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Captulo 3
Tcnicas histolgicas
Luzia Ftima Gonalves Caputo
Lycia de Brito Gitirana
Pedro Paulo de Abreu Manso
A histologia a cincia que estuda as clulas no contexto da estrutura

tecidual e a inter-relao delas com os constituintes da matriz extracelular. A
histotecnologia proporciona o entendimento dos fundamentos tcnicos para a
anlise dos elementos teciduais, normais ou patolgicos, isto , suas clulas e
os elementos da matriz extracelular, abrangendo diversas tcnicas histoqumicas.
Os procedimentos tcnicos aplicados na histotecnologia incluem tcni-
cas citoqumicas, histoqumicas, imuno-histoqumicas, voltadas para a pesquisa
cientfica e para o diagnstico patolgico, alm de anlises em nvel de
microscopia eletrnica. Neste captulo, sero realizadas consideraes somente
sobre as tcnicas histolgicas voltadas para a anlise histoqumica e imuno-
histoqumicas dos tecidos.
A tcnica histolgica representa um conjunto de procedimentos tcnicos
que, inicialmente, se difundiu entre os diversos profissionais das cincias natu-
rais, como os botnicos e zoologistas, sendo empregada tambm pelos
anatomistas e histologistas da poca. Geralmente, os estudiosos utilizavam um
90 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
microscpio simples para descrever os tecidos; porm, somente duzentos anos

aps a descoberta do microscpio, a utilizao da tcnica histolgica foi utilizada
como ferramenta para diagnstico histopatolgico. Por volta de 1828, Rudolph
Virchow, mdico alemo e antropologista, utilizou a anlise histopatolgica como
ferramenta bsica e essencial em qualquer laboratrio de histologia e/ou anatomia
patolgica para elaborar as bases da patologia celular.
Histotecnologista, ou histotcnico, a designao conferida ao profissi-
onal responsvel por executar a tcnica histolgica para atuar em instituies de
sade, instituies voltadas pesquisa cientfica e ao controle de qualidade,
normalmente em laboratrios de histo ou anatomopatologia. Sua funo, alm
de ser essencial aos servios de sade, pelo apoio ao diagnstico e ao trata-
mento de pacientes, est tambm localizada de forma central no moderno
paradigma mdico anatomoclnico.
Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou
preparados histolgicos retirados de um organismo para exame microscpico
incluem: coleta do material, fixao, clivagem, processamento, incluso,
microtomia (corte) e colorao. No caso de tecidos calcificados, o material
descalcificado aps a fixao e, em seguida, realizam-se os outros procedimen-
tos, os quais discutiremos um a um.
Vale a pena ressaltar a importncia do planejamento para a execuo de
qualquer procedimento que envolva a tcnica histolgica, pois tal planejamen-
to facilita e evita acontecimentos indesejados durante a realizao de qualquer
etapa desse processo. De forma geral, a organizao um dos principais
fatores para se criar um ambiente seguro para o desempenho do trabalho. Um
laboratrio limpo e organizado fundamental para se desenvolver um bom
trabalho, ao contrrio de um que apresente bancada entulhada por materiais e
sem espao adequado para a realizao dos procedimentos. Deve-se evitar
tambm empilhar caixas e deixar coisas pelo cho, obstruindo ou dificultando o
trnsito dos trabalhadores no laboratrio.
Tcnicas Histolgicas | 91
1. Coleta, fixao e clivagem
A . Coleta
Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo.

Essa coleta pode ser feita quando o organismo ainda est vivo, por meio de
bipsia ou durante uma cirurgia, ou mesmo post mortem, durante a realizao
de necropsia de animais ou seres humanos.
Quando a coleta realizada para diagnstico de determinada enfermi-
dade, o material originado de necropsia ou bipsia deve ser previamente
analisado por um patologista, o qual fornecer o laudo macroscpico, ressal-
tando aspectos macroscpicos da pea anatmica, como cor, tamanho e
aparncia do rgo analisado. Durante a coleta, tambm devemos respeitar
algumas regras que so fundamentais para a boa qualidade final da amostra,
que sero abordadas mais adiante.
Aps a coleta, o material deve ser registrado em um livro prprio de
protocolo, para registro. Por meio desse registro, o material ser identificado
por um nmero, que o acompanhar durante todos os procedimentos da
tcnica histolgica. Em instituies credenciadas para realizar procedimentos
histopatolgicos, o material obtido cirurgicamente deve ser acompanhado de
uma ficha com o pedido da anlise histopatolgica, contendo a identificao
do rgo e as datas da fixao e de entrada do material no laboratrio. Essa
ficha tcnica dever conter a identificao do paciente (nome, sexo, cor,
idade, estado civil, nacionalidade, naturalidade e profisso) e, no caso de
paciente de rede hospitalar, devero ser informados sua qualificao (registro
ou nmero do leito), registro ambulatorial, ou consultrio particular, identifica-
o do mdico responsvel, data da interveno cirrgica, descrio da bipsia,
morte ou necropsia, e outros dados que o mdico julgar importantes, que
auxiliaro o histopatologista no diagnstico.
Para material proveniente de trabalhos experimentais com animais em

instituies de pesquisa credenciadas, o registro dever ser feito aps a
eutansia, em livro prprio. No livro de registro experimental devem cons-
tar a identificao do laboratrio, a data da eutansia, os rgos colhidos,
o tipo de procedimento realizado com o animal experimental (por exem-
plo, infeco), o ttulo do projeto e as observaes necessrias para avali-
ao do pesquisador ou tecnologista. Atualmente, deve-se realizar tam-
bm o registro no comit de tica da instituio, que aprovar a realizao
da pesquisa, fornecendo o nmero de protocolo. Esse nmero importan-
te, pois deve ser informado ao se elaborar um trabalho cientfico, seja uma
dissertao de mestrado, tese de doutorado, publicao em revista indexada,
ou outro meio de divulgao cientfica. Tratando-se de animal experimental
nativo, originrio diretamente do meio ambiente, o pesquisador deve sub-
meter o seu projeto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renovveis (Ibama) a fim de obter uma autorizao para
coleta, sem a qual poder estar sujeito a sanes da legislao vigente.
Sem esses registros, o material no poder ser manipulado no laboratrio,
podendo o responsvel pela coleta responder a processo na Justia por
desrespeito s leis vigentes no territrio nacional.
Notas de biossegurana
Todo material biolgico coletado para anlise potencialmente infectante.
Assim, deve-se ter muito cuidado durante a coleta e a manipulao dos
espcimes, utilizando sempre os equipamentos de proteo individual (EPI).
imprescindvel, durante os procedimentos de coleta, o uso de luvas,
jaleco, mscara e culos de proteo. Voc deve ainda procurar se informar
na instituio sobre qual a poltica de descarte de material infectado.
Nunca descarte material biolgico ou seus derivados em lixo comum.
B. Fixao
Voc alguma vez refletiu sobre o que acontece quando esquecemos um

pedao de carne fora da geladeira? Por que a carne apodrece? O que,
realmente, acontece com esse material?
Ao se remover qualquer material (rgo ou tecido) de um organismo
aps a sua morte, esse material inicia um processo de autlise, ou seja, por no
receber o suprimento necessrio de oxignio e de substncias essenciais ao seu
funcionamento, comea a haver acmulo de dixido de carbono nos tecidos e,
em suas clulas, inicia-se o processo autoltico, no qual enzimas lisossomais
atuam no citoplasma da prpria clula.
Ao se colocar um pedao de carne na geladeira, esse processo
atrasado; porm, fora da geladeira a autlise acelerada.
Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um determinado rgo ao
microscpio, precisa-se preservar os tecidos, sendo imprescindvel a realizao
do processo de fixao.
A fixao uma das etapas mais importantes da tcnica histolgica, pois
visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os compo-
nentes bioqumicos intra e extracelulares, preservando e conservando os ele-
mentos teciduais, alm de permitir a penetrao de outras substncias
subsequentes fixao.
Diversos protocolos de fixao e tipos de fixadores so citados na
literatura tcnica; porm, nenhum desses procedimentos de fixao reconhe-
cido como perfeito. Alguns fixadores se revelam excelentes para determinadas
estruturas tissulares, enquanto outros so preferenciais para as clulas ou mes-
mo excelentes para anlise da bioqumica tecidual. Alm disso, h, tambm,
fixadores indicados para a preservao da antigenicidade dos elementos teciduais
que sero analisados pela imuno-histoqumica, em contraste com aqueles que
no preservam as molculas antignicas. Porm, no existe um fixador ideal que
alcance todos os objetivos da fixao, mas deve-se investigar qual o fixador

mais apropriado para o tipo de material a ser analisado. Por essa razo, deve-
se consultar a literatura cientfica antes de se realizar qualquer tipo de experi-
mento ou interveno cirrgica.
Basicamente, existem dois tipos de fixao: a fsica e a qumica. De fato,
sempre se utiliza uma associao dos dois tipos de fixao, pois mesmo a
fixao qumica sempre pode sofrer a influncia de um fator fsico ambiental,
como a temperatura. Outros fatores fsicos podem influenciar na fixao, como
as ondas eletromagnticas (micro-ondas) e a agitao molecular (ultrassom).
A fixao qumica obtida quando se utilizam substncias qumicas
capazes de formar reaes com os stios das biomolculas, estabilizando-as e
impedindo a alterao tecidual, tanto qumica quanto fsica.
Inicialmente, os fixadores eram divididos em duas classes: (1) fixadores
coagulantes ou desnaturantes, que precipitam as protenas dos tecidos. Esses
fixadores tambm so chamados de fixadores no aditivos, pois no se ligam s
protenas; (2) fixadores no coagulantes ou aditivos, que se ligam s prote-
nas, precipitando-as.
Sabe-se pouco sobre os efeitos dos fixadores qumicos; porm, na
tcnica histolgica se utiliza uma ou mais substncias qumicas, denominadas
lquidos ou misturas fixadoras, reunindo vrias substncias numa tentativa de
superar as desvantagens de uma determinada substncia pela vantagem de outra
substncia adicionada mistura. Tais misturas so capazes de agir sobre os
tecidos de forma a buscar a melhor preservao dos elementos teciduais.
A escolha de um fixador depende da natureza do processo patolgico
presente no tecido, da estrutura celular e/ou tecidual, ou, ento, da natureza
bioqumica do elemento que se deseja preservar. Por essas razes, o histotcnico
deve conhecer os diversos tipos de fixadores e saber qual a compatibilidade
do fixador com os diversos mtodos de colorao, com a propriedade antignica
do elemento tecidual, visando adequar o tipo de fixador com a propriedade

dos vrios tipos de tecidos. Essas informaes so importantes para auxiliar o
pesquisador ou o patologista.
Atualmente, com frequncia se utiliza a classificao de fixadores des-
crita por Leong (1996), que teve como base a classificao desenvolvida por
Hopwood (1977), sem muitas alteraes. Leong classificou as substncias
fixadoras da seguinte maneira:
Fixadores aldedos: formaldedo, glutaraldedo e paraformaldedo co-
mercial.
Agentes oxidantes: tetrxido de smio, dicromato de potssio,
permanganato de potssio e cido crmico.
Agentes desnaturantes ou coagulantes de protenas: metanol, etanol,
acetona e cido actico.
Mecanismo desconhecido: cloreto de mercrio, cido pcrico e sais
de zinco.
Combinao de reagentes: tetrxido de smio e glutaraldedo, tetrxido
de smio e iodeto de zinco, glutaraldedo e carbodiamida e formaldedo
com glutaraldedo.
Fixao a seco: carbowax 6000 (20% de polivinil lcool ou 20%
de polietileno glicol) ou fixao no vapor.
Micro-ondas: fixao pelas ondas eletromagnticas com ou sem a
utilizao de agentes fixadores.
Ser dada maior ateno aos fixadores aldedos, pois estes so fixadores
base de aldedos de amplo uso nos laboratrios de anatomia patolgica e
de histologia.
Os fixadores aldedos comumente utilizados so o formaldedo, o
glutaraldedo, e o paraformaldedo, que o prprio formaldedo na sua forma
pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as prote-

nas tissulares, tornando-as insolveis em forma de um gel.
Dentre os fixadores aldedos, o formaldedo comercial o mais usado
na rotina histolgica devido ao seu baixo custo financeiro, alm de ser de
fcil preparo. Contudo, algumas consideraes se fazem necessrias. O
formaldedo comercial, um gs incolor, comercialmente fornecido em solu-
o na concentrao de 37% ou 40%. Ao se preparar uma soluo base
de formaldedo comercial a 10%, de fato a soluo estar a 3,7% ou 4%;
apesar disso, convencionou-se chamar essa soluo de formalina, ou
formaldedo a 10%. Outro ponto importante a se mencionar que o
formaldedo, na presena de gua, encontra-se na sua forma monomrica. J
o paraformaldedo, por ser livre de metanol, muito utilizado para a fixao
de tecidos a serem analisados pela microscopia eletrnica, pois o metanol
pode ocasionar grandes prejuzos, interferindo nas anlises ultraestruturais.
Porm, o paraformaldedo comercial tem sido recomendado para anlise
imuno-histoqumica. Na realidade, o formaldedo contm polmeros de
paraformaldedo comercial, mas que s sero hidrolisados quando diludos
em gua.
Quando o formaldedo exposto luz, isto , ao oxignio atmosf-
rico e tecidual, ocorre a oxidao do formaldedo, formando cido frmico.
O cido frmico pode se precipitar nos tecidos sob a forma de um pigmen-
to de colorao marrom, sendo considerado um artefato. Para se evitar a
formao desse precipitado, deve-se preparar o fixador em solues
tamponadas, ou, ento, adicionar carbonato de clcio (giz) para neutralizar a
ao do pH da soluo. Contudo, o giz s recomendado em ltimo caso,
pois poder deixar reas de pseudocalcificao tecidual.
A seguir, encontram-se alguns dos fixadores aldedos e suas princi-
pais caractersticas:
Formalina 10%
Formaldedo comercial .......................................100 mL
gua destilada ................................................900 mL
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas);
pode levar deposio de pigmento formlico;
baixo custo;
fixa bem as protenas.
Tempo de fixao: 24-48 horas.
Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
Tratamento prvio dos cortes para a retirada do pigmento formlico

Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
Imergir os cortes em uma soluo saturada de cido pcrico em etanol
95% por 24 horas.
Lavar as lminas em gua corrente at desaparecer a cor amarela do
cido pcrico.
Seguir com o protocolo da colorao desejada.
Ao manipular formaldedo, ou solues contendo essa substncia, deve-se
fazer uso de luvas, mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local
arejado e com exausto. O preparo de solues fixadoras deve ser feito em
capela de exausto. Por serem muito volteis e sensveis luz, as solues
contendo formaldedo devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro mbar
firmemente fechado. O formaldedo txico quando ingerido, inalado ou em
contato com a pele. A inalao deste composto pode causar irritao nos
olhos, nas mucosas e no trato respiratrio superior. Em altas concentraes,
pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto classificado
como carcinognico e teratognico. Nunca descarte solues contendo
formaldedo ou outras solues fixadoras em esgoto sanitrio convencional;
procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Formol-salino
Formaldedo comercial........................................100 mL
gua destilada................................................900 mL
Cloreto de sdio...................................................9 g
Caractersticas:
soluo isotnica;
pode levar deposio de pigmento formalnico;
indicado para algumas reaes histoqumicas.
Tempo de fixao: 24 a 48 horas.
Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Indicado para algumas reaes histoqumicas.
Formalina tamponada de Carson ou formalina em tampo Millonig

Formaldedo comercial ........................................100 mL
gua destilada.................................................900 mL
Fosfato de sdio monobsico.................................18,6 g
Hidrxido de sdio..............................................4,2 g
Caractersticas:
utilizar soluo isotnica em pH 7,2 - 7,4 (310 mOsm);
indicado para a microscopia eletrnica e microscopia de luz;

provoca menor extrao de elementos celulares;
microtomia sofrvel de tecidos com muito sangue;
no interfere na maioria das coloraes;
fixa muito bem a maioria dos tecidos;
preserva a imunorreatividade de hormnios gastrintestinais, quan-
do preparado com paraformaldedo comercial no lugar do
formaldedo comercial.
Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Formalina-alcolica
lcool 95%...................................................900 mL
Caractersticas:
utilizada para a observao de minerais (cobre, magnsio, ferro
e clcio); indicada para tecido nervoso, parasitas, glicognio,
amiloide e mucossubstncias.
Lavagem: lcool 95% por 1 hora iniciando a desidratao.
Formalina neutra tamponada 10%

gua destilada.................................................900 mL
Fosfato de sdio monobsico.....................................4 g
Fosfato de sdio dibsico.......................................6,5 g
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas);
aproximadamente 165 mOsm;
pH 6,8;
indicada para clulas pancreticas, bactrias, alguns tipos de
carboidratos, clulas do tecido conjuntivo, fungos, minerais, teci-
do nervoso, pigmentos e glndulas.
Tempo de fixao: 24-72 horas.
Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:

Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL
Formaldedo comercial..........................................10 mL
cido actico glacial............................................5 mL
Caractersticas:
um fixador de rpida penetrao;
preserva relativamente bem a morfologia, cidos nucleicos e
carboidratos;
os lipdeos no so preservados;
misturar no momento do uso;
muito utilizado para fixar helmintos.
Tempo de fixao: 4 a 48 horas em tecidos e 10 a 30 minutos para
esfregaos e/ou distenses.
Lavagem: direto para o lcool 95% do processador.
Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferin-

do diretamente na preservao tecidual e, em ltima instncia, no tecido que
se deseja observar. Assim, deve-se analisar criteriosamente o protocolo de
fixao para identificar os fatores que podem influenciar diretamente na fixao
do tecido a ser analisado e consequentemente interferir na preservao tecidual.
Esses fatores so:
temperatura;
espessura do tecido;
penetrao;
tempo de fixao;
escolha do fixador;
relao volume do fixador tamanho do espcime;
estocagem apropriada;
pH do fixador;
osmolaridade da soluo fixadora;
adio de sais na mistura;
concentrao dos fixadores.
C. Clivagem
A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos teci-

dos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a clivagem pode-
r ocorrer em at algumas horas aps a fixao. Na clivagem ideal, os fragmen-
tos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porm, dependendo do tipo
de rgo, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Clivagem de coluna verte- Figura 2. Clivagem com 3mm de

bral de camundongos Swiss webster. espessura.
A reduo das dimenses do fragmento facilita a penetrao dos

fixadores e a difuso dos reagentes durante as demais etapas do processamento
dos tecidos.
Para uma boa anlise histolgica, devemos respeitar algumas regras du-
rante a coleta, a fixao e a clivagem:
fixar o tecido logo aps a coleta da amostra;
retirar, primeiramente, os rgos conhecidamente com alto metabolis-
mo, pois so os primeiros a sofrer autlise;
nunca comprimir o material a ser fixado com pina ou qualquer outro
instrumental, pois a fora imprimida pode causar distoro da estrutura
tecidual;
para se obter uma boa fixao de rgos encapsulados, a cpsula deve
ser removida;
os fragmentos devem possuir preferencialmente 3 mm de espessura,
pois geralmente os fixadores no penetram mais do que isto em tempo
hbil de evitar a autlise.
para se obterem fatias delgadas de rgos compactos, como fgado,

bao, rins, entre outros, coloque-os sobre uma placa de cortia ou
placa de Petri, previamente revestida com parafina, e com uma gilete
nova e afiada proceda confeco dos fragmentos;
como os fragmentos frequentemente se deformam durante a fixao,
conveniente que, aps essa etapa, sejam novamente clivados com gile-
te, de modo que cada fragmento apresente uma superfcie lisa de corte
que servir no somente de orientao ao tcnico durante o processo
de incluso, mas tambm auxiliar a etapa subsequente, ao se desbastar
o bloco;
usar, no mnimo, vinte vezes o volume de fixador em relao ao
volume dos fragmentos a serem fixados. Agitar, suave e periodicamente,
os fragmentos dos rgos durante a fixao do material para que o
fixador se misture uniformemente no frasco;
os frascos utilizados para a fixao devem ter boca larga, pois, alm de
facilitar o acesso aos fragmentos, ou mesmo aos rgos inteiros, esses
costumam aumentar seu volume aps a fixao;
nunca coloque o material a ser fixado em um frasco vazio, pois este
pode se aderir superfcie do vidro, impedindo que o fixador penetre
na rea em contato com o vidro;
acondicionar os tecidos clivados em cassetes histolgicos identificados
(Figuras 3 e 4).
Figura 3. Espcime clivado e acondi- Figura 4. Cassete identificado

cionado em cassetes histolgicos. pronto para o processamento.
Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com
as navalhas e giletes utilizadas. O material perfurocortante, bem como os
restos de material biolgico, devem ser descartados em lixo prprio.
2. Descalcificao
Em muitos tecidos, verifica-se a deposio de sais minerais, como clcio
e fosfato. Por exemplo, o tecido sseo uma especializao do tecido con-
juntivo, sendo rgido e inflexvel devido presena de cristais de hidroxiapatita
em sua matriz extracelular.
Em microscopia de luz, existem dois procedimentos tcnicos que auxi-
liam o estudo do tecido sseo: (1) a descalcificao, que remove a poro
mineral e analisa somente os constituintes orgnicos do tecido sseo; e (2)
o desgaste, que permite analisar os componentes inorgnicos do tecido.
Comentaremos neste captulo somente o procedimento da descalcificao,
que visa retirada dos componentes inorgnicos, como fosfato de clcio presen-
te em tecidos sseos, em tumores sseos ou em determinadas patologias.
A descalcificao, por remover os sais de clcio, se faz necessria para

tecidos mineralizados, pois os cristais de clcio destroem o fio da navalha,
criando dentes que impedem a confeco de bons cortes e levam formao
de artefatos tcnicos, impedindo a anlise histolgica adequada.
A escolha do mtodo de descalcificao depende da urgncia, do grau
de mineralizao, do interesse da investigao, das tcnicas de colorao que
se pretende empregar e do tipo de fixador utilizado. Quanto mais rpida for a
ao de um descalcificador, pior ser a preservao morfolgica do tecido.
A prtica da descalcificao
Aps a coleta o tecido, este deve ser fixado, lavado para retirar o
excesso de fixador e, s ento, submetido descalcificao.
A descalcificao pode ser realizada por mtodos qumicos e fsicos.
Os mtodos qumicos utilizam solues descalcificadoras em pH cido, solu-
es quelantes e meios de troca inica. Os mtodos fsicos esto sempre
associados a descalcificao qumica, englobando a dissociao eletroltica e
submisso do material contido em solues descalcificadoras, ao ultrassom e s
micro-ondas, que aceleram o processo de descalcificao.
Descalcificao qumica
A. Descalcificao por cidos

Os descalcificadores cidos possuem a propriedade de solubilizar sais
minerais. Na matriz inorgnica dos tecidos mineralizados, ocorrem principal-
mente sais de fosfato e de carbonato, que so pouco solveis na gua. Esse
mtodo possui a vantagem de ser simples; porm, recomenda-se fazer um
banho neutralizante com hidrxido de amnia ou oxalato de amnia ou
sdio aps a descalcificao.
A desvantagem desse mtodo a ocorrncia de dilatao e hidrlise da

matriz ssea e destruio de enzimas, cidos nucleicos e polissacardeos.
A soluo descalcificadora cida age removendo o clcio dos sais de
carbonato ou fosfato presentes no osso, efetuando uma troca inica que
resulta na formao de um sal de clcio solvel. Algumas das solues
descalcificadoras constituem-se de cidos orgnicos ou inorgnicos, que sero
citados a seguir.
Existe um grande nmero de agentes descalcificadores cidos, incluindo
cidos fracos ou fortes, que podem ser aquosos ou alcolicos, diludos ou no
em agentes fixadores.
cidos fortes - possuem maior poder descalcificante, causando dano
aos tecidos, principalmente aos ncleos que so hidrolisados, o que prejudica
a utilizao posterior de corantes nucleares. Esse tipo de descalcificador
empregado para anlises urgentes; para material no urgente, aconselham-se
agentes quelantes pelos motivos que sero descritos mais adiante.
cido ntrico (HNO3) - no causa o intumescimento dos tecidos e
proporciona maior nitidez nas coloraes. Geralmente utilizado em
concentraes de 5% a 10%, no se devendo expor o tecido a esta
soluo por mais de 48 horas. um descalcificador rpido muito preju-
dicial ao tecido.
cido clordrico (HCl) - um dos cidos de ao rpida mais utiliza-
dos. Geralmente usado em soluo tampo, como, por exemplo, o
sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou, ainda, diludo em lcool.
cido ntrico aquoso a 5%:

cido ntrico.........................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
cido ntrico aquoso a 10%:

cido ntrico........................................................10 mL
gua destilada......................................................90 mL
Formalina - cido ntrico:

Formaldedo.........................................................10 mL
gua destilada......................................................80 mL
cido ntrico........................................................10 mL
Fluido de Perennyi:
cido ntrico 10%................................................40 mL
Etanol absoluto.....................................................30 mL
cido crmico 0,5%.............................................30 mL
cidos fracos - os cidos mais usados nas misturas descalcificadoras

so o cido actico, cido pcrico e cido frmico. Os cidos actico e
pcrico tambm so muito utilizados em misturas fixadoras, fixando ao mesmo
tempo em que descalcificam os tecidos pouco mineralizados, como os teci-
dos embrionrios. Dentre os cidos, o cido frmico o mais utilizado na
soluo de 5% a 10 %.
cido frmico (HCOOH) - pode ser utilizado em soluo a 5%
aquosa ou alcolica, ou em mistura fixadora com o formol 10% a
20%. Geralmente usado em solues tampes, como o tampo
citrato de sdio, que proporciona uma melhor colorao em relao ao
mtodo com cido ntrico.
cido frmico a 5%:

cido frmico 90%.................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
cido frmico a 5%:

cido frmico 90%.................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
Formalina cido frmico:

cido frmico 90%...............................................10 mL
Formaldedo comercial...............................................5 mL
gua destilada......................................................85 mL
Mistura descalcificadora cido frmico-clordrico:

Soluo A cido clordrico 8%:
cido clordrico concentrado .......................40 mL
gua destilada..........................460 mL
Soluo B cido frmico 8%:
cido frmico......................................................40 mL
gua destilada....................................................460 mL
Soluo de uso: (preparar antes de usar):

Soluo A.........................................................500 mL
Soluo B..........................................................500 mL
cido pcrico (C6H2(NO2)3OH) - esse cido age muito lentamente

e utilizado principalmente em soluo aquosa saturada para descalcificar
tecidos embrionrios. Os tecidos devem ser lavados em lcool 70%
aps a descalcificao para remover o precipitado amarelo.
Procedimentos gerais para a descalcificao por misturas cidas:

1- A pea a ser descalcificada no deve possuir mais do que 5 mm de
espessura. Esta deve ser clivada para isso.
2- O volume da mistura descalcificadora deve ser de dez a vinte vezes

as dimenses da pea a ser descalcificada.
3- O material a ser descalcificado deve estar suspenso na mistura
descalcificadora, pois o clcio, ao sair do tecido, se deposita no fundo
do frasco (Figura 5).
4- A mistura descalcificadora deve ser substituda a cada 24 horas. O
tempo de descalcificao depender das dimenses da pea e do tipo
de soluo descalcificadora.
5- Ao trmino da descalcificao, deve-se neutralizar, os tecidos com
uma soluo alcalina de sulfato de sdio (Na 2SO4) a 5% por
24 horas.
6- Lavar com vrios banhos de gua por um perodo de 48 horas.
7- Seguir a rotina de processamento histolgico.
Figura 5. Suspenso dos tecidos durante a descalcificao.
B. Descalcificao por resinas de troca inica

Essa resina promove a acelerao do processo de descalcificao pela
rpida troca inica entre o cido frmico e os fosfatos ou carbonatos de clcio
tecidual, proporcionando, alm da rapidez, boa preservao dos detalhes
celulares, com qualidade superior aos mtodos de descalcificao por cidos.

Essa resina pode ser reaproveitada.
Resina :
WIN 3000 (resina de troca inica).............................100 g
cido frmico em soluo aquosa a 10% ...................800 mL
Figura 6. Resina de troca inica.
C. Mtodos histoqumicos
So mtodos escolhidos quando se deseja preservar enzimas (fosfatase

alcalina e desidrogenases), cidos nucleicos e polissacardeos (glicognio) pre-
sentes no tecido sseo. Os mtodos habituais que utilizam descalcificadores
cidos no permitem a anlise dessas molculas e substncias.
Os mtodos histoqumicos incluem dois procedimentos para a
descalcificao.
Mistura de tampes - nesse procedimento, os sais de clcio so

removidos do osso, quando imersos em soluo tampo de citrato com pH
4,5. Uma desvantagem desse mtodo a inativao reversvel da fosfatase
alcalina, que se torna ativa aps a neutralizao com a soluo de sdio
barbital.
Procedimento para a descalcificao:
1- Fixar os tecidos em lcool 80% de 24 a 48 horas.
2- Descalcificar com a soluo tampo (4C) o tempo de
descalcificao varia de acordo com o tamanho da pea e seu grau
de mineralizao.
3- Lavar em gua corrente e depois em gua destilada.
4- Neutralizar em soluo de sdio barbital a 37C por 6 horas.
5- Lavar em gua corrente por 6 horas.
Tampo cido ctrico-citrato (pH 4,5):

cido ctrico 1N...................................................50 mL
Citrato de amnio 1N..............................................50 mL
Sulfato de zinco 1%.................................................2 mL
Clorofrmio........................................................0,1 mL
Agentes quelantes - so compostos orgnicos que se ligam ao on

clcio (metal, ver tabela peridica) formando um metal quelado, por exemplo,
sequestrante ou versene (cido etilenediaminetetractico ou EDTA). Esse m-
todo bem lento, sem dano ao tecido. Assim, como as misturas de tampes,
ele inativa a fosfatase alcalina, que reativada aps um banho de 2 a 6 horas
em soluo de cloreto de magnsio 6%. A descalcificao por agentes quelantes
no produz artefatos durante a maioria das coloraes histolgicas, diferente
da descalcificao por cidos, que gera artefatos quase irreversveis.
Descalcificantes quelantes (EDTA)
EDTA neutro:
Sal de EDTA dissdico............................................250 g
gua destilada.................................................1.750 mL
A soluo fica esbranquiada e deve ser neutralizada (pH=7,0)
pela adio de aproximadamente 25g de hidrxido de sdio.
Hilleman e EDTA de Lee:

Sal de EDTA dissdico.............................................5,5 g
gua destilada......................................................90 mL
Formoldedo comercial.............................................10 mL
Soluo descalcificadora EDTA em Tampo Fosfato 0,1M:

1) Tampo fosfato 0,1 M para o preparo final da soluo descalcificadora
de EDTA:
Tampo fosfato 0,1 M (pH=7,0):
Soluo A:
Fosfato monobsico de sdio.........................................13,7g
gua destilada..............................................................1 L
Soluo B:
Fosfato dibsico de sdio..............................................35,8g
gua destilada..............................................................1 L
Para 1 litro coloca-se em um bquer 750 mL da soluo B e adiciona-
se gota a gota a soluo A at o pH atingir o pH 7,0.
Soluo de uso do descalcificador EDTA em tampo fosfato 0,1 M:

EDTA....................................................................100 g
Tampo fosfato 0,1 M (soluo 1)........... .................1000 mL
Acertar o pH do EDTA para 7,0 com hidrxido de sdio 10 M
Procedimento:
1- Suspender o espcime no lquido (Figura 5) descalcificador, com
o volume igual ou superior a vinte vezes o volume da pea.
2- Trocar a soluo descalcificadora diariamente. Se possvel, manter
o frasco em agitao.
3- Testar aps duas a trs semanas, para ver se j ocorreu a descalcificao.
4- Lavar em gua por algumas horas.
5- Proceder ao processamento histolgico.
Descalcificao fsica
A. Descalcificao eletroltica ou ionizao eltrica

Esse mtodo permite a formao de um campo eltrico entre dois eletrodos,
fazendo os ons de clcio migrarem rapidamente do osso (anodo) para o eletrodo
de carbonato (catodo). Os radicais cidos migram para o anodo.
um mtodo rpido; porm, a temperatura no deve exceder 45oC.
Aps a descalcificao, recomenda-se a neutralizao das peas, com soluo
sulfato de sdio (Na2SO4) a 5% por 24 horas, para evitar a formao de
artefatos durante a colorao. Aps a neutralizao, as peas devem ser lava-
das em vrios banhos de gua por no mximo 48 horas.
Soluo descalcificadora eletroltica:

cido frmico a 90% ..........................................100 mL
cido clordrico....................................................80 mL
gua destilada....................................................820 mL
Figura 7. Descalcificao eletroltica.
B. Descalcificao com auxlio das micro-ondas

O efeito benfico do calor foi reconhecido antes da era das micro-
ondas e foi primeiramente utilizado durante o procedimento de fixao por
Ehrlich (1898) para acelerar a fixao qumica por meio de calor externo.
As micro-ondas penetram vrios centmetros para dentro dos tecidos
biolgicos, e o calor produzido pode ser controlado pela potncia e o tempo
de exposio. O calor o principal responsvel pelos efeitos produzidos
pelas micro-ondas, assim como a agitao molecular e o fluxo eletromagntico,
acelerando o processo de descalcificao. Durante o aquecimento, a energia
termal aumenta a dinmica molecular, na qual a agitao molecular induzida pela
oscilao do campo eletromagntico aumentar a coliso de molculas, acele-
rando as reaes qumicas. Esse mtodo reduz o tempo de descalcificao; o
que normalmente levaria dias, nesse mtodo levar somente algumas horas.
Deve-se imergir a pea na mistura descalcificadora de escolha e irradiar

as micro-ondas.
C. Descalcificao com auxlio do ultrassom

Assim como as micro-ondas, o ultrassom acelera o processo de
descalcificao, promovendo a agitao molecular, com a vantagem de no
elevar a temperatura, mantendo as estruturas celulares.
Como possvel saber se a pea est totalmente descalcificada?

Existem mtodos fsicos e qumicos que permitem controlar o momento
de finalizao da descalcificao.
Mtodos fsicos
Manipulao do operador: tenta-se dobrar a pea ou inserir
uma agulha bem fina e verificar, assim, o grau de mineralizao.
Teste radiolgico: o raio-X o mtodo mais sensvel e confivel
para acompanhar a descalcificao.
Mtodos qumicos
Teste do oxalato de amnia: esse mtodo detecta a presena
de clcio no lquido descalcificador, indicando se a descalcificao
est completa ou no.
Teste do oxalato de Amnia / Hidrxido de Amnia:
Solues estoque:
Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5%:
Hidrxido de amnia 28%.....................................5 mL
gua destilada..................................................95 mL
Soluo B estoque de oxalato de amnia 5%:

Oxalato de amnia...............................................5 mL
gua destilada..................................................95 mL
Soluo de uso de oxalato de amnia / hidrxido de amnia

Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5% - 5 mL
Soluo B soluo estoque de oxalato de amnia 5% - 5 mL
A soluo deve ser preparada no momento do uso.
Procedimento:
1- retirar 5 mL de lquido descalcificador do fundo do frasco que
em se encontra a pea;
2- colocar em um tubo Falcon de 15 mL;
3- adicionar ao tubo 10 mL da soluo de uso de oxalato de
amnia-hidrxido de amnia;
4- misturar bem e deixar repousar em p por 12 horas;
5- se a descalcificao for completa, o lquido se manter lmpido;
caso contrrio, haver precipitao do clcio;
6- esse processo deve ser repetido at que o lquido descalcificante
se encontre lmpido por dois dias.
Muitos inconvenientes podem ser gerados durante o processo de
descalcificao e, para minimiz-los, devemos tomar alguns cuidados
Regras gerais para uma boa descalcificao:

somente descalcificar tecidos muito bem fixados;
reduzir ao mximo o tamanho da pea a ser descalcificada,
reduzindo assim o tempo de descalcificao;
a lavagem do material essencial antes da descalcificao e

antes do processamento subsequente;
renovar o descalcificador diariamente, pois esse vai perdendo
sua concentrao original;
o volume do lquido descalcificador deve ser no mnimo vinte
vezes o tamanho da pea;
verificar constantemente se a descalcificao foi finalizada;
neutralizar sempre os tecidos aps a descalcificao por substn-
cias cidas.
Ao manipular solues cidas e agentes quelantes, deve-se fazer uso de luvas
especficas para manipulao qumica, de mscara com filtro prprio para
vapores cidos e orgnicos, e deve-se faz-lo em local arejado e com exausto.
O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto. Deve-se,
previamente, consultar as fichas de emergncia qumica das solues cidas e
quelantes antes da sua manipulao. A inalao destes compostos pode
causar irritao e queimaduras.
Nunca descarte solues cidas em esgoto sanitrio convencional, procure
saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
3. P rocessamento
Processamento
O princpio do processamento histolgico consiste na difuso de reagentes
para o interior dos tecidos e na remoo do lquido tecidual que, aps a
fixao do material, o prprio fixador empregado.
O processamento tecidual tambm torna os fragmentos rgidos capazes
de proporcionar o seccionamento de fatias finas e delicadas para a observao
ao microscpio.
Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; po-

rm, no processamento convencional, comumente se utiliza a parafina.
O processamento para incluso de material em parafina passa por trs
etapas: desidratao, clarificao e impregnao.
A. Desidratao
A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as subs-

tncias previamente utilizadas para incluso em parafina no se combinam
homogeneamente com a gua.
Vrios so os agentes desidratantes. A substncia utilizada na rotina
histolgica o lcool etlico, por produzir bons resultados e possuir baixo
custo. Contudo, outros agentes desidratantes tambm so eficientes, variando
apenas o tempo de desidratao.
B. Clarificao ou diafanizao
A clarificao visa remover completamente o lcool do interior dos

tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. A remoo do lcool
de extrema importncia, pois a parafina no se mistura homogeneamente com o
lcool. Dessa forma, fundamental a completa remoo do lcool para que a
parafina possa penetrar completamente no interior dos tecidos.
Para remover o lcool e preparar o tecido para a penetrao da parafina
utiliza-se, nessa etapa, o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substi-
tuio ao lcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razo,
essa etapa denominada clarificao.
C. Infiltrao em parafina
A infiltrao dos elementos teciduais em parafina importante, pois a

parafina tambm o meio de incluso tecidual. Para a infiltrao, ela deve ter
sido previamente aquecida, pois a parafina lquida somente em temperatura

entre 56C a 60C, sendo slida temperatura ambiente.
Os tecidos tambm podem ser infiltrados por outros meios de incluso,
necessitando de processamentos especiais dependendo do meio de incluso.
Meios de incluso como polietilenoglicol (carbowax), resinas hidroflicas
e hidrfobas, gelatina, dentre outros, funcionam como meios alternativos de
incluso dependendo do objetivo da anlise.
O processamento dos tecidos possui variveis que podem afetar consi-
deravelmente os resultados do processo histolgico. Dentre as variveis, te-
mos: condies de operao (manual ou equipamentos automtico), tempera-
tura, caractersticas e concentrao dos reagentes utilizados e as propriedades
qumicas dos tecidos.
Processamento manual (Figura 9)

Limitaremos aqui a descrio para material destinado a incluso em
parafina.
Desidratao
Para a desidratao adequada, necessrio que o volume do lcool seja
vinte vezes o volume da amostra. Contudo, sendo a gua mais densa do que
o lcool, ela tende a se localizar no fundo do frasco aps a sua retirada do
tecido, exatamente onde a amostra se encontra (Figura 8).
Para que a desidratao seja satisfatria e a gua se acumule no fundo
do frasco, recomenda-se:
agitar constantemente o recipiente, para que a gua se misture
ao lcool;
realizar vrias trocas de lcool, pois a gua ser eliminada com o
lcool desprezado;
usar recipientes de fundo largo para diminuir o nvel de gua;

nunca aquecer o lcool, pois, alm de ser perigoso, o meio
ficar hidratado mais facilmente.
Figura 8. Material sendo desidratado e clarificado.
Clarificao
Apesar de as substncias diafanizadoras serem insolveis em gua e
solveis no lcool, que removido da pea durante a clarificao, deve-se
tomar algumas precaues:
agitar o frasco para melhorar a difuso (sada do lcool e
entrada do xilol); antigamente, esse procedimento seria repro-
vado, pois como o lcool menos denso do que a gua, ele
ficaria na superfcie do frasco e no estaria em contato com a
pea (Figura 8);
proceder, no mnimo, a duas trocas com a substncia clarificadora;
no deixar o material por muito tempo em xilol, pois ele resseca
muito o material, interferindo na sua qualidade.
Impregnao
A impregnao deve ser realizada em estufa a 60oC. Os fragmentos
sero transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeter-
minados. No se deve realizar somente uma passagem pela parafina, pois ser
insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos. Contudo, recomenda-se
nunca deixar o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a
parafina somente lquida em temperatura alta, o calor em um longo perodo
de tempo poder causar grande dano ao tecido.
Figura 9. Processamento manual de tecidos.
Processamento automtico
Existem dois tipos de equipamentos automticos (processadores) acess-
veis no mercado e que so tambm chamados histotcnicos ou autotcnicos.
Um tipo de processador o carrossel (Figura 10), mais tradicional
e de baixo custo, no qual os cassetes contendo os fragmentos so coloca-
dos em uma cesta que transportada mecanicamente de forma a imergir os
cassetes em cada reagente. Outro tipo possui uma cmara fechada, na qual
os reagentes so transferidos de recipiente a recipiente e, esses processadores

automticos, chamados processadores com transferncia de fluidos. Ambos
os equipamentos possuem doze estgios de processamento.
Alguns processadores esto acoplados a um sistema de vcuo (Figura
11) que, no do tipo carrossel, est no ltimo banho de parafina. Nos
processadores com transferncia de fluidos, o vcuo pode ser includo em
todos os banhos do processo. Todo o processamento ocorre em vcuo,
revelando significativa melhoria dos resultados em perodos de tempo reduzi-
do, em comparao aos resultados obtidos no processamento sem vcuo.
importante salientar que os recipientes com parafina para infiltrao
possuem termostatos que controlam a temperatura ideal de infiltrao. Alm
disso, todos os processadores possuem agitao automtica.
O trabalho com processadores automticos mais confivel, pois
no ocorre falha humana durante o processamento. O tcnico somente
deve programar o aparelho e trocar os reagentes para obter um bom
processamento do material. O protocolo de execuo tambm elabora-
do pelo prprio tcnico e pode ser alterado a qualquer momento de forma
simples e rpida.
Geralmente, os aparelhos so programados para trabalhar durante
toda a noite e, no dia seguinte pela manh, o material estar pronto para
ser includo. Outro fato considerado quando se quer ganhar tempo na
rotina laboratorial, pois se pode programar o equipamento para trabalhar
durante feriados e finais de semana.
Figura 10. Processador de tecidos Figura 11. Sistema de vcuo.

automtico.
Protocolos de processamento
Os protocolos de processamento variam de acordo com:
as dimenses dos fragmentos do material a ser processado;
tipo de reagentes utilizados;
tipo do espcime biolgico (material humano, de rato, de
camundongo, entre outros);
tipo de tecido;
processamento automtico ou manual;
presena de vcuo.
Citaremos um dos protocolos utilizados para processamento de tecidos
clivados com 3mm de espessura:
Passo Estgio Reagente Durao
1 Desidratao lcool 70 % 1h

6 Desidratao lcool 100% 1h
9 Clarificao Xilol I 1h
10 Clarificao Xilol II 1h
11 Impregnao Parafina I 1h
12 Impregnao Parafina II 2h
Fatores que influenciam no processamento

Temperatura;
Vcuo;
Agitao.
Todo material utilizado no processamento de tecidos altamente inflamvel.
Use luvas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos.
Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor
de xilol. Este elemento txico para as vias areas. Quando inalado por
tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir
com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol
mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior. No
descarte os resduos do processamento em esgoto sanitrio comum, procure
saber em sua instituio qual a poltica de descarte de substncias qumicas.
4. Incluso
A incluso se baseia em colocar, com o auxlio de uma pina previamente
aquecida, os tecidos que foram previamente infiltrados em parafina no interior de
um molde que j contm parafina lquida com a superfcie a ser seccionada (a ser
cortada ao micrtomo) para baixo (Figuras 11, 12, 13 e 14).
Os fragmentos devem ser colocados na parafina enquanto aquecidos,
evitando-se a formao de bolhas de ar em torno deles. Aps o resfriamento,
os blocos de parafina com o material includo so obtidos.
Para se realizar uma boa incluso, necessrio que o fragmento esteja
completamente desidratado, clarificado e corretamente impregnado.
Quando se observa que uma dessas etapas no foi corretamente efe-
tuada (observando reas opacas ou esbranquiadas no material), deve-se,
nesse caso, retroceder o processamento executando-o da seguinte forma:
remover a parafina de infiltrao com vrios banhos do agente
clarificador (xilol);
aps a completa remoo da parafina, proceder remoo do xilol,
passando o fragmento por vrias trocas do agente desidratante (lcool),
ou mesmo gua, caso o tecido no tenha sido desidratado corretamente;
em seguida, desidratar e clarificar novamente;
infiltrar e incluir o material novamente em parafina.
importante que logo aps o trmino da infiltrao seja efetuada a
incluso, evitando que o material se torne quebradio e retrado pelo efeito da
temperatura da parafina aquecida.
Figura 12. Central de incluso. Figura 13. Incluso do material.
Figura 14. Colorao do suporte Figura 15. Blocos prontos para a

com identificao do tecido. microtomia.
Em alguns laboratrios de histologia, observa-se que o tcnico remove

os fragmentos da parafina de infiltrao e deixa-os esfriar at o momento da
incluso. Esse comportamento est totalmente errado. O fragmento, ao ser
novamente submetido ao da temperatura elevada (56-58oC), pode ter
sua textura consideravelmente prejudicada pelo calor. Assim, devemos incluir o
fragmento logo aps o trmino da infiltrao.
A temperatura da parafina de incluso pode estar cerca de 5C acima
do ponto de fuso da parafina. Essa temperatura necessria para que possa-
mos manusear o fragmento dentro do molde, que por vezes metlico e esfria
rapidamente. No mercado existem aparelhos que possuem dispositivos que
auxiliam no processo de incluso, como tanques de acondicionamento da
amostra. Nesses equipamentos, o termostato permite o controle mais preciso

da temperatura.
As centrais de incluso (Figura12) possuem normalmente duas placas,
uma aquecedora para efetuar a incluso, e outra refrigerada para resfriar os
moldes com as amostras includas. Essas centrais tambm possuem um local
para aquecimento das pinas que sero utilizadas durante a incluso. Esses
aparelhos facilitam o procedimento da incluso, principalmente por manterem a
mesma temperatura de infiltrao em todos os tanques e placas, diminuindo
consideravelmente o tempo gasto com a incluso propriamente dita.
Dependendo do fabricante, alguns produtos, ao serem adicionados
parafina de incluso, alteram a sua consistncia, tornado-a mais macia ou mais
densa. A mudana de consistncia deve ser avaliada, pois sua consistncia
um fator importante na microtomia. Dentre as substncias que podem ser
adicionadas parafina, tm-se: cera de abelha, estearina, cera de carnaba,
dietileno glicol, dentre outras.
Outro fato a ser considerado o uso de cassetes durante o procedi-
mento at a incluso. Os cassetes de plstico so aconselhados, pois permitem
escrever, a lpis, o nmero de registro do material. Os cassetes tambm so
importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrtomo.
Procedimentos para incluso (Figuras 13, 14, 15,16 e 17)

Abrir o cassete e verificar o nmero de fragmentos contidos no
cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimenses dos
fragmentos a serem includos de maneira a sobrar cerca de 2 mm de
parafina nas margens do bloco.
Preencher o molde com parafina lquida pr-aquecida.
Com o auxlio de uma pina, selecionar o fragmento, sem deix-lo
esfriar, e coloc-lo no molde preenchido previamente com parafina.
Colocar a base do cassete, ou suportes, sobre o molde de maneira

que a parafina entre em contato com o cassete. Se para a incluso no
se utilizar o cassete, deve-se utilizar um papel para escrever a identifica-
o do bloco.
Levar o molde com o material includo para a placa resfriada.
Quando o molde comear a suar, o momento certo de retirar o
bloco do molde.
Figura 16. Procedimento de incluso. Figura 17. Molde com material

que foi includo.
Orientao dos fragmentos

A orientao dos fragmentos de rgos no molde um processo impor-
tante na confeco dos cortes e anlise dos tecidos. Por exemplo, rgos
tubulares, como intestinos, devem ser includos no plano transversal; fragmen-
tos de msculos tambm devem ser includos, considerando-se seus planos
longitudinais e transversais. Ao se incluir um fragmento de pele, deve-se
considerar a anlise de suas estruturas bsicas, isto , a epiderme e a derme.
Pequenos fragmentos de tecidos podem ser includos paralelamente,
enquanto fragmentos alongados so orientados longitudinalmente.
Para melhor compreenso do sentido desses materiais durante a incluso,
sugere-se que o tcnico procure atualizar seu conhecimento bsico sobre a
histologia, consultando a literatura especializada ou buscando orientao com o

chefe ou pesquisador do setor.
A parafina altamente inflamvel, mantenha esta substncia longe de chamas.
Evite queimaduras, pois as placas e pinas utilizadas neste procedimento so
aquecidas. A incluso deve ser realizada em local arejado ou com exausto. Os
vapores de parafina so txicos s vias respiratrias.
5. Microtomia
Para permitir a anlise dos tecidos ao microscpio de luz, eles devem ser
seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo
com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina
dos laboratrios.
O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal preciso o
micrtomo (Figura 18), sendo constitudo por trs partes: corpo, porta-bloco
e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas
manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte.
Existem dois tipos de micrtomos: do tipo rotatrio, tambm conhe-
cido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de
encontro navalha que est imvel no porta-navalha; e o do tipo corredia,
que avana o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se
encontra a amostra.
Encontram-se venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de
micrtomo, podendo ser automticos ou manuais. Muitos micrtomos foram
desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros,
para realizar cortes congelados, e h ainda aqueles micrtomos especficos para
a microscopia eletrnica, chamados ultramicrtomos, capazes de confeccionar
cortes ultrafinos. A ttulo de conhecimento geral, iremos descrever alguns
destes modelos.
Figura 18. Micrtomo.
Micrtomos
Micrtomo rotativo ou modelo Minot: so instrumentos peque-

nos e mais utilizados para microscopia de luz para tecidos includos em
parafina.
Criostato: utilizado para confeccionar cortes de tecidos que foram
congelados. Esse equipamento consiste de um micrtomo rotatrio acon-
dicionado dentro de uma cmara frigorfica com temperatura abaixo de -
20 oC (Figura 19).
Figura 19. Criostato.

Micrtomo de corredia: indicado quando os blocos contm frag-

mentos grandes, podendo ser utilizado para bloco de gelatina ou para-
fina. um micrtomo muito pesado, o que evita qualquer tipo de
vibrao mecnica. Muito utilizado para a confeco de cortes de teci-
do nervoso.
Micrtomo de congelao: esse tipo de micrtomo usado para
cortes de material fresco congelado. O sistema desse micrtomo igual
ao do micrtomo de corredia, em que a navalha que se move em
direo amostra, que permanece imvel. equipado com um cilindro
de dixido de carbono lquido que congela as amostras de tecidos e a
navalha. Esse tipo de micrtomo muito utilizado em centros cirrgicos
para um diagnstico rpido.
Ultramicrtomo: utilizado para confeccionar cortes de material includo
em resinas acrlicas ou epoxi. Esse equipamento permite seces semifinas
(com espessura em micrmetros) de pequenas amostras para microscopia
de luz, e ultrafinas (com espessura em nanmetros) em microscopia eletr-
nica. O ultramicrtomo vem adaptado com suporte para navalhas de vidro
para a confeco de cortes semifinos, e suportes para facas de diamante
ou safira, utilizadas para confeccionar cortes ultrafinos. um micrtomo
automtico que possui um controle de operao mecnica.
Micrtomo do tipo serra: um micrtomo especial utilizado para
cortar ossos calcificados, vidros ou cermicas. As amostras includas em
resinas so movidas contra uma serra de diamante.
Micrtomo vibratrio: utilizado para fazer seces de tecidos frescos
de material no fixado, ou tecidos moles; tambm utilizado para a
obteno de cortes de tecidos vegetais. O nome do micrtomo deriva
do fato de ele possuir um sistema de alta vibrao da navalha para cortar
o tecido. Diferentes graus de vibraes podem ser produzidos para
cortar os tecidos de diferentes densidades.
Utilize luvas ao cortar em criostatos, e lembre-se de que no caso de material
congelado, os espcimes no esto fixados.
Navalhas (ou facas)
Existe uma variedade de navalhas disponveis no mercado, variando de

qualidade conforme o grau de dureza do material, o meio de incluso ou o
tipo de micrtomo.
Navalhas de ao: so fabricadas com ao de alta qualidade. A super-
fcie de corte do ao no deve possuir impurezas e nem ser revestida
por substncias anticorrosivas. Essas navalhas so tradicionalmente usadas
para microtomia de material includo em parafina.
Navalhas de ao para criostato: so navalhas mais resistentes e total-
mente livres de impurezas, contendo ainda 12% a 15% de material
cromado ou de teflon, pois no oxidam na presena de gua e ofere-
cem maior durabilidade.
Navalhas descartveis: possuem adaptadores prprios, alm de produ-
zirem cortes de alta qualidade por no comprimirem os tecidos e permi-
tirem cortes sequenciais, denominados cortes em fita. Essas navalhas so
confeccionadas em platina ou material cromado para prolongar o uso
do gume ou fio da navalha muito afiado. Para confeco de cortes
includos em parafina, so comercializadas navalhas descartveis de alto
e baixo perfis; as navalhas de alto perfil servem para microtomia de
tecidos mais slidos, enquanto as de baixo perfil servem para cortar
tecidos mais delicados.
As navalhas descartveis so recomendadas por possurem custo menor
em relao s de ao, alm de dispensarem a utilizao de equipamentos,
como afiadores automticos, que so muito caros. Assim, representam econo-
mia de tempo para o tcnico, que no mais precisar amolar suas navalhas.
Existem tambm navalhas descartveis de tungstnio para a execuo de

cortes de rgos ou osso inclusos em resinas acrlicas.
Execuo dos cortes

Com o auxlio de uma navalha bem afiada, um micrtomo bem aferido e
um bloco contendo material condizentemente includo, possvel iniciar a
microtomia.
Material e equipamento necessrio:
micrtomo;
pina histolgica com ponta curva;
banho-maria;
cuba com gelo;
pincel (opcional);
gaze;
bloco de tecido;
navalha bem afiada;
suporte para lminas;
lminas com adesivo;
placa aquecedora (opcional);
estufa a 58oC.
Procedimento para a microtomia (Figuras 20, 21, 22 e 23)

1- Fixar o bloco no micrtomo.
2- Colocar o maior eixo do bloco verticalmente ao fio (gume) da
navalha. Se o rgo possuir cpsula, essa deve ficar no lado superior
do bloco.
3- Acertar o bloco para que a sua superfcie fique paralela navalha.
4- Colocar no micrtomo uma navalha j utilizada (velha) para desbastar

o bloco (retirar o excesso de parafina at se alcanar o material).
5- Aparar o bloco (desbastar).
6- Substituir navalha velha por nova e afiada.
7- Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a super-
fcie do tecido. Pode-se utilizar um cubo de gelo, o qual deve ter a
superfcie lisa para entrar em contato com a superfcie do material.
8- Secar a navalha e o bloco com cuidado para no atingir o fio da
navalha nem causar ranhuras.
9- Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o
auxlio de uma pina, a qual auxilia na manipulao da fita formada.
10- Retirar a fita do micrtomo, com o auxlio da pina, e transport-la
para o banho-maria, para realizar a distenso dos cortes. A temperatura
do banho-maria deve estar em torno de 40oC para que os cortes se
distendam sobre a superfcie da gua, evitando-se a formao de pre-
gas. Pode-se, tambm, aps a execuo dos cortes, coloc-los em
banho-maria em temperatura ambiente e distend-los em placa aquece-
dora com a temperatura em torno de 40 oC a 45 oC.
11- Se o tecido formar dobras, ainda no banho-maria, elas devem ser
removidas com o auxlio de uma pina curva, pois tais dobras interferem
na anlise histolgica.
12- Coletar o corte com lmina limpa e adesivada.
13- Transferir a lmina com o corte para uma placa aquecedora.
14- Levar a lmina estufa aquecida a 60 oC para retirar o excesso de
parafina e melhorar a adeso do corte a lmina.
Figura 20. Microtomia de tecidos. Figura 21. Distenso dos cortes

em banho-maria.
Figura 22. Coleta ou pescagem Figura 23. Lminas em um suporte

dos cortes. para secar.
Preparo prvio das lminas

As lminas devem ser muito bem limpas e desengorduradas para que os
cortes no se desprendam da lmina durante as etapas subsequentes.
Marcao: as lminas devem ser identificadas com o nmero de
registro correspondente ao bloco, o que pode ser feito com lpis
de diamante (permanente) ou lpis dermogrfico.
Adesivos
Geralmente, como os cortes podem se soltar das lminas durante a
colorao, para evitar que se desprendam podem-se usar adesivos colocados
antes da microtomia nas lminas lavadas e secas.
Os adesivos mais usados so:

albumina de Mayer;
gelatina;
celoidina
polylisina (para imuno-histoqumica);
silano (para tcnicas imuno-histoqumicas, hibridizao in situ e
PCR).
Problemas que podem ocorrer durante a microtomia

A maioria dos artefatos observados nos cortes causada por problemas
com a navalha durante a microtomia ou durante o processamento. Vamos listar
alguns dos problemas:
Problemas Principais causas
1. A navalha e o bloco no esto
paralelos
2. O bloco de forma irregular de
1. Fitas de cortes curvas ou paredes no paralelas
irregulares 3. Borda de corte da navalha
irregular
4. Parafina misturada no
homogeneamente ou impura
1. Faca mal afiada
2. Cortes comprimidos, irregulares 2. Faca ou bloco quente
ou pregueados 3. ngulo irregular da navalha
4. Parafuso do micrtomo solto
1. Incluso imperfeita
3. Fragmentao dos cortes ou 2. Parafina quente demais durante
rasgados a infiltrao ou incluso
1. Parafina suja (no filtrada

4. Arranhaduras nos cortes ou durante a incluso)
cortes divididos em segmentos 2. Sujeira no molde de incluso
3. Sujeira no bloco ou na navalha
4. Dente na faca
1. ngulo da navalha grande
5. Os cortes que se aderem no demais
bloco ao subir o brao do 2. Borda da faca suja
micrtomo 3. Faca sem fio
4. Borda do bloco suja de
parafina
1.Tecido duro demais
6. Espessura desigual no mesmo 2. Parafuso solto
corte, lembrando veneziana 3. Bancada do micrtomo com
vibrao
4.Tecido queimado durante a
infiltrao ou incluso
1. Parafina muito dura
7. Enrolamento dos cortes 2. Navalha cega
3. ngulo incorreto da navalha
1. O lcool ou o clarificador no
8. Fragmentao do tecido foram completamente removidos
durante a microtomia ou 2. Parafina de infiltrao ou
separao do tecido do bloco incluso muito quente
de parafina 3. Excessiva clarificao do tecido
4. A infiltrao foi insuficiente
1. Bloco grande demais
9. Cortes aparecem 2. Parafusos soltos
alternadamente finos e grossos 3. ngulo da faca pequeno
demais
Uma causa frequente de acidente em laboratrios de histotcnica a falta
de ateno na manipulao de navalhas durante a confeco do corte. A
microtomia deve ser realizada em local calmo, onde o tcnico possa se
concentrar exclusivamente no seu trabalho. Muito cuidado ao descartar as
navalhas. Utilize sempre caixas de descarte especial para perfurocortantes.
Lembre-se de que os funcionrios do setor de limpeza podem se acidentar
com navalhas descartadas indevidamente.
6. Colorao dos tecidos

A utilizao de corantes fundamental para visualizar os tecidos ao
microscpio de luz. Aps a microtomia, as clulas e o material extracelular
so habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualizao das
estruturas teciduais.
Os corantes aplicados para corar tecidos que foram previamente fixa-
dos so chamados corantes no vitais, como a hematoxilina, eosina, fucsina,
entre outros.
Podemos tambm corar clulas em cultura ou clulas de organismos
ainda vivos; nesse caso, necessria a utilizao de corantes chamados vitais,
que no causam danos s clulas e tambm no interferem no metabolismo
celular. Dentre eles, temos: o azul de tripan, verde janus B, vermelho tripan,
azul de metileno, vermelho neutro, entre outros.
Para compreender os conceitos bsicos sobre coloraes, devemos co-
nhecer algumas definies importantes.
O que so corantes?
Os corantes (Figura 24) so compostos orgnicos, aromticos e ionizveis,

fundamentalmente baseados na estrutura do benzeno. Contudo, esses corantes
so incolores e necessitam da adio de novos grupos qumicos sua estrutura

chamados cromforos (C=O cetona, C=N carboamnico, N=N
azoico, N=O nitroso, NO2 nitro e C=C etileno). Quanto
mais cromforos em um corante, mais intensa ser a sua cor.
A unio do cromforo aos compostos aromticos constitui os cromgenos,
compostos benznicos contendo grupamentos cromforos. Para que o corante
se ligue especificamente aos elementos tissulares, necessrio que um grupo
auxiliar do corante, denominado auxocromo, se ligue ao cromgeno. O
auxocromo determina o carter cido ou bsico do corante. As aminas bsicas
(-NH2) e os grupos hidroxila cidos (-OH) so exemplos de auxocromos.
Simplificando:
Corantes so compostos orgnicos aromticos formados pelo cromgeno
e auxocromo e coram seletivamente os componentes teciduais, como as clulas
e a matriz extracelular. De acordo com a carga inica, os corantes podem ser
cidos, bsicos ou neutros.
Corantes cidos: possuem auxocromo aninico (carga eltrica negativa
(-)), com afinidade por componentes bsicos do tecido (catinico (+)).
As estruturas coradas pelos corantes cidos so chamadas acidfilas,
como, por exemplo, o citoplasma e matriz extracelular. Um exemplo de
corante cido a eosina.
Corantes bsicos: possuem auxocromo catinico (+) com afinidade
por componentes cidos dos tecidos (aninico (-)). As estruturas cora-
das pelos corantes bsicos so chamadas basfilas, como o ncleo. A
hematoxilina um exemplo clssico de corante bsico.
Figura 24. Esquema da associao do corante com os tecidos.
Os corantes podem ser naturais ou sintticos (artificiais), sendo tambm

chamados corantes biolgicos, por revelar estruturas biolgicas dos tecidos.
Naturais: hematoxilina, ndigo, orcena, brasilina, entre outros.
Artificiais: so aqueles derivados do benzeno.
As coloraes podem ser classificadas segundo a ao do corante, o

tempo de colorao e a sua cromatizao.
Para compreender essa caracterizao, necessrio conhecer a definio
de dois termos da tcnica histolgica: o mordente e a diferenciao.
Mordente: um elemento, metal ou ons de metal, que se liga

covalentemente ao corante e facilita a ligao do corante ao tecido. O
mordente empregado para reforar a ao dos corantes e tornar as
coloraes mais seletivas, podendo ser usado antes, durante (adiciona-
do soluo corante) ou aps a utilizao do corante.
Diferenciao: esse termo se refere remoo do excesso de corante

do tecido, descorando seletivamente determinada estrutura e melhoran-
do a sua visualizao.
As coloraes podem ainda se caracterizar segundo a:

A. Ao
Diretas: quando o corante penetra no interior dos tecidos sem trata-
mento intermedirio com mordente.
Indiretas: quando necessrio um tratamento intermedirio com
uma soluo mordente para o corante se ligar ao tecido durante a
colorao.
B. Tempo
Progressiva: a colorao feita gradualmente sem a necessidade de se
proceder sua diferenciao, isto , que seja retirado o excesso do
corante.
Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu
excesso pela diferenciao para melhor visualizao dos elementos
teciduais.
B. Cromatizao
Depende da quantidade de corantes utilizados durante a execuo de
uma determinada tcnica de colorao.
Monocrmica = 1 cor.
Bicrmica = 2 cores.
Tricrmica = 3 cores.
Policrmica = mais de 3 cores.
Aps os comentrios apresentados, deve-se ainda aprofundar alguns

conhecimentos sobre a colorao.
Aps a microtomia, o preparado histolgico est pronto para ser
corado. Deve-se, inicialmente, utilizar uma colorao que proporcione
uma viso geral de todo o tecido de modo a permitir a identificao dos
elementos teciduais, propiciando o diagnstico histolgico. A colorao
pela hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre muito bem esse papel.
Nessa colorao, os ncleos so corados pela hematoxina, sendo eviden-
ciados em roxo, enquanto o citoplasma e os espaos intercelulares so
corados pela eosina, sendo visualizados em rosa. Havendo a necessidade
de se identificar certos elementos teciduais especficos, empregam-se tcni-
cas histoqumicas especiais.
H diversos mtodos especiais de colorao que propiciam uma melhor
identificao de determinados componentes teciduais. Por exemplo, a colora-
o pelo mtodo tricomtico de Masson, que utiliza corantes especiais, permi-
te evidenciar tecido muscular e fibras colgenas; a colorao pela resorcina
fucsina de Weigert demonstra fibras do sistema elstico; o azul de toluidina
em pH cido uma colorao especfica para mastcitos.
Outros mtodos utilizados para identificao de elementos teciduais
podem utilizar sais pesados a base de prata metlica e no corantes. Nessa
categoria podem-se citar o mtodo da reticulina de Gomori, que identifica
especificamente as fibras reticulares do tecido conjuntivo, sendo o mtodo de
Grocott especfico para fungos, e o mtodo de PAMS, especfico para
membrana basal.
Em determinadas coloraes histoqumicas, certas substncias, ao se com-
binarem com o tecido, formam uma nova substncia, e essa ligao pode ser
irreversvel. Essa a base da colorao com o azul da Prssia (ou Perls) e do
mtodo que utiliza o cido peridico associado ao reativo de Schiff (PAS).
Na colorao com o azul da Prssia, devido ao do cido clordrico, o ferro
conjugado s protenas ionizado e evidenciado aps reao com o ferrocianeto

de potssio. O resultado dessa reao produz um precipitado azul e insolvel
de ferrocianeto frrico.
Na reao do mtodo do PAS, o cido peridico oxida os grupos
hidroxila vicinal dos hidratos de carbono do glicognio, mucoprotenas e
glicoprotenas, os quais so convertidos a grupamentos aldedicos, de modo
que a cadeia polissacardica se transforma numa cadeia polialdedica. Os com-
postos aldedos se combinam com o reagente de Schiff, que incolor, e esse
complexo formado revela-se como um composto colorido.
As coloraes histolgicas de rotina e especiais, quando surgiram na
patologia clssica, constituram uma grande revoluo e avano na metodologia
de estudo da clula, fornecendo subsdios importantes para a anlise dos
tecidos, e representam o ponto de partida para o uso de tcnicas mais moder-
nas incorporadas rotina de investigao.
A seguir, encontram-se algumas sugestes de tcnicas histoqumicas.
Para evidenciar Clulas

HE, Feulgen, Papanicolau, Shorr,
Ncleo e citoplasma Giemsa, azul de toluidina, metil
green-pironina
Melancitos Fontana-Masson
Clulas do tecido nervoso Violeta cresil, azul de toluidina,

Golgi (Prata)
Secrees celulares PAS, PAS alcian blue pH 1,0

ou 2,5
Mastcitos e eosinfilos AB-safranina, Geimsa, azul de
toluidina, sirius red em pH 10,2
Para evidenciar Elementos da matriz extracelular
Glicoprotenas neutras PAS

Proteoglicanos PAS-alcian blue em pH 1,0 ou
pH2,5
Glicoprotenas no colagenosas PAMS, reticulina
Elementos fibrosos base de Tricomtica de Masson, tricomtica

colgenos de Gomori, picrossirius red
Fibras do sistema elstico Resorcina fucsina de Weirgert
Para evidenciar Tecidos especficos
Tecido conjuntivo Tricomtica de Masson, tricomtica

de Gomori, Goldner, picrossirius
red, reticulina de Gomori
Tecido linfoide e mieloide Giemsa, reticulina de Gomori
Tecido adiposo Sudan black
Tecido muscular Coloraes tricromticas, azul de
toluidina
Tecido cartilagionoso Coloraes tricromticas, PAS -
alcian blue em pH1,0 ou pH 2,5
Para evidenciar Micro-organismos
Fungos de forma geral Grocott e PAS
Treponema pallidun, Leptospira, Warthin-Starry, Giemsa

Helicobacter pylori
Mycobacterium leprae Mtodo de Fite, Wade, Kinyoun
Giardia lamblia, Giemsa, HE, leishman, PAS,

Entamoebahistolytica, hematoxilina frrica, Feulgen
Trichomonas vaginalis
Helmintos HE
Incluses virais HE
Criptococcus Mucicarmin, PAS, prata
metenamina
Consideraes importantes
Geralmente as estruturas teciduais so visualizadas na mesma cor, ou
muito semelhante em tom ao do corante utilizado. Essa propriedade conhe-
cida como ortocromasia. Porm, em alguns casos, certos elementos teciduais,
ao serem visualizados aps a sua interao com o corante, exibem uma cor
distinta do corante. Esse fenmeno designado metacromasia. Algumas tc-
nicas de colorao podem demonstrar a metacromasia, como a colorao pelo
azul de toluidina em condies especficas, que evidencia em magenta os
grnulos dos mastcitos e os proteoglicanos da matriz cartilaginosa.
Procedimentos gerais para coloraes

Antes de iniciar qualquer colorao, devemos nos lembrar de que, aps
a microtomia, os cortes dos tecidos esto impregnados pela parafina, que
precisa ser removida para que os corantes penetrem e se combinem com os
elementos teciduais.
O procedimento geral para qualquer colorao o seguinte:
Desparafinizao: visa retirada da parafina dos cortes aps a microtomia.
Esse procedimento realizado com o auxlio do xilol, a mesma substn-
cia utilizada para a clarificao dos tecidos durante o processamento para
a confeco do bloco contendo o fragmento do material a ser analisado.
Hidratao: realizada por meio de sequncias alcolicas em concen-
traes decrescentes, ou seja, lcool 100%, 95%, 80%, 70%, at a
gua destilada. Cabe ressaltar que a maioria dos corantes se encontra
diluda em gua, devendo o ltimo banho ser com gua. Porm, quan-
do se utiliza um corante alcolico, deve-se interromper a hidratao em
lcool 70%.
Colorao: a imerso propriamente dita dos cortes no corante,
favorecendo a combinao de suas estruturas com o corante para poste-
rior visualizao em microscpio de luz.
Desidratao: retira a gua do tecido, pois os meios de selagem no
so miscveis em gua, e so necessrios para a confeco dos prepara-
dos histolgicos permanentes. Assim, utiliza-se com concentraes alco-
licas crescentes: lcool 70%, 80%, 95% e 100%.
Clarificao: utiliza-se o xilol como lquido intermedirio entre o lcool
e o meio de selagem.
Selagem ou montagem da lmina propriamente dita: a etapa final da
preparao da lmina para anlise ao microscpio de luz. Essa etapa
consta em cobrir o tecido com uma lamnula de vidro, usando uma
substncia para fixar a lmina lamnula (selagem).
Protocolos de colorao para os tecidos
Colorao pela hematoxilina mayer e eosina-floxina

Solues:
A) Hematoxilina de Mayer (Mayer, 1903):
Hematoxilina.........................................................1 g
gua destilada..............................................1000 mL
Iodato de sdio................................................. 0,2 g
Almen de amnia ou potssio................................. 50 g
cido ctrico.........................................................1 g
Hidrato de cloral..................................................50 g
Dissolver a hematoxilina na gua destilada agitando (aquecer um pouco

at 60 C). Acrescentar o iodato de sdio e o almen. Agitar at dissolver
totalmente. Adicionar, ento, o cido ctrico e o hidrato de cloral. Deixar
agitando para que todos os componentes se dissolvam totalmente. A cor final
do corante vermelho-violeta. O corante estar pronto para o uso imediato e
poder ser usado por cerca seis meses (no mximo), sem que ocorra o amadu-
recimento exagerado.
Nota tcnica: existem vrios tipos distintos de solues para o preparo da

hematoxilina, como a de Mayer, Harris, Delafield e Erlich. Esses tipos de
solues variam de acordo com o tempo de colorao, aplicao e composi-
o qumica do corante. A hematoxilina de Harris muito utilizada nos labora-
trios de anatomia patolgica por produzir bons resultados com um tempo
curto de colorao. A hematoxilina de Mayer apresenta bons resultados,
porm com um tempo maior de colorao. As hematoxilinas de Erlich e
Delafield so empregadas em tecidos sseos que sofrero a ao por

descalcificadores contendo cidos fortes. A seguir, sero descritos os mtodos
de colorao pela hematoxilina e eosina, utilizando a hematoxilina de Mayer e
a de Harris.
B) Eosina-floxina:
1- Soluo estoque de eosina 1% em gua destilada.
2- Soluo estoque de floxina 1% em gua destilada.
3- Soluo de uso de eosina-floxina:
Eosina 1% (soluo estoque 1)............................100 mL
Floxina 1% (soluo estoque 2).............................10 mL
lcool etlico 95%...........................................780 mL
cido actico glacial PA........................................ 4 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
2- Corar com a hematoxilina de Mayer durante 20 minutos 1.
3- Lavar em gua corrente durante 25 minutos.
4- Comear a desidratao com lcool 70% durante 1 minutos.
5- Corar pela eosina-floxina durante 2 minutos.
6- Lavar rapidamente em lcool 95%.
7- Desidratar em 3 banhos de lcool absoluto por 1 minuto cada.
8- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar.
Resultados: ncleos em azul e citoplasma em vrias tonalidades de rosa.
1
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e
ainda se obterem bons resultados.
Ateno, pois o xilol e o lcool so altamente inflamveis. Use luvas nitrlicas,
jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a
manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol.
Esse elemento txico para as vias areas e, quando inalado por tempo
prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espu-
ma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais
pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior.
Colorao pela hematoxilina de Harris e eosina-floxina

Solues:
A) cido-lcool a 1%:
cido clordrico (HCl)..........................................1 mL
Etanol a 70%...................................................99 mL
B) gua amoniacal:
Hidrxido de amnio (NHOH)..........................2 a 4 mL
gua destilada......................................800 a 1000 mL
C) Carbonato de ltio saturado:

Carbonato de ltio (LiCO)...................................1,54 g
gua destilada................................................100 mL
D) Eosina-floxina (ver o mtodo de hematoxilina de Mayer e esosina-

floxina)
E) Hematoxilina de Harris (Harris, 1900):

Hematoxilina .....................................................5,0 g
Etanol a 100%..............................................50,0 mL
Almen de potssio ou de amnio...........................100 g
gua destilada..............................................1.000 mL
xido mercrio (p vermelho) (HgO)......................2,5 g
Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aque-

cedora e um agitador magntico em um recipiente. Dissolva a hematoxilina no
lcool temperatura ambiente, em recipiente separado. Lentamente, misture as
duas solues aquecendo em placa aquecedora, at entrar em ebulio. Retire
da fonte de calor e, com cuidado, acrescente lentamente o xido mercrio,
que faz com que a soluo entre rapidamente em ebulio, podendo transbor-
dar do recipiente. Retorne a soluo para a fonte de calor at que adquira a
cor prpura-escura. Esfrie, e a soluo estar pronta.
Para o uso:
Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao
dos ncleos.
Filtre sempre antes de cada uso.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada.
2- Corar com soluo recm-filtrada de hematoxilina de Harris
por 6 a 10 minutos2.
2
3- Lavar em gua de torneira por 5 minutos.

4- Diferenciar em lcool-cido, com 1 ou 2 mergulhos.
5- Lavar rapidamente em gua de torneira.
6- Colocar em soluo fraca de gua amoniacal ou de carbonato
de ltio saturada at que os cortes fiquem azul-brilhantes.
7- Lavar completamente em gua de torneira por 10 minutos.
8- Colocar em lcool etlico a 80% por 1 a 2 minutos.
9- Contracorar em soluo de eosina-floxina por 2 minutos3.
10- Desidratar a partir do lcool 95%.
11- Desidratar com 3 banhos de lcool absoluto.
12- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar.
Resultados:
Ncleos..............................................................azul
Citoplasma...........................................rseo a vermelho
Demais estruturas tissulares.........................rseo a vermelho
Nota de biossegurana: O xido mercrio txico, venenoso e combustvel

(oxidante).
Mtodo de colorao pelo Giemsa de Lennert (Lennert, 1978)

Solues:
A) cido actico 0,5%.
B) lcool isoproplico.
3
C) lcool etlico 95%.
D) Xilol
E) Soluo de Giemsa:
Giemsa Merck em soluo estoque..........................20 mL
gua destilada..................................................80 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
2- Corar utilizando a soluo de uso de Giemsa por 1 hora.
3- Diferenciar em cido actico 0,5% - 3 mergulhos
4- Continuar a diferenciao em lcool etlico 95%, olhando
sempre ao microscpio (o tempo varia de acordo com o tipo e
espessura do tecido).
5- Desidratar em lcool isoproplico - 3 banhos, de 3 minutos
cada.
6- Clarificar em xilol e selar.
Nota: A soluo de Giemsa descora com o tempo; aconselha-se examin-la e

fotograf-la o mais rpido possvel.
Resultados:
Citoplasma..........................................................rosa
Ncleos.............................................................azul
Hemcias.......................................................vermelho
Grnulos de mastcitos.......................................prpura
Bctrias..............................................................azul
Parasitas da malria..................................................azul
Mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)

(McManus, 1946)
Solues:
A) cido Peridico 0,5%.
B) Reagente de Schiff:
Fucsina bsica........................................................1 g
Metabissulfito de sdio ou bissulfito de sdio..................2 g
gua destilada.................................................200 mL
cido clordrico 1 N..........................................20 mL
Procedimento:
1- Dissolver em 200 mL de gua destilada quente, 1 g de
fucsina bsica.
2- Deixar entrar em ebulio.
3- Esfriar at 50 C.
4- Adicionar 2 g de metabissulfito ou dissulfito ou bissulfito de
sdio anidro.
5- Filtrar.
6- Colocar uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e em
seguida adicionar 20 mL de cido clordrico 1 N.
7- Agitar, esfriar e guardar na geladeira em frasco mbar ou
envolvido em papel alumnio.
8- No dia seguinte, colocar uma pitada de carvo ativado e

filtrar. O filtrado deve ficar branco ou cor-de-palha; caso contr-
rio, deve-se colocar mais uma pitada de metabissulfito de sdio
anidro e filtrar novamente.
C) Soluo sulfurosa:
Soluo estoque:
Metabisssulfito de potssio ou bissulfito de potssio...10 g
gua destilada................................................200 mL
cido clordrico 1 N..........................................10 mL
Soluo de uso:
Soluo estoque..........................................................6 mL
gua destilada........................................................114 mL
Procedimento:
2- Colocar as lminas na soluo de cido peridico 1% por 15
minutos.
3- Lavar em gua destilada por 5 minutos.
4- Corar pelo Schiff (guardado na geladeira e no escuro 4), por
15 minutos temperatura ambiente.
5- Colocar em trs trocas de soluo sulfurosa de uso durante 5
minutos cada e desprezar aps o uso.
4
Envolver o vidro com papel alumnio.

7- Corar pela hematoxilina de Mayer durante 10 minutos.
8- Lavar em gua corrente durante 5 minutos.
9- Desidratar, clarificar e selar.
Resultados:
Membrana basal, mesngio, fibrina, muco, amiloide, coloide, de colo-
rao rsea a vermelho prpura.
Mtodo de Gomori para fibras reticulares (Gomori, 1937)

Solues:
A) Soluo de permanganato de potssio 1%.
B) Soluo de cido oxlico 3%.
C) Soluo de almen de ferro 2%.
D) Soluo de nitrato de prata amoniacal de uso:

Nitrato de prata 10% (aquoso).............................20 mL
Hidrxido de potssio 10% (aquoso)........................5 mL
Hidrxido de amnia 28% (aquoso): adicionar aos poucos,
gotejando at que o precipitado marrom desaparea, sempre agi-
tando.
A soluo se tornar transparente. Acrescentar ento 3 gotas de nitrato
de prata 10%, agitando. Acrescentar gua destilada na proporo de 1:1.
Acrescentar finalmente 25 mL de gua.
E) Formaldedo 10%: (1 parte de formaldedo comercial + 3 partes

de gua destilada)
F) Cloreto de ouro 1%.
G) Tiossulfato de sdio 5%.
Observao: Os cortes devem ser aderidos em lminas quimicamente limpas e

desengorduradas, com uma fina camada de albumina de Mayer.
Procedimento:
2- Mergulhar em soluo de permanganato de potssio 1% por
1 minuto.
4- Descorar pelo cido oxlico 3% por 3 minutos.
5- Lavar em gua corrente por 3 minutos.
6- Colocar as lminas no almen de ferro 2% ou sulfato de ferro
e alumnio por 1 minuto.
8- Soluo de nitrato de prata amoniacal (soluo de uso) por 1
minuto.
10- Formaldedo 10% por 3 minutos.
11- gua corrente por 5 minutos.
12- Soluo de cloreto de ouro 1% por 10 minutos.

14- Tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto.
Resultado:
Fibras reticulares ...........................negro.
Mtodo de colorao tricromtica de Masson (Masson, 1929)

Solues:
A) Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico:
cido pcrico.....................................................1,2 g
gua destilada.................................................100 mL
B) Soluo fixadora de Bouin:

Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico ...750 mL
Formalina (37-40%)..........................................250 mL
cido actico, glacial...........................................50 mL
C) Soluo de uso de hematoxilina frrica de Weigert:

Misturar, em partes iguais, as solues estoques A e B (100 mL da
soluo A + 100 mL da soluo B).
Soluo estoque 1:
Hematoxilina, cristais................................................1 g
Etanol, 95%..................................................100 mL
Soluo estoque 2:
Cloreto frrico (FeCl ), 29%..................................4 mL
gua destilada..................................................95 mL
cido clordrico concentrado (HCl)............................1 mL
D) Soluo de fucsina cida - Biebrich Scarlet:

Biebrich Scarlet (C.I. 26905), soluo aquosa a 1%....90 mL
Fucsina cida (C.I. 42685), soluo aquosa a 1%.......10 mL
cido actico glacial.............................................1 mL
E) Soluo de cido fosfotngstico - fosfomolbdico:

cido fosfotngstico................................................5 g
cido fosfomolbdico..............................................5 g
gua destilada..................................................200 mL
F) Soluo de azul de anilina:

Azul de anilina....................................................2,5 g
cido actico glacial..............................................2 mL
gua destilada.................................................100 mL
G) Soluo de cido actico glacial a 1%:
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Colocar no lquido de Bouin por 1 hora a 56 oC ou
temperatura ambiente, por uma noite, se os cortes foram fixados

em formalina. Essa etapa no necessria se a fixao for feita no
lquido de Bouin.
3- Deixar esfriar por 10 minutos.
4- Lavar em gua corrente at que os cortes fiquem claros. Em
seguida, enxaguar em gua destilada.
5- Corar na soluo de hematoxilina frrica de Weigert por 10
minutos.
6- Lavar em gua corrente por 10 minutos. Aps, enxaguar em
gua destilada.
7- Corar em soluo aquosa de Biebrich Scarlet a 1% por 5
minutos.
8- Enxaguar em gua destilada.
9- Colocar na soluo de cido fosfotngstico-fosfomolbdico
por 10 a 30 minutos.
10- Corrar em soluo de azul de anilina por 15 a 30 minutos.
12- Diferenciar na soluo aquosa de cido actico a 1%, por 3
a 5 minutos.
13- Desidratar a partir do etanol a 95%, clarificar com xilol e selar.
Resultados:
Ncleos............................................................preto
Msculo, citoplasma, queratina..............................vermelho
Colgeno.............................................................azul
Mtodo de Weigert (Weigert, 1898)

Solues:
A) Resorcina fucsina de Weigert:
Fucsina bsica........................................................2 g
Resorcina.............................................................4 g
gua destilada................................................200 mL
Cloreto frrico 30 %.........................................25 mL
Dissolver 2 g de Fucsina bsica e 4 g de Resorcina em 200 mL de gua

destilada em ebulio. Adicionar 25 mL de cloreto frrico a 30%, deixando
ferver por mais 5 minutos. Filtrar e desprezar o filtrado. O precipitado que
ficou no papel de filtro deve ser dissolvido em 200 mL de etanol 90%
aquecido. Aps esfriar, completar para 200 mL com etanol 90% e juntar
4 mL de cido clordrico concentrado. O corante deve ser guardado na
geladeira, pois o lcool pode evaporar com o calor.
B) Soluo de persulfato de potssio 10% ou monopersulfato de

potssio 10% ou oxona 10%
C) Soluo de Van Gieson:

Fucsina cida, soluo aquosa a 1%...........................5 mL
cido pcrico, soluo saturada aquosa
(21 g para 1 L de gua) ..................................100 mL
cido clordrico concentrado................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at o lcool 70%.
2- Oxidar pela oxona 10% (desprezar aps o uso).
3- Corar pela resorcina-fucsina durante 1 hora.
4- Passar por 3 banhos de lcool 95% (em borris), para retirar
o excesso de corante por alguns segundos em cada banho.
5- Lavar em gua destilada.
6- Contracorar ou no com a soluo de Van Gieson
7- Desidratar rapidamente em 3 banhos de lcool absoluto (em
borris).
8- Clarificar em 3 banhos de 3 minutos de xilol.
Resultados:
Fibras elsticas ......................................... marrom-avermelhado.
Mtodo da prata metenamina de Grocott (Grocott, 1955)

Solues:
A) Soluo de cido crmico (trixido de cromo) a 4%.
B) Soluo de nitrato de prata a 5%.
C) Soluo de metenamina (hexametilenotetramina) a 3%.
D) Soluo de brax a 5%.

E) Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina:

Soluo de nitrato de prata a 5%.............................5 mL
Soluo de metenamina a 3%..............................100 mL
F) Soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina:

Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina...........25 mL
gua destilada..................................................25 mL
Soluo de brax a 5%.........................................2 mL
Prepare no momento de usar. No use se ficar turva.
G) Soluo de bissulfito de sdio ou metabissulfito de sdio a 1%:

Prepare no momento de usar.
H) Soluo de cloreto de ouro a 0,1%.
I) Soluo de tiossulfato de sdio (hipossulfato de sdio) a 5%.
J) Soluo estoque de light green a 0,2%:

Light green SF yellow.......................0,2 g
gua destilada.................................................100 mL
Aps misturar, acrescente 0,2 mL cido actico glacial.
K) Soluo de uso de light green:

Soluo estoque de light green ...............................10 mL
gua destilada...................................................50 mL
Procedimento:
2- Oxidar pela soluo de trixido de cromo a 4%, preparada
no momento de usar, e deixar por 1 hora.
3- Lavar em gua de torneira por poucos segundos.
4- Colocar na soluo de bissulfito de sdio a 1% por 1 minuto.
5- Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos.
6- Enxaguar em gua destilada; 3 trocas.
7- Colocar os preparados na soluo de trabalho de nitrato de
prata-metenamina, preparada no momento de usar, e deixar na
estufa a 58C - 60C, por 50 a 60 minutos.
8- Enxaguar em gua destilada vrias vezes.
9- Colocar na soluo de cloreto de ouro a 0,1% e deixar por
2 a 5 minutos.
11- Colocar na soluo de tiossulfato de sdio a 5%, e deixar
por 2 a 5 minutos.
12- Lavar em gua de torneira.
13- Contracorar na soluo de trabalho de light green por 30
a 45 segundos (esse tempo pode variar).
Resultados:
Fungos ............................nitidamente delineados em preto
Mucina.....................................................cinza-escuro
Parte interna de miclios e hifas.....................rosa-acinzentado
Fundo..............................................................verde
Mtodo de Warthin-Starry (Kerr, 1938)

Solues:
A) cido ctrico 1%.
B) Soluo de gua acidulada:

gua tridestilada deionizada...............................1000 mL
Acrescentar a soluo de cido ctrico a 1%, o suficiente para
alcanar o pH 4,0.
C) Soluo impregnante de nitrato de prata a 1%:

Nitrato de prata.....................................................1 g
gua acidulada................................................100 mL
D) Soluo de nitrato de prata 2% para revelao:

Nitrato de prata.....................................................2 g
gua acidulada................................................100 mL
E) Soluo de hidroquinona a 0,15%:

Hidroquinona cristalina qualidade fotogrfica...............0,15 g
gua acidulada...............................................100 mL
F) Soluo de gelatina a 5%:

Gelatina pura......................................................10 g
gua acidulada................................................200 mL
Conservar as solues de nitrato de prata 2%, gelatina 5% e

hidroquinona 0,15% em frascos de Erlenmayer de 50 mL, em banho-maria
54 C, at preparar a soluo G:
G) Soluo reveladora:
Nitrato de prata 2%..........................................1,5 mL
Gelatina 5%..................................................3,75 mL
Hidroquinona 0,15%........................................2,0 mL
Misturar num pequeno bquer os ingredientes acima na ordem descrita,
assegurando-se que a mistura do nitrato de prata e gelatina esteja totalmente
completa. Aps isso, adicionar a hidroquinona. Preparar a soluo somente
na hora de usar.
Procedimento:
2- Impregnar pela soluo de nitrato de prata a 1%, por 30
minutos em banho-maria pr-aquecido 43 oC.
3- Preparar a soluo reveladora. Usar a soluo imediatamente
aps colocar a hidroquinona.
4- Recobrir os cortes com a soluo reveladora, preparada no
momento do uso. Os cortes tornam-se marrons-claros ou amare-
los. Controlar ao microscpio. As espiroquetas aparecem em
negro com fundo amarelo ou marrom-claro.
5- Lavar rapidamente em gua morna comum (56oC).
6- Mergulhar em gua destilada.
7- Desidratar a partir do lcool 95%, clarificar e selar.
Resultados:
Espiroquetas, corpos de Donovani...negro
Colorao de fundo....................de amarelo a marrom-claro
Referncias:
C. H. Bridges e L. G. Luna estudaram vrias modificaes da
tcnica, que se encontra publicada em Lab. Invest.,1957.
Sirius red em pH 10,2 (Bogomoletz,1980; Luque,1989)

Soluo:
A) Soluo de sirius red em pH 10,2:
Sirius red ou direct red 80......................................0,5g
gua destilada..................................................45 mL
lcool absoluto.................................................50 mL
Adicionar NaOH 0,1N, at atingir o pH 10,2.

Deixar repousar por 2 horas.
Gotejar lentamente o cloreto de sdio 20% em baixo de luz
forte at aparecer o precipitado.
Deixar repousar durante a noite sob luz forte e filtrar na manh
seguinte.
Esta soluo dura um ms temperatura ambiente; mas pode durar mais,
caso fique na geladeira. Aps um ms, aumentar o tempo de colorao.
Procedimento:
2- Corar por 5 minutos pela hematoxilina de Mayer.
5- Passar pelo lcool 70% por 3 minutos.
6- Corar pela soluo de sirius red pH 10,2 por 1 hora ou mais.
Resultados:
Grnulos do eosinfilos......................................vermelho
Ncleos..............................................................azul
Mtodo de Fite (Fite, 1947)

Solues:
A) Vaselina terebentina:
Terebentina......................................................70 mL
Vaselina...........................................................30 mL
ou Soluo de leo de Anilina - Xilol:
leo de anilina..................................................30 mL
Xilol..............................................................70 mL
B) Soluo de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen:

Fenol, cristais fundidos........................................2,5 mL
Etanol absoluto...................................................5 mL
Fucsina bsica.....................................................0,5 g
gua destilada..................................................50 mL
Primeiro, deve-se dissolver a fucsina bsica no etanol, juntar o fenol e,
por ltimo, adicionar a gua destilada. Esta soluo deve ser filtrada.
C) Soluo de lcool-cido a 1%:

cido clordrico..................................................1 mL
lcool etlico (etanol) a 70%................................99 mL
D) Soluo estoque de azul de metileno:

Azul de metileno.................................................1,4 g
Etanol a 95%.................................................100 mL
E) Soluo de trabalho de azul de metileno:

Soluo estoque de azul de metileno........................10 mL
gua destilada...................................................90 mL
cido actico glacial............................................0,5 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar as lminas em 2 trocas, de 10 minutos cada,
em soluo de vaselina terebentina ou leo de anilina xilol em
estufa 60oC. Lembrar-se de que essas solues devem estar a
60oC antes de imergir as lminas.
2- Deixar os cortes secarem ao ar por 15 minutos. O filme de

leo remanescente prevenir a retrao e os danos aos cortes.
3- Corar na soluo filtrada de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen
por 30 minutos.
4- Lavar em gua de torneira por 10 minutos.
5- Diferenciar os cortes na soluo de lcool-cido a 1% at que
fiquem rosa-plidos.
7- Contracorar com a soluo de trabalho de azul de metileno
por 30 segundos a 1 minuto.
8- Enxaguar, em gua de torneira, o excesso de soluo de
trabalho de azul de metileno.
9- Desidratar os cortes rapidamente, em 2 trocas cada, em etanol
a 95% e etanol absoluto.
10- Clarificar em xilol; 2 trocas de 2 minutos cada.
11- Selar.
Resultados:
Bacilos da lepra e outros cido resistentes...............vermelho.
Fundo....................................................... azul-plido.
Mtodo do mucicarmim (Southgate, 1927)

Solues:
A) Soluo estoque mucicarmim de Southgate:
Carmim...............................................................1 g
Hidrxido de alumnio.............................................1 g
Etanol a 50%........................................................100 mL
Cloreto de alumnio, anidro..............................................5 g
Faa essa soluo em banho-maria. Quando frio, filtre.
B) Soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate:

Soluo-estoque de mucicarmim de Southgate...............10 mL
gua destilada..................................................90 mL
C) Soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert:

Partes iguais das solues estoque A e B (100 mL de A + 100 mL
de B). Ver o mtodo de colorao pela tricromtica de Masson.
D) Soluo de amarelo metanil a 0,25%:

Amarelo metanil.......................................................0,25 g
gua destilada........................................................100 mL
cido actico glacial................................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Deixar na soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert
por 7 minutos.
3- Lavar em gua corrente de torneira por 10 minutos.
4- Corar na soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate por
30 minutos e descart-la aps o uso.
5- Enxaguar rapidamente em gua destilada.
6- Contracorar na soluo de amarelo metanil por 1 minuto.

7- Desidratar a partir do etanol 95%.
8- Clarificar e selar.
Resultados:
Mucina......................................................rosa-escuro
Cpsula de Cryptoccocus sp............................ rosa-escuro
Ncleos............................................................preto
Fundo............................................................amarelo
Mtodo de Feulgen para DNA (Feulgen e Rossenbeck, 1924)

Solues:
A) cido clordrico 1N:
cido clordrico................................................8,3 mL
gua destilada...............................................91,7 mL
B) Metabissulfito de sdio 0,5%.
C) Reagente leuco fucsina de Schiff (ver mtodo do cido peridico +

reativo de Schiff (PAS)).
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar dos cortes at a gua destilada.
2- Lavar os cortes em cido clordrico 1N em temperatura
ambiente.
3- Transferir para o cido clordrico 1N pr-aquecido, a 60oC

para hidrolisar os cortes.
O tempo de hidrlise depende do fixador utilizado:
Formaldedo = de 8 a 12 minutos.
Bouin = de 5 a 8 minutos.
Helly = em torno de 5 minutos.
4- Transferir para a soluo o reagente leuco fucsina de Schiff
durante 45 minutos.
5- Lavar em 3 banhos de metabissulfito de sdio 0,5%, de 2
minutos.
6- opcional contracorar com light green 1% durante 1 minuto.
7- Desidratar, clarear e montar.
Resultados:
DNA.................................................. vermelho-prpura
Citoplasma.........................................................verde
Mtodo de Colorao pelo alcian blue em pH 2,5

(Lev. e Spicer, 1964).
Solues:
A) Soluo de cido actico glacial a 3%.
B) Soluo de alcian blue:

alcian blue, 8GX.................1 g
Soluo de cido actico a 3%............................100 mL
C) Soluo de nuclear fast red (kernechtrot):

Nuclear fast red (kernechtrot) ................0,1 g
Soluo de sulfato de alumnio a 5% .....................100 mL
Aquea a soluo lentamente, at ferver. Esfriar e filtrar. Acrescente
timol para preservar.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at gua destilada.
2- Colocar em soluo de cido actico glacial a 3% e deixar
por 3 minutos.
3- Corar na soluo de alcian blue por 30 minutos.
6- Contracorar com a soluo de nuclear fast red filtrada por 5
minutos.
7- Lavar em gua corrente por 1 minuto.
Resultados:
Mucossubstncias cidas sulfatadas e carboxiladas......... azul escuro
Ncleos................................................vermelho a rosa
Citoplasma...................................................rosa-plido
Mtodo de colorao pelo alcian blue, pH 1,0

(Lev e Spicer, 1964)
Solues:
A) Soluo de cido clordrico 1N:
cido clordrico..............................................83,5 mL
gua destilada..............................................916,5 mL
B) Soluo de cido clordrico 0,1 N:

Soluo de cido clordrico 1N..............................10 mL
gua destilada..................................................90 mL
C) Soluo de alcian blue:

Alcian blue, 8GX...................1 g
Soluo de cido clordrico 0,1 N........................100 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at gua destilada.
2- Colocar na soluo cido clordrico 0,1N e deixar por 3 minutos.
3- Corar pela soluo de alcian blue por 30 minutos.
4- Retirar o excesso de corante com papel de filtro. No enxa-
guar em gua.
Resultados:
Mucossubstncias sulfatadas .....................................azul-escuro
Ao manipular vrios produtos qumicos para os mtodos de colorao, use
mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com
exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto,
evitando sempre o contato com a pele ou a vias respiratrias. Observe a
ficha de segurana de cada produto qumico utilizado para os mtodos de
colorao, muitos so danosos sade se inalados, engolidos, ou se entra-
rem em contato com a pele. Nunca descarte as solues corantes ou
qualquer soluo preparada para o desenvolvimento das coloraes em
esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de
produtos txicos de sua instituio.
7. Tcnicas imuno-histoqumicas
Os corantes auxiliam o estudo histolgico das caractersticas qumicas
teciduais e, no caso de algumas coloraes especiais, destacam regies espe-
cficas do tecido ou at mesmo classes de protenas. Contudo, para se identi-
ficar alguns elementos teciduais, em situaes normais ou patolgicas, preciso
reconhecer certas protenas especficas, o que no possvel por meio das
tcnicas histoqumicas. Para tal, recomenda-se a utilizao de mtodos imuno-
histoqumicos, que, como o prprio nome sugere, renem conhecimentos
prprios da imunologia, histologia e qumica.
A imuno-histoqumica se baseia na capacidade de certas substncias com
afinidade especfica para determinados elementos, isto , anticorpos. Os
anticorpos, ao reconhecerem especificamente uma protena-alvo, possibilitam a
identificao molecular de elementos teciduais com observao nos diferentes
tipos de microscpio.
A imuno-histoqumica tem diversas aplicaes como mtodo de auxlio
ao diagnstico de doenas inflamatrias, infecciosas e neoplasias, alm de ser
utilizada para determinar fatores preditivos e prognsticos no cncer.
O que so anticorpos?
Os anticorpos (Ac) ou imunoglobulinas (Ig) so um grupo especial de

glicoprotenas produzidas naturalmente por clulas do sistema imunolgico de
diversas espcies animais e so classificados em cinco isotipos (tipos de
imunoglobulinas): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
O antgeno uma substncia que, em condies apropriadas, capaz
de estimular a produo de um determinado anticorpo. Quando um antgeno
originrio, por exemplo, de bactrias, fungos, vacinas, penetra no organismo,
ele reconhecido como elemento estranho, desencadeando uma srie de
eventos, como a produo de anticorpos que reconhecero especificamente
esse antgeno.
O reconhecimento do antgeno pelo anticorpo ocorre de duas formas:
qumica, pela afinidade entre essas molculas; e estrutural, pois os anticorpos
possuem uma estrutura tridimensional que se adapta perfeitamente estrutura
do antgeno, realizando uma ligao designada chave-fechadura.
Ao se introduzir um antgeno especfico em um animal, este reagir contra
esse antgeno e, aps um determinado tempo, ser possvel isolar anticorpos que
reconheam o antgeno do soro desse animal. Os anticorpos so utilizados para
determinar a presena desse antgeno em um tecido de outro animal. Atualmen-
te, os anticorpos comercializados por grandes empresas so obtidos a partir de
diferentes animais, como, por exemplo: camundongo, rato, coelho, macaco,
porco, dentre outros, utilizando metodologias avanadas.
Aplicabilidade do uso de anticorpos
Os anticorpos podem ser utilizados em clulas em cultura, ou em cortes

histolgicos de tecidos processados segundo a tcnica de incluso em parafina,
em cortes obtidos pelo mtodo de congelao ou ainda includo em resina.
importante notar que, independentemente do mtodo de processamento

histolgico, deve-se ter o cuidado de preservar o antgeno no tecido, evitando
modificaes na sua conformao tridimensional ou na composio qumica.
A preservao adequada dos antgenos depende de uma boa fixao
e de um bom processamento. O fixador utilizado em imuno-histoqumica
deve ser capaz de preservar tanto a morfologia tecidual quanto o antgeno,
alm de impedir sua extrao e deslocamento durante o processamento do
material. No existe o fixador ideal; porm, deve-se conhecer o mecanismo
de ao tecidual de cada soluo fixadora para escolher o mtodo de fixao
mais adequado.
O formol, assim como os demais fixadores aldedicos, ao estabelecer
ligaes cruzadas com as protenas teciduais, torna as protenas insolveis na
forma de um gel. Essas ligaes formam uma malha que pode impedir a ligao
do anticorpo ao antgeno tecidual, alm de mudar a configurao tridimensional
dos antgenos. Quanto maior o tempo de fixao, isto , o tempo em que um
determinado tecido submetido ao fixador, mais pontes sero formadas. Por
essa razo, importante controlar o tempo de fixao necessrio para preservar
as estruturas teciduais.
Para haver reao entre o antgeno e o anticorpo em materiais fixados
por aldedos, necessrio desmascarar os antgenos, desfazendo as pontes
intermoleculares formadas durante a fixao. Com esse objetivo, utiliza-se um
procedimento denominado recuperao antignica. Existem diversos mecanis-
mos para se recuperar os antgenos em um tecido. A escolha do mtodo ideal
depende do tipo de tecido a ser analisado e da prtica do laboratrio.
Os principais mtodos de recuperao antignica so:
Mtodo enzimtico, empregando-se enzimas como a tripsina ou pepsina.
Mtodo fsico-qumico por aquecimento, utilizando-se panela de pres-

so, panela a vapor, banho-maria e micro-ondas, devendo o material
ser imerso em uma soluo de tampo citrato ou tris-EDTA.
Mtodo fsico-qumico por sonicao5, isto , realiza-se a sonicao
em tampo citrato ou tampo tris-EDTA.
A reao imuno-histoqumica deve ocorrer em temperatura e pH con-
trolados. Por essa razo, as lminas devem ser mantidas em estufa ou geladeira
durante o procedimento e os cortes cobertos por uma soluo tamponada.
Temperaturas elevadas aceleram a reao entre antgeno e anticorpo, embora
diminuam a especificidade do anticorpo ao antgeno. Temperaturas mais baixas
diminuem a velocidade da reao, aumentando tal especificidade.
Geralmente, na rotina laboratorial, utilizam-se estufas reguladas a 37C
em um tempo de reao de 1 hora, ou geladeira a 4C em um tempo de
reao de um dia para o outro (over night).
A reao imuno-histoqumica tambm pode variar dependendo do pH
do meio em que a reao ocorre. Assim, utiliza-se uma soluo de tampo
fosfato (PBS) ou tampo tris (TBS) em pH 7,0 para recobrir os cortes
durante as lavagens ou para diluir as demais solues.
Tampo fosfato (PBS) pH 7,2 0,1M:

Fosfato de sdio, dibsico (Na2HPO4), anidro..................1,48 g
Fosfato de sdio, monobsico (NaH2PO4), anidro..............0,43 g
Cloreto de sdio (NaCl)..............................................7,2 g
gua destilada......................................................1000 mL
5
Sonicao o procedimento que utiliza a energia das ondas sonoras, mais comumente o ultrassom,
aplicado sobre determinados sistemas qumicos.
Outro fator que influencia a reao a concentrao do anticorpo.

Os anticorpos devem estar diludos em uma concentrao que permita o
reconhecimento do antgeno pelo seu respectivo anticorpo, sem haver
perda de sua especificidade. Para se encontrar a diluio ideal de cada
anticorpo, deve-se proceder a um teste utilizando-se um controle positivo,
isto , um material que se tenha conhecimento prvio da sua positividade
ao anticorpo que se deseja testar. Assim, usam-se diversas diluies at se
encontrar a diluio onde a marcao seja bem evidente e no haja reao
inespecfica de modo a mascarar a reao.
Para visualizar a reao, os anticorpos devem estar marcados com alguma
substncia capaz de exibir cor. Em geral, utiliza-se um anticorpo associado a
enzimas que, em etapa posterior, reagiro com substncias cromgenas, ou
anticorpos diretamente associados a fluorforos, radioistopos ou ouro coloidal.
A tcnica enzimtica mais usual na rotina laboratorial utiliza vrias
substncias. Inicialmente, empregam-se anticorpos associados a uma vitami-
na chamada biotina (anticorpo biotinilado). Esse anticorpo reage com a
estreptavidina, uma protena que possui quatro stios de ligao. A
estreptavidina que se encontra complexada a trs molculas de biotina
ligadas enzima peroxidase reconhecer, atravs de um stio vazio, a biotina
presente no anticorpo secundrio. A peroxidase reage com o perxido de
hidrognio na presena de 3,3-diaminobenzidina (DAB), que funciona
como um doador de eltrons para a reao. O DAB reduzido se precipita
no local da reao, sendo o produto dessa reao visualizado como um
precipitado castanho (Figuras 25 e 26).
Figura 25. Repesentao da tcnica imuno-histoqumica indireta. O antgeno

presente no tecido reconhecido pelo anticorpo primrio. Um anticorpo
secundrio biotinilado se liga ao anticorpo primrio. A estreptavidina se ligar
por meio do seu stio livre biotina, que est associada a peroxidase. Uma
soluo contendo perxido de hidrognio reage com a peroxidase na presena
do DAB, formando um precipitado insolvel castanho no local da reao.
H2O2+DAB H2O2+DAB
Figura 26. Tcnica imuno-histoqumica indireta utilizando o mtodo de

estreptavidina biotina-peroxidase revelada por DAB.(A) Marcao nuclear
identificando o receptor de progesterona. (B) Marcao citoplasmtica iden-
tificando a desmina.
Existem outros mtodos enzimticos, assim como outros cromgenos,

que so relatados em literatura mais especfica.
Pode-se tambm utilizar anticorpos associados a fluorforos. As primei-
ras tcnicas imuno-histoqumicas descritas utilizavam fluorforos associados a
anticorpos como marcadores, e so utilizadas at hoje. Diversas substncias so
utilizadas com este propsito, como FITC (isotiocianto de florescena), TRICT
(isotiocianato de tetrarodamina), Alexa 488, Cy5, dentre outras, mas neces-
sitam de um microscpio de fluorescncia para visualizar a reao, o que torna
por vezes esta tcnica mais onerosa.
Normalmente, os anticorpos que fazem ligao com os antgenos teciduais
(anticorpos primrios) no esto associados a enzimas ou fluorforos. Dessa
forma, para visualiz-los, utilizam-se anticorpos secundrios complexados
peroxidase ou a fluorforos. Assim, denomina-se esse mtodo como mtodo
indireto. Contudo, h anticorpos primrios comerciais j associados com enzimas,
e, por essa razo, chama-se esse tipo de reao mtodo direto. A marcao
direta diminui o risco de reaes inespecficas pela diminuio de etapas, em
contraste com reaes indiretas, que amplificam o sinal facilitando a identifica-
o dos antgenos.
Mesmo com o cuidado na escolha da concentrao adequada dos
anticorpos e na manuteno da temperatura e do pH, podem ocorrer reaes
inespecficas com componentes teciduais carregados eletricamente ou com re-
ceptores de imunoglobulinas teciduais. Podemos eliminar essa marcao
recobrindo esses stios inespecficos antes da reao com uma soluo con-
tendo albumina e um soro.
Soluo de bloqueio de stios inespecficos :

PBS....................................................................200 mL
Leite em p desnatado....................................................5 g
Filtrar a soluo.
Soluo de uso:
Filtrado de leite 2,5%...............................................100 mL
Albumina bovina.........................................................2,0 g
Soro fetal bovino........................................................8 mL
Guardar soluo em geladeira.
Outro elemento capaz de causar reaes inespecficas a peroxidase

endgena tecidual. Esse problema s ocorre quando o mtodo escolhido o
enzimtico, pois o substrato cromgeno reagir tanto com a peroxidase ligada
ao anticorpo da reao quanto com a peroxidase tecidual. Nesse caso, deve-
mos inibir a ao da enzima, utilizando uma soluo de perxido de hidrog-
nio (H2O2) 3%.
Para garantir a sua qualidade, sempre importante incluir um controle
positivo e controle negativo da reao. O controle positivo obtido com um
material que sabidamente possui o antgeno analisado. Esse material permitir
confirmar, por sua marcao positiva, a qualidade da reao, caso as lminas
testadas forem negativas. O controle negativo feito omitindo-se o anticorpo
primrio nas lminas testadas, ou utilizando o mesmo isotipo do mesmo animal
no qual foi produzido o anticorpo primrio. Assim, com esses cuidados, o
resultado da reao permite garantir que as demais etapas da reao no esto
reconhecendo inespecificamente nenhum componente tecidual.
A seguir, segue uma sugesto de protocolo de reao indireta para
material includo em parafina. Nesse procedimento, utiliza-se a panela de
presso como equipamento para auxiliar na etapa de recuperao antignica e
um anticorpo secundrio biotinilado, isto , associado biotina.
Protocolo:
1- Aps confeccionar os cortes e aderi-los em lminas previa-
mente tratadas com adesivo, deixar o corte aderir lmina por um
dia em estufa 37 oC.
2- Desparafinizar e hidratar as lminas, deixando-as por 5
minutos em cada banho nas respectivas solues (ver pr-
etapa da colorao).
3- Colocar cerca de 2 litros de tampo citrato em pH 6,0 em
uma panela de presso. Deixar esquentar e, quando o tampo
estiver fervendo, colocar as lminas imersas no tampo e fechar a
panela. Quando a panela comear a apitar, deixar por mais 1
minuto e apagar o fogo. Aliviar a presso pela vlvula de seguran-
a da panela e deixar a panela destampada para esfriar um pouco
a soluo (cerca de 10 minutos). Aps esse tempo, lavar os
cortes em gua corrente por mais 10 minutos.
4- Lavar as lminas por 10 minutos em PBS (tampo fosfato de
sdio 0,1M em pH 7,2) trocando o tampo por duas vezes.
5- Incubar com anticorpo primrio de um dia para o outro ( over
night) em geladeira a 4C. Cobrir os cortes delicadamente com
o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida.
6- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
7- Incubar as lminas por 20 minutos em uma soluo de perxido
de hidrognio 3% em PBS.
8- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
9- Incubar com anticorpo secundrio biotinilado por 1 hora em

estufa a 37C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo,
mantendo as lminas em cmara mida.
10- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5
minutos.
11- Incubar com a estreptavidina-peroxidase por 30 minutos em
cmara mida, em temperatura ambiente.
12- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5
minutos.
13- Incubar as lminas em uma soluo contendo 10mg de DAB
diludos em 10 mL de PBS e cerca de 150 mL de perxido de
hidrognio 3%. Controlar o tempo de reao ao microscpio,
observando o precipitado castanho se formar nos locais onde o
anticorpo reagiu. Essa reao pode durar em torno de 3 minutos.
14- Lavar as lminas em gua por 5 minutos.
15- Contracorar as lminas em hematoxilina diluda por 30 se-
gundos.
16- Lavar as lminas em gua corrente por 5 minutos.
17- Desidratar, clarificar e montar.
Importante: nunca deixe secar os cortes durante a reao imuno-histoqumica!
Durante o procedimento, tomar os cuidados citados anteriormente para o
manuseio do xilol e do lcool. Manusear a panela de presso com cuidado
para evitar queimaduras ou exploses. Como o DAB um produto altamen-
te txico e tem potencial carcinognico por exposio prolongada, evite
respirar o p seco e o contato com a pele ou mucosas e sempre utilize luvas
e jaleco durante a manipulao. Esse elemento tambm txico para o meio

ambiente, despreze a soluo de DAB num frasco plstico e adicione 10 mL
de hipoclorito de sdio para cada 100 mL dessa soluo. Procure saber a
poltica de descarte de substncias prejudiciais ao meio ambiente de
sua instituio.
8. Meios de selagem
Os meios de selagem, comumente chamados montagem, podem ser
permanentes ou provisrios. Os meios permanentes so meios resinosos e
hidrofbicos, sendo necessria a completa remoo da gua do interior dos
tecidos pela desidratao e pela clarificao com o diluente do meio de sela-
gem. Os meios provisrios so meios hidroflicos e no necessitam da remoo
da gua dos tecidos, sendo os preparados descartados aps a observao ao
microscpio.
Meios de selagem hidrofbicos e permanentes

Esses meios podem ser sintticos, como o DPX e o Entelan, ou
naturais, como o blsamo do Canad ou a goma de Damar. Existem
vrios protocolos para diluio desses meios. Citaremos apenas o da
goma de Damar.
Goma de Damar.................................................200 g
Xilol.............................................................100 mL
Misturar, e esperar dissolver. Acrescentar mais goma ou xilol caso se

queira uma textura mais ou menos viscosa.
Meios de selagem hidroflicos ou provisrios
Esses meios so utilizados quando os corantes aplicados perdem a sua

capacidade tintorial, ou mesmo quando o contedo de determinadas estruturas
teciduais se altera quando os tecidos so submetidos a desidratao ou aos
meios de selagem que tem o xilol como diluente.
A seguir, citamos um dos meios de selagem hidroflicos mais utilizados,
a gelatina - glicerina, por ser de baixo custo e de fcil aplicao.
Gelatina............................................................10 g
gua destilada..................................................60 mL
Aquea at que a gelatina esteja dissolvida. Acrescente, depois, 70 mL
de glicerina.
9. Artefatos de tcnica
So alteraes das imagens de tecidos quando os preparados histolgicos
so observados ao microscpio. Isso pode ocorrer devido a manipulaes
fsicas ou qumicas durante as etapas da tcnica histolgica.
Os artefatos, por exemplo, podem ser ocasionados por:
dente na navalha de corte, causando fendas;
talco na luva utilizada pelo tcnico;
precipitado de corantes ou mesmo pigmentos que se depositaram
sobre o tecido;
retrao ou intumescimento tecidual provocado por algum componen-
te qumico do fixador;
autlise associada proliferao bacteriana devido demora em se
fixar o material;
fragmentao e/ou rachadura do tecido provocada por elevao da
temperatura da parafina durante o processamento.
dobras no tecido formadas durante a microtomia;

bolhas provocadas durante a selagem da lamnula sobre o preparado
histolgico.
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A histologia a cincia que estuda as clulas no contexto da estrutura

microscpio simples para descrever os tecidos; porm, somente duzentos anos

1. Coleta, fixao e clivagem

Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo.

Para material proveniente de trabalhos experimentais com animais em

Voc alguma vez refletiu sobre o que acontece quando esquecemos um

alcance todos os objetivos da fixao, mas deve-se investigar qual o fixador

do elemento tecidual, visando adequar o tipo de fixador com a propriedade

pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as prote-

Tratamento prvio dos cortes para a retirada do pigmento formlico

Formalina tamponada de Carson ou formalina em tampo Millonig

indicado para a microscopia eletrnica e microscopia de luz;

Formalina neutra tamponada 10%

AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:

Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferin-

A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos teci-

Figura 1. Clivagem de coluna verte- Figura 2. Clivagem com 3mm de

A reduo das dimenses do fragmento facilita a penetrao dos

para se obterem fatias delgadas de rgos compactos, como fgado,

Figura 3. Espcime clivado e acondi- Figura 4. Cassete identificado

A descalcificao, por remover os sais de clcio, se faz necessria para

A. Descalcificao por cidos

A desvantagem desse mtodo a ocorrncia de dilatao e hidrlise da

cido ntrico aquoso a 5%:

cido ntrico aquoso a 10%:

Formalina - cido ntrico:

cidos fracos - os cidos mais usados nas misturas descalcificadoras

cido frmico a 5%:

cido frmico a 5%:

Formalina cido frmico:

Mistura descalcificadora cido frmico-clordrico:

Soluo de uso: (preparar antes de usar):

cido pcrico (C6H2(NO2)3OH) - esse cido age muito lentamente

Procedimentos gerais para a descalcificao por misturas cidas:

2- O volume da mistura descalcificadora deve ser de dez a vinte vezes

Figura 5. Suspenso dos tecidos durante a descalcificao.

B. Descalcificao por resinas de troca inica

celulares, com qualidade superior aos mtodos de descalcificao por cidos.

Figura 6. Resina de troca inica.

So mtodos escolhidos quando se deseja preservar enzimas (fosfatase

Mistura de tampes - nesse procedimento, os sais de clcio so

Tampo cido ctrico-citrato (pH 4,5):

Agentes quelantes - so compostos orgnicos que se ligam ao on

Descalcificantes quelantes (EDTA)

Hilleman e EDTA de Lee:

Soluo descalcificadora EDTA em Tampo Fosfato 0,1M:

Soluo de uso do descalcificador EDTA em tampo fosfato 0,1 M:

A. Descalcificao eletroltica ou ionizao eltrica

Soluo descalcificadora eletroltica:

Figura 7. Descalcificao eletroltica.

B. Descalcificao com auxlio das micro-ondas

Deve-se imergir a pea na mistura descalcificadora de escolha e irradiar

C. Descalcificao com auxlio do ultrassom

Como possvel saber se a pea est totalmente descalcificada?

Soluo B estoque de oxalato de amnia 5%:

Soluo de uso de oxalato de amnia / hidrxido de amnia

Regras gerais para uma boa descalcificao:

a lavagem do material essencial antes da descalcificao e

Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; po-

A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as subs-

A clarificao visa remover completamente o lcool do interior dos

A infiltrao dos elementos teciduais em parafina importante, pois a