Coordenao Geral de Acreditao

ORIENTAO SOBRE VALIDAO DE

MTODOS ANALTICOS
Documento de carter orientativo

DOQ-CGCRE-008
Reviso 03 FEV/2010

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SUMRIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Objetivo
Campo de Aplicao
Responsabilidade
Documentos Complementares
Siglas
Definies
Introduo
Validao
8.1. Planejamento da validao
8.2. Parmetros de validao
8.2.1. Seletividade
8.2.2. Linearidade
8.2.3. Faixa de trabalho e faixa linear
8.2.4. Limite de deteco
8.2.5. Limite de quantificao
8.2.6. Tendncia/recuperao
8.2.6.1. Materiais de referncia certificados
8.2.6.1.1. Erro relativo
8.2.6.1.2. ndice z
8.2.6.1.3. Erro normalizado
8.2.6.2. Ensaios de recuperao
8.2.6.3. Preciso
8.2.6.3.1. Repetitividade
8.2.6.3.1.1. Limite de repetitividade
8.2.6.3.2. Preciso intermediria
8.2.6.3.3. Reprodutibilidade
8.2.6.3.3.1. Limite de reprodutibilidade
8.2.6.3.4. Comparao da preciso entre mtodos
8.2.6.3.5. Avaliao da aceitabilidade das caractersticas de preciso de um
mtodo de anlise
8.2.6.3.5.1 Interpretao
8.2.6.3.5.2 Clculo do valor de Horwitz
8.2.6.4. Robustez
8.2.6.5. Comparaes interlaboratoriais
9. Documentao de mtodos validados
10. Documentos de Referncia
11. Histrico da Reviso
ANEXO Relao dos participantes da elaborao deste documento.

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1 OBJETIVO
Este documento tem como objetivo auxiliar os laboratrios na tarefa de demonstrar que um
mtodo analtico, nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a
obteno de resultados com a qualidade exigida.
Este documento no pretende abordar todas as tcnicas aplicveis validao de mtodos
analticos, cabendo ao laboratrio buscar aquela que mais se aplica ao estudo em questo.
2 CAMPO DE APLICAO
Este documento aplica-se Dicla, aos laboratrios acreditados ou postulantes acreditao, e
aos avaliadores e especialistas na rea de laboratrios de ensaios.
3 RESPONSABILIDADE
A responsabilidade pela reviso deste documento da Dicla.
4 DOCUMENTOS COMPLEMENTARES
Aplicam-se as ltimas edies dos seguintes documentos:

ABNT NBR ISO/IEC 17000 - Avaliao de conformidade Vocabulrio e princpios gerais

ABNT NBR ISO/IEC 17025 - Requisitos Gerais para a Competncia dos Laboratrios de
Ensaio e de Calibrao

VIM Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, verso

brasileira.

ABNT ISO/IEC Guia 43-1 Ensaios de proficincia por comparaes interlaboratoriais Parte 1:
Desenvolvimento e operao de programas de ensaios de proficincia

INMETRO. DOC-CCGRE-020 - Definies de termos utilizados nos documentos relacionados

acreditao de laboratrio

5 SIGLAS
ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas
APHA American Public Health Association
ANSI American National Standards Institute
ASTM American Society for Testing and Materials
AWWA American Water Works Association
Cgcre Coordenao Geral de Acreditao do INMETRO
CV Coeficiente de Variao
Dicla Diviso de Acreditao de Laboratrios do INMETRO
DP Desvio Padro
DPR Desvio Padro Relativo
IEC International Electrotechnical Commission
ISO International Organization for Standardization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LGC
MRC
NBR
NIST

Laboratory of the Government Chemist (UK)

Material de Referncia Certificado
Norma Brasileira
National Institute of Standards and Technology (USA)

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VIM Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia

WEF Water Environment Federation
6 DEFINIES
Para o propsito deste documento, so adotadas as definies contidas no documento DOQCCGRE-020, ABNT NBR ISO/IEC 17000, ABNT NBR ISO/IEC 17025 e no VIM.
7 INTRODUO
O laboratrio deve atender aos requisitos da ABNT NBR ISO/IEC 17025 para a seleo de
mtodos de ensaios (item 5.4.2), desenvolvimento de mtodos de ensaio pelo laboratrio (item
5.4.3), utilizao de mtodos no normalizados (item 5.4.4) e validao de mtodos (item 5.4.5).
fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para demonstrar, por
meio da validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e
adequados qualidade pretendida.
O laboratrio, ao empregar mtodos normalizados, necessita demonstrar que tem condies de
oper-los de maneira adequada, dentro das condies especficas existentes nas suas
instalaes antes de implant-los, no necessitando realizar os parmetros, descritos nos itens,
deste documento, referentes a seletividade (item 8.2.1), linearidade (item 8.2.2), faixa de trabalho
e faixa linear (item 8.2.3), comparao de mtodos (item 8.2.6.3.4), avaliao da aceitabilidade
(item 8.2.6.3.5) e robustez (item 8.2.6.4) e comparao da preciso entre os mtodos (item
8.2.6.3.4)desde que os parmetros de validao estejam declarados nos mtodos em questo.
Se um mtodo existente for modificado para atender aos requisitos especficos, ou um mtodo
totalmente novo for desenvolvido, o laboratrio deve se assegurar de que as caractersticas de
desempenho do mtodo atendem aos requisitos para as operaes analticas pretendidas.
8

VALIDAO

Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso pretendido, o laboratrio
deve validar:

Mtodos no normalizados;
Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio;
Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos;
Ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
O processo de validao de um mtodo deve estar descrito em um procedimento, e os estudos
para determinar os parmetros de validao devem ser realizados com equipamentos e
instrumentos dentro das especificaes, funcionando corretamente e adequadamente calibrados.
Do mesmo modo, o responsvel pela realizao dos estudos deve ser competente na rea e
precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho, sendo capaz de tomar as decises
apropriadas durante a realizao do mesmo.
8.1 Planejamento da validao
No planejamento e execuo da validao, sugere-se a seguinte sequncia de trabalho:

Definir a aplicao, objetivo e escopo do mtodo;

Definir os parmetros de validao e critrios de aceitao;

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Verificar se as caractersticas de desempenho do equipamento esto compatveis com o

exigido pelo mtodo em estudo;

Qualificar os materiais, por exemplo, padres e reagentes;

Planejar os experimentos de validao, incluindo o tratamento estatstico, e

Fazer os experimentos de validao.

Os experimentos e os resultados devem ser documentados e registrados.

8.2 Parmetros de validao
Os parmetros de validao devem estar claramente declarados no procedimento documentado e
incluir, quando aplicvel:

Seletividade

Linearidade

Faixa de trabalho e Faixa linear

Limite de deteco

Limite de quantificao

Tendncia/recuperao

Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade)

Robustez

Os parmetros que necessitam ser calculados durante o processo de validao podem variar de
acordo com o tipo de ensaio, como mostra o quadro 1.
Quadro 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio

Tipo de ensaio
Parmetros

Preciso
Seletividade
Tendncia / recuperao
Robustez
Sensibilidade
/
linearidade / faixa de
trabalho
Limite de deteco
Limite de quantificao

Qualitativo

Determinao do
componente (ou
analito) em maior
teor(1)

Anlise
de elementos
menores e
Traos (2)

Fonte: In-House Method Validation - A guide for Chemical Laboratories LGC / VAM, 2003

Propriedades
Fsicas

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(1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no ser necessria a determinao

dos limites de deteco e de quantificao, como por exemplo: determinao de sacarose em
balas e determinao do teor de gordura em carnes. por exemplo .componentes maiores com
concentrao entre 1 a 100%,
(2) So considerados como de menor teor concentraes entre 0,01 a 1% e elementos traos, os
elementos em concentrao abaixo de 0,01%
8.2.1 Seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medio. Os
interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito tambm pode depender
da concentrao.
Experimentos para avaliao da seletividade descritos na literatura sobre validao de mtodos
analticos envolvem ensaios com padres ou materiais de referncia, amostras com e sem o
analito, alm da avaliao da capacidade de identificao do analito de interesse na presena de
interferentes (quadro 2). Quando no h disponibilidade de interferentes, alguns autores sugerem
a avaliao da habilidade de medio do analito por diferentes mtodos, tcnicas ou por meio de
variaes nas condies instrumentais.
Se a seletividade no for assegurada, a linearidade, a tendncia e a preciso estaro seriamente
comprometidas.
Quadro 2 Avaliao da seletividade
Procedimento

Demonstrar

Comentrios

a) Fazer a anlise com a Habilidade do mtodo em estudo de identificar Evidncias necessrias para dar
amostra e materiais de e dosar o analito na presena de interferentes. suporte e gerar confiabilidade
suficiente.
referncia pelo mtodo em
estudo e outros mtodos
validados.
alteram
resultados,
b)
Analisar
amostras Efeito de interferentes - a presena de Se
contendo vrios interferentes interferente acentua ou inibe a deteco ou aperfeioar o mtodo ou
selecionar outro mais adequado.
suspeitos na presena do quantificao do analito de interesse.
analito de interesse.

8.2.2 Linearidade
A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa dinmica linear.
necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de concentrao do analito coincide com a
faixa dinmica linear e assegurar que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na
resposta.
A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta medida e a concentrao
do analito. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como
expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na
amostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :
y = a + bx

(1)

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sendo:
y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);
x = concentrao;
a = interseo com o eixo y, quando x = 0;
b = inclinao da curva analtica = sensibilidade.
O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao resultam em maior
variao na resposta, ou seja, maior inclinao (b).
Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimo cinco, para construir a
curva analtica. O nmero de replicatas em cada nvel de concentrao deve ser o mais prximo
possvel daquele empregado na rotina do laboratrio.
A linearidade de um mtodo pode ser observada pelo grfico dos resultados dos ensaios em
funo da concentrao do analito e verificada a partir da equao da regresso linear,
determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados. Para tal, deve ser verificada a ausncia de
valores discrepantes para cada nvel de concentrao e a homocedasticidade dos dados, antes de
fazer a regresso linear.
A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo teste de Grubbs (ISO 57253,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a
homocedasticidade, isto , homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran
(ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou o teste de BrownForsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005).
Calcular o modelo atravs da regresso linear, os resduos e o coeficiente de correlao linear (r).
Este freqentemente utilizado para indicar o quanto a reta pode ser considerada adequada
como modelo matemtico para o estudo de caso. Uma alternativa para avaliar a linearidade seria
a realizao da anlise de varincia (ANOVA) na regresso.
Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo aps qualquer
transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descrita por uma funo que modela
a concentrao do analito na amostra.
8.2.3 Faixa de Trabalho e Faixa Linear
Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do analito ou valores da
propriedade no qual o mtodo pode ser aplicado.
Todo experimento de determinao da faixa de trabalho iniciado pela escolha de uma faixa
preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de aplicao para a qual o ensaio vai ser usado
e a concentrao mais esperada da amostra deve, sempre que possvel, se situar no centro da
faixa de trabalho.
No limite inferior da faixa de concentrao, o fator limitante o valor do limite de quantificao. No
limite superior, os fatores limitantes dependem do sistema de resposta do equipamento de
medio.
Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e dentro desta, a resposta do
sinal ter uma relao linear com o analito ou valor da propriedade. A extenso dessa faixa pode
ser estabelecida durante a avaliao da faixa de trabalho.

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Tabela 1 - Mtodos para determinao da Faixa de Trabalho e Faixa Linear.

Observaes: Branco = gua reagente

Branco da amostra = matriz da amostra sem o analito de interesse
8.2.4 Limite de Deteco (LD)
Quando so realizadas medidas em amostras com baixos nveis do analito ou de uma
propriedade, como por exemplo, anlise de traos, importante saber qual o menor valor de
concentrao do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo mtodo.
A importncia desta determinao e os problemas associados a ela advm do fato de que a
probabilidade de deteco no muda rapidamente de zero para um quando seu limiar
ultrapassado. Os problemas tm sido investigados estatisticamente e diversos critrios de deciso
tm sido propostos. Muitas controvrsias so originadas devido ao fato de no haver atualmente
uma concordncia da terminologia aplicvel. O termo limite de deteco no aceito por todos,
apesar de ser usado em alguns documentos setoriais.
O limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em funo do tipo da amostra.
fundamental assegurar-se de que todas as etapas de processamento do mtodo analtico sejam
includas na determinao desse limite de deteco.
Para a validao de um mtodo analtico, normalmente suficiente fornecer uma indicao do
nvel em que a deteco do analito pode ser distinguida do sinal do branco/rudo.
Existem diversas formas de se calcular o limite de deteco. No quadro 3 so apresentadas
algumas destas metodologias.

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Quadro 3 - Determinao de Limite de Deteco (LD)

Matriz
Branco da amostra

Clculos
LD = X + t ( n 1, 1 ) .s

Observaes
A mdia e o desvio-padro
amostral dos brancos da
amostra so dependentes da
matriz.
Vlido somente quando os
valores
dos
brancos
apresentarem um desviopadro amostral diferente de
zero.

sendo:
X = mdia dos valores dos
brancos da amostra;
t a distribuio de Student,
dependente do tamanho da
amostra e do grau de confiana e,
s = desvio-padro amostral dos
brancos da amostra.
Ou
A menor concentrao
Branco da amostra com LD = 0 + t ( n 1, 1 ) .s
aceitvel aquela tida como
adio
da
menor
sendo:
a concentrao mais baixa
concentrao aceitvel
t = distribuio de Student,
para a qual um grau aceitvel
do analito
dependente do tamanho da
de incerteza pode ser
amostra e do grau de confiana e,
alcanado.
s = desvio-padro amostral dos
brancos da amostra, com adio.
A parte estatstica somente uma orientao, e que o LD deva ser obtido experimentalmente, j
que, conforme descrito, o limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em
funo do tipo da amostra e, por isso, no h uma frmula estatstica.
fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas em amostras com concentrao
igual ao limite de deteco determinado.
O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite de deteco, por isto, este
nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio.
recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD.
Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus de liberdade de uma matriz
de branco da amostra com adio da menor concentrao aceitvel do analito. Para esses graus
de liberdade, o valor de t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes
o desvio padro amostral.
O mtodo analtico deve ser especificado e o LD para cada analito deve ser expresso nas
unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra
usada para determinar o LD deve ser identificada.
8.2.5 Limite de Quantificao
Algumas vezes tambm denominado Limite de Determinao. Na prtica, corresponde
normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao (excluindo o branco). Este limite,
aps ter sido determinado, deve ser testado com amostras independentes, para averiguar se a
tendncia e a preciso conseguidas so satisfatrias.
A descrio do quadro 4 pode ser considerada como sendo uma maneira de se calcular o limite
de quantificao. A concentrao do analito corresponde ao valor da mdia do branco mais 5, 6
ou 10 desvios padro. Todavia, a maneira mais realista determinar o LQ experimentalmente,
com base em critrios de aceitao pr-definidos.

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Quadro 4 Determinao do Limite de Quantificao (LQ)

Matriz
Branco da amostra

Determinao

Branco com adio de

concentraes variadas
do analito, prximas ao
LD

LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s
onde:
X = mdia dos valores dos brancos
s = desvio-padro amostral dos brancos
- Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel
de concentrao.
- Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito,
para cada concentrao.
- Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um
valor para o LQ, por inspeo.

O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ para cada analito deve ser expresso nas
unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra
usada para determinar o LQ deve ser identificada.
Nota: Para a anlise em nvel de traos, recomendado adotar o LQ como a concentrao mais
baixa da curva analtica.

8.2.6

Tendncia/Recuperao

Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de um mtodo so, entre outros:
uso de materiais de referncia certificados (MRC), participao em comparaes interlaboratoriais
e realizao de ensaios de recuperao.
A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica numa combinao de
componentes de erros aleatrios e sistemticos.
A determinao da tendncia com relao aos valores de referncia apropriados importante no
estabelecimento da rastreabilidade aos padres reconhecidos.
A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:
valorobservado
x 100%.
valoresperado

Esta tendncia deve ser corrigida ou demonstrada ser desprezvel, mas em ambos os casos, a
incerteza associada com a determinao da tendncia permanece como um componente
essencial da incerteza global.
Nota: A exatido avaliada numericamente atravs da tendncia.
8.2.6.1 Materiais de referncia certificados
Sempre que possvel, os materiais de referncia certificados (MRC) devem ser utilizados no
processo de validao de um mtodo de ensaio. Um MRC possui um valor de concentrao, ou
outra grandeza, para cada parmetro, e uma incerteza associada. muito importante, portanto,
que o fornecimento desses MRCs seja realizado por organismos reconhecidos e confiveis, como
por exemplo: INMETRO, NIST, LGC, etc.

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O uso correto dos MRC consiste na sua anlise para avaliar o desempenho do laboratrio. Na
avaliao da tendncia utilizando um material de referncia certificado, os valores obtidos pelo
laboratrio mdia e o desvio padro amostral de uma srie de ensaios em replicata devem ser
comparados com os valores certificados do material de referncia. Para esta comparao podem
ser utilizados diversos critrios de deciso, entre os quais:
erro relativo;
ndice z (z-score), e
erro normalizado.
Quando o valor obtido no estiver dentro do intervalo da regio de aceitao para o valor
certificado, o laboratrio deve procurar as causas desse desvio e procurar elimin-las.
8.2.6.1.1 Erro relativo (ER)
Uma forma de avaliar a exatido do mtodo por meio do clculo do erro relativo (ER), expresso
em percentagem por meio da expresso:

ER =

X lab X v
. 100
Xv

(2)

Sendo:
Xlab = valor obtido experimentalmente ou mdia aritmtica de valores obtidos
Xv = valor aceito como verdadeiro (valor certificado do MRC)

8.2.6.1.2

ndice z (z score)

O ndice z tambm um modo de avaliar o desempenho do laboratrio em comparaes

interlaboratoriais.

z=

( X lab X v )
s

(3)

Sendo:
Xlab = valor obtido pelo laboratrio;
Xv = valor aceito como verdadeiro;
s = desvio-padro do ensaio de proficincia.
A avaliao feita com o seguinte critrio de deciso, de acordo com a ISO Guia 43:
|z| 2 => resultado satisfatrio;
2 < |z| < 3 => resultado questionvel;
|z| 3 => resultado insatisfatrio.
8.2.6.1.3 Erro normalizado
Quando o laboratrio calcular a incerteza expandida do seu resultado (Ulab), o valor verdadeiro
(Xv) deve estar dentro do intervalo (Xlab. Ulab). Quando isso no acontece, esse intervalo pode
estar subestimado. Nesses casos empregado o conceito de erro normalizado (En):

En =

( X lab X v )
2
2
U lab
+ U ref

(4)

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Sendo:
Uref = incerteza associada ao MRC
Se | En | 1, ento pode ser considerado que o resultado do laboratrio adequado.
8.2.6.2 Ensaios de recuperao
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras fortificadas com
quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser fortificadas com o analito em
pelo menos trs diferentes concentraes: baixa, mdia e alta, da faixa de uso do mtodo.
A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est necessariamente na
mesma forma que a presente na amostra. A presena de analitos adicionados em uma forma
mais facilmente detectvel pode ocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao.
A recuperao calculada segundo:

C1 C 2
C3

Recuperao (%) =

100

(5)

Sendo:
C1 = concentrao do analito na amostra fortificada,
C2 = concentrao do analito na amostra no fortificada,
C3 = concentrao do analito adicionada amostra fortificada.
8.2.6.3 Preciso
Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as trs formas mais
comuns de express-la so: por meio da repetitividade, preciso intermediria e da
reprodutibilidade, sendo usualmente expressas pelo desvio padro e coeficiente de variao.
O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambm conhecido como desvio
padro relativo (DPR), calculado da seguinte forma:

C.V. = DPR =

DP
100
CMD

(6)

Sendo:
DP

= desvio-padro;

CMD = concentrao mdia determinada

8.2.6.3.1 Repetitividade
As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando:
Mesmo procedimento de medio;
Mesmo observador;
Mesmo instrumento usado sob mesmas condies;
Mesmo local, e
Repeties no menor espao de tempo possvel.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica da disperso
dos resultados e pode ser determinada por meio da anlise de padres, material de referncia ou
adio do analito a branco da amostra, em vrias concentraes na faixa de trabalho.

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O nmero de replicatas para cada nvel de concentrao deve expressar a rotina do laboratrio.
8.2.6.3.1.1 Limite de repetitividade (r)
A partir do desvio-padro dos resultados dos ensaios sob condio de repetitividade
aconselhvel calcular o limite de repetitividade (r) que capacita o analista a decidir se a diferena
entre anlises realizadas nas condies de 10.7.1 significante.
O limite de repetitividade (r) dado por:

r = t (n -1, 1- ) 2 .

(7)

Sendo:

S = desvio-padro amostral associado aos resultados considerados para cada nvel de

concentrao
Caso o laboratrio obtenha resultados diferentes para r nos diferentes nveis de concentrao, o
limite de repetitividade (r) calculado de acordo com a norma ISO 5725-2.
8.2.6.3.2

Preciso intermediria

A preciso intermediria, de acordo com a ISO 5725-3, refere-se preciso avaliada sobre a
mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo
laboratrio, mas definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais), tais como:

diferentes analistas;

diferentes equipamentos;

diferentes tempos.

Esta medida de preciso representa a variabilidade dos resultados em um laboratrio.

Na maioria dos casos, o valor de preciso intermediria funo do nvel de concentrao do
ensaio e o seu clculo efetuado, preferencialmente, a partir dos resultados obtidos, aps
eliminao dos resultados discrepantes. A visualizao grfica dos valores tambm pode ser til
para identific-los.
Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso intermediria, existem vrios
mtodos para determinao e controle desse parmetro, tais como:

por meio de grfico de controle do desvio padro, que poder ser aplicados para replicatas de
amostras e para padres estveis ao longo do tempo;

por meio da expresso:

Spi( j ,k ) =

1
t ( n 1)

(y
t

jk

yj

j =1 k =1

Spi( j ,k ) = desvio padro de preciso intermediria

t = total de amostras ensaiadas (no confundir com o t de Student);
n = total de ensaios efetuados por amostra;
j = n da amostra, j = 1, t
k = n do ensaio da amostra j, k = 1, n
yjk = valor do resultado k para a amostra j
yj = representa a mdia aritmtica dos resultados da amostra j.

(8)

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Nesse caso, a determinao da preciso intermediria feita por meio de t valores de n ensaios
de amostras ou padres. A preciso intermediria baseia-se na disperso entre ensaios.
recomendado que o valor t (n-1), seja, pelo menos, igual a 15.
Quando n = 2 a equao (8) toma a forma:

Si( j ,k ) =

1 t
. ( y j1 y j 2 ) 2
2.t j =1

(9)

Sendo

y j1

= primeiro resultado obtido para a amostra j;

y j 2 = segundo resultado obtido para a amostra j

Um mtodo simplificado para estimar a preciso intermediria baseia-se na execuo de n
medies (n 15), em condies pr-definidas, sobre:
uma mesma amostra;
amostras supostamente idnticas;
padres

A estimativa da preciso internediria Si ( ), neste caso, dada por:

Si( j ,k ) =

1 n
( yk
n 1 k =1

y )2

(10)

em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo a esse grupo, onde os
smbolos relativos s condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex:
Si (T.O) significa tempo e operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando
comparado com os anteriores.
Sendo:
n = n de ensaios efetuados por amostra ou padro;
yk = cada resultado obtido;
y = representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.
8.2.6.3.3 Reprodutibilidade
Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao de mtodo executado por um
nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio busca a verificao do
desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de
comparao interlaboratorial.
A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite de
reprodutibilidade (R), o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da
duplicata das amostras analisadas sob condies de reprodutibilidade significante.

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O clculo terico do desvio padro da reprodutibilidade baseado na concentrao do analito pode

ser obtido pela equao de Horwitz, modificada por Thompson, de tal forma que:
- para c (concentraes) > 0,138

= 0,01 c 0,5

- para 1,2x10 7 c (concentraes) 0,138

- para c (concentraes) < 1,2 x107

= 0,02 c 0,8495
= 0,02 c

8.2.6.3.3.1 Limite de reprodutibilidade (R)

Do mesmo modo que para repetitividade, o limite de reprodutibilidade (R), dado por

R = t (n -1, 1- ) 2 . SR

(11)

Sendo:

Onde:

SR = desvio-padro associado aos resultados de todos os laboratrios

SR= Slab 2 + Sr 2
Slab = mdia das varincias dos resultados de cada laboratrio
Sr = varincia das mdias dos laboratrios

O clculo da reprodutibilidade efetuado para cada nvel, separadamente, aps eliminao dos
valores discrepantes (ISO 5725-2).
No quadro 5, est apresentado um resumo da determinao da repetitividade, preciso
intermediria e reprodutibilidade.
Quadro 5 Repetitividade, Preciso Intermediria e Reprodutibilidade
Analisar: Padres, materiais de
referncia ou amostras fortificadas
vrias concentraes ao longo da faixa
de trabalho

Repeti-es
(independentes)

a) Mesmo analista, equipamento,

laboratrio, perodo curto (repetitividade)

b) Analistas e equipamentos diferentes,

mesmo laboratrio, perodo estendido
(preciso intermediria)

c) Analistas, equipamentos e laboratrios

diferentes, perodo estendido
(reprodutibilidade)

O qu calcular a
partir dos dados?

Comentrios

Determinar o desvio- Determinar o desvio-padro

padro amostral (s) de amostral da repetitividade de
cada concentrao.
cada concentrao
Determinar o desvio-padro
Determinar o desvioda reprodutibilidade
padro amostral (s) de
intralaboratorial de cada
cada concentrao
concentrao.
Determinar o desvio-padro
Determinar o desvio- da reprodutibilidade
padro amostral (s) de interlaboratorial de cada
concentrao.
cada concentrao
Requer estudo colaborativo

O Laboratrio deve realizar o maior nmero de repeties tcnica e economicamente viveis, pois
se no nmero de repeties for pequeno, as concluses, para uma determinada confiabilidade,
podem no ter utilidade prtica ou o erro maior que o admissvel. A ISO 5725-3 que trata de
preciso intermediria recomenda que sejam efetuadas no mnimo 15 repeties.

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8.2.6.3.4 Comparao da preciso entre mtodos

Consiste na comparao dos resultados obtidos utilizando um mtodo a ser validado com os
resultados conseguidos por meio de um mtodo de referncia validado. O objetivo estudar o
grau de proximidade dos resultados obtidos pelos dois mtodos, ou seja, avaliar a exatido do
mtodo em processo de validao com o de referncia.
As anlises so efetuadas em replicata, utilizando os dois mtodos, em separado, sobre as
mesmas amostras, em toda faixa de concentraes em que se pretende validar o mtodo.
Existem vrias tcnicas para comparar os resultados obtidos por dois mtodos de ensaio, entre as
quais: testes de hiptese e planejamento de experimentos.
Considerando adequada a exatido dos mtodos, quando se pretende avaliar se dois mtodos (A
e B) tem diferenas significativas entre si, em termos de preciso, pode-se recorrer ao teste F.
Este baseia-se no clculo da razo entre as varincias dos dois mtodos (Fcalc = sA2/sB2),
colocando-se a maior no numerador, de modo que a razo seja maior ou igual a 1. Em seguida,
compara-se este valor obtido com o valor tabelado de F. Se Fcalculado Ftabelado, os dois mtodos
no apresentam diferenas significativas entre si, relativamente s suas precises.
O teste t student pode tambm ser utilizado para verificar se as mdias dos resultados de dois
mtodos podem ser consideradas estatisticamente iguais.
8.2.6.3.5. Avaliao da aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo de
anlise
No caso de no haver mtodo com os quais possam ser comparadas as caractersticas de
preciso, ento, valores tericos de repetitividade e reprodutibilidade podem ser calculados a
partir da equao de Horwitz [1]. A forma mais adequada o uso dos valores de HORRAT par
avaliar a aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo.
O valor de HORRAT dado por:
DPR(R) derivado do estudo colaborativo
DPR(R) previsto da equao de Horwitz
Assim, HOR, o valor HORRAT para reprodutibilidade, o valor do desvio padro relativo (CV) da
reprodutibilidade dividido pelo valor do desvio padro relativo (CV) da reprodutibilidade calculado
a partir da equao de Horwitz, na concentrao de interesse.
8.2.6.3.5.1 Interpretao
Se os valores de HORRAT forem menores ou iguais a 2, os valores da reprodutibilidade do
mtodos podem ser considerados satisfatrios. Os laboratrios devem se assegurar de que os
mtodos que eles empregam atendem esse critrio.
8.2.6.3.5.2 Clculo do valor de Horwitz
O valor de Horwitz derivado da equao de Horwitz, que estabelece para qualquer mtodo:
DPRR = 2 (1 0,5 logC)
(12)

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E que este valor independe da matriz/analito. Os principais valores so:

Razo de Concentrao
1 (100%)
10-1
10-2 (1%)
10-3
10-4
10-5
10-6 (ppm)
10-7
10-8
10-9 (ppb)

PDPRR
2
2,8
4
5,6
8
11
16
23
32
45

8.2.6.4 Robustez
Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden. Tratase de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a
influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de
cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for a robustez de um mtodo,
maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso.
8.2.6.5 Comparaes Interlaboratoriais
O ABNT ISO/IEC Guia 43-Parte 1 faz distino entre o uso de comparaes interlaboratoriais para
ensaios de proficincia para a determinao do desempenho do laboratrio, e para outros
propsitos tais como: estabelecer a eficcia e a comparabilidade de novos mtodos de ensaio ou
de medio, acompanhar mtodos estabelecidos e determinar as caractersticas de desempenho
de um mtodo, geralmente conhecidos como estudos colaborativos.
Para a avaliao dos resultados das comparaes interlaboratoriais tambm so aplicveis os
critrios de deciso descritos em 8.2.6.1.
Nos processos de comparao interlaboratorial, caso no se alcancem as condies satisfatrias,
deve ser efetuado um plano de aes corretivas para verificar as causas e reavaliar o ensaio.
9 DOCUMENTAO DE MTODOS VALIDADOS
Todos os dados relevantes no estudo de validao de um mtodo, como o planejamento,
experimentos e resultados obtidos, devem ser documentados e registrados de forma a possibilitar
a rastreabilidade de todo o processo. Documentaes que registrem etapas da validao so
necessrias tambm para fins de avaliao e podem ser exigidas por razes contratuais ou at
mesmo por organismos regulamentadores.
Depois de cumpridas todas as etapas do processo de validao, importante elaborar o
procedimento operacional de forma que o mtodo possa ser implementado de maneira clara e
sem ambigidades. A documentao apropriada auxilia na aplicao consistente do mtodo,
possibilitando sua execuo conforme descrito; caso contrrio o desempenho real do mtodo no
ir corresponder quele previsto nos dados de validao. Portanto, a documentao deve
minimizar a introduo de variao acidental no mtodo.
Os mtodos documentados formam uma parte importante do sistema da qualidade do laboratrio
e devem estar sujeitos a um controle eficaz de documentos, assegurando desse modo que
somente mtodos e procedimentos validados sejam utilizados. O mtodo documentado deve
informar quando foi autorizado para uso.
Convm que a documentao seja clara, precisa e concisa, dentro dos limites estabelecidos pelo
seu campo de aplicao. Um formato padronizado assegura que nenhum ponto importante foi
esquecido, que as informaes a serem includas no procedimento so fornecidas sempre na
mesma ordem e que qualquer assunto desejado pode ser encontrado rapidamente

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10 DOCUMENTOS DE REFERNCIA

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for the Examination of

Water and Wastewater, 21st ed. Washington, 2005.

AOAC (Association of Official Analytical Chemists). AOAC Official methods of analysis.

Appendix D: guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a
method of analysis. Washington: AOAC, 2002.

ASTM E178:2002 Standard Practice for Dealing With Outlying Observations.

BARRET, V.; LEWIS, T. Outliers in statistical data. 3 ed. New York: John Wiley, 1994. 604 p.

BELSLEY, D.A.; KUH, E.; WELSCH, R.E. Regression diagnostics: identifying influential data
and sources of collinearity. New York: Wiley, 1980. 292 p.

BROWN, M.B.; FORSYTHE, A.B. Robust tests for the equality of variances. J. Am. Stat.
Assoc., v. 69, p. 364-367, 1974.

BRUCE, P.; MINKKINEN P.; RIEKKOTA M.L. Practical Method Validation: Validation Sufficient
for an Analysis Method. Mikrochim. Acta. 128, 93-106. 1998.

COCHRAN, W. G. The distribution of the largest of a set of estimated variances as a fraction of

their total, Ann. Eugenics, 11, 47, 1941.

EAL.- P11. Validation of Test Methods - General principles and concepts. EAL European
cooperation for Accreditation of Laboratories. 1997.

EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. 1st ed. 1998.

GARFIELD, F.M. Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories. AOAC. Arlington.
1997.

GREEN, J.M. A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996.
(68) 305A-309A

GRUBBS, F. E.; BECK, G. Extension of sample sizes and percentage points for signicance
tests of outlying observations. Technometrics, 14:847-856, 1972.

GRUBBS, F. E. Procedures for detecting outlying observations in samples. Technometrics, v.

11, p. 1-21, 1969.

HORWITZ, W. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Food and Drugs.
Analytical Chemistry, 54 (1982) 67A

HUBER, Ludwig, Validation and Qualification in Analytical Laboratories. Interpharm Press.

1999.

ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results Part 1: General principles and definitions.

ISO 5725-2:1994(1998). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and

Results - Part 2: basic method for the Determination of Repeatability and Reprodutibility of a
Standard Measurement Method.

ISO 5725-3:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and

Results - Part 3: Intermediate Measures of Precision of a Standard Measurement Method.

ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results Part 4: Basic Methods for the Determination of the Trueness of a Standard Measurement
method.

ISO 5725-6:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and

Results - Part 6: Use in Practice of Accuracy Values.

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IUPAC; HORWITZ, W. Protocol for the design, conduct and interpretation of methodperformance studies. Pure &Appl. Chem., 67(2): 331-343, 1995.

KELLY, P.C. Outlier detection in colaborative studies. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 73, p. 5864, 1990

LEVENE, H. Robust tests for equality of variances. In: OLKIN, I.; GHURYE, S.G.;
HOEFFDING, W.; MADOW, W.G.; MANN, H.B. (Ed.) Contributions to probability and statistics.
Stanford: Stanford University Press, 1960. p. 278-292.

LGC / VAM In-House Method Validation - A Guide for Chemical Laboratories. 2003.

NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation
and Verification of Chemical Test Methods. 1997.

RELACRE. Guia Relacre 13. Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica.
Portugal. 2000.

SOUZA, S.V.C.; JUNQUEIRA, R.G. A procedure to assess linearity by ordinary least squares
method Analytica Chimica Acta, Vol. 552, issue 1-2, November 2005, p. 25-35.

TAYLOR, J.K . Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers, 1987.

THOMPSON, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations

in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, v.125, p. 385-6, 2000.

VIM - Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia (VIM).

Traduo do documento VIM JCGM 200-2008, dezembro de 2008.

WEISBERG, S. Applied linear regression. New York: Wiley, 1985. 324 p.

WOOD, R., How to validate analytical methods. Trends in Analytical Chemistry, v. 18, n. 9, 10
September 1999, pp. 624-632(9).

11. HISTRICO DA REVISO

Reviso geral do documento, que inclui:
9 a mudana do ttulo de Orientao sobre a Validao de Mtodos de Ensaios Qumicos para
Orientao sobre Validao de Mtodos Analticos.
9 reordenao de itens para tornar mais claro o documento.
9 retirada das definies de termos referenciando-as a documentos normativos.
9 atualizao do documento adequando-o terminologia e metodologias de validao mais
recentes.
9 retirada de frmulas para clculos, por exemplo, no teste de seletividade do mtodo, por
entender-se que h bastante bibliografia da qual os laboratrios podem se utilizar para este fim.
____________________

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ANEXO RELAO DOS PARTICIPANTES DA ELABORAO DESTE DOCUMENTO

De forma a auxiliar aos laboratrios de ensaios, especialmente os postulantes acreditao, na
tarefa de validar os mtodos por eles desenvolvidos, a Diviso de Acreditao de Laboratrios
(DICLA) da CGCRE/INMETRO reuniu a sua Comisso Tcnica de Qumica (CT-05),
congregando os especialistas, abaixo listados, que dedicaram um tempo de suas atividades
elaborao e reviso deste documento.
A DICLA agradece pela contribuio prestada no apoio ao fortalecimento da atividade de
acreditao de laboratrios.
Emisso e reviso 01: Hlio Lionel (in memoriam) Especialista em Qumica do Petrleo; Snia
Elisa Pereira (Coordenadora do trabalho) - Instituto Nacional de Tecnologia / INT; Suzana Saboia
de Moura - INMETRO / DICLA; Eduardo Castello Branco T. Guimares - UERJ / LABCON;
Margareth Westin D. de Azevedo - CETEC / Fundao Centro Tecnolgico de Minas Gerais;
Lina Yamachita Oliveras - CIENTEC / RS; Tnia Barreto Simes Corra - EMBRAPA / CTAA;
Alfredo Rodrigues de Oliveira - Hidroqumica; Vanderla de Souza - INMETRO / DQUIM;
Albert Hartmann - Millennium Chemicals; Lcia Helena Noanta de Souza - PETROBRAS /
CENPES; Vera Harcar - Rede de Tecnologia do Rio de Janeiro; Srgio Motta - SENAI / CETIND;
Kikue Higashi - Especialista em Qumica Ambiental; Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D.,
Estatstico; Reginaldo Ramos - Especialista em Qumica Ambiental; Walderez Bindilatti Qumica
__________________________
Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 02: Eduardo Castello Branco T.
Guimares (Coordenador do trabalho) - UERJ / LABCON; Akie Kawakami vila - FIOCRUZ /
Biomanguinhos; Alfredo Rodriguez de Oliveira - Especialista em Qumica Ambiental; Ilse Maria
Guilhermino Lemos - Especialista em Qumica do Petrleo; Janana Marques Rodrigues
Caixeiro - INMETRO / DQUIM; Kikue Higashi - Especialista em Qumica Ambiental; Olga
Benrio Ramos Leal - INMETRO / DICLA; Patrcia Ritter Martins - PETROBRAS / CENPES,
com a colaborao de: Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D., Estatstico; Renata M. Borges INMETRO / DICLA
__________________________
Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 03: Eduardo Castello Branco T.
Guimares - Coordenador do trabalho - IQ / UERJ; Adriane Castro Pereira - Laboratrio
Biominerais Ltda.; Akie Kawakami vila - Fundao BIO RIO; Eliane Cristina Pires do Rego
INMETRO / DQUIM; Ilse Maria Guilhermino Lemos - Especialista em Qumica do Petrleo; Lina
Yamachita Oliveras - CIENTEC/RS; Luzia Cristina Valente Rodrigues - LAMIM / CPRM;
Neimar Arajo IBP; Olga Benrio Ramos Leal; DICLA / INMETRO; Paula Fernandes de
Aguiar - IQ / UFRJ; Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D, Estatstico; Paulo Paschoal Borges
INMETRO / DQUIM; Patrcia Ritter Martins - CENPES / PETROBRAS; Renata M. Borges
INMETRO / DICLA; Roberto Gonalves Junqueira - ALM/FAFAR /UFMG; Tnia Barretto
Simes Corra - Especialista em Alimentos
______________________