Pop - LB.016 - Bacterios

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO POP.LB.
016
BACTERIOSCOPIA Página: 1
Elaborado por: Marcelo de Castro de Souza; Versão:

Guilherme Joselino de Lima Piana
Data da elaboração: 11/09/2023 Revisão:
OBJETIVO
Padronizar o procedimento para coloração e análise de lâminas de gram.
CAMPO DE APLICAÇÃO
Este POP aplica-se ao setor de laboratório do Hospital dos Acidentados.
RESPONSABILIDADE
Técnicos e auxiliares de laboratório e Biomédicos.
DEFINIÇÕES/SIGLAS
POP - Procedimento Operacional Padrão;
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
 Violeta de Genciana;
 Lugol fraco;
 Álcool-Acetona;
 Fucsina de Gram;
 Amostra Biológica;
 Lâminas de vidro;
 Alça Bacteriológica (1 e 10 μL);
 Tubo de ensaio estéril;
 Centrífuga;
 Microscópio Ótico
PADRÕES, REAGENTES E OUTROS INSUMOS
VIDE BULA
CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO
Amostras colhidas em desacordo com o POP.LB.XXX – COLETA DE AMOSTRAS

BIOLÓGICAS PARA CULTURA.
Elaborado: Aprovado: Revisado:
Data: Data: Data:

Assinatura: Assinatura: Assinatura:
Rua Luther King, N° 2399, Bairro: Jardim Clodoaldo | Cacoal - RO | CEP: 76963-697 | Telefone: (69) 3443-0700
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO POP.LB.016

METODOLOGIA/PROCEDIMENTO
PRINCÍPIO DO TESTE
Algumas espécies bacterianas, devido à natureza química de suas paredes celulares

compostas de peptidIoglicano, têm a capacidade de reter o cristal violeta, mesmo após tratamento
com um descorante orgânico (álcool-acetona). Tais bactérias são denominadas gram-positivas. As
bactérias gram-negativas, devido ao maior conteúdo lipídico de suas paredes celulares, perdem a
coloração primária do cristal violeta quando tratadas com o descorante. O corante secundário
usado no método de Gram é a fucsina. As bactérias gram-negativas, que perderam o cristal violeta
após a utilização do álcool-acetona, aparecem em vermelho, enquanto as bactérias gram-positivas
aparecem em azul-escuro.
PROCEDIMENTO DE ANÁLISE
Processar a amostra na capela de fluxo laminar, quando aplicável. Preparar o esfregaço do

material:
 Urina de jato médio (Gram de gota):

o Homogeneizar bem a amostra por agitação manual.
o Depositar três alçadas da urina em locais diferentes sobre a lâmina, sem
espalhar. Utilizar alça estéril calibrada (1µl).
 Amostras recebidas em “swab”:
o Girar o “swab” suavemente sobre a superfície da lâmina.
 Para amostras de secreções genitais, suspender o swab em 0,5 ml de
salina estéril (0,85%), agitar vigorosamente, comprimir o swab contra a
parede do tubo e utilizar esta suspensão para o preparo do esfregaço.
o Fazer observação direta e qualitativa em microscópio nos aumentos de 10x e
40x. Anotar no mapa de trabalho a visualização de leucócitos, células epiteliais,
Trichomonas vaginalis e estruturas fúngicas.
 Amostras de líquidos cavitários e sedimento de 1º jato urinário:
o Depositar sobre a superfície da lâmina uma gota do líquido cavitário ou do
sedimento, espalhando ligeiramente.
o Para aumentar a concentração do líquido, adicionar mais material sobre o 1º
esfregaço.
o Utilizar alça bacteriológica estéril não calibrada no preparo do esfregaço.
 Amostras purulentas, fezes e escarro:
Data: Data: Data:


o Espalhar sobre a lâmina uma alíquota da amostra deforma a obter um esfregaço

fino.
 Se a amostra for muito espessa, utilizar salina estéril (0,9%) para diluir o
esfregaço;
o Depositar uma ou duas gotas de salina estéril sobre a lâmina e misturar à
amostra.
 Biópsias e fragmentos de tecidos:
o Transferir a amostra para uma placa estéril e fragmentar com auxílio de uma
lâmina de bisturi e uma pinça estéreis.
o Retirar um fragmento e comprimir várias vezes sobre uma superfície da lâmina.
 Esfregaços de meios de cultura líquidos - Caldo de tioglicolato:
o Homogeneizar o meio de cultura por agitação mecânica ou manual.
o Retirar uma alçada do material e espalhar numa pequena área da lâmina.
 Hemocultura:
o Fazer antissepsia da tampa do frasco de hemocultura com algodão embebido em
clorexidina;
o Em seguida flambar a tampa na chama do bico de Bunsen.
o Introduzir uma agulha de coleta no frasco e retirar uma gota do material.
o Depositar sobre a lâmina e espalhar em uma pequena área.
 Esfregaços de colônias:
o Depositar sobre a lâmina uma gota de salina estéril (0,9%).
o Com uma agulha bacteriológica estéril, tocar na superfície da colônia isolada e
misturar à gota de salina estéril.
 Esfregaços de pontas de cateter:
o Rolar a ponta do cateter e comprimir sua superfície externa sobre a lâmina.
o Deixar o esfregaço secar espontaneamente ao ar ou em estufa a 36ºC ± 1ºC.
PROCEDIMENTO
 Colocar as lâminas em suporte próprio para coloração, com a superfície do esfregaço

voltada para cima.
 Cobrir o esfregaço com cristal violeta e aguardar 5 (cinco) minutos.
 Retirar o excesso de corante sem enxaguar a lâmina.
 Cobrir o esfregaço com lugol e aguardar 2 (dois) minutos.
Data: Data: Data:


 Lavar com água corrente

 Descorar rapidamente com solução de álcool-acetona até que a cor violeta não mais se
desprenda.
 Lavar com água corrente,
 Cobrir o esfregaço com fucsina e aguardar 30 (trinta) segundos.
 Lavar com água corrente.
 Secar ao ar;
 Examinar ao microscópio em objetiva de 10x para avaliar a qualidade do material clínico e
o esfregaço, verificando a presença de leucócitos e células epiteliais.
 Com objetiva de imersão (100x), analisar várias áreas do esfregaço e relatar a presença
ou a ausência de microrganismos.
o Gram de gota: contar o número de bactérias em vários campos e fazer a média
aritmética (nº bactérias/nº campos observados).
A bacterioscopia é expressa de forma semiquantitativa, da seguinte forma:
 Ausentes: zero (0)

 Raras: menos que uma bactéria em 2 (dois) campos examinados
 Alguns: 1 a 5 bactérias por campo
 Moderados: 6 a 15 bactérias por campo
 Vários: 16 a 30 bactérias por campo
 Abundantes: mais que 30 bactérias por campo
Data: Data: Data:


VALORES DE REFRÊNCIA
Ausência de Bactérias;
LINEARIDADE E LIMITES DE DETECÇÃO
Não se aplica.
LIMITAÇÕES DO MÉTODO
A baixa sensibilidade em alguns materiais (líquor, líquidos cavitários etc.) e a contaminação

com flora endógena, principalmente no caso de secreção de orofaringe, secreção retal e fezes,
limitam o valor diagnóstico do método. Um resultado negativo não necessariamente implica na
ausência de microrganismo na amostra porque a qualidade da amostra influencia diretamente no
resultado.
Um resultado positivo indica a presença de microrganismo, devendo sua patogenicidade ser
confirmada com a identificação do microrganismo e avaliação de sintomas clínicos. A coleta e o
manuseio inadequados da amostra podem levar a falsos resultados. Para visualizar
microrganismos por este método, em geral é necessária a presença de cerca de 104 UFC/mL.
REFERÊNCIAS
Sounis, E. Microbiologia para a área das Ciências Biológicas,B 2a. ed., Curitiba, 1985.
Lennette, E.H. et al. Manual de Microbiologia Clínica, Ed. Médica Panamericana, 4. edição, 1987.
Baron, Ellen J.et al. Diagnostic Microbiology, Editora Mosly, 9a.ed., 1994.
Mims, C.A et al. Microbiologia Médica, Editora Manole Ltda, 1995.
Henry, J.B. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, Saunders,
19a Ed.,1996.
La Maza, L.M. et al. Atlas de Diagnóstico em Microbiologia, Editora Artmed, 1999.

Oplustil, C.P. et al. Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica, Editora Sarvier, São Paulo,
2ªed.,2004.
ANEXOS
POP.LB.006 – BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO CLÍNICO
Data: Data: Data:


POP.LB.XXX – COLETA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS PARA CULTURA.

POP.LB.XXX – COLETA DE HEMOCULTURA.
Data: Data: Data:


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Este POP aplica-se ao setor de laboratório do Hospital dos Acidentados.

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PADRÕES, REAGENTES E OUTROS INSUMOS

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 Urina de jato médio (Gram de gota):

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Data: Data: Data:

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o Espalhar sobre a lâmina uma alíquota da amostra deforma a obter um esfregaço

 Colocar as lâminas em suporte próprio para coloração, com a superfície do esfregaço

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Data: Data: Data:

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Data da elaboração: 11/09/2023 Revisão:

 Lavar com água corrente

A bacterioscopia é expressa de forma semiquantitativa, da seguinte forma:

 Ausentes: zero (0)

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Data: Data: Data:

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Data da elaboração: 11/09/2023 Revisão:

LINEARIDADE E LIMITES DE DETECÇÃO

A baixa sensibilidade em alguns materiais (líquor, líquidos cavitários etc.) e a contaminação

Mims, C.A et al. Microbiologia Médica, Editora Manole Ltda, 1995.

La Maza, L.M. et al. Atlas de Diagnóstico em Microbiologia, Editora Artmed, 1999.

POP.LB.006 – BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO CLÍNICO

Elaborado: Aprovado: Revisado:

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