PT-LMC-004 - Requisitos Gerais para Exames Microbiologicos

Procedimento Operacional Padro de
Metodologias de Anlises
POP MET MIC 001
REQUISITOS ERAIS E ORIE!TA"#ES PARA
E$AMES MICRO%IO&'ICOS
Emisso( 0)*0+*1) Pgina( 1 de 121
Re,iso( 00
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S-MARIO
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Re,iso( 00
I. REQUISITOS ERAIS E ORIE!TA"#ES PARA E$AME MICRO%IO&'ICOS.................../
1.0 OBJETVOS E ALCANCE...................................................................................................... 3
2.0 NTRODUO....................................................................................................................... 3
3.0 PREMSSAS.......................................................................................................................... 4
4.0 PESSOAL............................................................................................................................. 11
5.0 APARELHOS E NSTRUMENTOS....................................................................................... 13
6.0 PREPARAO DE MATERAS DE VDRARA DE LABORATRO E OUTROS...............56
7.0 PREPARAO E ESTERLZAO DE MEOS DE CULTURA..........................................61
8.0 AMOSTRAS DE LABORATRO......................................................................................... 61
9.0 EXAME................................................................................................................................. 65
10.0 ENUMERAO.................................................................................................................. 69
11.0 MTODO DE DETECO (MTODO QUALTATVO)....................................................100
12.0 MTODOS DE CONFRMAO...................................................................................... 101
13.0 RELATRO DE ENSAO................................................................................................ 108
14.0 VALDAO DE MTODOS MCROBOLGCOS.........................................................108
15.0 GARANTA DE QUALDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE QUALDADE DE
DESEMPENHO........................................................................................................................ 109
16.0 BBLOGRAFA CONSULTADA........................................................................................ 110
II. 0IST'RICO 1AS RE2IS#ES.............................................................................................. 111
Anexo A.................................................................................................................................... 112
Anexo B.................................................................................................................................... 113
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Re,iso( 00
I. REQUISITOS ERAIS E ORIE!TA"#ES PARA E$AME
MICRO%IO&'ICOS
1.0 O%3ETI2OS E A&CA!CE
Abrange exame para bactrias, bolores e leveduras e pode ser usado se
suplementadas com orientao especfica para prons, parasitas e vrus. No
abrange o exame para toxinas ou outros metablitos (aminas, por exemplo)
produzidos por microorganismos.
Esta Norma aplica-se a microbiologia de alimentos, alimentos para animais,
indstria de produo de alimentos, e ambiente de produo primria.
O objetivo desta Norma contribuir para garantir a validade dos exames de
microbiologia de alimentos, e ajudar a garantir que as tcnicas gerais usadas
para a realizao desses exames so as mesmas em todos os laboratrios,
ajudar a alcanar resultados homogneos em laboratrios diferentes, e
contribuir para a segurana do pessoal de laboratrio, evitando riscos de
infeco.
).0 I!TRO1U"4O
Ao conduzir exames microbiolgicos especialmente importante que
- apenas os microorganismos que esto presentes nas amostras sejam
isolados e contabilizados;
- os microorganismos no contaminem o meio ambiente
Para conseguir realizar isso necessrio tambm ter ateno higiene
pessoal e realizar as tcnicas de trabalho com certeza de eliminao de
contaminaes externas, sempre que possvel.
Uma vez que, nesta Norma nternacional, possvel dar apenas alguns
exemplos de precaues que devem ser tomadas durante uma anlise
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Re,iso( 00
microbiolgica, um conhecimento profundo das tcnicas microbiolgicas e dos
microorganismos envolvidos essencial. importante que as anlises sejam
realizadas com a maior preciso possvel, incluindo monitoramento e registro
de aspectos que podem afetar os resultados e os clculos do nmero de
microorganismos e o clculo de incerteza de resultados.
Em ultima instncia, de responsabilidade do coordenador do laboratrio de
julgar se as manipulaes so seguras e se podem ser consideradas boas
prticas laboratoriais.
Um grande nmero de manipulaes podem, por exemplo, sem inteno levar
a uma contaminao cruzada e o analista deve sempre verificar a preciso dos
resultados dados por sua tcnica.
A fim de realizar as anlises corretamente necessrio tomar certas
precaues ao construir e equipar o laboratrio.
Certas precaues devem ser tomadas, no apenas por motivos de higiene,
mas tambm para garantir boa reprodutibilidade dos resultados. No possvel
especificar todas as precaues que devem ser tomadas em todas as
circunstncias, mas essa Norma nternacional pelo menos fornece as medidas
a serem tomadas ao preparar, esterilizar, armazenar os meios e utilizar os
equipamentos.
Se a orientao dada nessa Norma nternacional for seguida, ser uma
contribuio para manter a sade e segurana de todos. A fim de distinguir as
orientaes nessa Norma nternacional, elas esto impressas em um tipo de
letra diferente (Times New Roman).
/.0 PREMISSAS
/.1 eral
Esta clusula d requisitos gerais, para os princpios da concepo e
organizao de um layout de laboratrio de microbiologia.
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Re,iso( 00
Exame das amostras estgio primrio de produo (especialmente para
recepo de amostras e preparao de amostras) devem ser separadas da
anlise de outras amostras para reduzir os riscos de contaminao cruzada.
/.) Considera56es so7re seg8ran5a
O projeto de laboratrio dever cumprir os requisitos de segurana que vai
depender do tipo de micro-organismo. Para este efeito, os micro-organismos
so classificados em quatro categorias de risco:
Categoria de risco 1 (nenhum risco ou muito baixo para o indivduo e para a
comunidade).
Um micro-organismo que improvvel que causam a doena humana ou
animal.
Categoria de risco 2 (risco moderado para o risco individual e baixo para a
comunidade).
Um agente patognico que pode causar doenas no homem ou animal, mas
improvvel que seja um perigo grave para os trabalhadores de laboratrio, a
comunidade ou o ambiente. Exposies laboratoriais podem causar infeco
humana grave, mas o tratamento eficaz e medidas preventivas esto
disponveis e o risco de propagao da infeco limitada.
Categoria de risco 3 (alto risco para o risco individual e baixo para a
comunidade).
Um patgeno que geralmente causa doena humana ou animal grave, mas
normalmente no se espalham de um indivduo infectado para outro.
Tratamento eficaz e medidas preventivas esto disponveis.
Categoria de risco 4 (alto risco para o indivduo e para a comunidade).
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Re,iso( 00
Um patgeno que geralmente causa doena humana ou animal grave e que
pode ser facilmente transmitido de um indivduo para outro, direta ou
indiretamente. Tratamento eficaz e medidas preventivas no so geralmente
disponveis.
AVSO - Consulte a regulamentao nacional, que define a categoria de risco
de micro-organismos encontrados particularmente dentro das fronteiras do pas
em questo.
/./ 1esign de &a7orat9rio
As diretrizes para a disposio de laboratrio descrito abaixo cobrem exames
para a deteco de micro-organismos pertencentes categoria de risco 1, 2 e
3 para microbiologia alimentar.
Note-se que as medidas de segurana adicionais podem ser necessrias,
dependendo da legislao local.
/.: ;reas do &a7orat9rio
/.:.1 eral
O laboratrio compreende reas associadas com amostras e testes (ver 3.4.2)
e reas em geral (Ver 3.4.3). Estas devem ser separadas.
/.:.) ;reas associadas com amostras e testes
considerada boa prtica ter locais separados ou reas claramente
designadas, para o seguinte:
- recebimento e armazenamento das amostras;
- preparao de amostras, em particular no caso de matrias-primas (por
exemplo, produtos em p contendo um nmero elevado de micro-organismos);
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Re,iso( 00
- exame das amostras (a partir da suspenso inicial), incluindo a incubao de
micro-organismos;
- manipulao de patgenos presuntivo;
- armazenamento de cepas de referncia e outras cepas;
- preparao e esterilizao de meios de cultura e equipamentos;
- armazenamento de meios de cultura e reagentes;
- exame de alimentos para a esterilidade;
- descontaminao;
- limpeza de vidro e outros equipamentos;
- armazenamento de produtos qumicos perigosos, de preferncia mantidos em
armrios especialmente designados, salas ou prdios.
/.:./ ;reas gerais
As seguintes reas so consideradas separadas:
- entradas, corredores, escadas, elevadores;
- reas administrativas (por exemplo, escritrios, salas de documentao, etc);
- vestirios e banheiros;
- salas de arquivo;
- lojas;
- salas de repouso.
/.< &a=o8t e acess9rios das instala56es
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Re,iso( 00
/.<.1 O7>eti,os
O objetivo garantir que o ambiente dentro do qual os exames microbiolgicos
so realizados no afetem a confiabilidade dos resultados do teste.
Providenciar instalaes de forma a evitar o risco de contaminao cruzada.
Maneiras de atingir este objetivo so, por exemplo:
a) para a construo do laboratrio de acordo com o princpio do layout "no
volta";
b) a realizao de procedimentos de forma sequencial utilizando as devidas
precaues para garantir o teste e integridade da amostra (por exemplo, uso de
recipientes fechados);
c) separar as atividades por tempo ou espao.
Evitar condies extremas, tais como temperatura excessiva, poeira, umidade,
vapor, rudo, vibrao, etc.
Espao deve ser suficiente para permitir que as reas de trabalho sejam
mantidas limpas e arrumadas. O espao necessrio deve ser proporcional ao
volume de anlises e a organizao interna global do laboratrio. O espao
deve ser regulado pela legislao nacional, quando existir.
/.<.) Instala56es
As instalaes devem ser construdas e equipadas a fim de reduzir o risco de
contaminao por poeira e, portanto, por microorganismos (para micro-
organismos da categoria de risco 3 verificar a legislao nacional).
a) As paredes, tetos e pavimentos devem ser lisos, fcil de limpar e resistente a
detergentes e desinfetantes usados em laboratrios.
b) O piso deve ser antiderrapante.
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c) tubos suspensos de transporte de lquidos no devem cruzar as instalaes
a menos que sejam hermeticamente fechados. Qualquer outra estrutura area
deve ser coberta ou facilmente acessvel para limpeza regular.
d) Janelas e portas devem ser capazes de ser fechado quando realizao dos
ensaios, a fim de minimizar correntes de ar. Alm disso, devem ser construdos
de modo a evitar a formao de poeira, e assim, facilitar a sua limpeza. A
temperatura ambiente (18 C a 27 C) e qualidade do ar (contedo micro-
organismo, a taxa de poeira se espalhando, etc) deve ser compatvel com a
realizao dos testes. Um sistema de ventilao de filtro de ar de entrada e
sada de ar recomendado para esta finalidade.
e) Um sistema de extrao adequada deve ser instalado para evitar a
exposio s poeiras provenientes do manuseio de meios de cultura
desidratados, e as amostras em p.
f) Testes que devem ser realizados em uma atmosfera de baixa contaminao,
a sala deve ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou
cabine de segurana biolgica.
g) Se necessrio, o ambiente de laboratrio devem ser protegidos contra os
efeitos nocivos da radiao solar atravs da utilizao de venezianas ou
painis de vidro tratados adequadamente. Persianas instaladas internamente
no so adequadas, pois so de difcil limpeza e podem se tornar uma fonte de
poeira.
/.<./ O8tros pontos
Os seguintes pontos devem ser considerados:
- disponibilidade de abastecimento de gua de qualidade apropriada para o uso
pretendido;
- disponibilidade de energia eltrica;
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- disponibilidade de gs (encanado ou engarrafado);
- luz adequada em cada seo do laboratrio;
- superfcie de bancada e mveis de laboratrio fabricados em material liso,
impermevel, de fcil limpeza e desinfeco;
- mobilirio de laboratrio concebido de modo a facilitar a limpeza dos pisos
(por exemplo, mobilirio mvel);
- nenhuma moblia, documentos ou outros itens que no sejam os estritamente
necessrios para as atividades de teste, devem ser mantidos na rea de testes;
- disponibilidade de instalaes de armazenamento para armazenar
documentos usados ao manipular as amostras, meios de cultura, reagentes, e
etc;
- fornecimento de lavatrios de mo em cada sala de testes e, se necessrio,
em reas gerais, de preferncia perto da porta;
- disponibilidade de uma autoclave para destruio de resduos contaminados e
meios de cultura, a menos que um adequado sistema para a remoo de
resduos contaminados para incinerao esteja em vigor;
- fornecimento de sistemas de segurana para cobrir incndio, emergncia
eltrica e chuveiro de emergncia e instalaes para lavagem dos olhos;
- fornecimento de instalaes de primeiros socorros.
/.? &impe@a e desinAec5o
Os seguintes pontos devem ser verificados.
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Re,iso( 00
a) Os pisos, paredes, tetos, bancadas de laboratrio, mobilirio e junes entre
estes devem ser submetidos a manuteno e reparao regular, a fim de evitar
rachaduras que podem atuar como uma fonte de contaminao.
b) A limpeza regular e desinfeco devem ser realizadas a fim de manter as
instalaes em condies adequadas para a realizao de testes. Superfcies
contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser descontaminadas
utilizando desinfetante conhecido por ser bactericida e fungicida.
NOTA 1 Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumigao
com vapor de formaldedo, se permitido pela legislao nacional.
c) Os sistemas de ventilao e seus filtros devem receber manuteno
regularmente e os filtros mudados quando necessrio.
d) A qualidade microbiolgica de superfcies de trabalho laboratorial, superfcies
de contato pessoal, e ar devem ser monitorados regularmente (a frequncia
depende dos resultados de testes anteriores).
e) a contaminao de superfcie pode ser estimado atravs da aplicao direta
superfcie de uma placa de contato contendo neutralizantes contra agentes
sanitizantes (por exemplo, lecitina, tiossulfato de sdio). A qualidade do ar
pode ser examinada por exposio de 15 min uma placa de Petri abertas
contendo meio de gar no seletivo (gar contagem por exemplo placa - PCA)
ou um gar seletivo adequado para o microrganismo alvo procurado (por
exemplo, gar batata).
:.0 PESSOA&
:.1 eneralidades
Requisitos gerais sobre a competncia do pessoal pode ser encontrada em
SO / EC 17025.
:.) CompetBncia
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Re,iso( 00
Para cada mtodo ou tcnica, os critrios objetivos devem ser definidos para a
avaliao das competncias adequadas, ambos inicialmente e em uma base
contnua.
A competncia pode ser estabelecida dentro do laboratrio de controle de
qualidade interno (ver 15.1.2).
:./ 2eriAica5o de competBncia em c8rso do pessoal
Verificao de competncia em curso do pessoal deve ser avaliada
regularmente com parmetros objetivos. sso inclui participao em programas
internos de garantia da qualidade, testes de proficincia (ver SO / EC Guia 43-
1), o uso de materiais de referncia ou por avaliao atravs de testes para
enumerao de microorganismos como descrito na SO 14461-2.
:.: 0igiene
As seguintes precaues de higiene pessoal devem ser tomadas a fim de evitar
a contaminao das amostras, meios de cultura e para evitar o risco de
infeco do pessoal. Para maiores informaes ver POP MET MC 007.
a) Usar vesturio de laboratrio devidamente preso, limpo e em bom estado,
fabricados a partir de um tecido que limita os riscos de inflamabilidade. Esta
roupa no deve ser usada fora das reas de trabalho e, possivelmente,
vestirios.
b) Usar proteo para os cabelos e barba, se necessrio, para a integridade da
amostra.
c) Manter unhas limpas e de preferncia curtas.
d) Lave bem as mos em gua morna, de preferncia por uma torneira no-
operada manualmente, antes e depois de exames microbiolgicos e
imediatamente depois de ir ao banheiro banho. Use sabo lquido ou em p ou,
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Re,iso( 00
possivelmente, um desinfetante, entregue preferencialmente por um
dispensador mantido em boas condies de limpeza. Para a secagem das
mos, usar papel ou toalhas de pano descartveis. Estas precaues so
aplicveis tanto aos funcionrios do laboratrio quanto aos visitantes.
e) Ao trabalhar com amostras expostas, meios de cultura, e ao inocular, evitar
falar, tossir, e etc.
f) As pessoas que tenham infeces de pele ou doenas devem tomar
precaues, onde os micro-organismos podem contaminar as amostras e
invalidar os resultados.
g) No comer ou beber no laboratrio e no colocar alimentos para consumo
pessoal em refrigeradores ou freezers do laboratrio.
h) Pipetagem com a boca proibida.
<.0 APARE&0OS E I!STRUME!TOS
<.1 eral
De acordo com boas prticas de laboratrio, todos os aparelhos e
equipamentos devem ser mantidos limpos e em condio de bom estado de
funcionamento. Antes do uso, o equipamento deve ser verificado como apto
para o efeito pretendido e seu desempenho monitorado durante o uso, sempre
que necessrio.
Os aparelhos e dispositivos de monitorizao devem ser calibrados por rgos
de calibrao rastreveis e os controles necessrios intermedirios realizados,
e os procedimentos e os resultados documentados.
Equipamentos devem ser regularmente checados e mantidos para garantir a
segurana e adequao ao uso. O equipamento deve ser controlado de acordo
com as condies de trabalho e a preciso exigida para os resultados.
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Re,iso( 00
A frequncia de calibrao e verificaes de cada item do equipamento so, na
maioria dos casos, no especificadas nesta Norma, uma vez que ser
determinada por cada laboratrio, dependendo do tipo de equipamentos e ao
nvel de atividade do laboratrio, e de acordo com as instrues do fabricante.
Em um nmero limitado de casos, uma frequncia foi especificada desde que
foi considerada essencial.
Aparelhos e equipamentos devem ser construdos e instalados para facilitar a
operao e para permitir a facilidade de manuteno, limpeza,
descontaminao e de calibrao.
Quaisquer incertezas de medio indicados nesta clusula referem-se a
aparelhos e equipamentos em causa e no para todo o mtodo de anlise.
Ao longo desta clusula, os requisitos para a preciso de medio de
equipamentos de medio so dadas. Estes so baseados na tolerncia
prticas necessrias para demonstrar o controle adequado dos equipamentos
em uso rotineiro. A preciso declarada est relacionada com a incerteza
metrolgica do aparelho.
Para equipamentos de controle de temperatura, verificar a estabilidade e
homogeneidade da temperatura antes do uso inicial e depois de qualquer
reparao ou modificao que possa ter um efeito sobre o controle de
temperatura.
<.) Ca7ines de seg8ran5a
<.).1 1escri5o
Uma cabine de segurana uma estao de trabalho com o fluxo de ar laminar
horizontal ou vertical para remover poeira e outras partculas, como os
micrbios, a partir do ar.
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Re,iso( 00
O nmero mximo tolervel de partculas por metro cbico com um tamanho
maior ou igual a 0,5 m representa a classe de espalhamento de poeira de
uma cabine de segurana. Para cabines usadas em microbiologia alimentar, o
nmero de partculas no deve exceder 4 000 por metro cbico.
Cabines para uso em laboratrios de microbiologia de alimentos so de quatro
tipos.
a) Cabines de segurana de Classe possuem abertura frontal e se destinam a
proteger o operador e o meio ambiente, mas no ir proteger o produto de
contaminao externa. Aerossis potencialmente infectados sero contidos
dentro do gabinete e preso por impactao no filtro. O ar filtrado normalmente
descarregada para a atmosfera, se isso no for feito, o ar deve passar por dois
filtros HEPA montados em srie. Eles no so recomendados para trabalhar
com patgenos de categoria de risco 3 por causa das dificuldades em manter e
garantir a proteo do operador apropriado.
b) Cabines de segurana de Classe protegem o produto, o operador e o meio
ambiente. Eles recircular parte do ar filtrado, outra parte vai para a atmosfera e
retornam no ar de reposio atravs da abertura de trabalho, proporcionando
assim a proteo do operador. Eles so adequados para trabalhar com
patgenos de categoria de risco 3.
c) Fluxos laminares de sada horizontal protegem o trabalho de contaminao,
mas joga qualquer golpe de aerossol gerado para o rosto do operador.
Portanto, eles no so adequados para lidar com culturas inoculadas ou
preparao de cultura de tecidos.
d) fluxo de ar laminar vertical protege o produto atravs do uso de fluxo laminar
vertical de HEPA-ar filtrado. Eles tambm protegem o operador atravs do uso
de ar internamente recirculado. Eles so particularmente adequados para
proporcionar um ambiente assptico para a manipulao de produtos estreis e
para proteger o operador quando o manuseio de ps.
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Re,iso( 00
Usar cabines de proteo para todo o trabalho que envolva a manipulao de
agentes patognicos e ps contaminados, se necessrio por regulamentao
nacional.
O uso de um queimador de gs ou incinerador fio no recomendado em
armrios de proteo. Se for necessrio, o queimador de gs deve ter uma
pequena chama de modo que o fluxo de ar no seja perturbado. O uso de
material descartvel (alas, pipetas, etc) uma alternativa adequada.
<.).) Uso
Cabines devem ser mantidas livres de todos os equipamentos possveis.
Colocar todo material necessrio dentro da cabine antes de comear a
trabalhar para minimizar o nmero de movimentos do brao para dentro e fora
da abertura de trabalho. Posicionar equipamentos e materiais de forma a
minimizar a perturbao do fluxo de ar na abertura de trabalho.
Operadores devem ser adequadamente treinados para o uso correto de cabine
para garantir a sua segurana e a integridade do produto ou cultura.
<.)./ &impe@a e desinAec5o
Limpar e desinfetar a rea de trabalho aps o uso com desinfetante apropriado
e no corrosivo, de acordo com as instrues do fabricante. Examinar
regularmente grades, arame, pr-filtros de proteo e limpar com um pano
encharcado de desinfetante.
Para cabines de fluxo laminar, a superfcie do filtro deve ser limpa regularmente
com vcuo, tomando cuidado para no danificar o meio do filtro.
Cabines de segurana devem ser fumigadas antes de trocar de filtro ou
manuteno.
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Re,iso( 00
Aps a limpeza dos armrios, lmpadas UV podem ser utilizadas para a
desinfeco. As lmpadas UV devem ser regularmente limpas e substitudas
em conformidade com as instrues do fabricante.
<.).: Man8ten5o e inspe5o
Usar cabine de proteo que so apropriadas para a aplicao pretendida e as
condies ambientais no laboratrio.
A eficincia de uma cabine de proteo deve ser verificada por uma pessoa
qualificada, no recebimento e, posteriormente, em intervalos regulares,
conforme recomendado pelo fabricante, bem como aps qualquer reparo ou
modificao.
Verificao peridica de livre de qualquer contaminao microbiana deve ser
realizada por uma verificao da superfcie e das paredes da cabine.
A verificao peridica do nmero de presentes micro-organismos no ar deve
ser realizada durante o funcionamento dos filtros usando o equipamento usual.
Por exemplo, expor vrias placas de Petri abertas contendo um meio de cultura
de gar no-seletivo (por exemplo, PCA) em cada gabinete por 30 min. Outros
mtodos podem ser usados.
<./ %alan5as e dil8idores gra,imCtricos
<./.1 Uso e incerte@a de medi5o
Balanas so usadas principalmente para a pesagem da poro da amostra a
ser analisada, os componentes do ensaio, os meios de cultura e reagentes.
Alm disso, eles podem ser usados para a realizao de medies de lquido
de diluio por volumes em massa.
Diluidores gravimtricos so instrumentos eletrnicos constitudos de uma
balana e distribuidor de lquido programvel e so utilizados durante a
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Re,iso( 00
preparao de suspenses de amostra inicial; eles funcionam atravs da
adio de diluente a uma subamostra em uma proporo definida. A
subamostra , ento, pesada para a tolerncia especificada no set do aparelho,
e o diluidor dispensa diluente suficiente para a relao necessria (por
exemplo, 9 pra 1 para diluies decimais).
Um laboratrio de microbiologia de alimentos deve estar equipado com
balanas com o intervalo de incerteza necessrio para pesar os diferentes
produtos.
Salvo disposio em contrrio, os erros mximos admissveis devem ser 1% ou
melhor, ao pesar as amostras de teste.
Colocar o equipamento sobre uma superfcie estvel e horizontal, ajustado
conforme necessrio e protegido contra vibraes e vento.
<./.) &impe@a e desinAec5o
Os equipamentos devem ser limpos e desinfetados aps o uso ou derrame
durante a pesagem com um adequado e no corrosivo desinfetante.
<././ 2eriAica5o de desempenDo e cali7ra5o
O desempenho do sistema de equilbrio deve ser regularmente verificado
durante o uso e aps a limpeza com pesos de checagem e por uma pessoa
treinada. Calibrao deve ser verificada em toda a gama por uma pessoa
qualificada, dependente da frequncia de uso.
Pesos de checagem tambm podem ser verificados imediatamente aps a
calibrao da balana.
<E: 0omogenei@adoresE liF8idiAicadores e miGers
<.:.1 1escri5o
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
Este equipamento usado para preparar a suspenso inicial da amostra de
produtos no-lquidos.
Os seguintes aparelhos podem ser utilizados:
Stomacher com sacos estreis, possivelmente com um dispositivo de
regulao de velocidade e tempo; ou um homogeneizador rotativo
(liquidificador), a velocidade nominal de que entre 8 000 rpm e 45 000 rpm,
com vidro esterilizvel ou tigelas de metais equipados com tampas, ou um
misturador de vibrao (pulsifier) com sacos estreis, ou outro sistema de
homogeneizao com eficincia equivalente.
Em certos casos, mistura manual pode ser feita usando prolas de vidro
estreis com dimetro adequado (Cerca de 6 mm; ver POP MET MC 002).
<.:.) Uso
O tempo de funcionamento normal de um homogeneizador peristltico de 1
min para 3 min (ver POP MET MC 002 para determinados alimentos).
No use este tipo de aparelhos para determinados gneros alimentcios, tais
como:
produtos que correm o risco de puno da bolsa (presena de ntidas, as
partculas duras ou secas);
produtos que so difceis de homogeneizar por causa de sua textura (por
exemplo, salame).
O homogeneizador rotativo dever funcionar por um perodo tal que o nmero
total de rotaes entre 15000 rpm e 20000 rpm. Mesmo com o mais lento
homogeneizador, este tempo no deve exceder 2,5 min.
O misturador de vibrao pode ser usado para a maioria dos gneros
alimentcios, incluindo produtos duros ou secos. O tempo de operao usual
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
0,5 min a 1 min. Se os micro-organismos so susceptveis de serem
encontradas no fundo de estruturas coesas, a amostra deve ser cortada em
pedaos pequenos antes do processamento.
Contas de vidro podem ser usadas para a preparao, por agitao, de
suspenses iniciais de certos produtos viscosos ou espessos, em especial
determinados produtos lcteos (ver normas especficas).
<.:./ &impe@a e desinAec5o
Limpar e desinfetar homogeneizadores peristltico e misturadores vibracionais
regularmente e aps qualquer derrame do saco.
Para homogeneizadores rotativo, limpar e esterilizar o vidro ou tigela de metal
aps cada utilizao.
<.:.: Man8ten5o
nspeo e manuteno do equipamento de acordo com as instrues do
fabricante.
<.< p0metro
<.<.1 1escri5o
Um medidor de pH usado para medir a diferena de potencial, a uma
temperatura determinada, entre uma medio do eletrodo e uma referncia, os
dois eletrodos sendo introduzidos no produto. Devem ser capazes de medir
com uma preciso de 0,05 unidades de pH e sua resoluo ser de 0,01
unidades de pH. O medidor de pH deve ser equipado com manual ou
compensao automtica de temperatura.
NOTA: O eletrodo de medio e o eletrodo de referncia normalmente so
agrupados em um sistema de eletrodos combinados.
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
<.<.) Uso
Um medidor de pH usado para medir o valor de pH do meio de cultura e
reagentes, para verificar se o ajuste necessrio durante sua preparao e
como um controle de qualidade depois da esterilizao.
Tambm pode ser usado para medir o valor de pH de amostras e suspenses
de amostras. O uso de um medidor de pH discutido na rea especfica para
o produto a ser analisado, e em que as condies para a determinao do valor
de pH e para ajuste do valor do pH so especificados.
Ajustar o medidor de pH, conforme indicado no manual do fabricante para
medir o valor de pH em uma temperatura padronizada, por exemplo, 25 C.
Ler o valor de pH aps a estabilizao ser atingida. Registrar o valor para duas
casas decimais.
NOTA: A leitura pode ser considerada estvel quando o valor de pH medido
durante um perodo de 5 s varia de acordo com pH no superior a 0,02
unidades. Usando eletrodos em boas condies, o equilbrio normalmente
alcanado dentro de 30 s.
<.<./ 2eriAica5o e aAeri5o
Verificar o medidor de pH de acordo com as instrues do fabricante, usando
pelo menos dois, e de preferncia trs padres de solues tampo, pelo
menos, diariamente antes do uso. Definir erros mximos admissveis para esta
verificao, dependendo da utilizao.
As solues padro devem ter valores de pH especificado para duas casas
decimais na temperatura de medio (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e / ou pH
9,00 a 25 C, de acordo com as instrues do fabricante).
Os padres utilizados devem englobar o valor de pH a ser medido.
POP MET MIC 001
22 de
121
Re,iso( 00
Aps a verificao do medidor de pH com as duas solues tampo padro
rastreveis, o pH deve ser verificado pela uso de um terceiro tampo controle,
de, por exemplo, pH 5 ou 8.
Avaliar o medidor de pH quando as verificaes derem um resultado que no
se enquadram nos erros mximos admissveis e em acordo com as instrues
do fabricante.
Esta aferio pode ser seguida por uma calibrao que permita estimativa da
incerteza de medio do medidor de pH.
<.<.: Man8ten5o
Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instrues do fabricante.
necessrio, em particular,
- o acompanhamento regular da condio dos eletrodos com relao ao
envelhecimento e sujidade, e
- o tempo de resposta e estabilidade.
Enxaguar os eletrodos com gua destilada ou deionizada aps cada utilizao.
A fim de combater a sujidade e envelhecimento dos eletrodos, limpe-os
regularmente mais completamente de acordo com as instrues do fabricante.
Armazenar os eletrodos de acordo com as instrues do fabricante.
<.? A8tocla,e
<.?.1 1escri5o
Uma autoclave permite que uma temperatura de vapor saturado seja atingida
na cmara, e usado para a destruio de micro-organismos.
A autoclave deve ser equipada com
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121
Re,iso( 00
- pelo menos uma vlvula de segurana,
- uma torneira de drenagem,
- um dispositivo de regulagem permitindo que a temperatura na cmara para
ser mantida a + 3C da meta de temperatura (para levar em conta a incerteza
de medio associada ao termopar de medio), e
- uma sonda de temperatura ou um termopar de gravao.
Tambm deve ser equipado com um temporizador e registrador de
temperatura.
<.?.) Uso
Com a esterilizao a vapor, todo o ar expulso antes do acmulo de presso.
Se a autoclave no estiver equipada com um dispositivo de evacuao
automtica, necessrio remover o ar at que um jato de vapor contnuo seja
emitido.
Para a destruio de micro-organismos, o vapor saturado na cmara deve
estar a uma temperatura de pelo menos 121C.
Durante o mesmo ciclo de esterilizao, no use o autoclave para esterilizar o
equipamento limpo (e/ou meio cultura) e, descontaminar equipamentos usados
(e/ou meios de cultura utilizados).
prefervel usar autoclaves separadas para estes dois processos. Aps
autoclavagem, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro
da autoclave antes da remoo.
Por razes de segurana, no remova o contedo at que a temperatura caia
abaixo de aproximadamente 80C.
<.?./ Man8ten5o
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121
Re,iso( 00
Limpe a cmara, as vedaes de drenagem do filtro e porta regularmente.
Verificar a vedao da porta de integridade. Realizar operaes de drenagem e
descalcificao, se necessrio, em intervalos regulares. Siga as
recomendaes do fabricante.
<.?.: 2eriAica5o e cali7ra5o
A autoclave deve ser mantida em boas condies de funcionamento e deve ser
regularmente inspecionada pelas autoridades competentes, pessoal
qualificado, e em conformidade com as instrues do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condies de
funcionamento e verific-los regularmente.
Validao inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de
operao e cada configurao de carga usada em prtica. Este processo deve
ser repetido aps o reparo ou modificao significativa. Suficientes sensores de
temperatura devem ser posicionados dentro da carga para demonstrar a
penetrao de calor adequado em todos os locais. Validao e revalidao
devem considerar a adequao dos tempos de aquecimento e resfriamento,
bem como a temperatura de esterilizao.
Para cada carga, no mnimo, um indicador de processo deve ser includo no
centro da carga para verificar o processo de aquecimento onde um registro
rastrevel da eficincia do processo no est disponvel.
<.+ Preparador de Meio
<.+.1 1escri5o
Um preparador de meio desenvolvido principalmente para a esterilizao de
grandes volumes de meio (>1L). constitudo por uma caldeira, compartimento
de gua e um dispositivo de agitao contnua. O equipamento deve tambm
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25 de
121
Re,iso( 00
ser equipado com um medidor de temperatura, medidor de presso, timer, e
vlvula de segurana.
Alm disso, a unidade deve ter uma trava de segurana para impedir abertura
at que uma temperatura de <80 C seja alcanada.
<.+.) Uso
Siga as instrues do fabricante em todos os momentos.
Todo o processo produtivo ocorre dentro do aparelho. Aps a adio de todos
os ingredientes, eles so dissolvidos por agitao e aquecimento. sto
seguido pela esterilizao.
<.+./ Man8ten5o
Lavar o preparador e enxaguar abundantemente com gua purificada entre
cada lote de meio.
<.+.: 2eriAica5o
O preparador deve ser mantido em boas condies de funcionamento e
inspecionado regularmente por profissionais competentes, de acordo com as
instrues do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condies de
funcionamento e verificar regularmente o seu desempenho.
Validao inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de
operao e cada tamanho de carga utilizada na prtica. Este processo deve ser
repetido aps o reparo ou modificao significativa. Duas sondas de
temperatura, uma ao lado da sonda controle e outra adjacente a ele, devem ser
usadas para demonstrar aquecimento uniforme.
A temperatura e a durao de cada ciclo devem ser verificadas.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
<.H Est8Aa
<.H.1 1escri5o
Uma estufa consiste de uma cmara de isolamento que permite que a
temperatura seja mantida estvel e distribuda de forma uniforme, dentro do
erro mximo admissvel de temperatura especificado no mtodo de ensaio.
<.H.) Uso
Estufas devem estar equipadas com um sistema de regulao que permite que
a temperatura ou outros parmetros sejam mantidos estveis ao longo do
volume inteiro de trabalho. Definir o volume de trabalho para garantir que este
seja alcanado.
Se a temperatura ambiente prxima ou maior do que o da incubadora,
necessrio colocar um sistema de resfriamento para a cmara.
As paredes de estufas devem ser protegidas da luz solar.
Se possvel, as estufas no devem ser completamente preenchidas em uma
nica operao, porque os meios de cultura tero um longo tempo para entrar
em equilbrio da temperatura, independentemente do tipo de estufa utilizada
(por conveco forada de ar ou de outra forma). Evitar deixar a porta aberta
por longos perodos.
Ao carregar as estufas, deve ser dada ateno circulao de ar (ver 10.2.4).
<.H./ &impe@a e saniti@a5o
Limpar e higienizar regularmente as paredes internas e externas da estufa e,
se for o caso, remover o p do sistema de ventilao.
<.H.: 2eriAica5o
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121
Re,iso( 00
Verificar a estabilidade da temperatura e da homogeneidade da distribuio de
temperatura durante todo o volume de trabalho da estufa atravs do uso
simultneo de termmetros ou termopares com conhecida preciso e faixa de
temperatura adequada.
Use as informaes para definir a faixa de operao aceitvel da incubadora e
a posio ideal do termmetro usado para monitorar a temperatura de trabalho.
Por exemplo, para atingir uma temperatura alvo de 37 C 1 C quando os
dados de um lado mostrarem um intervalo de 36,8 C para 37,3 C do outro
lado da estufa, em seguida, a faixa de operao deve ser reduzida para 36,2
C para 37,7 C, a fim de garantir que a todas as partes da estufa atinjam a
temperatura alvo de 37 C.
Este processo deve ser repetido aps cada reparo ou modificao significativa.
A temperatura de operao deve ser verificada com um ou mais termmetros
de mxima e mnima ou termopares gravao, por exemplo.
O termopar ou termmetro de gravao utilizado para o monitoramento de
rotina da estufa deve ser fixado em uma posio definida a partir dos dados de
perfil como atingir a temperatura alvo.
Verifique a temperatura da estufa, pelo menos, a cada dia de trabalho. Para
este efeito, cada estufa deve incorporar pelo menos um dispositivo de medio
de trabalho, cuja sonda pode ser imersa em glicerol (ou outro dissipador de
calor apropriado) contida em um frasco lacrado.
Outros sistemas de verificao de desempenho equivalentes podem ser
utilizados.
<.I eladeiraE cJmaras ArigorKAicas
<.I.1 1escri5o
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
Estes so cmaras que permitem o armazenamento refrigerado. Para a
conservao de amostras de alimentos para anlise, a temperatura ser de
3C +2C (erro mximo admissvel), exceto para aplicaes especficas.
Para outros usos, a temperatura, salvo indicao em contrrio, deve ser de 5C
+3C.
<.I.) Uso
A fim de evitar a contaminao cruzada, use cmaras diferentes, ou pelo
menos diferentes recipientes, para alcanar separao fsica, para o
armazenamento de
- meios de cultura e reagentes no inoculadas,
- amostras de teste, e
- culturas de microorganismos e meios de cultura incubados.
Carregar geladeiras, chillers e cmaras frigorficas de tal forma que a
circulao de ar adequada seja mantida e o potencial de contaminao cruzada
minimizado.
<.I./ 2eriAica5o
Verifique a temperatura de cada cmara a cada dia de trabalho usando um
termmetro ou uma sonda instalada permanentemente. A preciso exigida do
dispositivo de monitoramento de temperatura dependente do propsito para o
qual a unidade utilizada.
<.I.: Man8ten5o e limpe@a
Realizar as seguintes operaes de manuteno em intervalos regulares para
garantir a operao adequada:
POP MET MIC 001
29 de
121
Re,iso( 00
- remoo da poeira das ps do motor ou do exterior de troca de calor placas;
- descongelao;
- limpeza e higienizao do interior das cmaras.
<.10 Lree@er e congelador
<.10.1 1escri5o
Um freezer uma cmara que permite o armazenamento de produtos
congelados. A temperatura, a menos que especificada de outra forma, deve ser
inferior a -15 C, de preferncia abaixo de -18 C para as amostras de
alimentos.
Um ultra-freezer uma cmara que permite armazenamento de produtos
ultracongelados. A temperatura, a menos que necessite contrrio, deve ser
abaixo de -70 C.
<.10.) Uso
<.10.).1 Lree@er
Cmaras diferentes, ou pelo menos diferentes recipientes, devem estar
disponveis para conseguir a separao fsica para o armazenamento de:
- reagentes no inoculados,
- amostras para anlise, e
-culturas de micro-organismos.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, em
particular quando produtos descongelados so introduzidos.
<.10.).) UltraMAree@er
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
usado no armazenamento de micro-organismos de cultura referncia, e / ou
de trabalho, e reagente.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, e evite a
contaminao cruzada entre micro-organismos e reagentes.
<.10./ 2eriAica5o
Verificar a temperatura de cada cmara regularmente, usando um dispositivo
de monitorizao de temperatura adequado.
<.10.: Man8ten5o
Realizar regularmente as seguintes operaes de manuteno:
- remoo da poeira das ps do motor e do externo de troca de calor placas (se
acessvel);
- descongelao;
- limpeza e higienizao do interior das cmaras.
<E11 %anDo controlado termostaticamente N7anDoMmariaO
<.11.1 1escri5o
Um banho controlado termostaticamente, cheio de um lquido (gua,
etilenoglicol, etc), com ou sem tampa ou equipado com outro dispositivo para
limitar a evaporao, necessria para manter uma temperatura especificada.
Controle de temperatura muitas vezes mais preciso do que em uma estufa
incubadora, permitindo erros mximos admissveis de 0,5C ou menores.
As temperaturas necessrias de trabalho e os erros mximos admissveis so
estipulados em cada aplicao ou mtodo. Um sistema de resfriamento
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
necessrio para manter uma temperatura prxima ou abaixo da temperatura
ambiente.
<.11.) Uso
Os principais usos so os seguintes:
- incubao a uma temperatura constante de meios de cultura inoculados;
- manuteno de gar estril fundido durante a preparao dos meios;
- manuteno de temperatura de gar estril fundido para uso em mtodos
especficos;
- preparao de suspenses ou solues de amostra inicial a uma temperatura
controlada;
- tratamento trmico de suspenses de amostra inicial a uma temperatura
controlada (pasteurizao, por exemplo).
Onde o controle preciso da temperatura necessrio, o banho deve ser
equipado com uma bomba de circulao de gua e um sistema de regulao
de temperatura automtico. Qualquer agitao do lquido no deve causar
disperso de gotculas.
Banhos com tampa so preferveis para o uso preciso ou altas temperaturas.
Tampas inclinadas que permitem a drenagem de condensado devem ser
usadas.
Para a incubao dos caldos inoculados, manter o nvel do lquido de modo
que a parte superior do caldo fique pelo menos 2 centmetros abaixo do nvel
do lquido no banho durante todo o perodo de incubao.
Outros recipientes devem ser colocados dentro do banho de forma que o nvel
do seu contedo seja inferior ao do lquido.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
A profundidade de imerso deve impedir a entrada de gua atravs do
fechamento.
Dispositivos para manter a estabilidade dos recipientes podem ser necessrios,
por exemplo, estantes.
Todos os recipientes devem ser secados aps a remoo do banho e antes de
nova utilizao.
<.11./ 2eriAica5o
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura em todo o banho
antes do uso inicial e depois de qualquer reparo ou modificao que tenha um
efeito sobre o controle de temperatura.
Monitorar cada banho com um dispositivo termopar, termmetro, ou gravador
de temperatura com o mnimo adequado grau de incerteza de medio (ver
5.28.2), e independente do sistema de regulao de temperatura automtico.
Um display digital tambm pode ser usado, desde que a sua preciso e
resoluo sejam verificadas.
Monitorar a temperatura do banho durante cada uso ou pelo menos
diariamente, por perodos prolongados de incubao.
<.11.: Man8ten5o
Banhos devem ser preenchidos com lquido, tal como recomendado pelo
fabricante. Para a incubao das culturas, gua destilada ou deionizada deve
ser preferencialmente utilizada.
Verifique regularmente o nvel do lquido para garantir o correto funcionamento
do banho e imerso satisfatria de itens na banheira. O nvel do lquido deve
cobrir sempre os elementos de aquecimento.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
Banhos devem ser esvaziados, limpos, higienizados e reabastecidos
regularmente e com uma frequncia dependendo do uso, ou depois da
ocorrncia de um derrame.
<.1) 2apori@adoresE incl8indo 7anDos de g8a Aer,ente
<.1).1 1escri5o
Vapor de gua fervente e banhos consistem de um elemento de aquecimento
cercado por gua em um recipiente com uma tampa aderente. Um banho de
gua fervente aquece a gua a uma temperatura igual ou prxima ao ponto de
ebulio, com ou sem a produo de vapor.
<.1).) Uso
Os principais usos so os seguintes:
-derretimento de gar;
- preparao de meio termo lbil;
- reduo da contaminao de pequenos itens de equipamentos entre o uso.
O nvel seguro e adequado de gua deve estar presente no recipiente para
garantir que os elementos de aquecimento esto cobertos em todos os
momentos.
Autoclave com um compartimento para liberar vapor tambm pode ser usado.
<.1)./ Man8ten5o
Mantenha vaporizadores e banhos de gua fervente com gua limpa.
Se necessrio, descalcificao regular deve ser feita a uma frequncia
dependente da dureza da gua local.
POP MET MIC 001
34 de
121
Re,iso( 00
<.1/ Lorno de esterili@a5o
<.1/.1 1escri5o
Um forno de esterilizao uma cmara que capaz de manter uma
temperatura de 160C a 180C para a destruio de micro-organismos pelo
calor seco.
<.1/.) Uso
Apenas os equipamentos robustos, como vidro e metal para devem ser
esterilizados no forno de esterilizao, no us-lo para artigos de plstico e
borracha.
Antes da esterilizao, limpe todos os vidros e metais para serem esterilizados
no forno.
Se vidro volumtrico for esterilizado no forno de esterilizao, deve-se verificar
regularmente a preciso dos volumes marcados.
A temperatura deve ser uniforme em toda a cmara. O forno deve estar
equipado com um termostato e um dispositivo de termmetro ou de gravao
de temperatura com preciso adequada.
Deve ser equipado com um indicador de tempo, ou temporizador.
Uma vez que a temperatura de funcionamento atingida, o processo de
esterilizao deve durar pelo menos 1 hora a 170C ou uma equivalente
combinao de tempo/temperatura.
Aps a esterilizao, para evitar rachaduras, vidros devem ser mantidos no
forno at seu resfriamento antes da remoo.
<.1/./ 2eriAica5o
POP MET MIC 001
35 de
121
Re,iso( 00
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura durante todo o forno
antes do uso inicial e depois de qualquer reparao ou modificao que possa
ter um efeito sobre o controle de temperatura.
O forno deve estar equipado com um dispositivo termopar termmetro, ou
temperatura de gravao-calibrada de preciso adequada, que independente
do sistema de regulao de temperatura automtico. O monitoramento do
dispositivo deve ter uma resoluo de 1C, ou melhor, na temperatura do forno
utilizado.
A temperatura do forno deve ser monitorada e gravada durante cada uso.
<.1/.: Man8ten5o
Limpar as superfcies internas quando necessrio.
<.1: Microondas
<.1:.1 1escri5o
Um forno de micro-ondas um dispositivo que permite o aquecimento de itens
por energia de micro-ondas em presso atmosfrica.
<.1:.) Uso
o uso disponvel do equipamento atualmente apenas para aquecer lquidos
ou derreter meios de cultura com gar.
ATE!"4O M !o aF8e5a meios contendo componentes sensK,eis ao calor
no microondas a menos F8e tenDa sido ,eriAicado F8e esta Aorma de
aF8ecimento no tem nenD8m eAeito so7re o desempenDo do meio.
!enD8ma a,alia5o ainda Aoi Aeita da eAiciBncia do microMondas para
esterili@ar meios de c8lt8ra e Aornos de microMondas no de,em ser 8sado
para esta Ainalidade.
POP MET MIC 001
36 de
121
Re,iso( 00
O forno deve ser capaz de aquecer lquidos e meios de cultura de forma
controlada atravs de um ciclo de emisso de micro-ondas. A distribuio das
micro-ondas deve ser homognea para evitar zonas de superaquecimento.
Fornos equipados com disco girador ou um agitador para o micro-ondas
possuem uma melhor distribuio de calor.
No utilize o equipamento de metal, incluindo os fechos de metal. Solte tampas
de garrafas ou tampas antes do aquecimento.
Aquecimento por perodos mais longos em avaliaes de baixa potncia pode
dar uma melhor distribuio de calor.
ATE!"4O M Man8seie itens aF8ecidos com c8idado. ContePdo podem se
tornar s8peraF8ecidos e podem Aer,er para Aora das garraAas o8 as
garraAas podem eGplodir.
O gar deve derreter em uma configurao de baixa potncia (por exemplo,
ciclo de degelo), e um dissipador de calor da gua (por exemplo, 50 ml a 100
ml de gua em um copo de micro-ondas) so recomendados para auxiliar o
controle do processo de aquecimento.
Um tempo de espera de pelo menos 5 min recomendada aps o processo de
aquecimento antes da remoo do frasco, do forno de micro-ondas.
<.1:./ 2eriAica5o
Tempos de aquecimento adequado e ajustes de potncia devem ser
estabelecidos primeiro para os diferentes volumes de lquidos e meios de
cultura rotineiramente manuseados, para garantir um timo desempenho e
evitar superaquecimento de produtos sensveis.
<.1:.: Man8ten5o
POP MET MIC 001
37 de
121
Re,iso( 00
Limpar o forno imediatamente caso ocorra qualquer derrame, bem como em
intervalos regulares, dependendo do uso.
Selos de porta dos fornos devem ser inspecionados para verificao da
integridade e o forno checado para vazamento de radiao em intervalos
regulares.
<E1< &a,ador de ,idro
<.1<.1 1escri5o
Lavadores de vidro de laboratrio so mquinas controladas eletronicamente
para lavagem geral de vidraria de laboratrio, que podem ser programadas
para diferentes ciclos de lavagem e enxgue (por exemplo, gua destilada ou
deionizada ou cido).
Dispositivos para lavagem de pipetas de vidro so lavadores de vidro
projetados especialmente para limpar os orifcios estreitos de pipetas.
<.1<.) Uso
Muitos tipos de mquina de lavar vidro esto disponveis, e estes so,
geralmente, instalados e utilizados de acordo com instrues do fabricante.
<.1<./ 2eriAica5o
Verificar a eficcia da limpeza por inspeo visual e, em aplicaes crticas,
realizar testes para assegurar que o vidro esta isento de substncias inibidoras.
Resduos alcalinos ou cidos podem ser verificados por meio de uma soluo
deindicador de pH, um pH dentro da faixa de 6,5 a 7,3 deve ser alcanado.
<.1<.: Man8ten5o
POP MET MIC 001
38 de
121
Re,iso( 00
Programar manuteno regular, conforme especificado pelo fabricante, com
uma frequncia adequada.
Manuteno mais frequente pode ser necessria para equipamentos muito
usados ou em reas de guas duras.
<.1? Microsc9pio 9ptico
<.1?.1 1escri5o
Existem diferentes tipos de microscpio: binocular, monocular, com um sistema
de visualizao por monitor, equipados com uma cmera de fluorescncia, com
uma fonte de luz interna ou externa. Para exames bacteriolgicos, objetivas de
10X (lente seco) a 100X (imerso em leo e com mola turret) so usados para
obter uma ampliao total de 100 a 1000X. Microscopia de contraste de fase
tambm de valor inestimvel para o exame de "Preparaes liquidas".
<.1?.) Uso
Configure o sistema tico do microscpio de acordo com as instrues do
fabricante. O eixo ptico da luz da lmpada de alta intensidade deve passar
pelo centro do condensador de sub-estgio, o deslizador e a lente objetiva pela
ocular para que aberraes esfricas e cromticas no ocorram.
<.1?./ Man8ten5o
Siga as instrues do fabricante para o armazenamento, a limpeza e
manuteno. Evitar a condensao que ocorre quando a umidade alta, pois
isso pode levar deteriorao da qualidade da lente.
Cada dia ou aps o uso, remover o leo das lentes de imerso e peas
relacionadas com o tecido da lente. Use um solvente recomendado pelo
fabricante. Regularmente remover da lente ocular a gordura causada por clios.
POP MET MIC 001
39 de
121
Re,iso( 00
O sistema ptico pode ser facilmente danificado, desejvel que a
manuteno seja feita de preferncia pelo fabricante.
<.1+ %ico de %8nsen o8 incinerador de Aio
<.1+.1 1escri5o
Bico de Bunsen produz uma chama nua estreita a partir de rede de gs ou
bujo. Variando a quantidade de ar misturado com o gs para controlar o grau
de calor produzido.
ncineradores de fio usam gs ou eletricidade para alcanar calor vermelho
sem uma chama para esterilizar alas ou agulhas usados para a manipulao
de culturas.
<.1+.) Uso
Um bico de bunsen usado principalmente para a esterilizao de alas de
metal e agulhas, trazendo-os ao calor vermelho e para outros pequenos itens
de equipamentos durveis a chama - esterilizante.
O incinerador de fio usado para esterilizar alas de metal e agulhas, e
preferido ao manusear bactrias patognicas, uma vez que evita respingos e
evita riscos de contaminao cruzada.
Queimadores a gs podem produzir muito calor e turbulncia do ar no
laboratrio.
Tcnica de assepsia pode ser alcanada sem um queimador de gs, utilizando
materiais descartveis. Em cabines de segurana biolgica, o uso de
queimadores a gs deve ser evitado, pois podem interferir inaceitavelmente
com o fluxo laminar de ar. Neste caso, o uso de material descartvel estril
recomendado.
<.1+./ Man8ten5o
POP MET MIC 001
40 de
121
Re,iso( 00
Limpar e desinfetar regularmente bicos de bunsen e capas dos incineradores
de fio, especialmente se qualquer cultura microbiana tiver sido derramada
sobre os dispositivos.
<.1H 1ispenser para meios de c8lt8ra e reagentes
<.1H.1 1escri5o
Um dispensador um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios
de cultura e reagentes em tubos, frascos ou Placas de Petri. Tais dispositivos
variam de cilindros de medio simples, pipetas ou seringas manuais, at
seringas automticas e bombas peristlticas programveis por dispositivos
controlados eletronicamente, com uma entrega varivel automtica.
<.1H.) Uso
Equipamento limpo usado para distribuio de meios de cultura e reagentes
deve estar livre de substncias inibidoras. Usar tubulao separada para meios
seletivos para minimizar o carreamento de tais substncias.
Se a distribuio assptica de meios de cultura estreis e reagentes
necessria, todas as partes do equipamento de dispensao em contato com o
produto devem ser estreis.
<.1H./ 2eriAica5o
A incerteza de medio do instrumento ou aparelho deve ser adequada para o
mximo de erro admissvel no volume a ser dispensado, que no deve exceder
5% rotineiramente. O mximo de erro admissvel em medio de volumes de
lquido de diluio usado para preparar diluies decimais 2%.
Verifique volumes dispensados antes do uso inicial, depois, regularmente, de
acordo com um cronograma documentado, e sempre aps os ajustes que
afetam o volume dispensado.
POP MET MIC 001
41 de
121
Re,iso( 00
<.1H.: &impe@a e man8ten5o
Limpar a superfcie externa do dispenser aps cada utilizao. Lavar e
enxguar bem todas as partes do dispenser que entrarem em contato com o
produto e esteriliz-los se necessrio para o uso em lquido estril. No utilizar
desinfetantes em superfcies que entrem em contato com o produto para ser
dispensado, pois podem transmitir propriedades inibidoras.
Todos os dispensadores automticos devero ser mantidos em boas condies
de manuteno, de acordo com as instrues do fabricante.
<.1I 29rteG
<.1I.1 1escri5o
Este instrumento facilita a mistura homognea de meios lquidos (por exemplo,
diluies decimais e amostras de lquido para teste) ou suspenses de clulas
bacterianas em um lquido.
A mistura alcanada por um movimento de rotao excntrica do contedo do
tubo ou recipiente (produzindo um vrtex).
<.1I.) Uso
Pressione a base do tubo ou recipiente contendo o lquido a ser misturado
contra a cabea do mixer. A velocidade de mistura controlada pela variao
da velocidade do motor ou o ngulo de contato com a cabea do mixer.
O operador deve assegurar que o derramamento no ocorra durante a mistura,
ajustando a velocidade quando necessrio e segurando o tubo
aproximadamente um tero de seu comprimento abaixo do topo, a fim de ser
capaz de controlar melhor o tubo e, evitar que o lquido suba muito alto no tubo.
Precaues apropriadas devem ser tomadas para minimizar a libertao de
aerossis ao abrir recipientes em agitao.
POP MET MIC 001
42 de
121
Re,iso( 00
<.1I./ 2eriAica5o
Mistura adequada evidenciada pelo aparecimento de um vrtice em toda a
profundidade do lquido durante a operao de mistura.
<.1I.: Man8ten5o
Manter o equipamento limpo. Se ocorrer o derramamento, descontaminar o
equipamento usando um desinfetante de laboratrio adequado.
<.)0 Contador de ColQnias
<.)0.1 1escri5o
Contador de colnias manual utiliza dispositivo de contagem acionadas por
presso e, geralmente, do uma indicao audvel de cada contar e possuem
um visor digital da contagem geral. Elas podem ser simples dispositivos pen-
like ou podem consistir de um suporte iluminado com uma grade calibrada para
a placa e uma lente de aumento para ajudar na deteco de colnia.
Contadores de colnia eletrnicos automatizados, analisadores de
incorporadores de imagem, operam por uma combinao de sistemas de
hardware e software, incorporando o uso de uma cmera e um monitor.
<.)0.) Uso
Seguir as instrues do fabricante. Ajustar a sensibilidade de um contador
automtico para garantir que todas as colnias sero contadas. Contadores
eletrnicos automatizados de colnia tambm exigem programao separada,
quando utilizado com diferentes tipos de agar e matrizes, e para a contagem
em spread plate e pour plate, para assegurar adequada discriminao de
colnias alvo.
<.)0./ 2eriAica5o
POP MET MIC 001
43 de
121
Re,iso( 00
Verificaes devem ser feitas manualmente em uma base regular para
assegurar que as contagens precisas so obtidas utilizando um contador de
colnia.
Alm disso, contadores de colnias automatizados devem ser verificados a
cada dia de utilizao com uma placa de calibrao contendo um conhecido
nmero de partculas contvel ou colnias.
<.)0.: Man8ten5o
Manter o equipamento limpo e livre de poeira, evitar arranhar as superfcies
que so um elemento essencial do processo de contagem. Programar a
manuteno peridica de contadores eletrnicos que incorporam analisadores
de imagem como especificado pelo fabricante, em uma freqncia adequada.
<.)1 EF8ipamento para c8lt8ra em atmosAera modiAicada
<.)1.1 1escri5o
Este pode ser um frasco que possa ser hermeticamente fechado ou qualquer
outro equipamento apropriado que permita condies de atmosfera modificada
(por exemplo, para anaerobiose) para ser mantido durante o tempo total de
incubao do meio de cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente
tais como cabines de anaerobiose, podem ser usados.
Siga as instrues do fabricante para a instalao e manuteno.
<.)1.) Uso
A composio da atmosfera necessria pode ser obtida por meio da adio de
uma mistura de gases (por exemplo, de um cilindro de gs) aps a sada do ar
do frasco, pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por qualquer
outro meio apropriado (como pacotes de gs disponvel no mercado).
POP MET MIC 001
44 de
121
Re,iso( 00
Em geral, incubao anaerbica requer uma atmosfera de menos de 1% de
oxignio, 9% a 13% de dixido de carbono; incubao microaerbica
(capnaerbica) requer uma atmosfera de 5% a 7% de oxignio e cerca de 10%
de dixido de carbono.
Condies talvez precisem ser modificadas dependendo das exigncias do
micro-organismo especfico.
<.)1./ 2eriAica5o
Coloque um indicador biolgico ou qumico para monitorar a natureza da
atmosfera em cada cmara durante cada uso. Crescimento da estirpe controle
ou uma mudana de cor do indicador qumico verifica se as condies de
incubao apropriada foram alcanadas.
<.)1.: Man8ten5o
Se um catalisador montado, deve-se regener-lo regularmente, em
conformidade com as instrues do fabricante. Se as vlvulas esto instaladas,
limpar e lubrificar-las para garantir o funcionamento correto e substituir se
necessrio.
Regularmente limpar e higienizar o equipamento.
<.)) CentrKA8ga
<.)).1 1escri5o
Centrfugas so dispositivos operados mecnica ou eletronicamente que usam
a fora centrfuga para separar partculas suspensas, incluindo micro-
organismos, a partir de fluidos.
<.)).) Uso
POP MET MIC 001
45 de
121
Re,iso( 00
Em algumas aplicaes, a concentrao de micro-organismos alvo atingida
por centrifugao de amostras de lquido para promover a formao de um
deposito que pode ser ressuspendido em lquido e submetido a um exame
mais aprofundado.
Tomar as precaues necessrias para impedir a gerao de aerossis e
contaminao cruzada, pelo uso correto do equipamento e o uso de tubos de
centrifugao fechados e estreis ou potes.
<.))./ 2eriAica5o
Onde a velocidade de centrifugao crtica ou especificada no ensaio, utilizar
regularmente um indicador de velocidade e tacmetro calibrado independente,
e sempre aps reparos ou modificaes significativas.
<.)).: Man8ten5o
Limpar e desinfetar centrfugas regularmente e aps qualquer derrame
envolvendo culturas microbianas ou amostras potencialmente contaminadas.
Centrfugas devem ser sofrer manuteno regularmente.
<.)/ Placa de aF8ecimento
<.)/.1 1escri5o
Placas de aquecimento so dispositivos de aquecimento controlados
termostticamente. Alguns equipamentos incorporam sistemas de agitao
magntica.
<.)/.) Uso
Placas de aquecimento equipados com sistemas de agitao magntica so
utilizados para aquecimento de grande volumes lquidos, tais como meios.
POP MET MIC 001
46 de
121
Re,iso( 00
No use placas de aquecimento sem sistemas de agitao para a preparao
dos meios de cultura.
<.)/./ Man8ten5o
Limpar qualquer derrame logo que a unidade for resfriada.
<.): PlaF8eador espiral a8tomtico
<.):.1 1escri5o
O plaqueador espiral automtico um equipamento que distribui um volume
predeterminado de lquido sobre a superfcie de uma placa de gar em rotao.
O brao de distribuio se move do centro do placa para a borda de fora,
formando uma Espiral de Arquimedes. O volume dispensado diminu assim que
o dispensador de distribuio se move do centro para a borda da placa, de
modo que se forme uma relao inversa entre o volume depositado e o raio da
espiral. O volume da amostra dispensado em qualquer segmento especfico
conhecido e constante. Uma fonte de vcuo necessria para o
carregamento e distribuio de lquidos.
<.):.) Uso
O equipamento utilizado para dispensar uma amostra de lquido, uma
amostra homogeneizada ou uma diluio em uma placa de gar adequada, a
fim de determinar a contagem de colnias. Aps a incubao, as colnias se
desenvolvem ao longo das linhas onde o lquido foi depositado. O nmero de
colnias em uma rea conhecida contada usando uma grade de contagem
fornecido com o equipamento e a contagem calculada.
A superfcie da placa de gar usada como base deve ser reta e livre de bolhas
de ar.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
As placas devem ser pr-secadas antes do uso para garantir que esto livres
do excesso de umidade.
O sistema de distribuio deve ser higienizado e lavado com gua estril antes
de cada amostra e aps o uso.
<.):./ 2eriAica5o
Verificar o ngulo de ponta da caneta diariamente usando um vcuo para
segurar uma lamnula sobre a face da caneta. A tampa de deslizamento deve
ser paralela e a 1 mm da superfcie do gar.
O padro de distribuio deve ser verificado por meio da supresso de tinta
lavvel. O padro espiral deve ser mais denso prximo ao centro do placa onde
a deposio comea e tornar-se cada vez menos denso, no ponto de sada da
caneta. A poro clara da placa deve ser central e com cerca de 2,0 cm de
dimetro.
Uma verificao diria deve ser realizada para garantir que a ponta da caneta
esteja no ngulo correto para a superfcie do gar usando a tampa de
deslizamento e indicador de nvel fornecido com o instrumento.
A esterilidade da placa espiral deve ser verificada por plaqueamento de gua
estril para cada srie de amostras examinadas.
Uma verificao gravimtrica do volume de dispensados deve ser realizada
regularmente com gua destilada. A massa obtida deve estar dentro de um erro
mximo admissvel de +5% da massa esperada para o volume dispensado.
<.):.: Man8ten5o
Desinfeco da tubulao de distribuio e da caneta pode ser conseguida
atravs de lavagem com uma soluo contendo 0,5% a 1% de cloro livre. sto
deve ser seguido por enxgue com gua destilada ou deionizada estril.
POP MET MIC 001
48 de
121
Re,iso( 00
Bloqueios podem ser evitados utilizando suspenses ou uma parcela do lquido
sobrenadante, para que todas as partculas sejam removidas antes da
colocao da suspenso da amostra.
Eventuais derrames devem ser removidos imediatamente e os equipamentos
limpos em uma base regular.
O equipamento deve ser reparado e verificado de acordo com o uso.
<.)< 1estiladoresE deioni@adores e aparelDos de osmose re,ersa
<.)<.1 1escri5o
Estes dispositivos so usados para produzir gua destilada ou deionizada/
desmineralizada com a qualidade exigida para a preparao de meios de
cultura microbiolgicos ou reagentes de laboratrio e para outras aplicaes.
<.)<.) Uso
nstalar, autorizar e usar equipamentos em conformidade com as instrues do
fabricante, tendo em conta a localizao da gua de laboratrio, resduos e
servios eltricos.
<.)<./ 2eriAica5o
gua deve ser controlada regularmente, ou quando usada aps o
armazenamento para condutividade satisfatria, e no ser mais de 25 S/cm
(equivalente a uma resistividade > 40 000D cm) para o preparo de meios e
reagentes.
Se a gua armazenada antes do uso ou produzida atravs de um trocador de
ons, controles adequados de contaminao microbiana devem ser realizados
em conformidade com o POP MET MC 001.
<.)<.: Man8ten5o
POP MET MIC 001
49 de
121
Re,iso( 00
Destiladores devem ser limpos e descalcificados com uma freqncia
dependente da dureza da gua de entrada. Deionizadores e aparelhos de
osmose reversa devem ser mantidos de acordo com as instrues do
fabricante.
<.)? Tempori@adores e dispositi,os de tempori@a5o NtimerO
<.)?.1 1escri5o
Dispositivos de temporizao e temporizadores integrais so instrumentos que
permitem que o perodo de tempo correto seja usado para muitas aplicaes
no laboratrio, onde a durao especificada e crtica.
<.)?.) Uso
Timer analgico ou digital, porttil ou de bancada so usados para monitorar a
durao das operaes de laboratrio (Por exemplo, aplicao de manchas de
filmes microbianos, homogeneizao das amostras) devem estar em boas
condies de funcionamento e capazes de alcanar a preciso exigida.
Operar timer integrado sobre equipamentos de laboratrio (por exemplo,
autoclaves, centrfugas, homogeneizadores), em conformidade com as
instrues do fabricante. Estes temporizadores devem ser capazes de alcanar
a preciso exigida.
<.)?./ 2eriAica5o
Verifique todos os temporizadores utilizados nas operaes de laboratrio,
onde a durao fundamental para o resultado, com outro marcador de tempo
regularmente, e aps reparos significativos.
<.)?.: Man8ten5o
Limpar e verificar regularmente o timer para o funcionamento correto.
POP MET MIC 001
50 de
121
Re,iso( 00
Dispositivos de tempo integral devem ser verificados como parte do
procedimento de manuteno para o instrumento.
<.)+ Pipetas e pipetadores
<.)+.1 1escri5o
Pipetas so dispositivos de vidro ou de plstico descartveis usados para
fornecer volumes de materiais lquidos ou viscosos; pipetas graduadas
entregam volumes medidos com uma preciso que depende da especificao.
Pipetadores automticos (mecnicos) equipados com pontas de plstico so
dispositivos que dispensam volumes fixos ou ajustveis de lquidos,
manualmente ou por ao de pisto operado eletronicamente.
<.)+.) Uso
Descartar pipetas que esto danificadas ou quebradas.
Pipetas Pasteur estreis ou pipetas graduadas e ponteiras devem ser
equipadas com uma ficha de l de algodo no-absorvente para evitar
contaminao quando usado para manipular culturas microbianas.
No executar pipetagem com a boca em instalaes microbiolgicas, exceto
para lquidos no-contaminados.
Bulbos usados em pipetas Pasteur ou pipetas graduadas e em ponteiras para
pipetadores automticos devem ser do tamanho correto para evitar sada de
liquido e garantir um funcionamento eficiente.
<.)+./ 2eriAica5o
Verificar se as pipetas graduadas entregam o volume correto, se o fabricante
no certificar a sua exatido (veracidade e preciso).
POP MET MIC 001
51 de
121
Re,iso( 00
Testar os pipetadores novos antes de entrar em uso, e em intervalos regulares,
dependendo da freqncia e natureza de uso, para confirmar que esto em
acordo com os erros mximos admissveis definidos em norma especfica.
Executar checagem gravimtrica intermediria usando gua destilada ou
deionizada para garantir que os volumes dispensados permanecem dentro dos
erros mximos admissveis.
Confira novos lotes de pipetas graduadas.
<.)+.: Man8ten5o
Descontaminar e limpar/ esterilizar apropriadamente pipetas no-descartveis
e pipetadores automticos, aps cada uso.
Se os barris ou pistes de pipetadores automticos se contaminarem em uso,
desmont-los para descontaminao e limpeza. Aps a montagem, recalibr-
los. Quando no for possvel que isso seja feito em laboratrio, retornar o
pipetadores ao fabricante para a montagem e recalibrao.
<.)H TermQmetros e dispositi,os de monitori@a5o da temperat8raE
incl8indo aparelDos de registro a8tomtico
<.)H.1 1escri5o
Termmetros so dispositivos de mercrio ou lcool em vidro que so usados
para monitorar temperaturas em toda a gama de atividades de laboratrio.
Outros dispositivos de monitorizao da temperatura incluem termmetros de
resistncia de platina e os instrumentos que usam termopares para medir
temperatura e fornecer um registro visual, impresso ou eletrnico de
temperatura com variao do tempo.
Termmetros de referncia e outros dispositivos de monitorizao da
temperatura devem ser calibrados para padres nacionais ou internacionais e
POP MET MIC 001
52 de
121
Re,iso( 00
certificada como tal. Eles devem ser utilizados apenas como referncia e no
deve ser utilizado para o monitoramento de rotina.
Termmetros de trabalho e outros dispositivos de gravao de temperatura
devem ser calibrados de forma que permita rastreabilidade a padres nacionais
ou internacionais.
Dispositivos de preciso adequados, que estejam em conformidade com uma
especificao internacional ou nacional podem tambm ser usados como
termmetros de trabalho aps verificao da sua performance.
<.)H.) Uso
Termmetros e outros dispositivos de monitorizao da temperatura devem ser
capazes de medir a temperatura requerida por um aplicativo dentro de
determinados erros mximos admissveis.
A incerteza de medio do dispositivo de monitoramento de temperatura deve
ser quatro vezes menor do que o alcance do erro mximo admissvel solicitado.
Por exemplo, para um erro mximo permissvel de +1C, a incerteza de
medio deve ser de +0,25C, para um erro mximo permissvel de +0,5C, a
incerteza de medio deve ser de 0,125C. A incerteza de medio da
calibrao do termmetro de referncia tambm deve levar em conta a
determinao da temperatura de funcionamento.
Termmetros ou termopares colocados em incubadoras de ar devem ser
protegidos em recipientes adequados cheio de glicerol, parafina lquida ou
polipropilenoglicol para proteger contra a perda de calor quando a porta
aberta e fornecer uma leitura estvel.
Usar termmetros de imerso total com apenas o bulbo imerso.
Termmetros colocados em banhos-maria devem ser imersos na gua, em
conformidade com as especificaes individuais, por exemplo, imerso parcial
POP MET MIC 001
53 de
121
Re,iso( 00
termmetros devem ser imersos na profundidade especificada para esse
termmetro, por exemplo, 76 mm ou 100 mm.
No usar termmetros se a coluna de mercrio ou lcool estiver quebrada.
Termmetros de mercrio em vidro so frgeis e, se houver um risco de
quebra, eles devem ser colocados dentro de dispositivos de proteo que no
interferem com as medies de temperatura.
A2ISO M O mercPrio C perigoso para a saPde. Remo,er derramesE em
conAormidade com reg8lamentos da legisla5o nacional.
<.)H./ 2eriAica5o
Termmetros de referncia devem ser calibrados em todos os pontos com
padres rastreveis nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial
e pelo menos a cada 5 anos. Verificao intermediria de um nico ponto de
calibrao (por exemplo, ponto de gelo) deve ser realizada para verificar o
desempenho.
Termopar de referncia deve ser totalmente calibrado com padres rastreveis
nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial e de acordo com
instrues do fabricante. Verificaes intermedirias so efetuadas com um
termmetro de referncia para verificar o desempenho.
Outros dispositivos de monitorizao da temperatura (como receptores de
ondas de rdio) devem ser calibrados com padres rastreveis de acordo com
normas nacionais ou internacionais, em conformidade com as instrues do
fabricante.
Termmetros de trabalho e termopares devem ser verificados no ponto de gelo
e / ou com um termmetro de referncia na faixa de temperatura de trabalho.
<.)H.: Man8ten5o
POP MET MIC 001
54 de
121
Re,iso( 00
Manter termmetros e termopares em bom estado de limpeza.
Manter outros dispositivos de monitorizao da temperatura de acordo com as
instrues do fabricante.
<.)I Separador im8nomagnCtico
<.)I.1 1escri5o
Este equipamento usado para separar e concentrar micro-organismos alvo
em culturas lquidas por meio de esferas paramagnticas revestidas com um
anticorpo apropriado.
Separador manual consiste de um misturador rotativo capaz de ir de 12 RPM a
20 RPM, e um concentrador de partculas com uma barra magntica removvel.
Separadores automticos usam matrizes de barras magnticas e suportes de
tubos. As partculas magnticas mudam de tubo para tubo e permitem que o
processo inteiro de separao, incluindo as etapas de lavagem, possa ser
executado automaticamente em um ambiente fechado.
<.)I.) Uso e ,eriAica5o
Siga as instrues do fabricante para uso e aquelas dadas em normas
especficas (por exemplo, E. coli O157).
Para o sistema manual, verificar a velocidade de rotao do misturador.
Para sistemas manuais e automatizados, verifique se o sistema capaz de
isolar em baixos nveis o micro-organismo alvo antes de coloc-lo em uso
rotineiro.
importante valorizar o potencial de contaminao cruzada durante os
procedimentos de separao manual e tomar as medidas adequadas para
evitar que isso acontea.
POP MET MIC 001
55 de
121
Re,iso( 00
<.)I./ Man8ten5o
nspeo e manuteno do equipamento de acordo com as instrues do
fabricante.
<./0 Sistema de Ailtragem
O sistema de filtrao utilizado deve ser como descrito no POP MET MC 003
TEM X.
<./1 O8tros eF8ipamentos e soAtRare
Outro equipamento e seu software associado devero ser capazes de alcanar
a preciso necessria e deve estar em conformidade com as especificaes
relevantes para os testes em questo. Programas de calibrao devem ser
estabelecidos para quantidades ou valores fundamentais em que essas
propriedades tm um efeito significativo sobre o resultado. Antes de uso
rotineiro, calibrar ou verificar o equipamento para comprovar que ele atende
aos requisitos do laboratrio e est em conformidade com as especificaes
padro. Quaisquer reconfiguraes ou modificaes feitas pelo laboratrio para
o software devem ser verificadas para garantir que o software modificado de o
resultado correto.
?.0 PREPARA"4O 1E MATERIAIS 1E 2I1RARIA 1E &A%ORAT'RIO E
OUTROS
?.1 Prepara5o
Vidro e materiais de laboratrio utilizadas em microbiologia devem ser de
projetos adequados, utilizados de forma adequada e preparados de modo a
garantir a sua limpeza e/ ou esterilidade at o momento do uso.
Deve ser projetado para evitar ou limitar o contato entre o operador e o material
infectante.
POP MET MIC 001
56 de
121
Re,iso( 00
Tubos e garrafas devem ser fechados pelos meios adequados. Se necessrio
vidros a serem esterilizados (pipetas, por exemplo) devem ser colocados em
recipientes especiais ou envolto em um material apropriado (papel especial,
papel alumnio, etc.) Vidraria para ser autoclavada vazia deve permitir o acesso
livre de vapor, caso contrrio, a esterilizao no ser alcanada.
?.) Esterili@a5o * descontamina5o
?.).1 eral
A temperatura e a durao da esterilizao / descontaminao devem ser
registradas. ndicadores de esterilizao podem ser usados para distinguir
entre materiais esterilizados e no esterilizados.
?.).) Esterili@a5o por calor seco
Aquecer vidros, etc, em um forno de esterilizao por pelo menos 1 hora a
170C ou equivalente.
?.)./ Esterili@a5o por calor Pmido N,aporO
Vapor mido sob presso o mtodo mais eficaz de esterilizao de vidraria
de laboratrio e materiais.
A temperatura da cmara de autoclave deve ser mantida em 121C por pelo
menos 15 min (ver 5.6).
?.).: 1escontamina5o com compostos F8Kmicos
Use compostos qumicos (por exemplo, produtos base de cloro, lcoois,
compostos quaternrios de amnio) em concentraes adequadas e por um
tempo de contato adequado.
Assegurar que os resduos qumicos no afetar a recuperao de micro-
organismos.
POP MET MIC 001
57 de
121
Re,iso( 00
?./ EF8ipamentos e materiais descart,eis
Equipamentos e materiais descartveis podem ser usados em vez de
equipamentos e materiais reutilizveis (vidro, placas de Petri, pipetas, frascos,
tubos, alas, espalhadores, etc), se as especificaes forem semelhantes.
aconselhvel verificar se tal equipamento adequado para uso em
microbiologia (em especial no que diz respeito sua esterilidade) e que o
material no contm substncias que inibem o crescimento de micro-
organismos.
?.: Arma@enamento de o7>etos de ,idro limpo e materiais
Proteger os vidros limpos e materiais contra a poeira durante o
armazenamento, em condies que ir manter a sua limpeza.
?.< erenciamento de o7>etos de ,idro esterili@ado e materiais
Armazenar vidro e materiais em condies que garantam que eles
permaneam estreis. Armazenar equipamento de uso nico, de acordo com
as instrues do fabricante, sem qualquer deteriorao da embalagem.
Armazenar equipamentos de preparo de laboratrio em condies limpas.
Quando o equipamento esterilizado destinado para microbiologia, coloque
uma data de validade (ou data de fabricao) em cada pacote.
?.? Uso de descontamina5o e desinAec5o
?.?.1 1escontamina5o de eF8ipamentos descart,eis
Descontaminar material descartvel antes da sua eliminao.
POP MET MIC 001
58 de
121
Re,iso( 00
Alm dos mtodos descritos nesta clusula, a incinerao pode ser usada. Se
houver um incinerador no local, descontaminao e descarte podem ser
realizados em uma nica operao.
?.?.) 1escontamina5o de artigos de ,idro e materiais antes da s8a
8tili@a5o
Em geral, a esterilizao dos equipamentos deve ser feito por calor mido (ver
6.2.3) ou calor seco (ver 6.2.2).
Em certas situaes (por exemplo, amostragem de campo), descontaminao
qumica pode ser apropriada. Aps o tratamento, os equipamentos devem estar
livres de substncias inibidoras.
?.?./ 1escontamina5o de artigos de ,idro e materiais ap9s o 8so
Materiais para descontaminao e eliminao devem ser colocados em
recipientes, por exemplo, sacos de plstico autoclavvel. Autoclavagem o
mtodo preferido para todos os processos de descontaminao (pelo menos 30
min a 121C). A autoclave deve ser carregada de uma maneira que favorea a
penetrao do calor para a carga (por exemplo, sem excesso de embalagem) e
tendo o cuidado de soltar tampas / abrir sacos.
Mtodo alternativo, que no a autoclave, pode ser usado se for permitido pelos
regulamentos nacionais.
Autoclave todos os equipamentos que tenham estado em contato com culturas
microbiolgicas (meios de cultura slidos ou lquidos), incluindo frascos
reutilizveis antes de serem lavados.
Durante o exame, descontaminao por imerso em desinfetante preparada
recentemente use a diluio para equipamentos pequenos e equipamentos
resistentes corroso (pipetas, por exemplo).
POP MET MIC 001
59 de
121
Re,iso( 00
Use pipetas Pasteur apenas uma vez.
A maioria dos desinfetantes (ver Anexo A) possuem alguns efeitos txicos. Use
luvas e culos de proteo quando manusear desinfetante concentrado.
?.+ esto de resKd8os
O descarte correto de material contaminado no afeta diretamente a qualidade
da anlise da amostra, mas uma questo de gesto de laboratrio.
Deve estar de acordo com normas nacionais ambientais, de sade e de
segurana.
Um sistema para a identificao e separao de materiais contaminados e
suas embalagens devem ser estabelecidos
- para lixo no contaminado (por exemplo, amostras de alimentos no
inoculadas) que pode ser descartado no lixo em geral,
- bisturis, agulhas, facas, vidro quebrado,
-material contaminado para autoclavagem e reciclagem, e
- material contaminado para autoclave e eliminao, ou para eliminao
somente se o material for ser incinerado (ver, No entanto, os requisitos
especiais para o risco de categoria 3 micro-organismos abaixo).
ncinerao de materiais contaminados e seus recipientes devem ser
realizados em conformidade com a legislao nacional ambiental, de sade e
de segurana.
Materiais contaminados com micro-organismos de categoria risco de 3 e seus
recipientes devem ser autoclavados antes de serem incinerados.
?.H &a,agem
POP MET MIC 001
60 de
121
Re,iso( 00
Lavar equipamentos reutilizveis somente depois de ter sido
descontaminados. Aps a lavagem, enxge todo o equipamento com gua
deionizada.
Equipamentos especializados podem ser usados para facilitar as operaes de
limpeza (por exemplo, uma mquina de lavar pipeta, mquina de lavar loua,
atravs de ultra-som).
Aps a lavagem, equipamentos reutilizveis devem estar livres de resduos que
possam afetar o crescimento subseqente de micro-organismos.
+.0 PREPARA"4O E ESTERI&ISA"4O 1E MEIOS 1E CU&TURA
Preparar e esterilizar meios de cultura, de acordo com as instrues do POP
MET MC 001.
H.0 AMOSTRAS 1E &A%ORAT'RIO
H.1 Amostragem
H.1.1 eral
Embora extremamente importante para a interpretao dos resultados,
amostragem e planos de amostragem no so uma parte desta Norma.
importante que o laboratrio receba uma amostra representativa do lote do
produto que no tenha sido danificada ou alterada durante o transporte e
armazenamento.
A amostra deve ser protegida contra a contaminao pelo ar esterno, o
recipiente da amostra, os dispositivos de amostragem usados e o manuseio
inadequado. Um recipiente da amostra no deve ter mais de trs quartos do
produto, a fim de evitar vazamentos e para permitir uma boa mistura da
amostra no laboratrio.
POP MET MIC 001
61 de
121
Re,iso( 00
dentificar amostras de forma clara e completa, e gravar a informao da
amostra.
Freqentemente, a temperatura no momento da coleta e aps o recebimento
til para o laboratrio para a interpretao de resultados.
A amostra dever ser apresentada na embalagem original, sem abrir.
Se o produto volumoso ou em um recipiente grande demais para o envio para
o laboratrio, transferir uma parcela da amostra assepticamente para um
recipiente estril.
O recipiente da amostra estril deve ser aberto apenas no tempo suficiente
para permitir que a amostra seja transferida e fechada imediatamente depois.
H.1.) Plano de amostragem
O laboratrio no realiza a amostragem dos produtos.
H.) Transporte
O modo de transporte das amostras para o laboratrio deve assegurar que eles
so mantidos em condies que ir minimizar qualquer alterao no nmero de
microorganismos presentes.
Entregar amostras para o laboratrio imediatamente com as condies de
armazenamento original mantida tanto quanto possvel.
A amostra deve ser acondicionada de modo a que a ruptura ou derrame seja
evitado.
O rtulo do produto deve indicar se a refrigerao necessria.
POP MET MIC 001
62 de
121
Re,iso( 00
Amostras que no exigem refrigerao ou congelamento podem ser
acondicionadas em um recipiente que use material de embalagem adequado
para evitar a quebra.
No use gelo solto, pois isso pode causar contaminao do produto, se houver
quebra de recipiente ou vazamentos.
Salvo disposio em contrrio ao POP MET MC 002 as seguintes
temperaturas durante transporte so recomendadas:
- produtos estveis: temperatura ambiente (abaixo de 40C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15C, de preferncia
abaixo de -18C;
- outros produtos no estveis temperatura ambiente: 1C a 8C;
- amostras de swab: ver SO 17604.
Quando no h condies especificadas, recomendvel que as partes
envolvidas concordem com a durao e a temperatura de transporte.
H./ Rece7imento
Verificar as condies das amostras no recebimento.
Se sua condio no satisfatria ou se as amostras so insuficientes, o
laboratrio deve recusar amostras.
Em circunstncias especiais, podem ser testados, aps discusso e acordo
com o cliente.
No entanto, o relatrio de ensaio deve incluir reservas sobre a validade dos
resultados.
POP MET MIC 001
63 de
121
Re,iso( 00
Documentar as amostras admitidas no laboratrio de tal maneira que o seu
progresso at o momento da elaborao do relatrio de ensaio possa ser
monitorado. A identidade e codificao das amostras e os registros devem
assegurar rastreabilidade em todas as fases no laboratrio.
Se necessrio, as superfcies externas das embalagens podem ser
desinfetadas com um desinfetante apropriado.
Verifique os recipientes de amostra para defeitos fsicos evidentes.
Observe as seguintes informaes:
- data (e hora, se for o caso) de recepo;
- detalhes da amostragem (data de amostragem e do tempo, se a condio de
amostra relevante e conhecida);
- nome do cliente e endereo.
Aps a recepo de amostras perecveis, registrar a temperatura de transporte
ou a temperatura de uma amostra simulada includa para este fim.
Examine as amostras o mais rapidamente possvel aps a recepo, de
preferncia no prazo de 24 h, ou conforme acordado entre as partes.
Para produtos altamente perecveis (como crustceos), os testes devem
comear no prazo de 24 h de amostragem. Para produtos perecveis (tais como
peixes, leite cru), o teste deve comear dentro de 36 h.
Se os prazos dos testes mencionados acima no puderem ser respeitados, as
amostras podem ser congeladas a abaixo de -15 C, de preferncia -18 C,
desde que tenha sido demonstrado que a recuperao do micro-organismo
alvo(s) no significativamente prejudicada.
H.: Arma@enamento
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
Armazene as amostras espera do ensaio em condies que ir minimizar
qualquer alterao no nmero de micro-organismos presentes.
As temperaturas de armazenamento seguintes so recomendadas:
- produtos estveis: temperatura ambiente (18 C a 27 C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15 C, de preferncia
abaixo de -18 C;
- outros produtos no estveis temperatura ambiente, incluindo alimentos
estragados: 3 C 2 C (ver POP MET MC 002);
- amostras de swab: ver SO 17604.
H.< Por5o de teste
H.<.1 Regras especKAicas para a tomada de por56es para ensaio
Referem-se ao POP MET MC 002 responsvel pelas regras especficas da
retirada da poro de ensaio e preparao da suspenso e homogeneizao
inicial.
H.<.) Conser,a5o e destr8i5o de amostras de la7orat9rio
Exceto em casos especiais, manter as amostras de laboratrio at que todos
os resultados tenham sido obtidos, ou por mais tempo, se necessrio, embal-
las em um recipiente estril (por exemplo, um saco plstico) e armazen-los
em sua temperatura de armazenamento original.
Produtos perecveis devem ser congelados.
NOTA: No normalmente aceita a prtica de retestar as amostras, devido a
possveis mudanas no status microbiano.
POP MET MIC 001
65 de
121
Re,iso( 00
I.0 E$AME
I.1 Preca856es de Digiene d8rante a anlise
Para evitar a contaminao do meio ambiente e das pores de teste,
manipular produtos em p (desidratados) em uma sala ou rea separada, ou
em uma cabine de segurana biolgica.
Antes de abrir amostras comuns, passe lcool 70% (em volume) (ou outro
produto equivalente) ao redor do ponto de abertura previsto e deixe evaporar.
Antes de abrir embalagens esterilizadas, mergulhe a rea a ser aberta em uma
soluo contendo de 100 ppm a 200 ppm de cloro livre (ou outro esterilizante
adequado) por menos 10 min para destruir micro-organismos que possam
contaminar a amostra.
Qualquer instrumento utilizado para abrir a embalagem e retirar a totalidade ou
parte da amostra (abridor de latas, tesoura, colher, pinas, pipetas, etc) devem
ser esterilizados.
A rea de trabalho adjacente deve ser limpa com um desinfetante apropriado
antes do incio dos testes.
As mos devem ser lavadas imediatamente antes de comear os testes e
novamente durante os testes se forem contaminadas.
Todos os instrumentos utilizados devem ser esterilizados e protegidos da
exposio contaminao antes e durante o uso.
Todos os instrumentos e ferramentas utilizadas devem ser colocados em um
recipiente adequado para posterior eliminao ou esterilizao.
Tomar precaues para que o trabalho seja realizado, na medida do possvel,
sob condies asspticas. Por exemplo:
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
a) certificar-se que a rea de trabalho seja limpa, que todas as possveis fontes
de contaminao sejam removidas ou reduzidas ao mnimo e que no haja
correntes de ar (ou seja, que as portas e janelas estejam fechadas), e evitar a
movimentao desnecessria de pessoal durante o exame;
b) antes e depois do trabalho, descontaminar a superfcie de trabalho com um
desinfetante apropriado;
c) antes de comear, certifique-se que tudo que necessrio para a realizao
do trabalho (e apenas isso) esteja disponvel;
d) realizar o trabalho sem demora;
e) separar as atividades por tempo ou local em "limpa" e "suja" (isto
particularmente importante com alto risco amostras, como carne crua e ovos
crus);
f) usar equipamentos descartveis;
g) se todo o contedo de um mao de pipetas descartveis, placas de Petri,
etc, no for utilizado durante o curso de um exame, certificar-se que a
embalagem est bem fechada aps remoo do nmero apropriado de
unidades;
h) limpar imediatamente qualquer derramamento, por meio de almofadas de
algodo ou qualquer outro material apropriado impregnado com 70% (em
volume) de lcool ou qualquer outro desinfetante apropriado
1)
, em seguida,
limpar e desinfetar a superfcie de trabalho antes de continuar;
i) usar cabine de segurana para o manuseio de produtos susceptveis de
conter bactrias patognicas, se recomendado por regulamentao nacional;
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
j) ao remover uma pipeta estril de uma embalagem, no permita que a ponta
toque a superfcie externa das pipetas restantes, pois tais superfcies esto
sujeitas contaminao;
k) no permitir a pipeta tocar as bordas ou gargalos de garrafas de diluio.
1) Quando outros desinfetantes alem do lcool 70% (em volume) so usados,
os tempos de contato apropriado, de acordo com a instrues do fabricante,
so necessrios para a desinfeco eficaz.
Os aerossis so uma das principais causas de contaminao ambiental e de
infeco. Aerossis podem ser formados por exemplo:
- ao abrir placas de Petri, tubos e frascos;
- quando se utilizar shakers, seringas, centrfugas, etc;
- ao esvaziar pipetas;
- ao esterilizar alas de inoculao ou agulhas;
- quando abrir ampolas contendo culturas liofilizadas.
Sua formao deve, portanto, minimizada.
I.) Prepara5o da s8spenso inicial e dil8i56es
I.).1 eral
Prepare a suspenso inicial e diluies, de acordo com a parte relacionada no
POP MET MC 002. O tempo que decorre entre o final da preparao da
suspenso inicial e o momento em que o inculo entra em contato com o meio
de cultura no deve exceder 45 minutos, a no ser especificamente
mencionado em normas internacionais pertinentes.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
A suspenso inicial e as etapas de diluies podem ser seguidas por uma
etapa de enriquecimento, conforme descrito em normas especficas.
I.).) Concentra5o
I.).).1 CentriA8ga5o o8 Ailtra5o por mem7ranas
Se for necessria a contagem de nmeros baixos de micro-organismos, a
enumerao pode ser melhorada, tanto em termos de sensibilidade e preciso,
atravs da introduo de um teste de concentrao de poro. Esta
concentrao pode ser obtida por centrifugao ou filtrao por membranas.
Se estiver usando a centrifugao, ressuspender o depsito centrifugado em
um volume conhecido de diluente e continuar a anlise.
Para cada combinao (alimentos mais micro-organismo) considerar, realizar
um estudo prvio para demonstrar quando se deve fazer teste de concentrao
de poro.
A filtrabilidade de suspenses de alimentos deve ser avaliada.
O desempenho do mtodo global, em termos de sensibilidade, seletividade,
linearidade e repetibilidade, devem ser verificados.
Se o nvel de contaminao desconhecido, o mtodo padro (sem filtrao)
deve ser conduzido em paralelo.
I.).).) Im8nossepara5o
Se os nmeros baixos de micro-organismos alvo esto presentes na amostra,
separao e concentrao de micro-organismos podem ser alcanadas com
esferas imunomagnticas revestidas com anticorpos especficos.
Espalhe as esferas, juntamente com os micro-organismos alvo capturado,
diretamente no meio slido especfico em acordo com as normas especficas.
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
No entanto, verifique se as esferas imunomagnticas revestidas com os
anticorpos especficos utilizados para esta etapa de concentrao so
adequadas, como mostrado por estudos de avaliao publicado na literatura
cientfica internacional, de preferncia relacionados com microbiologia
alimentar.
10.0 E!UMERA"4O
10.1 eral
Ao avaliar a qualidade microbiolgica e/ou segurana de alimentos e alimentos
para animais, muitas vezes saber se os micro-organismos esto presentes no
suficiente para. Na maioria dos casos, o aspecto quantitativo igualmente
importante, o que traz a necessidade de enumerar micro-organismos. sto pode
ser conseguido de vrias maneiras: atravs de exame direto (microscopia),
atravs da inoculao em meio slido ou lquido, por citometria de fluxo, por
reao em cadeia da polimerase em tempo real, etc. No entanto, esta Norma
s cobre enumerao em meios slidos e lquidos.
Enumerao em meios slidos se baseia na capacidade de muitos micro-
organismos para produzir colnias no interior ou na superfcie de gar, que
pode ser reconhecido como tal a olho nu ou com o auxlio de uma lupa simples.
No entanto, se a matriz contm muitas partculas que podem interferir com a
deteco de colnias, ou se o nvel de bactrias muito baixo, este princpio
no pode ser utilizado sem antes se separar os micro-organismos alvos da
matriz (por exemplo, por filtrao ou imunosseparao). Nesses casos,
enumerao com meios lquidos muitas vezes uma alternativa mais
adequada.
10.) En8mera5o 8sando 8m meio s9lido
10.).1 eral
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
Placa de Petri deve ser rotulada com o nmero da amostra, diluio, data e
qualquer outra informao desejada.
Diluies devem ser selecionadas para garantir que as placas obtenham o
nmero apropriado de colnias (ver 10.3.1) e elimine qualquer possibilidade de
propriedades inibidoras.
Usar uma pipeta estril para transferncias de cada diluio, salvo se trabalhar
a partir da maior diluio para a menor diluio.
10.).) !Pmero de placas de Petri por dil8i5o
Para as tcnicas de enumerao em microbiologia alimentar, duas placas
devem ser utilizadas de acordo com o POP MET MC 003 TEM X.
10.)./ TCcnica de po8r plate
10.)./.1 eral
Retirar os volumes definidos da diluio a ser examinada, tocando a ponta da
pipeta contra o lado do tubo para remover o excesso de lquido que aderirem
ao exterior. Levante a tampa da placa de Petri estril apenas alto o suficiente
para inserir a pipeta, em seguida, dispensar o contedo. Despeje agar fundido
a 44C a 47C em cada placa de Petri
2)
. Evite derramar o meio fundido
diretamente sobre o inculo. mediatamente misture o meio derretida e o
inculo cuidadosamente de modo a obter uma distribuio homognea dos
micro-organismos dentro do meio. Permitia o esfriamento e solidificao,
colocando a placa de Petri sobre uma superfcie fria horizontal (o tempo de
solidificao do Agar no pode exceder 10 minutos).
Depois de retirar agar temperado do banho-maria, seque a garrafa com uma
toalha limpa para evitar a gua de contaminar as placas. Evite derramar o meio
do lado de fora da embalagem ou no interior da tampa da placa quando vazar.
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
sto pode exigir que se segure a garrafa em uma posio quase horizontal, ou
evitando o ajuste da garrafa entre os passos derramamento.
Se existir a possibilidade da presena de colnias invasoras que faam
espalhamento (por exemplo, Proteus spp.). Est previsto que a placa a ser
examinada, possa ser coberta com gar no nutritivo estril ou gar idntico ao
meio de cultura utilizado no teste
3)
, para evitar ou minimizar o espalhamento.
2) Geralmente 18 a 20 ml de gar em 90 milmetros placas de Petri, para obter
pelo menos 3 mm de espessura.
3) Geralmente 5 ml de gar em 90 milmetros placas de Petri.
10.).: Inoc8la5o em s8perAKcie
10.).:.1 eral
Mtodos de plaqueamento projetado para produzir apenas colnias de
superfcie em placas de Agar tm certas vantagens sobre o mtodo de placa
derramar. A morfologia de colnias de superfcie facilmente observada,
melhorando a habilidade do analista para distinguir entre diferentes tipos de
colnia.
Micro-organismos no so expostos ao calor do meio gar derretido, de modo
contagens mais altas podem ser obtidas.
Usar placas com pelo menos 3 mm de espessura do meio de gar, com
superfcie lisa, e livres de bolhas de ar e umidade na superfcie.
Para facilitar a disseminao uniforme, a superfcie do gar solidificado deve
ser seca em conformidade com o POP MET MC 001 de forma que o inculo
seja absorvido dentro de 15 min.
10.).:.) MCtodo SpreadMplate com al5a de 1rigalsTi
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
Usando uma pipeta estril, transferir o inculo (geralmente 0,1ml ou 0,5ml) da
amostra teste lquida ou da suspenso inicial, no caso de outras amostras para
a placa de gar (90 mm ou 140 mm de dimetro, respectivamente). Repetir
este passo para a diluio decimal seguinte (as colnias para serem contadas,
devero, estar presente em uma etapa de diluio de 10
-1
, no caso de material
da amostra de lquida e 10
-2
, no caso de amostra de outro material) e, se
necessrio, repetir o procedimento para outras diluies decimais.
Se for necessrio para detectar baixas contagens microbianas no caso de
certos produtos, o limite de deteco pode ser aumentado em um fator de 10,
analisando 1,0 ml da amostra no caso de produtos lquidos e 1,0 ml da
suspenso inicial no caso de outros produtos. Para esse fim, 1,0 ml do inculo
espalhado ou sobre a superfcie de uma placa de Petri grande (140 mm de
dimetro) ou sobre as superfcies de trs pequenos placas de Petri (90 mm de
dimetro).
Usando uma ala de Drigalski feita de vidro, plstico ou ao (por exemplo feito
de um basto de vidro e em forma um taco de hquei sobre 3,5 mm de
dimetro e 20 cm de comprimento, dobrados em ngulo reto em cerca de 3 cm
de um lado e achatado nas extremidades por aquecimento), espalhar o inculo
o mais rpido possvel uniformemente sobre a superfcie do gar sem tocar as
paredes laterais da placa de Petri. Permitir que o inculo seja absorvido na
placa com as tampas no lugar por cerca de 15 min temperatura ambiente.
Em certos casos (como indicado em normas internacionais pertinentes), o
inculo pode ser depositado em uma membrana, e espalhada em seguida,
como descrito anteriormente.
10.).:./ MCtodo do plaF8eamento em Spiral
10.).:./.1 eral
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
O mtodo do plaqueamento em espiral para determinar o nvel de micro-
organismos foi testado em ensaios interlaboratoriais com leite, produtos lcteos
e outros tipos de alimentos.
O equipamento utilizado o plaqueador espiral automtico - descrito em
5.24.
10.).:./.) Prepara5o da placa de gar
Um dispensador automtico com um sistema de entrega estril recomendado
para a preparao de placas de gar, para garantir que as placas esto
niveladas.
Despeje a mesma quantidade de gar em todas as placas para que a mesma
altura do gar seja dispensada a fim de manter o ngulo de contato correto.
Alternativamente, preparados de placas de gar pronto para uso podem ser
usadas.
10.).:././ Processo de plaF8eamento e contagem
Descontaminar a ponta da caneta e tubos puxando primeiro uma soluo de
hipoclorito de sdio (ver 5.24.4) e depois gua esterilizada atravs do sistema,
antes de tirar a amostra lquida para a caneta.
Colocar uma placa previamente derramada com gar, na plataforma giratria
inferior a caneta. A amostra diferencialmente dispersada conforme a ponta da
caneta passa na superfcie da placa de gar rotativo. Remover a placa
inoculada e devolver a caneta para sua posio inicial. Descontaminar a caneta
e carregar para a inoculao de uma outra placa.
Aps a incubao, colocar a grade de contagem da placa espiral central no
lugar. Use a regra de 20 contagens para determinar a contagem. Escolher
qualquer fatia e comear a contar as colnias a partir da borda externa do
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
primeiro segmento em direo ao centro, at que 20 colnias sejam contadas.
Completar atravs da contagem de colnias remanescentes na segmento a
partir da vigsima colnia. Contar uma rea correspondente no lado oposto da
placa e dividir o nmero de colnias contadas em ambos os lados pelo volume
de amostra depositada nestas duas reas. O volume de amostra associado a
cada parte da grade de contagem dado no manual operacional que
acompanha cada plater espiral.
10.).< Inc87a5o
Salvo recomendao contrria em normas especficas, inverter imediatamente
as placas aps a inoculao, e coloc-las rapidamente na estufa incubadora
temperatura adequada. Se a desidratao excessiva ocorrer (por exemplo, em
55 C ou em caso de forte circulao de ar), enrole os placas vagamente em
sacos plsticos antes da incubao ou usar qualquer sistema similar de
eficincia equivalente.
Durante o perodo de incubao, pequenas variaes na temperatura de
incubao podem ser inevitveis e aceitvel, por exemplo, durante as
operaes usuais de carga ou descarga da estufa incubadora, mas
importante que esses perodos sejam mantidos a um mnimo possvel. A
durao destas variaes deve ser monitorada para garantir que elas no
tenham um efeito significativo sobre o resultado.
NOTA: Em certos casos, pode ser til para armazenar placas inoculadas em
3C 2C para usar em comparao com placas inoculadas e incubadas na
contagem, a fim de evitar confundir as partculas do produto a ser examinado
com colnias. A lupa binocular tambm pode ser usada para distinguir
partculas do produto das colnias.
Em determinadas circunstncias, pode ser desejvel para a organizao do
trabalho no laboratrio refrigerar as placas inoculadas por um perodo mximo
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
de 24 horas antes da incubao. Se isso for feito, o laboratrio deve assegurar
que essa prtica no afete a contagem resultante.
Geralmente, placas de Petri no devem ser empilhadas em mais de seis placas
para incubao aerbica e devem ser separadas umas das outras e das
paredes da incubadora pelo menos 25 mm. No entanto, pilhas maiores com
menos espaamento pode ser aceitvel em incubadoras equipadas com
sistemas de circulao de ar, neste caso, a distribuio de temperatura deve
ser verificada.
Aps a incubao, as placas normalmente devem ser examinadas
imediatamente. Podem, no entanto, ser armazenadas, salvo descrito em
normas especficas, por at 48 h na geladeira. Armazenamento refrigerado por
perodos mais longos s aceitvel se tiver sido demonstrado que no tm
efeito sobre os nmeros, aparncia ou a confirmao posterior das colnias.
Com certos meios contendo corantes indicadores, placas podem ser
refrigeradas para equilibrar a temperatura ambiente antes de se examinar, para
garantir que a cor correta tenha sido recuperada.
10./ Clc8lo e eGpresso dos res8ltados o7tidos com meios s9lidos
10./.1 Contagem de colQnias
Aps o perodo de incubao indicado na norma especfica, a contagem de
colnias (colnias total, colnias tpicas ou colnias presuntivas) para cada
placa contendo menos de 300 colnias (ou qualquer outro nmero indicado na
norma especfica).
Ao contar colnias tpicas ou presuntivas, a descrio das colnias a indicada
no padro especfico.
Em certos casos, pode ser difcil contar as colnias (por exemplo, quando os
micro-organismos espalhados esto presentes). Considerar colnias
espalhadas como colnias individuais. Se menos de um quarto da placa estiver
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
coberto por espalhamento, contar as colnias na parte no afetada do placa e
calcular o nmero dele para toda a placa. Deduzir por extrapolao o nmero
terico que deve corresponder placa inteira. Se mais de um quarto estiver
coberto, descarte a contagem. Considerar colnias espalhadas como uma
colnia.
Nas diferentes modalidades de clculo dado em 10.3.2, contagens tiradas das
placas que no contenham colnias, devero ser feitas onde essas placas
foram mantidas.
Quando um plaqueador espiral automtico tiver sendo usado, a contagem de
colnias como descrito em 10.2.4.3.3.
10./.) EGpresso dos res8ltados
10./.).1 eral
10./.).1.1 Os casos de F8e trata este s87item so casos gerais(
- inoculao de uma placa de Petri 90 mm de dimetro por diluio;
- nmero mximo de contagem para as colnias totais presentes: 300 por
placa;
- nmero mximo total de colnias (tpicas e atpicas) em uma placa, em uma
contagem de colnias tpicas ou presuntivas: de preferencialmente 300 por
placa;
- nmero mximo de contagem de colnias tpicas ou presuntivas: 150 por
placa;
- nmero de colnias inoculadas presuntivas para identificao ou confirmao
(ver 10.3.2.3): em geral 5 em cada placa.
Estes nmeros so definidos nas normas especficas.
POP MET MIC 001
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Re,iso( 00
Quando as placas com um dimetro diferente de 90 milmetros so usadas, o
nmero mximo de colnias deve ser aumentado ou diminudo em proporo
rea da superfcie dos placas (ou membranas).
10./.).1.) Os mtodos de clculo apresentados a seguir so para os casos que
ocorrem mais freqentemente quando os testes so realizadas de acordo com
boas prticas de laboratrio. Casos especiais podem acontecer
ocasionalmente (por exemplo, a relao dos fatores de diluio usada para
duas diluies sucessivas pode ser muito diferente), e , portanto, necessrio
que os resultados de contagem obtidos sejam analisados e interpretados por
um qualificado microbiologista e, se necessrio, rejeitado.
10./.).) MCtodo de clc8lo( caso geral Ncontagem de colQnias total o8
colQnias tKpicasO
Para um resultado ser considerado vlido, geralmente necessrio contar as
colnias em pelo menos uma placa contendo pelo menos 10 colnias [colnias
total, colnias tpicas ou colnias em conformidade com critrios de
identificao (Ver 10.3.2.3)].
Calcular o nmero N de micro-organismos presentes na amostra de teste como
uma mdia ponderada de duas diluies sucessivas atravs da Equao (1):
Onde,
a soma das colnias contadas com duas placas retidas a partir de duas
diluies sucessivas, sendo que pelo menos uma das quais contenham um
mnimo de 10 colnias;
V o volume de inculo colocado em cada placa, em mililitros;
POP MET MIC 001
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121
Re,iso( 00
d a diluio correspondente diluio primeiro retido [d= 1 quando o
produto retido for um lquido no diludo (Amostra)].
Arredondar o resultado calculado para dois algarismos significativos. Ao fazer
isso, se a terceira figura for inferior a 5, no modificar a figura anterior, se a
terceira figura for maior ou igual a 5, aumente uma unidade do nmero anterior.
Expressar o resultado de preferncia com um nmero entre 1,0 e 9,9
multiplicado pela potncia de 10 adequada, ou um nmero inteiro com dois
algarismos significativos.
Exprimir o resultado com o nmero N de micro-organismos por mililitro
(produtos lquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
a primeira diluio reteve (10
-2
): 168 colnias;
a segunda diluio reteve (10
-3
): 14 colnias.
Arredondando o resultado especificado acima, o nmero de micro-organismos
17000 ou 1,7 x 10
4
por mililitro ou por grama de produto.
10./.)./ MCtodo de clc8lo( ap9s a identiAica5o
Quando o mtodo utilizado requer a identificao, um determinado nmero A
(geralmente 5) de colnias presuntivas devem ser identificadas a partir de cada
um das placas retidas para a contagem de colnias. Aps a identificao,
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121
Re,iso( 00
calcular, para cada uma das placas, o nmero d de colnias em conformidade
com os critrios de identificao, atravs da Equao (2):

onde
b o nmero de colnias em conformidade com critrios de identificao entre
as colnias identificadas A;
C o nmero total de colnias presuntivo contou com o placa.
Arredondar o resultado calculado para o nmero inteiro mais prximo. Ao fazer
isso, se a primeira figura aps o ponto decimal for inferior a 5, no modificar a
figura anterior, se a primeira figura depois do ponto decimal for maior ou igual a
5, aumentar a figura anterior em uma unidade.
Calcular o nmero N de micro-organismos identificados presentes na amostra
de teste, substituindo por na equao dada em 10.3.2.2.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado, conforme especificado no 10.3.2.2.
EXEMPLO
-3
): 66 colnias;
-4
): 4 colnias.
Teste das colnias selecionadas foi realizado:
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121
Re,iso( 00
- das 66 colnias, 8 colnias foram testadas, 6 dos quais cumpriu com os
critrios, d= 50;
- das 4 colnias, todas as 4 cumpriram os critrios, d= 4.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o nmero de
micro-organismos 49000 ou 4,9 x 10
4
por mililitro ou por grama do produto.
10./.).: MCtodo de clc8lo( 7aiGas contagens
10./.).:.1 caso F8ando 8ma placa Namostra o8 s8spenso inicial o8
primeira dil8i5oO contCm menos de 10 colQnias
Contagens de 10, at o limite (prtica) superior de cada mtodo esto na faixa
de preciso ideal. Preciso diminui rapidamente medida que o nmero de
colnias diminui abaixo de 10, no entanto. Dependendo da finalidade do teste,
um limite inferior de determinao pode ser definido como a seguir para
contagem inferior a 10.
A definio de limite de determinao : concentrao mdia mais baixa de
partculas x por poro analtica onde o padro da incerteza relativa esperada,
igual a um valor especificado (RSD)". RSD o desvio-padro relativo, que
calculado dividindo-se a estimativa do desvio padro s de uma populao a
partir de uma amostra por dessa amostra. Em vez de RSD, smbolo o w ser
usado para o desvio padro relativo. Assim,
No caso de uma distribuio de Poisson, x calculada pela equao:
POP MET MIC 001
81 de
121
Re,iso( 00
Se w fixado em 50% para o limite de preciso relativa aceitvel (o que parece
ser razovel em microbiologia), o limite inferior de determinao ser o nmero
de colnias dadas por:
Assim, os resultados com base na contagem de menos de quatro deve ser
tratada como mera deteco da presena do micro-organismo.
Resumindo:
Se a placa tiver menos de 10 colnias, mas, pelo menos, 4, calcular o resultado
como dado, no caso geral (10.3.2.2), e relat-lo como nmero x estimado de
micro-organismos por mililitro (produtos lquidos) ou por grama (outros
produtos).
Se o total for de 3 a1, a preciso do resultado muito baixa e o resultado
dever ser reportado como:
"Os micro-organismos esto presentes, mas menos do que (4 x d) por grama
ou ml".
10./.).:.) Caso onde a placa Namostra o8 s8spenso inicial o8 primeira
dil8i5oO no contCm colQnias
Se a placa que contm a amostra do teste (produtos lquidos) ou a suspenso
inicial (outros produtos) ou a primeira diluio inoculada ou retida no contm
quaisquer colnias, o relatrio do resultado dado da seguinte forma:
"nferior a 1/d micro-organismos por mililitro" (produtos lquidos) ou "menos de
1/d micro-organismos por grama"(Outros produtos)
POP MET MIC 001
82 de
121
Re,iso( 00
onde d o fator de diluio da suspenso inicial ou da primeira diluio
inoculada ou retida (d= 10
0
=

1 onde a amostra de teste inoculada diretamente
do produto lquido retida).
10./.).:./ Casos especiais
10./.).:./.1 eral
Estes casos dizem respeito contagem de colnias tpicas ou presuntivas.
10./.).:./.) Caso 1
Se o nmero de colnias tpicas e atpicas para a placa tiver uma primeira
diluio d
1
maior do que 300 (ou qualquer outro nmero indicado na norma
especfica), com colnias tpicas visveis ou colnias confirmadas, e se, o placa
contendo o d
2
diluio subsequente possuir menos de 300 colnias (ou
qualquer outro nmero indicado na norma especfica), e nenhuma colnia tpica
visvel ou confirmada, relatar o resultado da seguinte forma:
"Menor que 1/d
2
e maior que 1/d
1
micro-organismos por mililitro" (produtos
lquidos) ou "menor que 1/d
2
e maior que 1/d
1
micro-organismos por grama
"(outros produtos), onde d
1
e d
2
so os fatores de diluio correspondente
diluio d
1
e d
2
.
EXEMPLO
- a primeira diluio reteve (10
-2
): mais de 300 colnias no placa, com colnias
tpicas ou confirmadas presente;
- a segunda diluio reteve (10
-3
): 33 colnias, sem colnias tpicas ou
confirmadas presente.
POP MET MIC 001
83 de
121
Re,iso( 00
O resultado, expresso em micro-organismos, menor que 1000 e maior que
100 por mililitro ou por grama de produto.
10./.).:././ Caso )
Se o nmero de colnias tpicas e atpicas na placa, tiver uma primeira diluio
d
1
maior do que 300 (ou qualquer outro nmero acima do indicado na norma
especfica), com colnias tpicas visveis ou colnias confirmadas, e se a placa
d
2
contendo a diluio subsequente tiver menos de 300 colnias (ou qualquer
outro nmero indicado na norma especfica) ou nenhuma colnia tpica visvel
ou confirmada, o relatrio do resultado dado da seguinte forma:
"Menor que 1/d
2
micro-organismos por mililitro" (produtos lquidos), ou menor
que 1/d
2
micro-organismos por grama" (Outros produtos)
onde d
2
o fator de diluio correspondente diluio d
2
.
EXEMPLO
-2
): mais de 300 colnias no placa, sem colnias
tpicas ou confirmadas presente;
-3
): 33 colnias, sem colnias tpicas ou
confirmadas presente;
O resultado, expresso em micro-organismos, inferior a 1000 por mililitro ou
por grama de produto.
10./.).< MCtodo de clc8lo( casos especiais
10./.).<.1 Quando o nmero de colnias contadas (colnias total, colnias
tpicas ou colnias presuntivas) superior a 300 (ou qualquer outro nmero
indicado em norma especfica) para a placa contendo uma primeira diluio d
1
,
POP MET MIC 001
84 de
121
Re,iso( 00
com um nmero de colnias (colnias totais, colnias tpicas ou colnias em
conformidade com critrios de identificao) menor que 10 para a placa
contendo a diluio d
2
subsequente:
- se os nmeros de colnias para a placa contem a diluio d
1
dentro do
intervalo de 334 a 300 (a parte superior do intervalo de confiana para uma
mdia ponderada igual a 300), use o mtodo de clculo para casos em geral
(ver 10.3.2.2);
- se os nmeros de colnias para a placa contem a diluio d
1
maior do que
334 (o limite superior do intervalo de confiana para uma mdia ponderada
igual a 300), apenas levar em conta o resultado da contagem de diluio d
2
e
calcular uma contagem estimada (ver 10.3.2.4), exceto, quando um mximo de
300 for definido para a contagem de colnias, se esta contagem estimada for
inferior a 8 (limite inferior do intervalo de confiana para uma mdia ponderada
igual a 10), uma vez que a diferena entre as duas diluies ento
inaceitvel.
Os nmeros correspondentes aos intervalos de confiana devem ser
adaptados para o nmero mximo indicado para a contagem de colnias.
EXEMPLO1
-2
): 310 colnias;
-3
): 8 colnias.
Usar o mtodo de clculo para os casos em geral, usando as duas placas
retidas com diferentes diluies.
EXEMPLO 2
POP MET MIC 001
85 de
121
Re,iso( 00
-2
): mais de 334 colnias no placa;
-3
): 9 colnias.
Assinalar uma contagem estimada com base nas colnias contadas no placa
para a diluio 10
-3
.
EXEMPLO 2
Contagem (quando um nmero mximo de 300 foi fixado para a contagem de
colnias) produziu os seguintes resultados:
-2
): mais de 334 colnias no placa;
-3
): 7 colnias.
O resultado desta contagem inaceitvel.
EXEMPLO 4
Contagem (quando um nmero mximo de 150 foi fixado para a contagem de
colnias) produziu os seguintes resultados:
-2
): mais de 167 colnias na placa (limite superior
do intervalo de confiana com uma mdia ponderada mdia igual a 150);
-3
): 7 colnias.
Assinalar uma contagem estimada com base em colnias contadas na placa
para a diluio 10
-3
.
10./.).<.) Quando a contagem de colnias (colnias totais, colnias tpicas ou
colnias presuntivas) para cada uma das placas, para todas as diluies
inoculadas produz um nmero superior a 300 (ou qualquer outro nmero
indicado na norma especfica), o relatrio do resultado dado seguinte forma:
POP MET MIC 001
86 de
121
Re,iso( 00
"Maior que 300/d" (no caso das colnias total ou colnias tpicas) ou "maior que
" (no caso de colnias confirmadas), expressa em micro-organismos por
mililitro (produtos lquidos) ou micro-organismos por grama (outros produtos)
onde
d a diluio da ltima diluio inoculada;
b o nmero de colnias em conformidade com critrios de identificao entre
as colnias presuntivas A.
10./.).<./ Quando o placa que contm a ltima diluio inoculada tiver mais de
10 colnias e menos de 300 (ou qualquer outro nmero indicado na norma
especfica) colnias (colnias total, colnias tpicas ou colnias presuntivas),
calcular o N nmero de micro-organismos presentes usando a Equao (4):
onde
c o nmero de colnias contadas na placa;
V o volume do inculo utilizado em cada placa, em mililitros;
d a diluio correspondente diluio retida.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado com o nmero N de micro-organismos por mililitro
(produtos lquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
POP MET MIC 001
87 de
121
Re,iso( 00
- na ltima diluio inoculada (10
-4
): 120 colnias.
Assim
Arredondando o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o nmero N 'de
micro-organismos 1200000, ou 1,2x 10
6
por mililitro ou por grama do produto.
10./.).? Incerte@a de medi5o
Ver SO/TS 19036 para determinaes quantitativas.
10.: En8mera5o de 7olores e le,ed8ras
10.:.1 eral
Bolores e leveduras geralmente devem ser enumerados seja por uma tcnica
de pour-plate, que facilita a enumerao ou por uma tcnica spread-plate que
fornece a mxima exposio das clulas ao oxignio atmosfrico e evita o
estresse de calor do agar derretido. Placas de gar vertidas devem ser secas
antes de serem inoculadas conforme POP MET MC 001.
Alguns bolores e leveduras podem ser infecciosos ou podem provocar reaes
alrgicas, s vezes at mesmo em indivduos saudveis. Assim, importante
estar razoavelmente cauteloso ao trabalhar com eles. dealmente, as placas
devem ser mantidas em incubadoras, no em uma sala aberta. Tampas das
placas devem ser removidas o mais raramente possvel, normalmente apenas
para fins essenciais, tais como a preparao de uma lamina para exame
microscpico. Agulhas esterilizadas pelo calor devem ser resfriadas antes de
fazer transferncias, para evitar disperso de condios e outras clulas.
Bancadas de trabalho e as incubadoras devem ser desinfetadas
rotineiramente.
POP MET MIC 001
88 de
121
Re,iso( 00
Placas de Petri devem ser incubadas em posio vertical e no devem ser
manipuladas at que as placas estejam prontas para serem contadas, o
movimento pode resultar na liberao de condios ou esporos e subseqente
desenvolvimento de colnias de satlite, dando uma superestimativa da
populao.
10.:.) Contagem de col9nias de 7olores e le,ed8ras
Placas com 10 a150 colnias so geralmente contadas. Se a micoflora consiste
principalmente de fungos, selecione placas contendo as contagens na faixa de
menor populao; se a micoflora consiste principalmente de leveduras, placas
que contenham at o limite superior podem ser selecionadas para a contagem.
Se a identidade das colnias estiver duvidosa, examinar em microscpio pelo
menos cinco colnias por amostra para confirmar que bactrias no esto
presentes.
10.< En8mera5o 8sando 8m meio lKF8ido
10.<.1 PrincKpio
Pores de teste so inoculadas em um meio lquido que projetado para
suportar o crescimento de um determinado micro-organismo ou um grupo de
micro-organismos, e muitas vezes inibem a proliferao de micro-organismos
no-alvo.
Para determinar se o crescimento dos micro-organismos-alvo tenha ocorrido,
vrios critrios podem ser usados, por exemplo, deteco visual de turbidez,
produo de gs, mudanas de cor, posterior isolamento dos micro-organismos
em um gar seletivo. A composio do meio de crescimento e os critrios para
distinguir entre um resultado positivo e um negativo so definidos nas normas
correspondentes.
POP MET MIC 001
89 de
121
Re,iso( 00
Usando essa abordagem, apenas um valor qualitativo pode ser atribudo a
cada poro de teste, ou seja, o resultado ou positivo ou negativo. Para obter
uma estimativa da quantidade de micro-organismos que est presente,
necessrio examinar vrias pores de ensaio e os procedimentos estatsticos
para determinar o nmero mais provvel (NMP).
10.<.) Inoc8la5o
10.<.).1 eral
Se um meio de crescimento seletivo usado, a adio da amostra de ensaio
no deve reduzir as suas propriedades seletivas (permitindo assim o
crescimento de micro-organismos no-alvo). Na maioria das normas padres
informaes sobre a compatibilidade de uma determinada matriz e do meio
lquido descrita no mbito, mas cuidados devem ser tomados com matrizes
como especiarias, cacau, caldo de carne, etc, pois podem conter substncias
inibidoras de crescimento, que exigem a adio de compostos neutralizantes, o
uso de uma quantidade maior de fatores de diluio, filtrao, centrifugao ou
separao imunomagntica para separar o micro-organismo alvo a partir da
matriz, mesmo que isso nem sempre seja especificado nas normas
correspondentes. ncompatibilidade tambm pode ser devido composio
biolgica da matriz: amostras ambientais altamente contaminadas, produtos
fermentados ou produtos com bactrias probiticas, obviamente representam
um desafio maior para a anlise do microbiologista do que as amostras que
contm somente muito poucos micro-organismos. Para essas matrizes
problemticas, experimentos com micro-organismos representativos devem ser
realizados para verificar se o mtodo realmente compatvel com a matriz.
10.<.).) Procedimento
Salvo disposio em contrrio das normas correspondentes, volumes inferior
ou igual a 1ml da poro teste so normalmente adicionados cinco a dez vezes
ao volume de um nico meio com concentrao simples. Volumes entre 1ml e
POP MET MIC 001
90 de
121
Re,iso( 00
100ml so normalmente adicionados a volumes iguais de meios com dupla
concentrao.
Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados podem ser
usados. Para fins especiais, meios estreis desidratados podem ser dissolvidos
a frio (ou pr-aquecidos a 30C) da amostra a ser analisada.
Salvo disposio em contrrio, o tempo entre preparar a primeira diluio de
uma amostra e inoculao do ltimo tubo, placa de vrios poos, ou frasco
devem ser inferior a 15 minutos.
Uma nova pipeta estril deve ser utilizada para cada diluio.
10.<./ EscolDa do sistema de inoc8la5o
A essncia do mtodo NMP que a diluio de uma amostra a um grau tal que
inculos, s vezes, mas nem sempre contm micro-organismos viveis. O
"resultado", isto , o nmero de inculos produzindo crescimento em cada
diluio, dar uma estimativa da concentrao inicial de bactrias na amostra.
A fim de obter estimativas sobre uma ampla gama de concentraes possveis,
microbiologistas usam diluies em srie, incubando vrios tubos (ou placas,
etc) em cada diluio. O nmero mais provvel (NMP) de micro-organismos
presentes na amostra original, e a preciso da estimativa, pode ser calculada
por procedimentos estatsticos sobre a base do nmero de tubos positivos e
negativos observados aps a incubao.
Fazer a escolha das vrias configuraes disponveis de NMP de acordo com
- o nmero esperado de micro-organismos na amostra em estudo,
- requisitos regulamentares,
- a preciso necessria, e
- quaisquer outras consideraes prticas.
POP MET MIC 001
91 de
121
Re,iso( 00
A incerteza de medio depende do nmero de positivo nas pores teste
observadas, semelhante a incerteza de medio em contagem do nmero de
colnias, que depende do nmero de colnias em uma placa. A incerteza de
medio aumenta medida que uma funo da raiz quadrada do nmero de
tubos utilizados aumenta. O nmero de tubos tem que ser quadruplicado para
reduzir pela metade a incerteza de medio. Quando os sistemas usam apenas
alguns tubos de replicao, a incerteza de medio baixa.
Dependendo do seu tamanho, pores de teste podem ser inoculadas em
tubos ou frascos contendo a quantidade necessria do meio lquido. Para
pores de teste pequenas, placas com vrios poos tambm podem ser
usadas.
10.<./.1 Sistema Pnico de dil8i5o
Quando a concentrao de micro-organismos esperado pequena ou varia
apenas moderadamente, o mais adequado o sistema de inoculao em uma
srie nica de pores de ensaio igual. Onde a relao esperada entre o
nmero mximo e mnimo de micro-organismos menor que 25, dez pores
de teste em paralelo a menor nmero esperado de funcionar; com 50 tubos
paralelos, uma relao de 200 o limite. Exemplos de sistema nico de
diluio NMPs so indicados no anexo B, Tabelas B.1 a B.4.
10.<./.) Sistema MPltiplo de dil8i5o
Quando a concentrao de micro-organismos na amostra desconhecida, ou
se suspeita de haver grande variao, pode ser necessrio inocular tubos em
srie de vrias diluies. nocular um nmero suficiente de diluies para
garantir um sistema com resultados positivos e negativos. O nmero de
diluies tambm depende do mtodo de clculo utilizado para estimar o valor
do NMP. Se tabelas forem usadas, ento os resultados de trs diluies devem
estar disponveis, e as configuraes dos sistemas so restritas aos
POP MET MIC 001
92 de
121
Re,iso( 00
disponveis em tabelas. Com programas de computador, o nmero de diluies
e tubos paralelos irrestrito.
10.<././ Sistema de dil8i5o simCtrica
O sistema NMP simtrico mais comumente aplicado utiliza trs ou cinco tubos
paralelos por diluio. A preciso obtida com este sistema diminui rapidamente
com o menor nmero de tubos por diluio. Os resultados de trs tubos de
design so pouco mais do que indicaes da ordem de grandeza da
concentrao. Se maior preciso for necessria, recomenda-se que cinco ou
mais tubos paralelos sejam escolhidos. Exemplos de NMP de trs tubos e um
NMP de cinco tubos so indicados no anexo B, Tabelas B.5 e B.7,
respectivamente.
10.<./.: Sistema de dil8i5o noMsimCtrica
Em um sistema de diluio no-simtrica, os diferentes nveis de diluio no
tm o mesmo nmero de tubos. Usar esses sistemas apenas para calcular o
nmero de micro-organismos dentro de uma faixa bem definida. Para
exemplos, consulte o POP MET MC 003 TEM X.
10.<.: Inc87a5o
ncubar os tubos, frascos ou garrafas inoculados em uma estufa incubadora ou
em banho-maria. Coloque placas de vrios poos, em uma estufa incubadora.
Escolher a durao e a temperatura de incubao aps a referncia de um
mtodo especfico, pois dependem do microrganismo ou grupo de micro-
organismos procurado.
Para alguns micro-organismos, um processo de incubao de dois estgios
e/ou uma etapa de confirmao pode ser necessria.
Pesquisar em normas especficas para obter detalhes.
POP MET MIC 001
93 de
121
Re,iso( 00
10.<.< Interpreta5o dos res8ltados
Os critrios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo
com cada micro-organismo ou grupo de micro-organismos e so definidos nas
normas correspondentes. Usando estes critrios, contar e registrar o nmero
de resultados positivos obtidos em todos os testes derivados de uma amostra.
10.<.? 1etermina5o dos ,alores !MP
H trs possibilidades diferentes para determinar o valor do NMP: clculo com
frmulas matemticas, consulta das tabelas de NMP, ou utilizao de
programas de computador especfico. Desde que sejam baseados nas mesmas
consideraes estatsticas, eles so igualmente vlidos. Estes trs mtodos
so detalhados a seguir.
10.<.?.1 L9rm8las matemticas
10.<.?.1.1 L9rm8la aproGimada para todos os casos
Os valores aproximados de NMP para qualquer nmero de diluies e tubos
paralelos so derivados da aplicao da seguinte equao (adaptado da
referncia [36]):

onde
Z
p
o nmero de tubos positivos;
m
r
a massa de referncia da amostra, em gramas;
m
s
a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com as reaes
negativas;
POP MET MIC 001
94 de
121
Re,iso( 00
m
t
a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.
NMP expresso por massa de referncia da amostra em gramas (geralmente
1 g, por vezes 100 g).
10.<.?.1.) Sol85o UeGataU para 8ma sCrie de t87os
O valor do NMP para uma nica srie de tubos derivado da seguinte frmula:
onde
m
r
m
m
a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da srie;
ln o logaritmo natural;
n o nmero de tubos na srie;
z
p
o nmero de tubos com uma reao positiva.
10.<.?.1./ Preciso estimada em ensaios de dil8i5o simples
Os limites de confiana de 95% da estimativa NMP podem ser calculados
aproximadamente atravs da equao:
onde
POP MET MIC 001
95 de
121
Re,iso( 00
x o limite de confiana superior ou inferior a 95%;
m
r
m
m
a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da srie;
ln o logaritmo natural;
n o nmero de tubos na srie;
z
n
o nmero de tubos com uma reao negativa.
O sinal positivo conectado com o limite inferior e o sinal de menos com o
limite superior. A aproximao no muito bom quando a maioria dos tubos
so negativos (estril), mas melhora quando a proporo de tubos positivos
aumenta.
10.<.?.1.: Preciso estimada em ensaios de dil8i5o mPltipla simCtrica
O padro de incerteza log
10
de um sistema de NMP de diluio mltipla
simtrica pode ser obtido pela equao aproximada de Cochran:
onde
SE o erro padro de log
10
NMP;
f o fator de diluio entre diluies consecutivas (principalmente 10);
n o nmero de tubos por diluio.
Os limites superior e inferior do grau confiana de 95% podem ser
conseguidos, respectivamente, multiplicando e dividindo a estimativa NMP pelo
POP MET MIC 001
96 de
121
Re,iso( 00
antilogaritmo de 2x SE. Esse procedimento tende a exagerar o limite de
confiana superior.
10.<.?.) Ta7elas de !MP
10.<.?.).1 Ta7elas para sistemas dil8i5o simples
Tabelas B.1 a B.4 (Anexo B) fornecem os valores de NMP e os intervalos de
confiana de 95% por poro de teste para 10, 15, 20 e 25 tubos paralelos
[cada tubo inoculado com a mesma diluio (simples)].
Para expressar o resultado por massa de amostra de referncia (ou o volume
de amostras de lquido), multiplique o NMP e os 95%d os valores-limite pela
razo (massa de referncia) / (massa toma de ensaio). No multiplicar o
padro logartmico
ncerteza. A massa de referncia em microbiologia alimentar geralmente 1g.
A massa tomada no ensaio corresponde quantidade de amostra (em gramas)
que est presente no volume usado para inocular os tubos, por exemplo, 0,1g
se 1ml do homogeneizado 10
-1
foi utilizado.
EXEMPLO
Vinte tubos de caldo de dupla concentrao foram inoculados com 5 ml
alquotas de uma amostra de dez vezes diluda (0,1 g / ml). Aps a incubao,
16 dos tubos apresentaram crescimento visvel. Qual foi a densidade mais
provvel de bactrias (organismos por grama) na amostra? Tabela B.3 d 1,61
como o nmero mais provvel de organismos por tubo, com um limite inferior
de 95% de 0,93 e um limite superior de 95% de 2,77.
Cada tubo recebeu uma poro teste de 5 ml, o que corresponde a 0,5 g de
amostra. Portanto, o nmero mais provvel de micro-organismos em 1 grama
de amostra dada por:
POP MET MIC 001
97 de
121
Re,iso( 00
NMP= /g = 3,2/g
com o intervalo de confiana de 95%, variando de
limite inferior de 95% = /g= 1,9/ g;
limite superior de 95% /g = 5,5/g
10.<.?.).) Ta7elas para sistemas de dil8i5o mPltiplas( trBs dil8i56es
s8cessi,as
Com sistemas simtricos, comum a prtica do uso de trs diluies
sucessivas com trs ou (Tabela B.5) ou cinco (Tabela B.7) repeties. Registrar
o nmero de resultados positivos para cada conjunto de tubos e, a partir da
tabela de NMP para o sistema de inoculao utilizada, leia o nmero mais
provvel de micro-organismos presentes no volume de referncia da amostra.
Algumas combinaes de tubos positivos so mais provveis do que outras.
Por exemplo, uma combinao de resultados positivos 0, 0, 3 muito menos
provvel de ocorrer do que a combinao 3, 2, 1. Para quantificar esta
probabilidade, todas as combinaes de resultados positivos tm sido
atribudas a uma categoria, variando de 0 a 3. A categoria de resultado 1 um
resultado com maior probabilidade, enquanto que uma categoria de resultado 3
rara e no pode ser reproduzido facilmente. Os piores casos so de categoria
0 resultados, que devem ser considerados com grande suspeita. Supondo-se
que os resultados da anlise estiverem corretos, seria de esperar que 95% das
combinaes observadas cairiam na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na
categoria 3 e apenas 0,1% na categoria 0. Categorias so mais bem explicadas
na Tabela B.6.
POP MET MIC 001
98 de
121
Re,iso( 00
No caso em que mais de trs diluies so feitas, a seleo da combinao
"direta" de trs diluies consecutivas nem sempre muito clara. No entanto,
isso pode ser feito facilmente pela gravao de todas as possveis
combinaes de tubos positivos e lendo a categoria correspondente na Tabela
B.5.
A partir da, aplicar as seguintes regras:
1) Selecione a combinao de trs diluies consecutivas com uma categoria 1
de perfil para obter o ndice de NMP. Se mais de uma combinao de perfil de
categoria 1 tiver sido obtida, use a que apresentar o maior numero de tubos
positivos.
2) Se nenhuma combinao de perfil de categoria 1 estiver disponvel, usar
uma de perfil de categoria 2. Se mais de uma combinao de perfil de
categoria 2 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
3) ) Se nenhuma combinao de perfil de categoria 2 estiver disponvel, usar
uma de perfil de categoria 3. Se mais de uma combinao de perfil de
categoria 3 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
Alguns exemplos so mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 - Exemplos de seleo de resultados positivos para o clculo do MPN
POP MET MIC 001
99 de
121
Re,iso( 00
10.<.?./ Programas de comp8tador
Os programas de computador mais versteis no representam nenhuma
restrio sobre o nmero de diluies e tubos paralelos ou simetria do sistema
de NMP. MPN Assa Analzer um programa disponvel gratuitamente com
base em um programa anterior.
10.<.+ EGpresso dos res8ltados
Do ndice NMP lido na tabela B.5 [de acordo com a combinao de trs (ou
cinco) diluies consecutivas retida], determinar o numero de micro-organismos
mais provveis no volume referido.
Resultados do relatrio como o nmero mais provvel de micro-organismos (ou
grupo especfico de micro-organismos) por grama ou mililitro. A massa ou o
volume de referncia pode ser diferente de g ou ml (por exemplo, 100 g ou 100
ml).
11 MCtodo de detec5o NmCtodo F8alitati,oO
11.1 eral
POP MET MIC 001
100 de
121
Re,iso( 00
Um mtodo de deteco um mtodo que determina a presena ou ausncia
de micro-organismos em uma determinada quantidade de produto.
11.) PrincKpio
Salvo disposio em contrrio de norma internacional especifica, misturar
(produtos lquidos) ou homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P do
produto a ser examinado com 9 x P ml ou 9 x P g de um caldo eletivo e/ou
seletivo.
Para facilitar a recuperao de micro-organismos estressados em alimentos, as
amostras so geralmente pr-enriquecidas em um caldo no-seletivo seguido
de enriquecimento seletivo e isolamento em meios agar seletivos / diferenciais.
O uso de dois diferentes caldos de enriquecimento, bem como de dois ou mais
meios de gar seletivo, aumentam a sensibilidade do mtodo.
Aps a incubao, espalhar com uma alada obtida do caldo seletivo sobre a
superfcie de um meio agar seletivo de tal forma a obter colnias isoladas.
Salvo disposio em contrrio, os caldos de enriquecimento incubados s
podem ser refrigerados aps a avaliao do impacto de sistemas de
refrigerao nos resultados e somente se claramente estipulado no resultado
do teste.
Um nmero (geralmente cinco por placa de gar) das colnias obtidas aps a
incubao so, ento, identificadas com tcnicas adequadas de confirmao.
A seleo de colnias para confirmao dever abranger representativamente
colnias tipicamente suspeitas.
11./ Incerte@a de medi5o
A estimativa da incerteza de medio de determinaes qualitativa est sendo
investigada pela SO/TC 34/SC 9.
POP MET MIC 001
101 de
121
Re,iso( 00
1) MCtodos de conAirma5o
1).1 eral
Utilizar apenas culturas puras para confirmao bioqumica e sorolgica.
Os testes de confirmao de referncia so descritos nas normas especficas.
Como uma alternativa aos testes bioqumicos descritos nessas normas
especficas, os mtodos de confirmao descritos nesta clusula (bioqumicos,
sondas de DNA) podem ser utilizados nas condies descritas na clusula,
salvo disposio em contrrio as normas especficas.
1).) Prepara5o de 8ma c8lt8ra p8ra
Comear a preparao de uma cultura pura pela seleo de uma nica colnia
em um meio agar. Ento inocular a colnia selecionada em meio de gar no-
seletivo. Aps a incubao, selecione uma colnia bem isolada para
posteriores testes de confirmao. Repita a operao se necessrio.
Se possvel, os testes de confirmao devero ser feitos usando clulas de
uma nica colnia. Se houver material insuficiente em uma colnia, ele deve
primeiro ser repicadas em um meio lquido ou em um meio inclinado gar, aps
o qual a subcultura pode ser utilizada para os testes a serem realizados.
1)E/ Teste de ram NtCcnica de 08cTer modiAicadaO
1)./.1 eral
Esta forma de colorao de clulas bacterianas permite a descrio da
morfologia da bactria e sua classificao em dois grupos em funo de serem
ou no capazes de reter a colorao de cristal violeta (Gram +) nas condies
de ensaio. Esta diviso resulta principalmente de diferenas na estrutura da
parede da clula dos dois grupos e se correlaciona com outras diferenas
importantes entre os dois grupos.
POP MET MIC 001
102 de
121
Re,iso( 00
A alternativa satisfatria colorao de Gram o uso de soluo de hidrxido
de potssio 3% (KOH). Uma alada do crescimento bacteriano agitada em 2
gotas de soluo de KOH. Bactrias gram-negativas faro com que a soluo
tornar-se muito viscosa e mucide em 30 segundos, com formao de um filete
da seguinte mistura na ala, quando levantada.
H uma srie de maneiras de conduzir um teste de Gram, mas todos seguem
as sequncias abaixo.
1)./.) Sol856es
1)./.).1 eral
Solues disponveis no mercado podem ser utilizados.
Neste caso, siga as recomendaes do fabricante.
1)./.).) Sol85o de cristal de ,ioleta
1)./.).).1 Composi5o
Cristal violeta 2,0 g
Etanol (95%) 20 ml
Oxalato de amnio (C2H8N2O4) 0,8 g
gua 80 ml
1)./.).).) Prepara5o
Dissolver o cristal violeta no etanol, e o oxalato de amnio na gua destilada.
Misturar as duas solues e manter a mistura em repouso por 24 h antes do
uso.
1)./.)./ Sol85o de iodo
POP MET MIC 001
103 de
121
Re,iso( 00
1)./.)./.1 Composi5o
1,0 g de iodo
odeto de potssio (K) 2,0 g
gua 100 ml
1)./.)./.) Prepara5o
Dissolver o iodeto de potssio em 10 ml de gua e adicionar o iodo em fraes.
Aps dissoluo, completar o 100 ml em um balo volumtrico.
1)./.).: Sol85o de saAranina
1)./.).:.1 Composi5o
Safranina 0,25 g
Etanol (95%) 10 ml
gua 100 ml
1)./.).:.) Prepara5o
Dissolver o safranina no etanol, em seguida, misturar com a gua destilada.
12.3.3 Tcnica de Gram
Depois de fixar uma alada de bactrias numa lmina de microscpio com a
chama, preparada a partir de uma cultura 18 a 24 horas ou quando o caldo
estiver turvo, cobrir o filme com o cristal violeta. Deixar reagir por 1 min.
Delicadamente lavar com gua a lamina inclinada por alguns segundos.
Cubrir a lmina com a soluo de iodo. Deixar reagir por 1 min.
POP MET MIC 001
104 de
121
Re,iso( 00
Delicadamente lavar com gua a lamina inclinada por alguns segundos.
Despeje delicadamente e de forma contnua um filme de etanol (95%) sobre a
rampa inclinada durante um perodo no superior a 30 s at que nenhuma cor
violeta saia da lamina.
Delicadamente lavar com gua a lamina inclinada para eliminar o etanol. Cubra
a lmina com uma soluo de safranina por 10 segundos. Delicadamente lavar
com gua a lamina inclinada.
Secar a lamina.
1)./.: Interpreta5o
Colocar uma gota de leo de petrleo na lamina, e examinar na objetiva de alta
potncia de um microscpio. As clulas bacterianas que aparecem em azul ou
violeta so denominadas Gram-positivas (+ Gram), aquelas que so cor de
rosa, ou cor vermelha escura so denominadas Gram-negaivas (- Gram).
Para uma cultura pura de certos tipos de bactrias, tanto as clulas Gram-
positivas e Gram-negativas podem ser obtidas no mesmo campo do
microscpio.
NOTA Quantidade muito densa de clulas pode dar uma resposta incomum.
1).: Uso de galerias 7ioF8Kmicas para identiAica5o
Galerias bioqumicas disponveis podem ser usadas para identificao de
colnias isoladas.
Verificar se as galerias so adequadas, atravs de estudos de avaliao
publicados em revistas de literatura cientficas internacionais, de preferncia
relacionados microbiologia de alimentos
4
. Esta verificao especialmente
importante se o fabricante no tem validao de dados sobre as galerias.
POP MET MIC 001
105 de
121
Re,iso( 00
O laboratrio deve obter um certificado de controle para cada lote, com
indicao das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar tambm as cepas de controle que o laboratrio
pode usar para verificar a preservao do desempenho das galerias.
As galerias devem incluir, no mnimo, os testes bioqumicos descritos nas
normas especficas ou ser complementadas por outros testes.
1).< Uso de sondas n8clCicas para a identiAica5o
Sondas nuclicas podem ser utilizadas para identificao de colnias isoladas.
No entanto, deve-se verificar se as sondas nuclicas utilizadas para a
confirmao so adequadas, como mostradas por estudos de avaliao
publicados em literatura cientfica internacional, de preferncia relativa
microbiologia de alimentos. Esta verificao especialmente importante se o
fabricante no tem dados de validao das sondas.
O laboratrio deve obter um certificado de controle para cada lote, com
indicao das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar tambm as cepas controle que o laboratrio pode
usar para verificar a manuteno do desempenho da sonda.
4) Os pedidos de informao devem ser dirigidos para o centro de referncia
nacional, regional ou internacional indicado para cada micro-organismo.
1).? MCtodos sorol9gicos
1).?.1 eral
Quando confirmao sorolgica necessria, realiz-la aps a identificao
bioqumica das colnias isoladas.
POP MET MIC 001
106 de
121
Re,iso( 00
1).?.) Testes de agl8tina5o em laminas
Reaes antgeno-anticorpo causam nas clulas bacterianas agregao e
formao massas floculantes ou densos grnulos. No caso das bactrias da
famlia Enterobacteriaceae, a reao entre o antgeno "H" (flagelar) e seu
antissoro homlogo resulta em um amontoado floculante, enquanto que a
reao envolvendo o antgeno "O" (somtico) resulta em uma mais densa
aglomerao granular.
Antes de aglutinao com anti-soros, um teste deve ser realizado para
determinar se as clulas bacterianas aglutinam em soluo de 3% de cloreto
de sdio. Se as clulas bacterianas aglutinarem, a cepa autoaglutinante e
no deve ser aglutinada com anti-soros.
Anti-soros disponveis comercialmente so de dois tipos: anti-soros polivalentes
que reagem com micro-organismos de um determinado gnero ou com grupos
de sorovares e que so adequados para triagem preliminar, e anticorpos
monoclonais especficos, cuja utilizao permite a identificao de um sorovar
especifico.
O laboratrio deve obter um certificado de controle para cada lote de anti-
soros, com indicao das cepas testes.
Verifique se os testes de aglutinao so adequados, como mostrado por
estudos de avaliao publicado em literatura cientfica internacional, de
preferncia relacionados microbiologia de alimentos
5
.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser
usados.
1).?./ Teste de agl8tina5o de lteG
POP MET MIC 001
107 de
121
Re,iso( 00
Um mtodo mais rpido est disponvel comercialmente, empregando
partculas de ltex revestidas com grupos de anticorpos especficos. O
antgeno no extrato testado contra uma srie de ltex reagentes.
Verifique se os testes de aglutinao em ltex so adequados, como mostrado
por estudos de avaliao publicados em literatura cientfica internacional, de
preferncia relacionados microbiologia de alimentos. O laboratrio deve obter
um certificado de controle para cada lote, com indicao das cepas testes.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser
usados. Os pedidos de informao devem ser dirigidos para o centro de
referncia nacional, regional ou internacional indicado para cada
microorganismo.
1/.0 RE&AT'RIO 1E E!SAIO
O relatrio deve especificar o mtodo utilizado, se necessrio a temperatura de
incubao, e os resultados obtidos. Deve tambm mencionar todos os detalhes
operacionais no especificadas nesta Norma, bem como aqueles considerados
como opcional, juntamente com os detalhes de quaisquer incidentes que
possam ter influenciado os resultados.
Constar tambm no relatrio de ensaio se mais testes devem ser realizados
por um laboratrio de referncia, ou, e se esses testes foram realizados, quais
foram os resultados.
O relatrio de ensaio deve incluir todas as informaes necessrias para a
identificao completa da amostra. Tambm apropriado incluir todas as
informaes necessrias para a interpretao dos resultados do teste.
Se necessrio, a medida de incerteza, deve ser includa no relatrio de ensaio.
1:.0 2A&I1A"4O 1E MVTO1OS MICRO%IO&'ICOS
1:.1 2alida5o de mCtodos de reAerBncia
POP MET MIC 001
108 de
121
Re,iso( 00
A validao de mtodos de referncia est sendo investigada pela SO/TC
34/SC 9.
1:.) 2alida5o de mCtodos alternati,os
A SO 16140 orienta para o protocolo tcnico de validao de mtodos
alternativos comparados com mtodos de referncia.
1:./ 2alida5o de mCtodos internos
A validao de mtodos internos est sendo investigada pela SO/TC 34/SC 9.
1<.0 ARA!TIA 1E QUA&I1A1E 1OS RESU&TA1OS * CO!TRO&E 1E
QUA&I1A1E 1E 1ESEMPE!0O
1<.1 Controle de F8alidade interno
1<.1.1 Controle de qualidade interno composto por todos os procedimentos
realizados por um laboratrio para a contnua avaliao do seu trabalho. O
objetivo principal garantir a consistncia dos resultados no dia-a-dia e a sua
conformidade com critrios bem definidos.
1<.1.) Um programa de verificaes peridicas necessrio para demonstrar
que a variabilidade (entre os analistas, entre equipamentos ou entre materiais)
est sob controle. Todos os testes includos no escopo de atividade do
laboratrio precisam ser protegidos.
O programa deve envolver:
- o uso de amostras fortificadas, com nveis variveis de contaminao,
incluindo a cepa alvo e flora contaminante;
- o uso de amostras naturalmente contaminadas a partir de uma gama de
matrizes;
POP MET MIC 001
109 de
121
Re,iso( 00
- o uso de materiais de referncia (incluindo materiais para ensaios de
proficincia);
- testes de replicao;
- replicao de testes de avaliao.
O intervalo entre essas verificaes influenciado pela natureza dos ensaios
efetuados pelo laboratrio e a freqncia na qual os testes so realizados.
Recomenda-se que, sempre que possvel, os testes devem incorporar
controles para monitorizao do desempenho.
1<.1./ Em casos especiais, um laboratrio pode realizar um teste especfico
raro. reconhecido que, em tais casos, um programa de controle de qualidade
interno em curso pode ser inadequado e que pode ser mais adequado realizar
em paralelo com o teste um esquema para demonstrar desempenho
satisfatrio.
1<.) Cepas de reAerBncia
Manuteno de cepas de referncia de acordo com o POP MET MC 001.
1<./ A,alia5o eGterna da F8alidade Nensaios de proAiciBnciaO
Laboratrios devem participar regularmente em programas de ensaios de
proficincia que so relevantes para o seu mbito de atividade.
Deve ser dada preferncia aos programas de ensaios de proficincia que
utilizem matrizes adequadas.
Laboratrios devem usar avaliao externa da qualidade no s para avaliar
tendncia de laboratrio, mas tambm para verificar a validade do seu sistema
de qualidade como um todo.
POP MET MIC 001
110 de
121
Re,iso( 00
1?.0 %I%&IORALIA CO!SU&TA1A
SO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs General
requirements and guidance for microbiological examinations.
II. 0IST'RICO 1AS RE2IS#ES
RE2IS4O 1ESCRI"4O 1ATA
00 Emisso inicial 02.07.2012
POP MET MIC 001
111 de
121
Re,iso( 00
POP MET MIC 001
112 de
121
Re,iso( 00
AneGo A
POP MET MIC 001
113 de
121
Re,iso( 00
InAormati,o
POP MET MIC 001
114 de
121
Re,iso( 00
AneGo %
N!ormati,oO
1etermina5o do nPmero mais pro,,el N!MPO
Tabela B.1 - valores de NMP por poro de ensaio e limites de confiana de
95% para uma srie de 10 tubos.
Tabela B.2 Valores de NMP por poro de ensaio e limites de confiana de
POP MET MIC 001
115 de
121
Re,iso( 00
Tabela B.3 - Valores de NMP por poro de ensaio e limites de confiana de
POP MET MIC 001
116 de
121
Re,iso( 00
Tabela B.4 - Valores de NMP por poro de ensaio e limites de confiana de
POP MET MIC 001
117 de
121
Re,iso( 00
Tabela B.5 - ndices e limites de confiana (95%) de NMP, quando trs pores
de ensaio de 1g (ml), trs de 0,1g (ml) e trs de 0,01g (ml) so usados.
a fonte: Referncia: De Man, J.C. MPN tables (corrected), Eur. J. Appl. Biotechnol. 1983, 17,
pp. 301-.
b Veja a Tabela B.6.
c os limites de confiana apresentados nesta tabela so destinados apenas para fornecer uma
idia da influncia das variaes estatsticas nos resultados.
Haver sempre tambm outras fontes de variao, que pode s vezes ser ainda mais
importante.
POP MET MIC 001
118 de
121
Re,iso( 00
Tabela B.6 - Explicao de categorias de resultados
categoria
a
1eAini5o
1 Quando o nmero de bactrias na amostra igual ao NMP encontrado, o
resultado aquele que tm a maior chance de ser obtido. H no mximo
apenas 5% de chance de se obter um resultado que menos provvel do que
mnimo provvel nesta categoria.
) Quando o nmero de bactrias na amostra igual ao NMP encontrado, o
resultado um daqueles que tm menos chance de ser obtido, que o minimo
provvel na categoria 1, mas no h, no mximo, 1% de chance de se obter
um resultado que menos provvel do que mnimo provvel nesta categoria.
/ Quando o nmero de bactrias na amostra igual ao NMP encontrado, o
provvel na categoria 2, mas no h, no mximo, 0,1% de chance de se obter
um resultado que menos provvel do que mnimo provvel nesta categoria.
0 Quando o nmero de bactrias na amostra igual ao NMP encontrado, o
provvel na categoria 3. H apenas 0,1% de chance de obter um resultado,
nesta categoria, sem que nada esteja errado.
a
Antes de iniciar um teste, ele deve ser decidido qual a categoria ser aceitvel, ou seja,
apenas 1, 1 e 2 ou mesmo 1, 2 e 3. Quando o deciso a ser tomada com base no resultado
de grande importncia, apenas a categoria 1, ou no mximo 1 e 2, os resultados devem ser
aceitos. Resultados da categoria 0 devem ser considerados com grande suspeita.
POP MET MIC 001
119 de
121
Re,iso( 00
Ta7ela %.+ M 2alores de !MP por grama de amostra com limites de conAian5a de I<W
NQ8ando tomada cinco por56es teste de 1 gE cinco de 0E1 g e cinco de 0E01gO
POP MET MIC 001
120 de
120
Re,iso( 00

PT-LMC-004 - Requisitos Gerais para Exames Microbiologicos

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