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Doq-Cgcre-8 - 02 Inmetro Validação Metodos PDF
Doq-Cgcre-8 - 02 Inmetro Validação Metodos PDF
DOQ-CGCRE-008
Reviso 02 JUNHO/2007
SUMRIO
1 Objetivo
2 Campo de Aplicao
3 Responsabilidade
4 Documentos de Referncia
5 Introduo
6 Definies
7 Questes relevantes na utilizao de mtodos analticos
8 Validade de mtodos
8.1 Validao
8.2 Comparao de mtodos
8.3 Programas interlaboratoriais
9 Planejamento de validao
10 Parmetros de validao
10.1 Especificidade e seletividade
10.2 Linearidade
10.3 Faixa de trabalho e faixa linear de trabalho
10.4 Sensibilidade
10.5 Limite de deteco
10.6 Limite de quantificao
10.7 Exatido e tendncia (bias)
10.7.1 Materiais de referncia certificados (MRC)
10.7.2 Recuperao
10.8 Preciso
10.8.1 Preciso
10.8.2 Reprodutibilidade
10.8.3 Preciso intermediria
10.8.4 Comparao da preciso entre mtodos
10.9 Robustez
10.10 Incerteza de medio
11 Documentao de mtodos validados
12 Itens revisados
1 OBJETIVO
Este documento tem como objetivo auxiliar laboratrios na tarefa de demonstrar que um mtodo
de ensaio qumico, nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a
obteno de resultados com a qualidade exigida.
2 CAMPO DE APLICAO
3 RESPONSABILIDADE
4 DOCUMENTOS DE REFERNCIA
Diretiva Parte 2 : 2007 Regras para a Estrutura e Redao de Documento Tcnico ABNT
ASTM D 5172:1991(2004) Standard Guide for Documenting the Standard Operating Procedures
used for the Analysis of Water.
Bruce, P., Minkkinen P., Riekkota M.L. Practical Method Validation: Validation Sufficient for
an Analysis Method. Mikrochim. Acta. 128, 93-106. 1998.
CFR Title 40 - Part 136 - Guidelines Establishing Test Procedures for the Analysis of Pollutants
Appendix B Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit.
Revision 1.11.
EAL.- P11. Validation of Test Methods - General principles and concepts. EAL European
cooperation for Accreditation of Laboratories. 1997.
EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. 1st ed. 1998.
GARFIELD, F.M. Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories. AOAC. Arlington.
1997.
GREEN, J.M. A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996.
(68) 305A-309A
ISO 3534-1:1993 - Statistics - Vocabulary and Symbols - Part 1: Probability and general
statistical terms.
ISO 3534-2:1993 - Statistics - Vocabulary and Symbols - Part 2: Statistical quality control.
ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results - Part
1: General principles and definitions.
ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results - Part
4: Basic Methods for the Determination of the Trueness of a Standard Measurement method.
ISO 78-2:1999 Chemistry Layout for standards Part 2: Methods of chemical analysis.
LGC / VAM In-House Method Validation - A Guide for Chemical Laboratories. 2003.
NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation
and Verification of Chemical Test Methods. 1997.
RELACRE. Guia Relacre 13. Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica.
Portugal. 2000.
5 INTRODUO
fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para demonstrar, por
meio da validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e
adequados qualidade pretendida. Se um mtodo existente for modificado para atender aos
requisitos especficos, ou um mtodo totalmente novo for desenvolvido, o laboratrio deve se
assegurar de que as caractersticas de desempenho do mtodo atendem aos requisitos para as
operaes analticas pretendidas.
O laboratrio, ao empregar mtodos de ensaios qumicos emitidos por organismos de
normalizao, organizaes reconhecidas na sua rea de atuao ou publicados em livros e/ou
peridicos de grande credibilidade na comunidade cientfica, necessita demonstrar que tem
condies de operar de maneira adequada estes mtodos normalizados, dentro das condies
especficas existentes nas suas instalaes antes de implant-los.
6 DEFINIES
6.1 Validao
Comprovao, atravs do fornecimento de evidncia objetiva, de que os requisitos para uma
aplicao ou uso especficos pretendidos foram atendidos. (ABNT NBR ISO/IEC 9000).
O laboratrio deve estar ciente dos requisitos da Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025 para a
seleo de mtodos de ensaios (item 5.4.2), desenvolvimento de mtodos de ensaio pelo
laboratrio (item 5.4.3), utilizao de mtodos no normalizados (item 5.4.4) e validao de
mtodos (item 5.4.5).
Quando o laboratrio utilizar mtodos normalizados, ser necessrio verificar se os dados de
desempenho declarados so adequados ao propsito do ensaio e, se necessrio, fazer declarao
de competncia. No caso do mtodo normalizado, se no declarar dados de desempenho
relevantes para a aplicao em questo, o laboratrio deve comprovar a sua competncia.
8.1 Validao
Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso pretendido, o
laboratrio deve validar:
Mtodos no normalizados;
Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio;
Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos;
Ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
O processo de validao de um mtodo deve estar descrito em um procedimento, e os estudos
para determinar os parmetros de desempenho devem ser realizados com equipamentos e
instrumentos dentro das especificaes, funcionando corretamente, adequadamente calibrados e
validados. Do mesmo modo, o operador que realiza os estudos deve ser competente na rea de
estudo e precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho sendo capaz de tomar as decises
apropriadas durante a realizao do estudo.
9 PLANEJAMENTO DA VALIDAO
10 PARMETROS DE VALIDAO
Vrios testes e suas estatsticas correspondentes podem ser utilizados para o estudo da
seletividade dependendo da disponibilidade do analito, da matriz sem o analito e de amostras de
referncia nas concentraes de interesse. Se a matriz da amostra sem analito ou um grupo
satisfatrio de amostras de referncia esto disponveis, podem ser aplicados os testes F
(Snedecor) de homogeneidade de varincias e o teste t (Student) de comparao de mdias, ou
ento realizada a anlise dos desvios em relao aos valores de referncia. Normalmente, parte-
se da hiptese em que a matriz no afeta o sinal do analito em nveis de concentraes elevados
ou acima da faixa. Preparam-se dois grupos de amostras de teste, um com a matriz e o outro
sem, ambos os grupos com a concentrao do analito idntica em cada nvel de concentrao de
interesse. O nmero de amostras paralelas em cada nvel de concentrao deve ser maior ou
igual a 7 (sete) para permitir o uso adequado dos modelos estatsticos e proporcionar uma
comparao vlida. Primeiro, faz-se o teste F para verificar se as varincias das amostras podem
ser consideradas iguais, calculando-se:
s12
F calclado = s22 (1)
onde s12 e s22 so as varincias de cada amostra, com a maior varincia no numerador. Ao
mesmo tempo, obtm-se o valor de Ftabelado, com (n1-1) graus de liberdade no numerador e (n2-1)
graus de liberdade no denominador; usualmente, adota-se um nvel de confiana de 95%. Tem-se
dois casos:
(I) se F calculado for menor que o F tabelado, as varincias podem ser consideradas iguais, isto
, a matriz no tem um efeito importante sobre a preciso do mtodo na faixa de concentrao
em estudo. Neste caso, os desvios-padro dos grupos de testes podem ser agrupados e a
igualdade das mdias dos dois conjuntos de amostras pode ser testada com a distribuio t de
Student.
Desse modo, calculam-se:
a) x1 e x 2 = mdias das respostas dos analitos em amostras com matriz e sem
matriz, respectivamente, na mesma faixa de concentraes;
x1 x2
tcalculado = (2)
1 1
s 2 +
n1 n2
(n1 1) s 21 + (n 2 1) s 22
onde s =2
e n1 e n2 so os tamanhos das amostras 1 e 2.
(n1 + n 2 2)
O valor de ttabelado obtido a partir da tabela da distribuio de Student para (n1 + n2 2) graus de
liberdade e a confiana desejada.
(II) se F calculado for maior que o F tabelado, as varincias no podem ser consideradas iguais,
ou seja, a matriz tem um efeito importante sobre a preciso do mtodo na faixa de concentrao
em estudo, e o tcalculado :
x1 x2
t calculado = (3)
s12 s 22
+
n1 n2
=
(s 2
1 n1 + s 22 n 2 ) 2
-2
(4)
(s2
1 n1 ) + (s
2 2
2 n2 ) 2
n1 + 1 n2 + 1
x n
t calculado = d (5)
sd
onde:
[(d ]
n 2
d i2 ) x d
xd =
n
(d i1 d i 2 ) sd = i =1
i1
(6) e (7)
i =1 n n 1
Nas equaes, x d = mdia das diferenas entre as respostas dos pares de analitos;
d i1 , d i 2 = respostas do analito para o par de amostras com matriz e sem matriz; s d = desvio
padro das diferenas e n = nmero de pares. O valor de t tabelado obtido da distribuio t de
Student com (n-1) graus de liberdade e a confiana desejada.
Se o valor de t calculado for menor que o t tabelado, pode-se concluir que a matriz no afeta o
ensaio. Se o valor de t for maior que o t tabelado, pode-se concluir que a matriz tem um efeito
estatisticamente significante sobre o resultado do ensaio.
Se a matriz sem o analito no estiver disponvel, a seletividade pode ser testada comparando-se
as inclinaes das curvas de adio padro. Isto feito preparando-se dois grupos de amostras
que contenham a mesma adio de analito para cada nvel de concentrao. Um grupo inclui a
matriz da amostra (contendo um nvel bsico do analito) e o outro grupo no inclui a matriz de
amostra. Os resultados destas amostras podem ser representados em um mesmo grfico em
funo da concentrao de analito adicionado. Se as inclinaes destas duas curvas de regresso
linear forem as mesmas, o nico efeito de matriz presente a interferncia natural causada pelo
nvel bsico do analito.
Outros testes so encontrados na literatura e podem ser bastante teis para a aplicao dos dados
dos laboratrios.
10.2 Linearidade
Linearidade a habilidade de um mtodo analtico em produzir resultados que sejam diretamente
proporcionais concentrao do analito em amostras, em uma dada faixa de concentrao. A
quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta medida e a concentrao do
analito. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como expresso
matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na amostra real.
y = ax + b (8)
Onde:
y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);
x = concentrao;
a = inclinao da curva de calibrao = sensibilidade;
b = interseo com o eixo y, quando x = 0.
A linearidade de um mtodo pode ser observada pelo grfico dos resultados dos ensaios em
funo da concentrao do analito ou ento calculada a partir da equao da regresso linear,
determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados.
O coeficiente de correlao linear (r) freqentemente usado para indicar o quanto pode ser
considerada adequada a reta como modelo matemtico.
resduo
t calculado = sr n
(9)
onde:
resduo = |xmedido xcalculado|
sr = desvio padro dos resduos
n = nmero de pontos
Se o valor de t calculado para um ponto duvidoso de uma curva de calibrao for menor ou igual
ao valor de t unilateral, para a confiana desejada e (n-1) graus de liberdade, considera-se que o
ponto pertence curva e a faixa at ele linear:
A maioria dos equipamentos de deteco existentes estabelece a sua faixa dinmica linear.
necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de concentrao do analito coincide com a
faixa dinmica linear e assegurar que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na
resposta.
Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo aps qualquer
transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descrita por uma funo adequada da
concentrao do analito na amostra.
10.4 Sensibilidade
Sensibilidade um parmetro que demonstra a variao da resposta em funo da concentrao
do analito. Pode ser expressa pela inclinao da reta de regresso de calibrao, conforme a
equao (10) e determinada simultaneamente com os testes de linearidade.
dx
S= (10)
dc
Onde:
S = sensibilidade;
dx = variao da resposta;
dc = variao da concentrao.
Calcular a varincia (s2 ) e o desvio padro (s) das medies em replicata e calcular o LD como a
seguir:
LDM = t ( n 1, 1 ) . ( s ) (11)
Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus de liberdade de uma matriz
de branco da amostra com adio da menor concentrao aceitvel do analito. Para esses graus
de liberdade, o valor de t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143
vezes o desvio padro.
O mtodo analtico deve ser especificado e o LD para cada analito deve ser expresso nas
unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra
usada para determinar o LD deve ser identificada.
Onde:
Uref incerteza associada ao valor verdadeiro
10.7.2 Recuperao
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras adicionadas com
quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser adicionadas com o analito em
pelo menos trs diferentes concentraes, por exemplo, prximo ao limite de deteco, prximo
concentrao mxima permissvel e em uma concentrao prxima mdia da faixa de uso do
mtodo. A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est
necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena de analitos adicionados
em uma forma mais facilmente detectvel pode ocasionar avaliaes excessivamente otimistas
da recuperao.
A recuperao calculada segundo:
C C2
Recuperao (%) = 1 100 (15)
C3
onde: C1 = concentrao determinada na amostra adicionada,
C2 = concentrao determinada na amostra no adicionada,
C3 = concentrao adicionada.
10.8 Preciso
Preciso um termo geral para avaliar a disperso de resultados entre ensaios independentes,
repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, em condies definidas.
normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as duas formas mais
comuns de express-la so por meio da repetitividade e a reprodutibilidade, sendo usualmente
expressas pelo desvio-padro.
Ambas repetitividade e reprodutibilidade, so geralmente dependentes da concentrao do
analito e, deste modo, devem ser determinadas para um diferente nmero de concentraes e, em
casos relevantes, a relao entre preciso e a concentrao do analito deve ser estabelecida. O
desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%) pode ser mais til neste caso,
pois foi normalizado com base na concentrao e deste modo ele praticamente constante ao
longo da faixa de interesse, contanto que esta no seja muito grande:
DPR = DP/CMD x 100
Onde:
DP = desvio padro;
CMD = concentrao mdia determinada
10.8.1 Repetitividade
o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas de um mesmo mensurando,
efetuadas sob as mesmas condies de medio, chamadas de condies de repetitividade, a
seguir:
Mesmo procedimento de medio;
Mesmo observador;
Mesmo instrumento usado sob mesmas condies;
Mesmo local, e
Repeties em curto espao de tempo.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica da disperso
dos resultados e pode ser determinada por meio da anlise de padres, material de referncia ou
adio a branco em vrias concentraes na faixa de trabalho. Sugere-se 7 ou mais repeties
para o clculo do desvio padro para cada concentrao, chamado desvio padro de
repetitividade.
r = t 2 . Sr (16)
r = 2,8 . S r (17)
10.8.2 Reprodutibilidade
o grau de concordncia entre os resultados das medies de um mesmo mensurando, efetuadas
sob condies variadas de medio.
Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao de mtodo executado por um
nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio busca a verificao do
desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de
comparao interlaboratorial.
Preciso sob condies de reprodutibilidade, por exemplo, onde resultados dos ensaios so
obtidos com o mesmo mtodo, variando-se laboratrios, operadores ou equipamentos
denominada preciso intermediria (ver 10.8.3).
A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite
de reprodutibilidade R, o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da
duplicata das amostras analisadas sob condies de reprodutibilidade significante.
R = t 2 . SR (18)
R = 2,8 . S R2 (19)
(y )
t n
1 2
Si ( j , k ) = jk yj (20)
t (n 1) j =1 k =1
Onde: Si( ) - desvio padro de preciso intermediria (onde os smbolos relativos s condies
intermedirias de preciso podem aparecer entre parnteses, ex: Si (T.O.) significa tempo e
operadores diferentes)
t total de amostras ensaiadas (no confundir com o t de Student);
n total de ensaios efetuados por amostra;
j n da amostra, j = 1, t
k n do ensaio da amostra j, k = 1, n
yjk valor do resultado k para a amostra j
y j - representa a mdia aritmtica dos resultados da amostra j.
Nesse caso, a determinao da preciso feita por meio de t valores de n ensaios de amostras ou
padres. A preciso intermediria baseia-se na disperso entre ensaios. recomendado que o
valor t (n-1), seja, pelo menos, igual a 15.
Quando n = 2 a equao (17) toma a forma:
1 t
Si ( j , k ) = . ( y j1 y j 2 ) 2 (21)
2.t j =1
1 n
Si ( j , k ) = ( yk
n 1 k =1
y)2 (22)
em que Si ( ) o desvio padro de preciso intermediria relativo a esse grupo, onde os smbolos
relativos s condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O)
significa tempo e Operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando
comparado com os anteriores.
Onde:
n n de amostras / padres;
y k - cada resultado obtido;
y - representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.
Recomenda-se a leitura da Norma ISO 5725-3 para aprofundar conhecimento nesta rea. Na
Norma ISO 5725-6 so expostos vrios exemplos prticos de estimativa e controle da preciso
intermediria, por meio de grficos de controle.
Na Tabela 4, est apresentado um resumo da determinao da repetitividade, reprodutibilidade e
preciso intermediria.
10.9 Robustez
A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas
variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes
que possam ocorrer quando esse est sendo executado.
Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden. Trata-
se de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a
influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de
cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for a robustez de um mtodo,
maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso.
Nesse mtodo so realizados 8 ensaios, separados para determinar os efeitos da variao das 7
diferentes etapas, no procedimento analtico. As oito medies podem ser realizadas numa
ordem aleatria. Para ilustrar, a Tabela 5 mostra um exemplo dos efeitos das alteraes nos
fatores a serem determinados.
Se a combinao 1 for ensaiada, o resultado ser s. Se a combinao 2 for ensaiada ser t e assim
sucessivamente at que todas as 8 combinaes tenham sido ensaiadas. Para determinar a
variao de um fator, encontrar os 4 valores correspondentes s letras maisculas e as 4
minsculas e comparar as mdias dos dois grupos. Por exemplo, ao calcular as alteraes de C
s+u+w+ y t+v+x+z
para c, usar os resultados: e .
4 4
12 ITENS REVISADOS
Reviso 01
Includo texto complementando o item 11.1.2 e introduzindo os itens 11.2 e 11.2.1 (incio),
que foram inadvertidamente suprimidos na edio da reviso anterior.
Reviso 02
Reviso geral do documento.
-------------
Tnia Simes
EMBRAPA / CTAA
Vanderla de Souza
INMETRO / Diviso de Metrologia Qumica
Albert Hartmann
Millennium Chemicals
Vera Harcar
Rede de Tecnologia do Rio de Janeiro
Srgio Motta
SENAI / CETIND
Hlio Lionel
Especialista em Qumica do Petrleo
Kikue Higashi
Especialista em Qumica Ambiental
Reginaldo Ramos
Especialista em Qumica Ambiental
Walderez Bindilatti
Qumica
__________________________
Kikue Higashi
Especialista em Qumica Ambiental
Paulo Afonso
Ph. D., Estatstico
Renata M. Borges
INMETRO / Diviso de Credenciamento de Laboratrios