorpos policlonais anti E coli O157. Na lngua inglesa, estas microesferas so denominadas de beads. 2.2.1 Lavagem das microesferas: Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados s partculas imunomagnticas. 2.3 Isolamento: Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada sobre a superfcie seca de gar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as clulas aderidas s microesferas formem colnias. Normalmente mais de uma clula se adere a cada partcula imunomagntica, o que pode resultar em colnias originrias de mais do que uma clula aderida. No gar MCS, o efeito seletivo exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta presentes no meio, que atuam inibindo a flora Gram positiva. A fermentao do sorbitol evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho intenso. 2.4 Identificao bioqumica: Baseia-se na inoculao das culturas suspeitas em

uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada teste, so reidratados pela adio da suspenso do microrganismo teste em diluente especfico para esta finalidade. Durante a incubao a 36 1C, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanas de colorao dos indicadores contidos no substrato. Novobiocina; Soluo aquosa de Cefixime 1%; Soluo de Sorbitol 10%; Soluo de Celobiose 10%; Soluo de Dulcitol 10%; Reativo para oxidade (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Cloreto frrico; Reativo de Kovacs(ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich); Hidrxido de potssio; Alfa naftilamina 0,5%; Alfa naftol; cido sulfanlico 0,8%; Soluo aquosa de Cloreto de Clcio 10 mmol; Partculas imunomagnticas de 280nm cobertas com anticorpo antiEscherichia coli O157; Sistema miniaturizado para identificao de Enterobactrias. Em alguns testes, a leitura final somente se realiza aps a adio de reativos especficos. 2.5 Ltex teste O ltex-teste para identificao de Escherichia coli O157 consiste de dois reagentes base de ltex. O primeiro formado por partculas de ltex, cobertas com anticorpo especfico produzido em coelho (ltex reagente); o segundo o reagente controle, que formado por partculas de ltex, cobertas com globulinas de coelho primune (ltex controle). Quando cultivos de Escherichia coli O157 so submetidos ao ltex-teste, ocorre aglutinao do ltex-reagente e no do ltex-controle. 2.6 Provas complementares Outras provas complementares so realizadas com a finalidade de identificar e diferenciar Escherichia coli O157:H7 de outros membros de sua espcie, tais como motilidade, produo de -Dglicuronidase, e fermentao de carboidratos. A verificao da produo de -hemolisina destina-se obteno de um indicativo sobre a verocitotoxigenicidade do isolado, j que existe uma forte correlao positiva entre a produo desta hemolisina e de verotoxina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e outros materiais bsicos para laboratrios de microbiologia de alimentos; gar MacConkey-sorbitol (MCS); gar eosina azul de metileno (EMB); gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); gar soja triptona, com CaCl2 e eritrcitos lavados de carneiro (ASSTCa); gar soja triptona; gar estoque; gar motilidade; Soluo salina peptonada tamponada com vancomicina, cefsulodin e cefixime (SPT - VCC);

MUG);

Caldo verde brilhante-bile-lactose 2% - metilumbeliferil-glicurondeo (BRILACaldo verde brilhante-bile-lactose 2%; Caldo vermelho de fenol-base; Caldo soja triptona; Caldo EC modificado com novobiocina (Caldo EC + n); Soluo salina tamponada pH 7,2; Soluo salina tamponada 1% adicionada de 0,02% de tween 20; Soluo salina 0,85%; Soluo salina peptonada 0,1%; Meio SIM; Soluo aquosa de Vancomicina 0,8%; Soluo aquosa de Cefsulodin 1%;

4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios para laboratrios de microbiologia; Cmara UV (366 nm); Misturador de Amostras; Separador Imunomagntico; Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e ponteiras correspondentes, com barreira. 5.PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar assepticamente 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL de amostra em sacos de stomacher ou frascos Erlenmeyer estreis, seguindo as orientaes contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Pr-enriquecimento: A cada alquota adicionar 225 mL de SPT-VCC e incubar por 6 horas a 36 1C. 5.4 Separao imunomagntica: Aps as 6 horas de incubao, de cada amostra pr-enriquecida, transferir 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada. Adicionar a cada eppendorf 20 L de beads 280nm cobertas com anticorpo policlonal antiEscherichia coli O157. Aps homogeneizao, por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos em baixa velocidade. Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magntico j acoplado, onde devem permanecer por 5 minutos. Sem retirar os tubos do separador magntico, extrair todo o lquido dos tubos eppendorf, com o auxlio de pipetas Pasteur ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante. Retirar o suporte magntico do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada - 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses. Recolocar o suporte magntico no separador e deixar por mais 5 minutos. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional

com PBS sem tween, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS. 5.5 Semeadura, seleo e isolamento: Inocular no centro de uma placa com gar MCS, previamente seca, 10 L da FIS. Espalhar com auxlio de ala de Drigalski ou basto tipo hokey. Partindo dos 10 L restantes da FIS, inocular com ala de 1 L sobre outra placa com gar MCS, de forma a obter colnias isoladas. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar BEM. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 18 a 24h. Aps o perodo de incubao, observar a pureza e caractersticas das culturas e, quando necessrio, reisolar em superfcie seca de gar MCS. Quando, aps dois procedimentos de reisolamento, no forem obtidos cultivos puros, repicar para tubos com caldo EC+n, ou com caldo verde brilhante bile lactose 2% e incubar por 18 a 24 horas a 36 1C, inoculando posteriormente sobre a superfcie seca de gar MCS e de gar EMB, independentemente da produo de gs nos tubos de Durhan. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar EMB. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.6 Teste da oxidase: A partir dos cultivos puros em gar estoque inclinado, usando palitos de madeira estreis ou de plstico descartvel, ala de platina ou pipeta de Pasteur, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase (podem tambm ser utilizadas tiras para oxidase, comercialmente disponveis). O aparecimento de cor azul intensa (N N N N -tetrametil-parafenilenodiamina) ou vermelho escuro (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou de ao para realizar a prova de oxidase. Todas as cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam resultado negativo na prova de oxidase. As culturas que apresentam resultado positivo no pertencem famlia Enterobacteriaceae, portanto no necessitam ser submetidas a testes complementares para Escherichia coli 0157:H7. 5.7 Teste de aglutinao de ltex: Submeter as culturas puras obtidas conforme item 5.5 ao teste de aglutinao de ltex, suspendendo-as em duas gotas de soluo salina colocadas sobre o carto de teste que acompanha o kit. primeira, misturar uma gota do ltex reagente e sobre a outra uma gota do ltex controle. Misturar por um minuto e observar aglutinao. Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem aglutinao apenas no ltex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os controles que acompanham o kit.

As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinao de ltex devem ser descartadas. 5.8 Testes adicionais 5.8.1 Verificao da motilidade das culturas suspeitas.: A partir das culturas puras, em gar estoque inclinado, que apresentarem reao positiva frente ao ltex reagente e negativa frente ao ltex controle, repicar para tubos contendo gar motilidade modificado, utilizando agulha de inoculao. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade positiva) ou apenas na linha de inoculao (motilidade negativa). As cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa. 5.8.2 Verificao da produo de -D-glicuronidase e de gs em caldo BRILAMUG. A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG), com tubos de Durhan invertidos. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Observar a produo de gs nos tubos de Durhan. Anotar os resultados. Em cmara de UV (366nm), verificar a formao de 4-metilumbeliferona a partir do MUG. Considerar como positivo para -Dglicuronidase as culturas que produzirem fluorescncia no meio de cultura. A Escherichia coli O157:H7 no produz -D-glicuronidase, portanto no se observa fluorescncia no caldo BRILA-MUG. A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescncia (reao positiva) neste meio. OBS: A cultura de E.coli O157:H7 ATCC 43888 (no toxignica) no produz gs no caldo verde brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157:H7 verotoxignicas ATCC 43889, ATCC 43890 e ATCC 43894 so capazes de produzir gs neste meio. 5.8.3 Verificao da fermentao do sorbitol, da celobiose e do dulcitol A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 mL de caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de dulcitol (esterilizados por filtrao), de forma a obter uma concentrao final do acar de 0,1%. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 30 horas. Aps incubao, observar a produo de cido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas culturas fermentadoras dos acares presentes. Os resultados esperados esto na tabela abaixo: Cultura Escherichia Escherichia Escherichia Escherichia Sorbitol + Celobiose + + -* Dulcitol + -/+

coli O157:H7 hermannii fergusonii coli

: 60% so pos. -/+ : 19% so positivas -*: 2% so positivas 5.8.4 Verificao da produo de enterohemolisina: A partir das culturas puras obtidas conforme item 5.5, repicar em estrias para a superfcie seca de gar soja triptona, com cloreto de clcio e eritrcitos de carneiro (ASSTCa). Para preparar o ASSTCa, a cada 100mL de gar soja triptona adicionar 1 mL CaCl2 1M e 5 mL de eritrcitos lavados de carneiro. Incubar a 36 1C por 4 horas. Verificar atividade hemoltica e registrar os resultados obtidos. Reincubar at 24 horas repetindo a leitura.

Considerar como positivas para produo de enterohemolisina as culturas que no produzirem hemlise em 4 horas e apresentarem reao hemoltica caracterstica de alfa-hemolisina (colorao esverdeada ao redor das colnias) aps 24 horas de incubao. A grande maioria das cepas de Escherichia coli O157:H7 verotoxignicas so alfa-hemolticas. 5.9 Provas Opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 5.9.1 Sistema miniaturizado para identificao de enterobactrias: Repicar, para tubos com gar estoque inclinado, as culturas que apresentaram reao positiva frente ao ltex reagente, negativas frente ao ltex controle, motilidade positiva, -Dglicuronidase negativa, com ou sem produo de gs a partir da lactose, no fermentadoras do sorbitol e da celobiose, e capaz de fermentar o dulcitol. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Seguir as recomendaes do fabricante do sistema utilizado. 6. RESULTADOS Considerar o resultado positivo para Escherichia coli O157:H7 as amostras em que os isolados se comportarem como abaixo descrito: a) Colnia caracterstica de E.coli em VRBA e BEM; b) Sorbitol negativo no MCS; c) Celobiose negativa no caldo vermelho de fenol; d) Dulcitol positivo no caldo vermelho de fenol; e) Sorbitol negativo no caldo vermelho de fenol; f) Aglutinao positiva frente ao ltex reagente em um minuto; g) Aglutinao negativa frente ao ltex controle; h) Motilidade positiva. i) -D-glicuronidase negativa j) No hemoltica em 4 horas k) Alfa-hemoltica em 24 horas (presuntivo para verotoxina) l) Perfil bioqumico correspondente a Escherichia coli no sitema para identificao de enterobactrias. As culturas que se comportarem como Escherichia coli O157:H7 devem ser mantidas pelo laboratrio e encaminhadas Instituio de Referncia para enterobactrias, designada pela CLA para sorotipificao, inclusive com soro flagelar H7, e teste de verotoxigenicidade. Os resultados de confirmao sorolgica e de verotoxigenicidade podem demorar um tempo relativamente grande. Por este motivo, emitir o resultado de anlise considerando os resultados obtidos no laboratrio. Quando o resultado sorolgico confirmar a presena de E.coli O157:H7 (verotoxignica ou no), comunicar por escrito ao responsvel pelo SIF que encaminhou a amostra para anlise. Manter arquivo de todas informaes sorolgicas realizadas pela Instituio de Referncia. 6.1 Expresso do resultado; Expressar o resultado como: Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Presena /25 g ou mL; ou Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Ausncia/25 g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, A.R.; MacPHEE, S. BETTS, R.P. The isolation and detection of

Escherichia coli O157:H7 by use of immunomagnetic separation and immunoassay procedures. Letters in Applied Microbiology. Oxford; v. 22, p. 237-243, 1996. BEUTIN, L.; MONTENEGRO, M.A.; OSKOV, I. et al. Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. Washington; v. 27, p. 2559-2564, 1989. CHAPMAN, P.A. Evaluation of commercial latex slide test for identifying Escherichia coli O157. Journal of Clinical Pathology. London, v. 42, p. 1109-1110, 1989. CUBBON, M.D.; COIA, J.E.; HANSON. M.F. et al. A comparison of immunomagnetic separation, direct culture and polymerase chain reaction for the detection of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 in human faeces. Journal of Medical Microbiology. Essex, v.44, p. 219-222, 1996 DYNAL(a). Cell separation and protein purification technical handbook. 2 ed. Oslo: DYNAL, 1996. 165p. DYNAL(b). Testing food sample for Escherichia coli O157:H7 - IMS vs direct plating. Oslo: DYNAL, 1996. FRATAMICO, P.M.; SCHULTZ, F.J.; BUCHANAN, R.L. Rapid isolation of Escherichia coli O157:H7 from enrichment cultures of foods using an immunomagnetic separation method. Food Microbiology, London, v. 9, p. 105-113, 1992. MARCH, S.B.; RATNAM, S. Latex agglutination test for detection of Escherichia coli serotype O157. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 27, p. 1675-1677, 1989. OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOV, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. WRIGHT, D.J.; CHAPMAN, P.A.; SIDDONS, C.A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli O157 from food samples. Epidemiology and Infection, Cambridge, v. 113, p. 31-39, 1994. CAPTULO XIX PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. larvae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Paenibacillus larvae subsp. larvae (referido no restante do texto como P. larvae), agente da enfermidade Cria Ptrida Americana. A metodologia destina-se verificao da presena de esporos do agente em amostras de produtos da colmia. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Preparo da Amostra; O aquecimento da amostra a 45C visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuio homognea dos esporos e facilitar a manipulao. A diluio com soluo salina tamponada, alm de viabilizar a concentrao dos esporos pela centrifugao que se segue, contribui para bloquear parcialmente a ao inibidora de crescimento bacteriano, exercida por substncias presentes no mel. 2.2 Centrifugao; Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugao a 3.000 x g por 30 minutos (g = 0, 0000118 x raio do rotor (cm) x rpm2).

2.3 Choque Trmico; Por meio do aquecimento, a 80C por 10 min., do sedimento da amostra obtido por centrifugao, obtm-se a eliminao das formas vegetativas de bactrias que podem interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e dificultar a seleo de colnias. 2.4 Isolamento e Seleo; Baseia-se na semeadura sobre a superfcie seca de gar Paenibacillus larvae (ABL), meio composto por gar estoque, gar soja triptona, gar Cereus (PEMBA) - base, suplementado com emulso de gema de ovo, cido nalidxico e cido pipemdico. A emulso de gema de ovo promove a multiplicao de P.larvae e permite a diferenciao de microrganismos pela reao da lecitinase. A presena de 0,1% de peptona, associada ao piruvato de sdio (presentes no PEMBA), evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo, provocada por espcies de Bacillus que possuem essa propriedade. O manitol, carboidrato presente no meio, no fermentado pelo Paenibacillus larvae. O indicador de pH presente no meio o azul de bromotimol. O cido nalidxico atua inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei, B. megaterium, P.larvae subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O cido pipemdico atua prevenindo o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides, P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius. 2.5 Provas confirmativas: Baseiam-se na observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais; na observao da capacidade de decompor a casena; na incapacidade de produzir catalase; no crescimento escasso em gar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento tpico no gar leite com tiamina (ALT). 3.REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia; Tubos para centrfuga tipo Falcon ou similar, com tampa rosquevel, cap. 100 mL; gar cereus (PEMBA) - base* (opcional: gar manitol gema de ovo poliximina segundo Mossel (MYP) - base); gar estoque*; gar soja triptona*; Emulso de gema de ovo 50%*; cido pipemdico soluo 0,2%*; cido nalidxico soluo 0,1%*; Tiamina cloridrato soluo aquosa 0,1%**; Leite desnatado UHT**; gar gar com extrato de levedura**; gar nutriente sem extrato de levedura; Caldo crebro-corao com tiamina (BHIT); Soluo salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS); Perxido de hidrognio 3%; Caldo experimental para anaerbios; * Componente do gar Bacillus larvae (ABL); ** Componente do gar leite com tiamina (ALT). 4. EQUIPAMENTOS Centrfuga (3.000 x g); Banho-maria a 80C; Termmetro 100C. 5. PROCEDIMENTOS

5.1 Preparo da amostra: Mel e produtos in natura: Aquecer a amostra em banhomaria a 45C para facilitar a manipulao da mesma e a homogeneizao dos esporos presentes. Transferir, assepticamente, 20 mL da amostra para tubo de centrifuga estril e adicionar 30 mL de soluo salina fosfatada tamponada (PBS). Homogeneizar bem. Produtos da colmia liofilizados: pesar, assepticamente, 5g do produto em tubo de centrfuga estril e adicionar 45 mL de PBS. Deixar em repouso por 10 a 15 min. Homogeneizar bem. Plen: pesar, assepticamente, 5g da amostra e adicionar 45 mL de PBS misturando vigorosamente. Filtrar a mistura em papel filtro n 2 (Whatman). Deixar em repouso por 2 horas para decantao do plen residual. Transferir cuidadosamente para tubos de centrfuga estreis com tampa. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Concentrao por centrifugao Centrifugar a 3.000x g por 30 minutos. Aps centrifugao, descartar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS e transferir para tubos com tampa de rosca. Aquecer a 80C, em banho-maria, por 10 minutos. 5.4 Isolamento: Transferir 0,1 mL da suspenso preparada conforme item 5.3 para a superfcie seca de placas com ABL. Com o auxlio de basto tipo hockey, espalhar cuidadosamente o inculo sobre a placa paralelamente, usando ala de 10 L, inocular a suspenso por estrias sobre a superfcie seca de outra placa com ABL. Incubar as duas placas invertidas a 36 1C por at 5 dias, observando, aps 48h e depois diariamente, o crescimento de colnias tpicas de Paenibacillus larvae. No ABL, as colnias tpicas de Paenibacillus larvae se apresentam planas, com superfcie suavemente granulada, achatadas, com ou sem centro elevado de maior densidade, com bordas levemente irregulares, sem brilho, de cor verde- amarelada e dimetro de 2 a 5mm, sem halo de precipitao da lecitina, com ou sem halo de liplise. Alguns isolados podem apresentar colnias com centro muitas vezes mais denso (opaco) que as bordas (translcidas). 5.5 Seleo: Selecionar 3 a 10 colnias tpicas e testar quanto presena de catalase. 5.5.1 Prova da Catalase; Com auxlio de uma ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur estreis, retirar uma alquota do cultivo, transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. As culturas de Paenibacillus larvae so catalase negativas. Repicar as colnias catalase negativas para tubos contendo gar leite com tiamina inclinado e incubar a 36 1C por 24 a 48 h. Manter essas culturas para testes complementares, caso sejam necessrios. 5.6 Provas Confirmativas: Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das colnias catalase negativas.

5.6.1 Colorao de Gram; Das colnias suspeitas, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram. O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porm, pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento varivel. As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem ser testadas para: 5.6.2 Crescimento em superfcie de gar nutriente sem extrato de levedura: A partir das colnias catalase negativas, repicar tambm em tubos com gar nutriente inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 1C por 3 dias. A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em gar nutriente sem extrato de levedura aps 3 dias. 5.6.3 Decomposio da casena e verificao de crescimento tpico no ALT A partir das colnias catalase negativas, repicar sobre a superfcie seca de placas com gar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 1C por 3 dias. Aps incubao, verificar a presena de halo transparente ao redor das colnias. O Paenibacillus larvae decompe a casena em at 3 dias. As colnias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de colorao entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas). Diferenciao entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apcolas. Microrganismos P.larvae subsp. larvae Paenibacillus alvei Brevibacillus laterosporus P.larvae subsp. Pulvifaciens Paenibacillus popilliae Paenibacillus lentimorbus Decomposio da casena POS* POS POS POS NEG NEG Catalase NEG POS POS NEG NEG NEG Crescimento em gar nutriente sem extrato de levedura NEG ou escasso POS POS POS NEG NEG

Associado ao crescimento caracterstico no ALT. 6. RESULTADOS 6.1 Interpretao Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como bastonetes Gram positivos finos, mdios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas, com reao positiva para hidrlise da casena associada ao crescimento tpico no ALT, e com crescimento escasso no gar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias. 6.2 Expresso do Resultado Expressar o resultado das anlises de mel como: Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presena /20 mL de mel; ou Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausncia /20 mL de mel. Para outros produtos da colmia expressar o resultado como: Presena (ou Ausncia) / quantidade de amostra submetida anlise. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA SCHUCH, D.M.T.; MADDEN, R.H.; SATTLER, A. 2001. An improved method for the detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey J. Apicult. Res., 40(2): 59-64.

GOCHNAWER, T. A., CORNER, J. 1974. Detection and identification Bacullis larvae in a commercial pollen samples. J. Apicult. Res. 13: 264-267. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date - (Approved Lists, Validation Lists).Nov. 2002. Braunschweig, Germany.Disponvel In: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm CAPTULO XX TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ - pH > 4,6 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a verificao da eficcia do processo de esterilizao aplicado a alimentos de baixa acidez, comercialmente estreis; Aplica-se a amostras de alimentos comercialmente estreis de baixa acidez (enlatados). 2. FUNDAMENTOS Pr-incubao:: Baseia-se na incubao das amostras nas temperaturas de 36 1C pelo perodo de 10 dias e a 55 1C pelo perodo de 5 a 7 dias, objetivando a deteco de crescimento bacteriano com formao de gs, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificao de possveis microfugas. 2.1 Semeadura e incubao: Baseia-se na utilizao de meios lquidos no seletivos com capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubao em aerobiose e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesfilos e termfilos. 2.2 Provas complementares 2.2.1 Colorao pelo mtodo de Gram e de esporos: Baseia-se na observao microscpica das caractersticas morfolgicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de seus esporos. Prova da Catalase Baseia-se na verificao da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase, que decompe o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.2.3 Prova da termofilia estrita: Baseia-se na verificao da germinao e crescimento dos esporos nas temperaturas de 36 1C e 55 1C para certificao da exigncia absoluta de elevada temperatura para seu desenvolvimento. A germinao dos esporos a 36 1C indica a capacidade mesoflica do microrganismo. O crescimento a 36 1C e a 55 1C indica a capacidade termoflica facultativa do microrganismo. O crescimento somente a 55 1C indica a capacidade termoflica estrita do microrganismo. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Equipamentos, vidraria e outros; Abridores metlicos estreis; Pinas estreis; Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi; Caldo glicose triptona;

gar glicose triptona; gar nutriente; gar nutriente com sulfato de mangans; gar para esporulao; gar crebro-corao (ABHI); Corantes para a colorao de esporos; Corantes para a colorao de Gram; Perxido de hidrognio 3%; Vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos alimentos. bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pr-incubao: Seguir os procedimentos para pr incubao no item 3.1.1 do Anexo V, Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos. Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a alterao, quando ocorrer. 5.1.1 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao: Ao final da pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da pr-incubao. Proceder conforme item 5.3 para a anlise destas amostras. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Amostras tufadas; As amostras que derem entrada no laboratrio com evidncias de tufamento e estiverem acompanhadas de ofcio com solicitao de anlise especial sero analisadas imediatamente, devendo ser preparadas conforme as instrues descritas abaixo: Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Colocar um chumao de algodo embebido em soluo desinfetante, previamente aprovada pelos testes do laboratrio, no local onde ser iniciada a abertura da embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o analista contra uma possvel contaminao proveniente do alimento em anlise pela expulso de gases e/ou lquidos presentes no recipiente no momento do rompimento da hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, mscara, toucas, etc. tambm devero ser adotados. Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio sob o chumao de algodo. Deixar em repouso sem retirar a proteo de algodo sobre o orifcio at que a

presso interna do produto esteja equilibrada com a externa. Com outro abridor estril, abrir cuidadosamente a lata e transferir pores do contedo, tomadas do lado oposto ao local do orifcio inicialmente feito, para os meios de cultivo indicados. Aps a retirada das alquotas estabelecidas pela metodologia especfica, fechar cuidadosamente a lata e acondicion-la em saco plstico autoclavvel, fechando-o com fita adesiva. A amostra, assim embalada, dever ser imediatamente descartada conforme norma especfica do laboratrio. As amostras alteradas que chegarem desacompanhadas de ofcio com solicitao especfica no sero analisadas. Fazer constar no Certificado Oficial de Anlise a informao do motivo da no aceitao. No flambar os recipientes tufados. Os mesmos devero ser somente desinfetados com algodo embebido em soluo desinfetante. Manter registros das condies das amostras no momento da sua recepo no laboratrio. 5.4 Inoculao das amostras; Utilizando a amostra incubada a 36 1C, retirar alquotas de cerca de 1 a 2 gramas ou mL e semear em quatro tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, e tambm em quatro tubos contendo caldo glicose triptona. Aps a inoculao das amostras, acrescentar, assepticamente, sobre o caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi uma camada de aproximadamente 2 cm de vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida, estril, previamente fundido. 5.5 Incubao; Incubar dois tubos de cada meio nas temperaturas de 36 1C e 55 1C por 120 horas (5 dias). 5.6 Leitura e Interpretao: Verificar, nos tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, a formao de gs, a turvao do meio e possvel alterao na aparncia da carne do meio, sinais indicativos de crescimento bacteriano. Os clostrdios sacarolticos produzem cido e gs com odor cido, sem a digesto da carne cozida mas com conseqente avermelhamento da mesma. Os clostrdios proteolticos degradam a protena em aminocidos, com a precipitao da tirosina na forma de cristais brancos, produzindo um odor ftido de compostos sulfurados com conseqente enegrecimento da carne cozida e turvao do caldo. Verificar, nos tubos com caldo glicose triptona, se ocorreu turvao e/ou formao de pelcula na superfcie do caldo, alteraes que indicam crescimento bacteriano. Considerar como negativo o teste para a esterilidade comercial quando no se observar nenhuma das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. Dar seqncia ao teste quando forem observadas quaisquer das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. 5.6.1 Confirmao de tubos com crescimento positivo ou suspeito: Os tubos suspeitos de apresentarem crescimento devem ser repicados por estriamento em placas de ABHI, conforme segue: 5.6.1.1 Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 36 1C (aerbios mesfilos) repicar concomitantemente para duas placas com ABHI. Incubar uma destas placas a 55 1C e a outra a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.2 Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 55 1C (aerbios termfilos) repicar para uma placa com ABHI. Incubar a 55 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.3 Quando o tubo suspeito for o de caldo de carne cozida (ou de caldo

Tarozzi), incubado a 36 1C (anaerbio mesfilo) ou a 55 1C (aerbios termfilos), repicar para uma placa com ABHI. Incubar por 24 a 48 horas, na mesma temperatura de incubao usada para o tubo de origem (36 1C ou 55 1C), em anaerobiose. 5.6.2 Leitura: Aps a incubao, verificar o crescimento de microrganismos nas placas. O no crescimento indicar resultado negativo para o teste de esterilidade comercial. Quando for verificado crescimento nas placas, repicar as culturas obtidas para tubos com gar estoque inclinado e incubar nas mesmas condies das placas de origem. Aps incubao, realizar os testes complementares a seguir: 5.7 Testes complementares 5.7.1 Colorao de Gram: A partir das colnias que crescerem nas placas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando for verificada a presena de bastonetes Gram positivos nos tubos incubados em anaerobiose, a realizao da prova de catalase necessria para a diferenciao entre Bacillus sp (catalase positiva) e Clostridium sp (catalase negativa). Registrar no resultado final a morfologia dos cultivos celulares isolados observada. 5.7.2 Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur estril, transferir a cultura para uma lmina de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. No caso da presena de bastonetes Gram positivos, resultados de catalase negativos indicam a presena de Clostridium sp e resultados positivos indicam a presena de Bacillus sp. Quando for detectada a presena de Clostridium sp, guardar as culturas para testes complementares, caso sejam necessrios. 5.7.3 Prova da termofilia estrita: Quando forem detectados bastonetes termfilos, realizar prova para confirmao de termofilia estrita do microrganismo isolado. A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a 55 1C, repicar maciamente para tubos contendo gar nutriente inclinado com sulfato de mangans (ou gar para esporulao). Incubar a 55 1C de 2 a 10 dias. A partir do segundo dia, verificar a presena de esporos por meio da aplicao da tcnica para colorao de esporos, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspenso de esporos, lavando o crescimento obtido no tubo com gar nutriente/sulfato de mangans com 1 mL de gua destilada ou deionizada estril. Inativar as formas vegetativas por meio da aplicao de um choque trmico a 80C por 15 minutos na suspenso preparada de 1 mL. Inocular 0,1 mL do lavado, aps o choque trmico, em dois tubos contendo caldo glicose triptona. Incubar um tubo a 36 1C e outro a 55 1C por 2 a 4 dias. Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvao do caldo. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a 55 1C determina a termofilia estrita do microrganismo isolado. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do

microrganismo isolado. Registrar no resultado final a caracterstica mesoflica ou termoflica do microrganismo isolado. 5.7.4 Confirmao de microrganismos flat sour (opcional): A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose triptona incubados a 55 1C, repicar para a superfcie seca de 2 placas com gar glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 1C por 72 horas e a outra a 55 1C por 48 horas em cmara mida. O crescimento de colnias amarelas, regulares, com dimetro de aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificao tambm amarela, nas placas incubadas a 55 1C, com ncleo opaco e o no crescimento naquelas incubadas a 36 1C, confirmar a presena de Bacillus stearothermophilus (renomeado Geobacillus stearothermophilus ), microrganismo responsvel pela deteriorao flat sour. 6. RESULTADOS 6.1 Pr-incubao: Expressar, no campo referente a emisso do resultado para prova de pr-incubao, nas temperaturas requeridas, o resultado como sem alterao quando no se observar qualquer alterao ou anormalidade no recipiente e nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra, e como alterado quando for observada qualquer alterao ou anormalidade no recipiente ou nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alterao observado. 6.2 Pesquisa de aerbios e anaerbios termfilos e mesfilos: Expressar, nos campos referentes a emisso dos resultados para as pesquisas de aerbio e anaerbio mesfilo e termfilo, o resultado como negativa, quando no for observado qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como positiva quando for observada a presena de microrganismos. Sempre que possvel, fazer constar do resultado final as observaes feitas ao microscpio. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento-Secretaria de Defesa Animal - Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenao Geral de Laboratrio Animal - Mtodos de Anlise Microbiolgica para Alimentos - Teste de Esterilidade Comercial Braslia, D.F. 1991/1992 - 2 Reviso, p. 111 - 113. DEIBEL K. E.; JANTSCHKE, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 577-588. DENNY C. B; PARKINSON, N.G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.583-600. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date-(Approved Lists, Validation Lists).Nov.2002.Braunschweig, Germany.Disponvel In:http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm