UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE – UNIVALE

NÚCLEO DA SAÚDE

MICROBIOLOGIA BÁSICA
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS

Professora Responsável:
Profa. Dra Monique Ellen Torres Resende

Técnica: Thais Silveira Pereira

Governador Valadares - MG
 Sumário

Normas para trabalho no laboratório de Microbiologia ............................................................. 3

Normas para uso do Microscópio. ...............................................................................................4

Prática 01. Ubiquidade dos Microrganismos. ........................................................................... 5

Prática 02. Morfologia microscópica de bactérias/ Coloração pelo método de gram. ..............7

Prática 03. Respiração de Microrganismos. ............................................................................ 10

Prática 04. Estudo do metabolismo dos microrganismos/ Processo de obtenção de energia -

Fermentação ............................................................................................................................. 12

Prática 05. Estudo dos Fungos ................................................................................................ 16

Prática 06. Crescimento e titulação de Vírus Bacteriano ........................................................ 19

Prática 07. Controle da População Microbiana .......................................................................21

Referências de Estudo .............................................................................................................. 24

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 NORMAS PARA TRABALHOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

01. É conveniente a leitura das aulas práticas antes da realização das mesmas e é
indispensável o roteiro de aula prática em todas as aulas.
02. Os alunos deverão adquirir para uso individual o seguinte material:
a) Fósforo ou isqueiro (para uso do bico de gás).
b) Caneta para retroprojetor
03. É obrigatório o uso de jaleco, sem o qual não será permitida a permanência do aluno no
laboratório.
04. Os alunos deverão observar os horários e estarem sempre munidos do material solicitado
(item 2).
05. O laboratório deve ser um recinto calmo. Os alunos devem ocupar sempre o mesmo lugar,
evitando falar em voz alta e sair, desnecessariamente, de seus lugares.
06. No caso de acidentes comunicar imediatamente ao professor.
07. As alças, pinças, pipetas, meios em tubos, etc. devem ser colocados nos suportes e não
abandonados sobre a mesa.
08. As pipetas usadas, lâminas, lamínulas, etc. devem ser colocadas em recipientes
apropriados, com solução desinfetante, que encontram-se sobre as mesas.
09. Ao acender o bico de gás, aproximar primeiro, a chama ao bico, e em seguida abrir a
torneira e mantê-lo aceso somente quando necessário.
10. As alças, agulhas e espátulas de repicagem devem ser flambadas antes e após a sua
introdução nos tubos de cultura. Estes deverão ter as suas bocas flambadas apos a retirada da
rolha e, também antes de recolocá-la.
11. Na mesa de trabalho não deve haver acúmulo de objetos, nela permanecendo apenas os
indispensáveis para a experiência em execução.
12. Não ingerir alimentos e nem fumar dentro do laboratório.
13. Os meios de cultura semeados devem ser devidamente identificados e mantidos sobre a
mesa para que o professor possa levá-los para a estufa.
14. Os alunos serão avaliados com relação aos trabalhos práticos desenvolvidos diariamente.
15. Antes de qualquer observação microscópica devem ser verificadas as condições em que se
encontra o microscópio (abertura do diafragma, posição do condensador, tipo de objetiva,
etc).
16. Após o uso do microscópio, limpar as lentes com algodão fino.
17. Terminado o exercício prático, lavar e guardar a cuba de coloração e deixar a mesa em
ordem.

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18. Nunca deverá colocar material contaminado nas pias.
19. Sempre lavar as mãos com água e sabão após terminar o trabalho.

NORMAS PARA O USO DO MICROSCÓPIO

A) Focalização com objetivas 10 x e 40 x

1) Ligar a lâmpada, fazer coincidir os raios luminosos sobre o espelho.
2) Centrar a objetiva, verificar posição do condensador e do diafragma, para se obter o
campo do microscópio bem iluminado.
3) Colocar a lâmina preparada na platina do microscópio e com a objetiva de 10 x em
posição de foco, abaixar o canhão do microscópio por meio do parafuso macrométrico até o
aparecimento da imagem.
Com o parafuso micrométrico ajustar a sua nitidez.
4) Sem mover o canhão e a platina do microscópio, mudar a objetiva de aumento 10 x
para a objetiva de 40 x. Se houver necessidade, ajustar a iluminação e o foco.

B) Focalização com objetiva de Imersão

1) Idem (A).
2) Idem (A).
3) Suspender o condensador ao máximo, abrir todo o diafragma, verificar se o campo
do microscópio está todo iluminado.
4) Colocar a lâmina, com urna gota de óleo de imersão sobre o esfregaço, na platina do
microscópio.
5) Com a objetiva de imersão em posição de foco, abaixar o canhão do microscópio,
mergulhando-a no óleo até o aparecimento da imagem. Com o parafuso micrométrico ajustar
a nitidez da imagem.

NOTA IMPORTANTE:
1) Para focalizar lâmina de fungos use objetiva de 40 x sem óleo de imersão, com o
condensador baixo e diafragma totalmente aberto.
2) Para focalizar lâmina de bactérias, use objetiva de 100x com óleo de imersão,
condensador alto e diafragma totalmente aberto.

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PRÁTICA Nº 01: UBIQUIDADE DOS MICRORGANISMOS

01 - INTRODUÇAO:
Não há parte da biosfera onde não se encontrem microrganismos. Na grande maioria
dos casos, fazem parte do ecossistema, onde exercem profundas influências no equilíbrio
biológico, e conseqüentemente, na preservação, da natureza - nestes casos são chamados de
autóctones, ou nativos. No solo (em qualquer parte do globo terrestre), nas águas, na
superfície externa e interna do organismo animal (pele, boca, estômago, intestino), na
superfície externa de vegetais e, em certos casos, no interior de seus tecidos estão os
microrganismos presentes, permanentemente ou transitoriamente.
São encontrados, inclusive, na atmosfera, embora sem alguma atividade, pois para que
possam manter-se em atividade, é necessário que estejam em contato com o substrato de onde
retiram os nutrientes de que necessitem. No entanto, a demonstração da existência de
microrganismos na atmosfera é de grande importância e de aplicação em diferentes campos de
atividade do microbiologista (na medicina, na indústria, na agricultura, nas técnicas
microbiológicas, etc.). Quanto mais movimentado e populoso é o ambiente, mais rico em
microrganismos que podem ser disseminados pela movimentação do ar e pelas correntes
aéreas.

02 - OBJETIVO:
a) Demonstrar a existência de microrganismos em diferentes ambientes do Campus II da
UNIVALE.

03 - MATERIAL:
• Agar simples em placa.
• Agar Sabouraud em placa.

04 - EXECUÇÃO:
a) Deixar placas de Petri com meio de cultura Agar simples e outra com Agar Sabouraud
expostas ao ar durante 5 minutos e 15 minutos.
b) Identificar as placas em relação à turma, mesa, nº do lugar. Deixa-las sobre a mesa para
serem guardadas a temperatura ambiente, até a aula seguinte, quando serão examinadas.

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05 - RESULTADO:
Contar o nº de colônias de bactérias e fungos e preencher o quadro abaixo.
Meios de Tempo de Numero de Colônias
cultura exposição Fungos Bactérias TOTAL
Placas com 5 mim
Agar Simples 15 mim
Placas de 5 mim
Ágar
Sabouraud 15 mim

06 - COMENTÁRIO:
O microbiologista deve conduzir seu trabalho de forma e evitar que bactérias e fungos
do meio ambiente interfiram no seu trabalho.
A exposição de culturas em placa e tubos, por tempo prolongado e principalmente
distante da área estéril da chama do bico de gás favorece a contaminação; da mesma forma
que a tosse e a conversa, quando se repica uma cultura ou se manipula meios e material
esterilizado, ou quando se opera em campo cirúrgico.
O material empregado em bacteriologia, micologia e virologia passam por um ciclo
ininterrupto de fases, cada uma com uma serie de particularidades.

07 – ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:
a) Em que parte de sua casa você acha que tem mais microrganismos e onde existem menos?
b) Qual a importância dos resultados dessa prática?
c) Esta técnica permite a demonstração de todos os microrganismos presentes nos ambientes
estudados?
d) Qual a sua conclusão sobre a prática?

08 - PADRAO DE DESEMPENHO:
Reconhecer e diferenciar colônias de bactérias e fungos.

09 - CONTEUDO DE ENSINO:
Morfologia macroscópica de bactérias e fungos.

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PRATICA Nº 02: MORFOLOGIA MICROSCÓPICA DE BACTÉRIAS
COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

01 – INTRODUÇÃO:
A morfologia da bactéria é urna característica fundamental inicial para a sua
identificação. Além das suas formas fundamentais (esféricas, em bastão e em espiral) são
também de particular interesse a dimensão e o modo de agrupamento das células bacterianas.
O comportamento dessas células frente a diferentes corantes, isto e, a reação físico-química
entre o material celular e os corantes pode fornecer valiosa contribuição à identificação de
uma espécie bacteriana. Entre os vários métodos de coloração de bactérias, o Método de
Gram e o mais empregado na rotina bacterioscópica, pois permite observar a forma, o tipo de
agrupamento bacteriano, à determinação do tamanho da célula, e fornece ainda informação a
respeito do comportamento do material celular frente a corantes básicos, com a vantagem de
ser de fácil execução.

02 - OBJETIVO:
a) Reconhecer microscopicamente a morfologia das bactérias e classifica-las quanto à
coloração de Gram.

03 - MATERIAL:
• Bateria de corantes para coloração de Gram.
• Lâminas.
• Placas com bactéria Gram positiva e Gram Negativa.

04 - EXECUÇÃO:

Exame Bacteriológico
a) Ascender o Bico de Bunsen.
b) Com o auxilio de uma alça de platina previamente flambada e fria retirar uma alíquota
(amostra) do material da placa e coloca-lo sobre a lâmina, fazer um esfregaço, deixa-lo secar
ao ar, em seguida iniciar a coloração de Gram.
c) Flambar novamente a alça de platina e coloca-la no suporte.

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MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM (com modificações de Burke e Kopeloff-Beerman)
01- Fazer um esfregaço e deixá-lo secar ao ar,
02- Fixar o esfregaço passando a lâmina sobre a chama do bico de gás (bico de
Bunsen), 3x seguidas.
03 - Cobrir o esfregaço com solução de CRISTAL VIOLETA, acrescenta: 5 gotas de
solução de BICARBONATO DE SÓDIO e deixar atuar por 2 a 3 minutos.
04 - Lavar o esfregaço com água cobri-lo com LUGOL e deixar atuar por 2 minutos.
05 - Lavar novamente, e descorar com ACETONA-ÉTER (tempo delicado) Lavar
novamente com água após o uso de ACETONA-ETER.
06- Cobrir o esfregaço com solução de FUCSINA, por 30 segundos.
07 - Lavar, secar ao ar e examinar com lente de imersão (100 x).

05 - RESULTADO E CONCLUSÃO:
Organismos gram positivos corados em azul, gram negativo corados em vermelho.
Desenhe as formas bacterianas observadas no esfregaço, os tipos de agrupamentos
presentes e a cor que tomaram após a coloração, indicando o aumento de 40x e de 100x para
cada uma.

Gram Positiva Gram Negativa

06 - COMENTÁRIOS:
A primeira informação que se deve obter de uma bactéria, é a forma que possui e se é
Gram positiva ou Gram negativa.
Sendo uma informação primordial, e necessária para que a coloração seja bem feita,
com bons reagentes para que a informação seja fidedigna.
A coloração deve ser feita com cultura jovem, observando sistematicamente o tempo

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de atuação de cada reagente.
Uma bactéria Gram positiva, em cultura velha, pode apresentar-se Gram negativa ou
um descoramento muito rápido ou intenso pode a1terar informação.
A adição de solução de bicarbonato de sódio ao cristal violeta e descoramento pela
mistura de acetona-éter são modificações do método original, que impedem a passagem de
certas bactérias Gram positiva (as Gram lábeis) a Gram negativas. As bactérias Gram
positivas, devido a sua constituição química estrutural, principalmente de parede, retém o
complexo iodo-pararosanilina, não se descorando pela ação do solvente acetona-éter.
Ao contrário, as bactérias Gram negativas não retendo o complexo iodo-
pararosanilina, quando submetidas à ação do solvente orgânico são decoradas e novamente
coradas pelo corante de fundo, a fucsina.
Entre os métodos de coloração o de Gram é o mais usado, porque cora a maioria das
bactérias, permitindo, ainda, a sua divisão em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram
negativas.

07 – ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:
a) Qual a importância da visualização dos microrganismos e de detalhes de sua estrutura no
estudo dos mesmos?
b) Qual a importância da coloração de Gram na prática de bacteriologia?
c) Qual a sua conclusão sobre a prática?
d) Faça um desenho explicando a Coloração de Gram.

08 - PADRAO DE DESEMPENHO:
Identificar microscopicamente todos os tipos morfológicos de bactérias e classificar quanto à
coloração de Gram.

09 - CONTEUDO DE ENSINO:
Morfologia e citologia de bactérias e mecanismo da colorada de Gram.

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PRÁTICA Nº 3: RESPIRAÇÃO DE MICRORGANISMOS

01 - INTRODUÇÃO:
O conceito de respiração em microbiologia é muito mais amplo do que em organismos
superiores. Aqui, a respiração está relacionada com a oxidação de metabólitos, resultando na
captação de energia pelo organismo. Em última análise nas oxidações biológicas, o oxigênio
atua como um aceptor de elétrons e prótons.
Compostos que atuam como aceptores de elétrons e prótons podem tomar o lugar do
oxigênio em várias oxidações, sendo os mesmos reduzidos nas reações.
Oxidações e reduções bacterianas são fenômenos associados e podem ser estudados
juntos. Quase todas as oxidações em células vivas podem ser explicadas baseadas na remoção
de hidrogênio ao invés da adição do oxigênio.
As bactérias são capazes de reduzir alguns corantes como o azul de metileno,
resazurina, cloreto de trifenil tetrazólio (T.T.C.) e outros. A reação ocorre
intracelularmente ou na superfície celular. A velocidade do descoramento para uns corantes e
o aparecimento de cor para outros, é proporcional a população microbiana.
O emprego do T.T.C. para verificar a presença de células viáveis, apresenta vantagens
sobre outros corantes, pelo fato da reação ser irreversível, o que não acontece com outros
como o azul de metileno, que se reoxila facilmente.

02 - OBJETIVO:
Verificar a viabilidade de culturas bacterianas utilizando o azul de metileno e T.T.C.

03 - MATERIAL:
• Solução de azul de metileno e T.T.C.
• Cultura de E. coli.
• Pipetas.

04- EXECUÇÃO:
a) Colocar 1 mL de solução de azul de metileno em um dos tubos de cultura de E. coli. Deixar
sobre a mesa (observar o descoramento após 10 minutos).
b) Colocar 1 mL de solução de T.T.C. no outro tubo de cultura de E. coli. Deixar sobre a
mesa, observar o aparecimento de uma cor rósea após 10 minutos.

05 - RESULTADO:

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 Observar a mudança de cor do azul de metileno e do T.T.C. e anotar.

06 – ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:
1) O que você concluiu da prática?
2) Compare seu resultado com os de seus colegas. O tempo gasto para ocorrer à reação foi o
mesmo? Explique. O que você pode supor em relação à velocidade de reação e a população
microbiana (quantitativamente)?
3) Quanto ao tipo de respiração, considerando presença e/ou ausência de oxigênio, as
bactérias são classificadas em: .
Você saberia classificar a bactéria utilizada na aula prática quanto à respiração?
4) Explique o que são bactérias aeróbicas e anaeróbicas.

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PRATICA Nº 04: ESTUDO DO METABOLISMO DOS MICRORGANISMOS
PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENERGIA - FERMENTAÇÃO

01 - INTRODUÇÃO:
Técnicas de cultivo e ação de bactérias sobre carboidratos.
As etapas seguintes, após a identificação morfológica de uma bactéria e o seu
isolamento e a verificação de algumas propriedades bioquímicas.
O isolamento de bactérias de crescimento rápido, e feito em placas de Petri,
semeando-se por esgotamento ou por incorporação.
O isolamento de bactérias de crescimento lento, e feito em tubos, colocando-se aos
meios de cultura inibidores para microrganismos de crescimento rápido.
Quando o material contém um baixo número de bactérias que se deseja isolar, antes de
isolá-las, semeia-se o material em meio de enriquecimento.
Nos meios de enriquecimento há uma prévia multiplicação, aumentando a
probabilidade de isolamento nos meios seletivos e seletivos indicadores (meios de
isolamento). Obtendo-se colônias isoladas, estas são transferidas para meios sólidos ou
líquidos em tubos com auxílio de agulhas ou alças em ganchos (para fungos), a fim de se
obter a cultura pura. Em seguida, se necessário, as culturas puras são repicadas em meios
especiais para estudo de suas propriedades bioquímicas ou determinação da sua
patogenicidade “in vitro” podendo, ainda, ser inoculadas em animais de laboratório para a
verificação de sua ação patogênica.
A incubação das bactérias aeróbias estritas faz-se na tensão normal de oxigênio; a das
microaerófilas faz-se em meio contendo substâncias redutoras como o tioglicolato de sódio.
Para as bactérias anaeróbias, substitui-se o O2 por um gás inerte, geralmente uma mistura de
N2 (95%) e CO2 (5%).
Um artifício de uso freqüente em bacteriologia para reduzir o O2 é o de colocar o
material juntamente com uma vela acesa e um algodão úmido em recipiente hermeticamente
fechado (dessecador de vidro ou jarras de anaerobiose - jarras de GASPAK).
Uma bactéria de crescimento rápido produz um apreciável número de células num
período de 6 a 24 horas, enquanto uma de crescimento lento leva de 2 a 60 dias.

Técnica de cultivo e ação de bactérias sobre proteínas

Vários substratos protéicos são utilizados para identificação dos microrganismos como
peptonas, leite, gelatina, etc. Além da ação de microrganismos sobre substratos protéicos
observa-se o tipo de ataque verificado como: coagulação do leite, liquefação da gelatina,

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liberação de produtos finais (indol e H2S provenientes da ação enzimática sobre aminoácidos
como triptofano e cisteina, respectivamente).

Liquefação da gelatina:
A liquefação da gelatina e produzida por enzimas extracelulares denominadas
gelatinoses. A presença dessas enzimas pode ser demonstrada pela inoculação de
microrganismos em meio de gelatina que são geralmente, incubados 37º C durante 48 a 72
horas. Como a gelatina se liquefaz a esta temperatura, é necessário que se coloque os tubos de
cultura na geladeira, para então, proceder-se à leitura da hidrólise.

Produção de Indol:
É um composto produzido pela ação de algumas bactérias sobre o triptofano. A
formação de indol a partir da triptofano se deve a presença de uma enzima; a triptofanase que
depende do piridoxal fosfato para a sua ação.

Produção de Gás Sulfídrico:

Cistina e metionina são os dois aminoácidos que contem enxofre. Sob o ponto de vista
bacteriológico, a cistina e de ocorrência mais comum e mais importante. Nem todas as
proteínas contem cistina. De modo geral, as proteínas utilizadas para produção de peptona
contem quantidades apreciáveis de cistina.
Alguns microrganismos são capazes de produzir H2S a partir desse aminoácido. O
primeiro passo nessa reação e a redução de uma molécula de cistina a duas de cisteina. Pela
ação da enzima cisteina-desulfidrilase ocorre à liberação de H2S.
O gás sulfídrico e evidenciado nos meios de cultura, pela propriedade que tem de
reagir com metais pesados (Fe, Bi, Co, Ni, Pb, que são comumente usados) formando sulfetos,
que são pretos.
Dois métodos são usados:
a) incorporação de sais ao meio de cultura
b) uti1ização de tiras de papel de filtro impregnadas com sais.
Será empregado o ultimo método (tiras embebidas em acetato de chumbo).

02 - OBJETIVO:
a) Verificar a ação metabólica de bactérias sobre diferentes substratos.
b) Relacionar o produto final obtido dessa ação metabólica com o tipo de metabolismo
realizado pela bactéria.
c) Executar corretamente as técnicas de inoculação de microrganismos em meios de cultura.

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03 - MATERIAL:
Tubos de ensaio com meios de cultura contendo: glicoses, lactose, amido, citrato de
sódio, gelatina, leite, água peptonada.
Tubos de ensaio com caldo simples inoculados com E. coli e Proteus.

04 - EXECUÇÃO:
Com o auxílio de uma alça de platina previamente flambada e fria, retirar amostra de
uma cultura de E. coli ou Proteus e inocula em cada meio de cultura abaixo relacionado.
Após cada inoculação e necessário flambar a alça de platina, esfriar para se fazer outra
inoculação. Os tubos de cultura só deverão ser abertos próximo ao bico de gás para evitar
contaminação.
Meios de cultura:
a) Caldo glicosado
b) Caldo lactosado
c) Meio de Simons (citrato de sódio)
d) Meio MIO
e) Meio SIM
(No meio Indol (MIO e SIM) são adicionadas 5 gotas do reativo de Kovac’s).
Após a inoculação identificar os tubos: TURMA, MESA, LUGAR e deixa-los sobre a
mesa para serem incubados a 37º C.
Leitura dos resultados na próxima aula.

05 - RESULTADOS:
Complete o seguinte abaixo com os resultados obtidos da ação dos microrganismos
sobre os substratos (colocar a cor e se teve formação de gás).

Bactéria Caldo glicosado Caldo lactosado Citrato de MIO SIM

sódio

E. coli

Proteus

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06- ATIVIDAE DE CONCLUSÃO
a) Quando se deseja verificar a ação de microrganismos sobre um determinado tipo de
substrato e importante observar os seguintes itens:
-Qual a natureza química do substrato
-Como ele e assimilado
-Que tipo de nutriente ele pode fornecer a célula bacteriana
-Que via metabólica estaria envolvido em sua utilização
-Como se pode evidenciar a utilização desse substrato pelo microrganismo.
Tente responder os itens acima relacionados para cada um dos substratos testados.
b) O que você concluiu da pratica?
c) Cite as características gerais das enterobactérias.
d) Quais os aspectos fisiológicos?
e) Cite mais 5 gêneros da família enterobacteriaceae.
f) Como é feito a diferenciação dos gêneros e espécies?
g) Explique os testes realizados.

07 - PADRÃO DE DESEMPENHO:
Executar corretamente todos os passos de inoculação de microrganismos em meios de cultura.
Explicar as alterações ocorridas nos meios de cultura.

08 - CONTEÚDO DE ENSINO:
Metabolismo dos microrganismos.

09 - COMENTÁRIO:
Meios básicos (água peptonada, caldo simp1es, Agar simples) são aqueles que
oferecem os elementos essenciais para o crescimento de microrganismos pouco exigentes
nutricionalmente, e servem de base aos meios de cultura enriquecidos (Agar sangue, caldo
soro, etc.), empregados no cultivo de microrganismos exigentes. Meios de enriquecimento são
aqueles que facilitam o crescimento de urna espécie em relação às outras.
Meios de isolamento são, geralmente, seletivos e indicadores empregados para
obtenção de colônias isoladas, com a finalidade de separar espécies de microrganismos
diferentes. Meios especiais são empregados para triagem de microrganismos, estudos das
propriedades bioquímicas, produção de toxinas, de enzimas, etc.
Embora se disponha de vários substratos naturais e sintéticos para obtenção de meios
de cultura bastante enriquecidos, alguns microrganismos ainda não são cultiváveis “in vitro”.

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PRÁTICA Nº 05: ESTUDO DOS FUNGOS
a) Morfologia macroscópica e microscópica dos fungos
b) Reprodução dos fungos

01 - INTRODUÇÃO:
Com relação ao aspecto das colônias bacterianas e importante observar: tamanho,
consistência, transparência, presença de pigmento, produção de enzima quando se usa meios
especiais para este fim, ex. produção de hemolisina em Ágar sangue, etc.
As colônias têm um crescimento limitado, a não ser quando são móveis. E quando
produzem pigmento apresentam cor uniforme. Em relação ao aspecto das colônias de fungos
observa-se: tamanho, consistência, coloração de centro e bordas, de verso e reverso. As hifas
dos fungos miceliais têm crescimento progressivo até o esgotamento da reserva nutritiva.
Portanto, colônias destes fungos têm diâmetro muito grande em relação às colônias de
bactérias e fungos 1eveduriformes.
As colônias de fungos podem apresentar cores diferentes nas bordas e centro, do verso
e reverso, durante o seu desenvolvimento.
As colônias bacterianas podem ser definitivamente identificadas desde o momento em
que possam ser observadas a olho nu. As colônias de fungos dependem de uma seqüência de
observações até que apareçam as estruturas de reprodução.
Os fungos podem se reproduzir por processos: sexual, assexuado ou ambos. A
reprodução assexuada é a mais freqüente entre os fungos, na classe dos Deuteromicetos ou
fungos imperfeitos, só há este tipo de reprodução.
Reprodução assexuada e aquela que se faz a partir de uma célula sem envolver núcleo
e citoplasma de outra célula, ocorrendo por:
1 - Cissiparidade
2 - Brotamento
3 - Artrosporos
4 - Clamidosporos
5 - Conídias: a) Microconídias
b) Macroconídias
Quando há formação de esporos (conídia) na reprodução assexuada estes variam em
forma e tamanho, podendo ser moveis ou imóveis, endógeno ou exógeno, dependendo do
gênero e espécie a que pertence o fungo.

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 Reprodução sexuada é aquela que se faz envolvendo a união de núcleo e citoplasma de
duas células, através de:
1 - Zigosporos
2 - Ascosporos
3 - Basidiosporos
Em micologia a reprodução dos fungos e deimportância fundamental na sistemática
dos mesmos. A identificação de um fungo depende unicamente da morfologia e das estruturas
de reprodução sexual ou assexuada ou de ambas.

02- OBJETIVOS:
a) Reconhecer e diferenciar microscopicamente colônias de fungos leveduriformes e
filamentosos.
b) Identificar microscopicamente as estruturas somáticas e reprodução dos fungos.

03- MATERIAL:
• Placas de petri com meios de cultura - Agar simples e Agar sabouraud - previamente
expostas ao ar.
• Lâminas prontas com estruturas de fungos.
• Lâminas para serem preparadas e lamínulas.
• Lactofenol.

4 - EXECUÇÃO:
1 - Observar a olho desarmado o aspecto das colônias de fungos que cresceram nos meios de
cultura e anotar.
2 - Observar ao microscópio em lâminas prontas, as seguintes estruturas dos fungos: hifas
septadas, asseptadas, leveduras, macroconídias, microconídias, gêmula, clamidosporo,
artrosporo, esporângios; esporo, e desenhar os campos microscópicos observados.
3 - Preparar uma lâmina de uma cultura de fungos. Com o auxilio de uma alça de platina
previamente flambada e fria pegue urna amostra da colônia e coloque sobre uma lâmina
contendo 1 gota de LACTOFENOL, espalhe levemente e cubra com uma lamínula leve ao
microsc6pio e observe utilizando a objetiva de 40 x a seco. Anote o resultado.

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05- RESULTADO:
1 - Descreva o aspecto macroscópico das colônias de fungos leveduriformes e
filamentosos.

06 – ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:

a) Qual é a relevância e as limitações do estudo da morfologia na caracterização e

identificação dos fungos? Discuta, considerando os fungos filamentosos e leveduriformes.
b) Quais são as variações morfológicas observadas em relação aos esporos de reprodução
assexuada? Discuta sua importância prática.
c) Qual o objetivo da utilização do LACTOFENOL?

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PRÁTICA Nº 06: CRESCIMENTO E TITULAÇÃO DE VÍRUS BACTERIANO

1- INTRODUÇÃO:
Vírus são entidades biológicas formadas de um ácido nucléico (RNA ou DNA)
envolvido por um envelope de proteína. Os vírus não possuem complexos enzimáticos
elaborados e sistemas de biossíntese essenciais a atividades de uma célula viva independente.
Esta ausência de mecanismos metabólicos indica que eles existem como parasitas e não
podem ser cultivados fora de uma célula viva sensível.
Os vírus que infectam células bacterianas, usualmente denominados bacteriófagos,
constituem uma ótima ferramenta de estudo do processo de infecção, ciclo de replicação e
outros fenômenos biológicos associados aos vírus que infectam células animais.
Os bacteriófagos são facilmente isolados e cultivados em culturas bacterianas ativas,
utilizando-se meios líquidos ou meios sólidos em placa. As partículas podem ser visualizadas
com o auxílio de microscopia eletrônica ou então pela comprovação de seus efeitos sobre
células bacterianas em cultivo. Em meios sólidos a ação fágica pode ser constatada pela
formação de placas de lise na superfície do meio previamente inoculado com uma alta
concentração de bactérias sensíveis.
O estudo do ciclo lítico de bacteriófago tem como modelo a infecção de Escherichia
coli B pelo colifago T4.

2- OBJETIVO:
a) Técnicas para determinar a concentração (título) de bacteriófagos em meio sólido
b) Identificação de placas de lise (efeito lítico) de bacteriófago.

3- MATERIAL:
• 0,5 ml de cultura de Escherichia coli B em fase log em Caldo Nutritivo.
• Suspensão de bacteriófago T4 diluído de 10-1 a 10-10.
• Placas de Petri contendo Ágar Nutritivo, glicose 1% e Indicador de Andrade 1%.
• 5 ml de Ágar Nutritivo fundido, em banho-maria a 45-50oC.
• Pipetas graduadas de 1 ml, estéreis.

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4- EXECUÇÃO:
ETAPA 1
1. Diluição do bacteriófago T4 de 10-1 a 10-10 (Este item é realizado pelo laboratório)
2. Misturar 0,5 mL da diluição do bacteriófago com 0,5 mL de cultura de E. coli B.
Homogeneizar.
3. Transferir 0,2 ml da mistura fago/bactéria para o tubo contendo 5 ml Ágar
Nutritivo (glicose 1% e Indicador de Andrade 1%) fundido, em banho-maria a 45-50oC.
4. Verter o conteúdo do tubo para uma Placa de Petri contendo 15 ml de Ágar
Nutritivo, glicose 1% e Indicador de Andrade 1%%. Homogeneizar. Identificar a placa com o
nº da mesa de trabalho e a diluição do fago.
5. Incubar as placas de Petri por 24 horas a 37ºC.

ETAPA 2
1. Contar as placas de lise sobre originado da ação de uma partícula de fago
inicial sobre o “tapete” de bactérias.
2. Observar as placas dos colegas inoculadas com as outras diluições do
bacteriófago T4.
3. Avaliar o título da amostra original do Fago utilizando a seguinte fórmula:
UFP = Nº de placas de lise x Fator de Diluição /alíquota
(UFP = Unidade formadora de Placa).

5- ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:

a) Observar as placas de Petri contendo as diluições 10-1 e 10-10 do fago. Qual é a principal
diferença entre elas?
b) Qual o significado da presença de colônias bacterianas nas placas onde houve lise
confluente?
c) Explicar como são formadas as placas de lise
c) Após a realização dessa pratica, você e capaz de explicar o termo efeito citopático?

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PRATICA Nº 07: CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA

01 - INTRODUÇÃO:
Controle da população microbiana por métodos físicos:
a) calor seco - estufa - visita a sala de esterilização.
b) calor úmido - autoclave - observar o funcionamento no Lab. Microbiologia.
Controle da população microbiana por métodos químicos:
Ação de anticépticos sobre a microbiota da mão.
Antibiograma:
Ação “in vitro” de antibióticos contra microrganismos.

02 - OBJETIVO:
a) Conhecer os processos de esterilização, desinfecção e antissepsia mais empregados.
b) Realizar e interpretar o antibiograma.

03 - EXECUÇÂO:

a) Controle da população microbiana por agentes químicos

1) Dividir, com pincel atômico, a parte externa do fundo da placa de ágar simples em 3
setores: I, II, III.
2) Sem lavar as mãos, abria a placa e tocar o dedo indicado da mão direita no setor 1. Fechar
a placa.
3) Lavar as mãos demoradamente com água e sabão (3 minutos), enxugar em toalha de papel
estéril e tocar o mesmo dedo no setor II.
4) Lavar as mãos novamente com água e sabão e passar um anticéptico (álcool iodado),
enxugar com toalha estéril e tocar o dedo no setor III. Fechar a placa.
5) Identificar o material e incubar a 37º C.

b) Antibiograma
Material:
• Tubo com meio de cultura, caldo simples inoculado com Staphylococus aureus/ E.coli.
• Placa de Petri com meio de Agar Mueller-Hinton.
• Discos de antibióticos.

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 1. Com os cuidados de adequados, próximo ao bico de gás, umedecer um “swab”
(zoragatoa) no tubo com S. aureus e comprimi-lo na superfície do tubo para reduzir o
inoculo.
2. Espalhar o inoculo com o auxilio do “swab” na superfície da placa de Agar Mueller-
Hinton, tendo o cuidado de espalhar em toda a superfície da placa.
3. Com pinça previamente flambada, retirar um disco de antibiótico do frasco e coloca-lo
na superfície do ágar, evitando contaminação. Observar a distribuição dos discos na placa.
4. Levar as placas à estufa a 37º C por 24 horas.
5. Após o tempo de incubação verificar o halo de inibição formado em volta dos discos de
antibióticos.

04 – RESULTADO E CONCLUSÃO:
a) Controle da população microbiana por agentes químicos
Observar a placa e anotar os resultados na tabela abaixo:
Setor Nº de colônias Nº de tipos de
colônias
Mãos antes de lavar I
Mãos após lavar II
Mãos após anti-sepsia III

1) Como explicar as diferenças observadas no setor I, II e III.

2) Compare seus resultados com os de seus colegas. Houve diferenças? Tente explicá-las.

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b) Antibiograma
Verificar a formação do halo de inibição em volta dos discos de antibióticos e anote os
resultados:
Bactéria sensível a:
Bactéria resistente a:
O que é um antibiograma e qual a sua importância?

Quando e como se deve pedir um antibiograma?

Descreva os passos que devem ser seguidos antes de chegar execução do antibiograma
propriamente dito.

05- PADRÃO DE DESEMPENHO:

Executar corretamente as técnicas de inoculação e do antibiograma.
Interpretar os resultados obtidos no antibiograma.

06 - CONTEUDO DE ENSINO:
Processo de controle da população microbiana.
Mecanismo de ação de drogas sobre os microrganismos.

07- ATIVIDADE DE CONCLUSÃO:

Após a realização desta prática tente responder as seguintes questões:
a) Como é possível controlara a população microbiana em um ambiente?
b) O calor é eficiente germicida?
c) Existem variações entre os microrganismos quanto à sensibilidade ao calor?
d) qual e o tempo e temperatura padrão para e esterilização de rotina?
e) Como se pode demonstrar a existência de microrganismos na pele humana?
f) Seria possível reduzir o numero ou eliminar estes microrganismos?

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REFERÊNCIAS DE ESTUDO

TRABULSI, Luiz R.; ALTERTHUM, F. (Ed.). Microbiologia. 6. ed. Reimp. São Paulo:
Atheneu, 2017.

TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Cristiane L. Microbiologia. 12. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2017.

MADIGAN, Michael T.; MATINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 14. ed.
Reimp. São Paulo: Prentice Hall, 2017.

MURRAY, Patrick R.; ROSENTHAL, Ken S.; PFALLER, Michael A. Microbiologia médica.
8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2017.

LEVINSON, Warren; JAWETZ, Ernest. Microbiologia médica e imunologia. 13. ed. Porto
Alegre: Artes Médicas, 2016.

SEHNEM, Nicole Teixeira (Org.). Microbiologia e Imunologia. São Paulo: Pearson, 2015.
(Bibliografia universitária Pearson).

GOERING, Richard V. et al. Mims microbiologia médica. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier,
2014.

PELCZAR, Michael J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e

aplicações. 2. ed. São Paulo: Makron Books, 1997. v. 1.

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