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Práticas Micro Geral PDF
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DISCIPLINA
MICROBIOLOGIA GERAL
• O avental ( ou jaleco ) é de uso obrigatório. Não será permitida a entrada do aluno no laboratório em
horário de aula ou fora dela sem o mesmo.
• O laboratório deve ser um recinto calmo, os alunos devem evitar conversar e sair de seus lugares
desnecessariamente.
• Em caso de algum acidente, comunicar imediatamente ao professor. No caso de quebra, durante a
manipulação com tubos ou placas contendo meios contaminados, não remover os fragmentos quebrados,
deixando-os no local. Na ausência do professor, verter sobre estes formol, avisando o professor ou
monitor o horário do acontecido para após transcorrido o tempo necessário para que o formol mate os
microrganismos, o material seja removido e o local devidamente limpo.
• Sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após terminar o trabalho prático.
• Não fumar, não comer e nem levar à boca qualquer objeto. No laboratório de microbiologia trabalha-se
com microrganismos potencialmente patogênicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma
possível contaminação ( a boca é porta de entrada para muitas infecções ).
• Na bancada de trabalho não deve haver acúmulo de objetos, nela permanecendo apenas os
indispensáveis para o experimento em execução, além do roteiro e caneta ou lápis para as devidas
anotações. Todo material do aluno deverá ficar nas estantes que se encontram nos laboratórios.
• Durante os trabalhos, manter o bico de gás aceso somente quando necessário.
• As alças e agulhas de platina, pinças, estiletes, cotonetes, tubos contendo os meios de cultura, reagentes
e corantes, etc., devem ser colocados nos suportes apropriados e não abandonados sobre a bancada de
trabalho.
• As pipetas usadas, lâminas e lamínulas (quando for o caso), etc., devem ser colocados em recipientes
apropriados contendo solução desinfetante ou detergente.
• Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo as placas de Petri e os tubos de ensaio
contendo meios de cultura ou soluções, deverão ser devidamente identificados para observações
posteriores.
(Estes devem conter: disciplina, data, curso, equipe, microrganismo ou material utilizado)
• Antes de qualquer observação microscópica, devem ser verificadas as condições em que se encontra o
microscópio.
• Após o uso do microscópio, desligar a lâmpada, retirar a lâmina usada e quando for o caso, dispensá-la
na cuba apropriada. Limpar as objetivas com algodão embebido em xilol ou benzina e depois com um
algodão seco ou flanela.
• Terminado o trabalho prático, deixar a bancada em ordem.
• O material contaminado nunca deve ser colocado na bancada, pia ou lixo. Deve voltar ao recipiente de
onde foi tirado para ser esterilizado.
OBS: Cada aula prática deverá iniciar-se com uma explicação e um período de demonstração. O trabalho
não deve ser iniciado pelo aluno, até que haja recebido todas as instruções necessárias.
Os alunos deverão adquirir para seu uso individual o seguinte material, que deverá acompanhá-lo
impreterivelmente em todas as aulas práticas:
♦ Isqueiro ou caixa de fósforos.
♦ Caneta para retroprojetor azul ou preta ( para identificação do material ).
♦ Pinça inoxidável.
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Constituição Do M.O.C.
Atualmente, o microscópio óptico composto (M.O.C.) é constituído por duas partes – uma
parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes
constituintes do microscópio (fig. 1).
Ocular
Tubo Revólver
Objetiva
Coluna
Platina
Diafragma
Condensador
Fonte de luz
Pé
A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica. Esta parte é
constituída por:
Braço ou Coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes
constituintes do microscópio.
Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas
de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de
objectiva.
Fonte Luminosa – existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada
(iluminação artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminação natural).
Posição do Observador
- Se o M.O.C. possuir uma ocular, deve olhar por ela com o olho esquerdo, mantendo os
dois olhos abertos. Se o M.O.C. tiver duas oculares, deve olhar por ambas.
Focalização
- Deve-se pegar no M.O.C. pelo braço, com a mão direita, enquanto se suporta a base
com a mão esquerda;
- Não se deve tocar no sistema óptico com os dedos;
- A lente das objetivas não deve tocar na lamela;
- O M.O.C. deve estar completamente pousado numa mesa desocupado, e afastado da
borda da mesa.
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Material Necessário
Objetivos da aula
A) B)
C) D)
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B) COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS
COLORAÇÃO DIFERENCIAL:
Nesta coloração utilizamos geralmente 2 corantes, além do mordente e do diferenciador. Baseia-se na
diferença química existente entre as bactérias e consequentemente na reação diferente que as bactérias
podem apresentar frente a um determinado corante. É utilizada para distinguir diferentes tipos de bactérias.
Os métodos de Gram (1884) e de Ziehl-Neelsen (1882) são exemplos de coloração diferencial.
lo com uma gota de água destilada ou salina estéril (colocada anteriormente sobre a lâmina com auxílio de
uma alça de platina estéril) até obter-se uma leve opalescência. Espalhar com movimentos circulares até
formar uma fina camada sobre a lâmina. Deixar a lâmina secar ao ar, em repouso. A secagem ao ar evita a
formação de aerossóis que acontecem quando fixamos a lâmina antes que a mesma esteja seca. Os
aerossóis se constituem de fonte de contaminação, pois nestes estão contidos os microrganismos presentes
no material.
Após seca, a lâmina deverá ser fixada, antes de iniciarmos o processo de coloração. A fixação
evita que as células dos microrganismos sejam lavadas e perdidas durante o processo de coloração. Além
disto, a fixação permite a aderência das células à lâmina, matando os microrganismos através da coagulação
seus protoplasmas, preservando suas estruturas na forma e posição originais. O calor é o método de fixação
freqüentemente utilizado. Para fixarmos, passamos a lâmina com o esfregaço voltado para cima, por três
vezes através da chama. Evitar o super aquecimento testando a cada passada a temperatura da lâmina no
dorso da mão.
SOLUÇÕES EMPREGADAS:
1- CRISTAL VIOLETA - função: corante principal ( cora igualmente todas as bactérias )
2- LUGOL ( solução de iodo-iodeto de potássio) - função: mordente. O mordente tem a finalidade de
aumentar a afinidade do corante pela célula, permitindo que ela se core mais intensamente.
3- ÁLCOOL ETÍLICO - função: agente descorante e diferenciador. Sua utilização permite que algumas células
se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de descoloração é que diferencia as
bactérias.
4-- FUCSINA DILUÍDA - função: corante de contraste, corante secundário ou contracorante. É o corante que
dá às células descoradas uma cor diferente daquelas que mantêm a cor do corante principal.
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Os microrganismos que não se descoram facilmente retêm a cor do corante principal ( cristal
violeta ) enquanto que aqueles que se descoram facilmente poderão ser visualizados, pois corar-se-ão com o
corante de contraste ( fucsina. ).
TÉCNICA:
1º- Cobrir o esfregaço já fixado com solução de Cristal Violeta por um (1) minuto.
2º-Escorrer o cristal violeta, lavar em fio d’água e cobrir o esfregaço com Lugol por um (1) minuto.
3º-Escorrer o lugol, lavar em fio d’água .
4º- Descorar rapidamente com Álcool Etílico ( +/- 20 segundos)
5º-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregaço com fio d’ água.
6º-Cobrir o esfregaço com Fucsina diluída por 30 segundos.
7º-Lavar e secar com papel filtro, pressionando o esfregaço cuidadosamente.
8º-Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observar ao microscópio, utilizando a objetiva de
imersão.
RESULTADO: Bactérias coradas em roxo ( cor do cristal violeta ) - GRAM POSITIVAS
Bactérias coradas em vermelho ( cor da fucsina ) - GRAM NEGATIVAS
IMPORTÂNCIA :
a)Prevenir transmissão de doenças.
b)Prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos.
c)Prevenir a deterioração e danos de materiais pelos microrganismos.
OBJETIVOS: remoção, inibição ou morte dos microrganismos através da ação de agentes físicos e químicos.
CALOR:
a) Calor Seco:
1- Forno de Pasteur (forno de ar quente): ação esterilizante (causa a morte por promover: a oxidação das
proteínas que constituem o microrganismo).
- Condições de esterilização: de 150 a 170° C, de 1 a 2 horas
- Utilização: esterilização de substâncias imiscíveis em água (como pós, óleos etc.), instrumentos
cortantes (tesouras, bisturis, agulhas hipodérmicas e etc.) e vidrarias limpas e secas (placas de Petri,
seringas de vidro, pipetas, balões, tubos de ensaio).
b) Calor Úmido:
1- Autoclavação: realizada em autoclaves (aparelhos que utilizam vapor saturado sob pressão). Ação
esterilizante. Causa a morte por promover a desnaturação das proteínas que constituem os microrganismos.
- Condições para esterilização: 121° C por 15 a 30 minutos a 1 atmosfera a mais de pressão.
- Substâncias miscíveis com água (meios de cultura, solução salina, água, etc.), cotonetes, luvas de
látex (cirúrgica), sondas, cateteres, gaze, rouparia, material contaminado, etc.
OBS: utilizada apenas em materiais que não se alteram com a temperatura.
2- Ebulição: água à temperatura de 100°C por um tempo de 30 minutos. Causa desnaturação protéica,
eliminando apenas formas vegetativas.
4- Vapor Fluente Fracionado - Tyndalização : submeter ao vapor fluente contínuo por 3 vezes, com intervalo
de 12 a 18 horas após cada execução, tomando-se o cuidado de não abrir o recipiente onde está
acondicionado o material. Elimina formas vegetativas e esporuladas. Causa a morte por promover a
desnaturação de proteínas dos microrganismos.
- Uso: soluções (vitaminas, carboidratos) e materiais que não suportam temperaturas acima de
100ºC.
1- Radiações Não Ionizantes - raios Ultra-Violeta: baixo poder de penetração: λ longo (carreia menos
energia). Utilizado apenas em superfícies. Causam danos ao DNA levando a formação de dímeros de
pirimidina (mutação).
- Utilizado: eliminação de microrganismos em superfícies.
2- Radiações Ionizantes - raios X e raios Gama : alta penetrabilidade. λ curto (muita energia). Promovem a
b) Aldeídos e derivados: atua alquilando grupamentos funcionais das proteínas como aminas,
carboxilas e hidroxilas, formando hidroximetilderivados inativos.
Mais empregados: aldeído fórmico (concentração: 3 - 8%) e aldeído glutárico a 2%.
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c) Fenóis e derivados: Atua sobre proteínas a uma concentração de 0.2 a 1%. Bastante tóxico.
Mais empregados: cresóis (metacresol é um dos isômeros mais ativos). A creolina (mistura de cresóis) é
utilizada na desinfecção de pisos, vasos sanitários, excrementos, etc.
INDICADORES DE ESTERILIZAÇÃO:
- Substâncias com ponto de fusão conhecidos :Ácido Benzóico (121°C) e Uréia (125°C).
- Cultura de microrganismos esporulado: Bacillus stearothermophilus
- Fitas indicadoras de esterilização.
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ANTISSEPSIA DA PELE
Várias substâncias químicas são utilizadas no processo de anti-sepsia da pele. Dentre estas,
encontramos o iodo, álcool, triclosan e clorexidina como uma das mais utilizadas.
O iodo é um halogênio que exibe sua ação sobre os microrganismos através de diferentes
mecanismos de ação quais sejam: promovendo inativação enzimática ou como oxidante, causando assim sua
morte, Atua como bactericiada, fungicida e esporocida, combinando-se irreversivelmente com proteínas,
através de interação com aminoácidos aromáticos (fenilalanina e tirosina). As soluções alcoólicas contendo
2% de iodo exercem ação imediata.
Os Álcoois: anti-sépticos ou desinfetantes. Atua sobre formas vegetativas promovendo a precipitação
e desnaturação de proteínas. É mais eficiente à 70%, pois as proteínas celulares são mais facilmente
desnaturadas na presença da água.
O gluconato de clorexidina é um Anti-séptico químico, Antifúngico e um bactericida capaz de eliminar
tanto bactérias gram-positivas quanto as gram-negativas, no entanto mostra-se menos eficiente com os
microrganismos gram-negativos. Também é um bacteriostático, impedindo a proliferação de bactérias.
Acredita-se que o mecanismo de ação ocorra através da ruptura da membrana celular, e não pela inativação
por ATPase como pensava-se anteriormente.
Gluconato de clorexidina
Triclosan ou triclosano é um agente anti-séptico efetivo contra bactérias gram negativas, bem como
gram positivas. É eficaz também contra fungos e bolores. É encontrado em medicamentos, sabonetes, loções
e cremes dentais. Apresenta boa tolerância para uso na pele e cavidade bucal em baixas concentrações.
Triclosan
OBJETIVO: utilizar uma solução de iodo, álcool, triclosan e clorexidina sobre uma porção da pele com a
finalidade de reduzir a microbiota , eliminando quase todos os microrganismos presentes.
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TÉCNICA:
Dividir o fundo da parte externa da placa como auxílio de uma caneta de retroprojetor, escrevendo de
um lado “ salina “ e do outro “ iodo, álcool, triclosan ou clorexidina “. Depois proceder como segue:
1º: molhar o cotonete em solução fisiológica ( salina ) e esfregá-lo no dorso de uma das mãos, em uma área
de + ou - 4 cm ( girando sempre o cotonete ).
2º: Semear com este cotonete a metade da placa, no lado correspondente à “salina.”
3º: Com a outra extremidade da haste ( não utilizada ) deste mesmo cotonete, embebê-la na solução de iodo
e esfregá-la sobre o dorso da outra mão em área de + ou _4 cm. AGUARDAR 5 ( CINCO ) MINUTOS PARA
QUE O IODO POSSA ATUAR SOBRE OS MICRORGANISMOS DA PELE, ELIMINANDO-OS.
4º: Pegar o outro cotonete e molhá-lo em solução fisiológica, esfregando-o sobre a área onde foi passada a
solução de iodo, álcool, triclosan ou clorexidina.
5º: Semear com este cotonete a outra metade da placa, no lado correspondente ao “iodo, iodo álcool,
triclosan ou clorexidina”.
6º: Levar a placa identificada para ser incubada na estufa a 37ºC por 24 horas. Após esse prazo retornar ao
laboratório para complementar seu experimento, conforme instruções abaixo.
Fazer leitura da placa após 24 horas de incubação, concluir o resultado e realizar um Gram das diferentes
colônias crescidas dos dois lados da placa, descrevendo o observado.
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MEIOS DE CULTURA
OBJETIVO: Técnica para a execução dos meios de cultura; tipos de meios empregados para o isolamento e
identificação de microrganismos ( bactérias e fungos ).
MEIO DE CULTURA:
Os microrganismos possuem um ciclo natural na água, solo, ar, na nossa superfície corporal e de
outros animais etc. Estes microrganismos conseguem sobreviver à custa de materiais orgânicos e inorgânicos
existentes nestes ambientes. O ciclo artificial (meio de cultura) é o modo que empregamos em laboratório
para cultivarmos os microrganismos. Chamamos de meio de cultura ao conjunto de substâncias necessárias
ao crescimento e multiplicação dos microrganismos
No ciclo artificial tentamos reproduzir as condições naturais fornecendo:
A - Substâncias nutritivas em concentrações adequadas, que devem servir como:
- fonte de energia - fonte de nitrogênio
- fonte de carbono - fonte de sais e íons
- fonte de enxofre e fósforo - fatores de crescimento
- doador de elétrons - receptor de elétrons
Finalidade:
- Meios de enriquecimento: aumentam a possibilidade de crescimento da espécie desejada, quando a mesma
se encontra em pequeno número.
- Meios indicadores (ou diferenciais): revelam uma propriedade bioquímica, permitindo uma identificação
presuntiva.
- Meios seletivos: impedem o crescimento de determinados grupos num inóculo misto, mas permite o
desenvolvimento de outros.
- Meios seletivos-indicadores: revelam uma propriedade bioquímica e selecionam grupos
de bactérias.
- Meios de triagem: empregados para separar bactérias da mesma família.
- Meios de transporte: garantem por mais tempo a viabilidade dos microrganismos que não podem ser
semeados logo após a coleta e que poderiam morrer.
- Extratos: de carne e de levedura. Concentrados aquosos desidratados que servem como fonte de:
carboidratos, vitaminas, compostos orgânicos nitrogenados e sais.
- Peptonas: derivados da hidrólise ácida ou enzimática de proteínas de origem animal ou vegetal (peptona de
caseína, peptona de soja) que servem como fonte de N orgânico, vitaminas, carboidratos, enxofre, fósforo,
cálcio e magnésio.
- Agar-agar: polissacarídeo obtido a partir de algas rodofíceas. Função: agente solidificante, cujo P.F.= 95° C
e o P.S.= 45° C. Não tem função nutritiva.
- NaCl: mantém o equilíbrio osmótico do meio e serve como fonte dos íons Na e Cl.
- Água: umidade e fontes de íons.
Isolamento de um microrganismo:
O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura (colônias isoladas de um único
microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material ).
Finalidades do isolamento:
. Identificação de um microrganismo.
A simples observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação
dos microrganismos. Para isto lançamos mão da análise de uma série de características destes como:
características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas características está na
dependência do microrganismo que se pretende identificar.
1- Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a
alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador).
2- Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado ( que deverá
estar na mão esquerda ) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER
SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO.
3- Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria.
4- Flambar novamente a boca do tubo e fechar.
5- Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar.
6- Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar.
7- Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.
OBS: Para a realização da semeadura utilizando-se inóculos pesados não diluídos, a técnica é a mesma que
a descrita anteriormente, só que ao invés de interrompermos o processo uma vez para flambarmos a alça, o
faremos duas vezes.
AGAR MAC-CONKEY:
Finalidade: meio de cultura seletivo-indicador, utilizado para isolamento de enterobactérias ( bacilos Gram
negativos ) a partir de fezes, urina, líquor, alimentos, água residual, etc.
FÓRMULA:
Peptona de caseína cristal violeta
Peptona de carne agar-agar
Lactose água destilada
Mistura de sais biliares
Cloreto de sódio
Vermelho neutro pH: + ou - 7.1
FUNDAMENTOS:
1) Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota Gram-positiva por ventura existente
no material (seletividade para Gram-negativo).
2) A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradação (
fermentação ) deste carboidrato ( o que é feito por apenas parte dos membros desta família). Quando ocorre
a fermentação, a bactéria é classificada como Lac +.
LEITURA:
• Colônias lactose-positiva (Lac. +) : degradação ( fermentação ) da lactose com acidificação do meio que
produzirá colônias de cor rosa com halo central mais claro. Ex.: E. coli, Klebsiella, Enterobacter.
• Colônias lactose-negativa (Lac. -): não utilização da lactose, formação de colônias incolores e
transparentes. As colônias assumem a coloração do meio, que se apresentará um pouco alterado, devido
a utilização dos outros componentes ( só não utilizará a lactose) . Ex.: Proteus, Salmonella, Shigella.
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METABOLISMO DE CARBOIDRATOS
1- Fermentação de carboidratos:
Algumas bactérias são capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacarídeos até glicose), e metabolizar a
glicose até ácidos (com ou sem liberação de gás) e/ou álcoois.
Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) glicose ác. pirúvico ácidos, álcoois e gases.
Meio utilizado: meio de cultura indicador que contém: caldo simples + carboidrato + indicador de pH (indicador
de Andrade ) + tubo de Durhan.
TÉCNICA:
a) repicar o microrganismo já isolado para o meio contendo o carboidrato e incubar em estufa a 37° C por
24 horas.
b) Leitura: observar se houve produção de ácidos (viragem da cor do meio) com ou sem produção de gás
(formação de bolha no interior do tubo de Durhan).
2- Prova do citrato:
Muitas bactérias são capazes de utilizar o citrato (ác. orgânico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono
.A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe várias denominações, dentre elas, citratoliase e citrilase.
Os produtos de clivagem são acetato e oxaloacetato, este último sendo subseqüentemente convertido em
Piruvato e CO2 , por uma oxalacetato descarboxilase.
Meio utilizado: Citrato de Sódio + H2O + Indicador de pH ( azul de bromotimol ). O pH final do meio após
preparo: 6.8 .
Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente ácido ( 6.8 ) e azul em pH acima de 7,6.
Técnica: repicar o microrganismo já isolado no meio do citrato e incubar na estufa a 37° C por 24 horas.
Leitura: - teste positivo: meio de cultura azul (a bactéria utilizou o citrato, liberando CO2,)
- teste negativo: meio inalterado ( verde ): bactéria não utilizou o citrato.
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METABOLISMO DE PROTEÍNAS
TÉCNICA:
Semear com agulha ( picada até + ou - 1/3 do tubo ) a bactéria já isolada para o meio SIM. Incubar em estufa
a 37ºC por 24 horas. Após incubação, adicionar de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs e proceder a leitura.
FUNDAMENTO:
1- Produção de Indol: degradação do tryptofano
2- Produção de H2S:
Cistina: aminoácido que contém enxofre (S). Degradação da cistina com liberação de H2S.
2. INDICAÇÕES:
Para microrganimos isolados e identificados como os agentes causadores da infecção;
quando o microrganismo causador da infecção apresenta, estatisticamente, grande variabilidade no
espectro de resistência ou tendência à mesma.
Ex.: Enterobactérias, Staphylococcus aureus, Pseudomonas.
3. DISPENSADO:
Para microrganismos, cuja sensibilidade não apresenta variação ao longo do tempo.
Ex.: Neisseria meningitidis e Streptococcus do grupo A (sensíveis à penicilina G),
Salmonella typhi (sensível ao cloranfenicol)
4. TIPOS DE TESTE:
5.5. VALIDADE E CONSERVAÇÃO DOS DISCOS: observar sempre: a data de validade, a umidade e a
temperatura ideal de armazenamento
MÉTODO DE KIRBY-BAUER
Método de difusão em meio de cultura sólido pelo sistema de discos únicos. Padronizado pela OMS
em 1977.
Características necessárias ao meio de cultivo para TSA:
• O meio de cultivo, sem enriquecimento, deve sustentar o bom crescimento dos organismos em
teste.
• Não deve possuir substâncias que antagonizem os antibióticos testados.
• Deve ser resistente a mudanças de pH durante o período de incubação.
• Deve permitir o acréscimo de sangue quando o organismo em teste exigir.
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• Meio não deve conter carboidratos fermentáveis porque o pH ácido estimula as ciclinas (enquanto
que o pH alcalino estimula aminoglicosídeos e macrolídeos).
• O pH do meio deve manter-se entre 7,2 e 7,4.
O meio Miller – Hinton satisfaz parcialmente estas exigências, sendo recomendado por diversos
autores.
Quando usado para o teste de difusão, deve ser adicionado às placas em quantidade suficiente para
que solidifique com uma espessura de 4 mm.
MATERIAL:
. suspensão bacteriana em caldo ( concentração: 108 células/mL).
- É recomendado um inóculo correspondente ao padrão 0,5 da escala de MacFarland.
. placa contendo meio de cultura padrão: Agar Müeller-Hinton
. cotonete estéril ( para a semeadura)
. discos de papel contendo os antimicrobianos ( em concentrações padronizadas )
Escala de MacFarland:
Preparar solução de ácido sulfúrico a 1%.
Preparar solução aquosa de cloreto de bário a 1,175%.
Lentamente, e sob constante agitação, adicionar as quantidades indicadas a 10 tubos previamente
preparados.
Fechar os tubos hermeticamente, conservando-os à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
O precipitado de sulfato de bário, quando ressuspendido, corresponde à densidade conferida por cultivo de E.
coli em meio líquido, nas concentrações relacionadas na tabela:
0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2(ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4(ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Concentração 1,5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
(x108/ml)
O inóculo pode ser obtido de formas variadas:
• Selecionar 4 – 5 colônias desenvolvidos em meio sólido e que apresentem o mesmo tipo morfológico.
Transferir estas colônias para o meio líquido.
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• Obter suspensão bacteriana em salina estéril ou em meio líquido a partir de colônias que se tenham
desenvolvido em meio sólido.
Utilizar tantas colônias quantas forem necessárias para a obtenção da turvação visível.
Ajustar a turvação com salina estéril ou meio líquido até obter a concentração desejada.
Obs: Esse método é recomendado especialmente para bactérias que se desenvolvem com dificuldade em
meio líquido.
TÉCNICA:
. retirar a suspensão bacteriana contida no tubo com o cotonete , tomando o cuidado de retirar o excesso de
caldo , comprimindo a haste contra a parede do tubo;
. semear a suspensão na placa contendo o Agar Müeller-Hinton, em três planos, para que haja crescimento
confluente;
. deixar a placa secar entreaberta durante no máximo, por 15 minutos, em frente à chama;
. colocar os discos de papel com o auxílio de uma pinça flambada, resguardando um espaço de 2 cm do disco
para a borda da placa e de 3 cm entre um disco e outro;
. esperar de 20 a 30 minutos para que ocorra a difusão do antimicrobiano, antes que o microrganismo
comece a se desenvolver;
. levar à estufa a 35 ou 37º durante 12 a 18 horas;
. após a incubação, promover a leitura e interpretação.
OBSERVAÇÕES:
OBS: Staphylococcus sp., o período de incubação deve ser prolongado até 24 horas, visando detecção de
cepas meticilina resistentes (O.R.S.A.).
Incubação em atmosfera de microaerofilia não é recomendada, uma vez que o CO2 proporciona acidificação
da superfície do meio de cultivo.
Organismos que requerem CO2 para seu desenvolvimento devem ser testados (N. gonorrhoeae, N.
meningitidis, H. influenzae) no ambiente solicitado, ainda que, idealmente, o procedimento deva ser
acompanhado por teste paralelo com cepa padrão.
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Leituras:
Resultados quantitativos expressos em concentração inibitória mínima.
Resultados qualitativos como sensível, intermediário, resistente.
Interpretação de antibiogramas recomendada pelo NCCLS:
Sensível (S): Uma infecção por determinada cepa pode ser tratada apropriadamente com dosagem
de agente antimicrobiano recomendada para aquela infecção, salvo qualquer outra contra – indicação.
Intermediária (I): A CIM dos agentes antimicrobianos aproximam-se dos níveis plasmáticos e
tissulares habituais. Pode apresentar uma resposta menor que a das cepas sensíveis.
Resistentes (R): Cepas não são usualmente inibidas por concentrações sistêmicas avaliadas do
agente.
Seleção de antimicrobianos:
• Antimicrobianos devem ser os mais adequados para o microrganismo isolado e o sítio da infecção.
• Devem ser adequados ao hospital ou à instituição.
• Orientações publicadas anualmente pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory
Standards).
Controle de qualidade:
• Utilização de cepas padrão para verificação dos testes.
• Cepas padrão ATCC (American Type Culture Collection).
Exemplos:
E. coli ATCC 25922 β - Lactamase negativa para controle de discos para enterobactérias.
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Guia para realização do teste de avaliação da resistência pelo método de difusão em disco:
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1 - INTRODUÇÃO:
1.1 - IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DOS FUNGOS
Os fungos são seres vivos e apresentam uma característica marcante que é a ubiqüidade, ou seja, se
encontram amplamente disseminados na natureza, onde desempenham efeitos benéficos (manutenção do
equilíbrio dos diversos ecossistemas, participação no ciclo de vida na terra, fertilização do solo, etc.) e
maléficos (causando doenças e deteriorando alimentos e materiais) para a humanidade. Ressalta-se também
a utilização desses microrganismos em indústrias de alimento e bebidas (queijo, pão, vinho, cerveja, etc.),
farmacêutica (antibióticos, hormônios, alucinógenos) e química (enzimas, ácidos orgânicos, vitaminas,
pigmentos, etc.). Os fungos são também largamente usados como ferramentas em pesquisa básica de
genética, fisiologia, bioquímica, entre outras.
O habitat natural desses microrganismos é bastante variado, permitindo classificá-los como
anemófilos (fungos do ar), geofílicos ou telúricos (do solo), aquáticos (da água), zoofílicos (de animais),
antropofílicos (do homem) e fitofílicos (de vegetais). Portanto, é possível promover o isolamento desses
microrganismos de qualquer um destes locais, ou de materiais como madeira, couro, alimentos e detritos de
um modo geral. Para isto, é necessário que sejam fornecidas condições ambientais e nutrientes adequados
para promover o desenvolvimento destes microrganismos nos meios de cultura.
3 - IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS
A identificação dos fungos se baseia principalmente em características morfológicas (macro e
microscópicas), reprodutivas e metabólicas.
A tabela de identificação macromorfológica dos fungos (em anexo) poderá servir de base para tal descrição.
. Observação da micromorfologia
Os alunos deverão fazer observação microscópica dos fungos focalizados, analisando as
características e diferenças de micélio, órgãos de reprodução (corpo de frutificação) e esporos. Anotar (ou
desenhar) as características observadas. Correlacionar os dados da micromorfologia dos fungos focalizados
com os tipos expostos em culturas. Muitos fungos expostos nas culturas estão igualmente focalizados nos
microscópios.
Coleta de material
Os alunos deverão escolher um ambiente para investigar a presença de fungos anemófilos. Neste
local, as placas de Petri contendo agar Sabouraud deverão ser abertas e expostas ao ar, por
aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas serão fechadas, identificadas e incubadas à
temperatura ambiente.
. Descrição da micromorfologia:
A colônia de fungo anemófilo escolhida será agora analisada sob o aspecto microscópico, utilizando a
técnica de fragmento de colônia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superfície da colônia
escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes serão colocados sobre uma lâmina, juntamente com 1 gota
de lactofenol e cobertos por lamínula. Em seguida, observar ao microscópio no menor, médio e maior
aumento. Anotar (ou desenhar) as características observadas. Estes dados poderão permitir a identificação
do fungo escolhido.
OBS: Esta tabela tem por finalidade orientá-lo na verificação das principais características macromorfológicas
que deverão ser observadas. Entretanto, não significa que a colônia que você deseja identificar tenha todos
os itens descritos acima, e além disto, para cada item poderá ser observada mais de uma característica. (por
exemplo: a superfície de uma colônia poderá ser ao mesmo tempo: lisa, pastosa e brilhante).