Pop - LB.019 - Guia de Semeaduras

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO POP.LB.
019
GUIA DE SEMEADURAS Página: 1
Elaborado por: Guilherme Joselino de Lima Piana Versão: 01
Data da elaboração: 13/09/2023 Revisão:
OBJETIVO
Padronizar o procedimento de semeadura de Amostras biológicas em meios de cultura.
CAMPO DE APLICAÇÃO
Este POP aplica-se ao setor de laboratório do Hospital dos Acidentados.
RESPONSABILIDADE
Técnicos e auxiliares de laboratório e Biomédicos.
DEFINIÇÕES/SIGLAS
POP – Procedimento Operacional Padrão;
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
 Meio de cultura a ser utilizado, especificado no POP próprio ou na tabela a seguir;

 Material biológico;
 Alça Estéril Descartável;
METODOLOGIA/PROCEDIMENTO
MEIOS SÓLIDOS EM TUBO
As semeaduras de amostras biológicas em meios de cultura seguem padrões pré-definidos

por convenções e sociedades com o intuito de padronizar técnicas e garantir repetibilidade e
confiabilidade de diagnósticos. A seguir, apresentam-se diagramas de semeadura de amostras em
diversos tipos de meios de cultura:
Elaborado: Aprovado: Revisado:
Data: Data: Data:

Assinatura: Assinatura: Assinatura:
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO POP.LB.019
Fig1: Semeaduras em ágares inclinados.
A semeadura em ágares inclinados é realizada com agulha bacteriológica, fazendo uma

linha reta, com cuidado para não ferir o ágar, partindo da base para a extremidade do bisel. O
objetivo é a obtenção de pequena massa de micro-organismos. Em ambos os casos, a semeadura
é feita somente na superfície do ágar. Não ocorre perfuração do meio de cultura. Essas técnicas
são muito utilizadas para armazenar culturas puras por um período razoável de tempo, pois os
tubos fechados perdem menos umidade e a exposição ao ar é muito pequena.
Data: Data: Data:

Fig2: Picada em ágares inclinados.
A picada é realizada com agulha bacteriológica, no centro do ágar e, ao chegar na superfície

inclinada, fazer uma estria sinuosa (zig-zag). Dependendo da finalidade, a agulha deve penetrar
até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. O objetivo é verificar fermentação e motilidade em algumas
provas de identificação bacteriana. É possível analisar o metabolismo aeróbico e anaeróbico de
micro-organismos.
Data: Data: Data:

Fig3: Picada em profundidade em ágares semissólidos ou sólidos sem inclinação.
A picada em profundidade é realizada com agulha bacteriológica, no centro do ágar.

Dependendo da finalidade, o inóculo deve ser inserido até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. O
objetivo é verificar fermentação e motilidade em algumas provas de identificação bacteriana,
principalmente de micro-organismos com metabolismo anaeróbio.
MEIOS LÍQUIDOS (CALDOS)
Data: Data: Data:

Fig4: Difusão de inóculo em meio líquido.
Fazer o repique da cultura em estudo (colônias ou caldo) para o caldo que será inoculado,
usando alça bacteriológica ou pipetando o caldo incubado anteriormente. Agitar a alça para maior
difusão dos micro-organismos. Dependendo do objetivo e da bactéria estudada, pode ser
necessário a incubação da cultura em incubadora com agitador orbital (shaker incubator), por
exemplo 250 rpm a 37ºC. O objetivo é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio
líquido. O grau de crescimento pode ser verificado pela turbidez do meio.
MEIOS SÓLIDOS EM PLACA
Data: Data: Data:

Fig5: Pour plate ou incorporação de inóculo.
Transferir 1 mL da cultura para placa de Petri vazia, colocar 20 mL do meio fundido (e

resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos
circulares. Uma variação dessa técnica é misturar a cultura com o meio fundido que já foi
autoclavado em frasco e volume ideais, homogeneizar e depois transferir a mistura para a placa. O
objetivo é obter uma contagem bacteriana. É utilizado também para análise de micro-organismos
anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira
camada.
Data: Data: Data:

Fig6: Estria simples em placa de petri.
Fazer o repique da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica
sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zig-zag (estria sinuosa) ou como uma
linha reta sobre o meio (estria reta). O objetivo é a visualização de determinadas propriedades
metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de
ovo, sangue etc.) e produção de pigmentos.
Data: Data: Data:

Fig7: Semeadura por esgotamento.
Fazer o repique da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica
sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes ("imaginários") e a inoculação pode ser feita de
dois tipos:
 Três estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a
metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o
meio restante.
 Quatro estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo
quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa),
girar 90° e estriar o restante do meio.
O objetivo é obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a
alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se,
alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um
pequeno inóculo para a próxima estria.
Data: Data: Data:

Fig8: Semeadura por espalhamento ou distensão.
Transferir 0,1 mL da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente por toda
a placa. O espalhamento pode ser feito com alça bacteriológica, com swab ou com alça de
Drigalski, dependendo do objetivo. O objetivo é a obtenção de crescimento confluente ou para
contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de teste de susceptibilidade
antimicrobiana ("antibiograma").
MEIOS DE CULTURA A SEREM UTILIZADOS E TÉCNICAS DE SEMEADURA
URINA
O meio de cultura utilizado para urocultura é o ágar Cled. O material deverá estar
acondicionado em frasco estéril. Para a manipulação do frasco, deverá ser colocado um pedaço de
papel higiênico na bancada para evitar o derramamento de urina. O frasco deverá estar levemente
homogeneizado antes da manipulação.
Com auxílio de alça estéril calibrada de 1 µL (0,001mL), previamente esterilizada e esfriada,
deverá ser retirada a amostra do frasco e semeada em ágar Cled e MacConkey de modo
quantitativo (Espalhamento). Essa técnica consiste em espalhar 1 µL de urina sobre a superfície do
ágar começando na parte de cima indo até a parte de baixo da placa. Estriar de um lado ao outro,
Data: Data: Data:

de forma a espalhar o inóculo em toda a superfície até o final da placa.

Outras culturas semeadas de forma quantitativa são: Lavado broncoalveolar, escarro e
esperma.
Para cultura de fungos, utilizar também alça calibrada de 1 µL e semear em tubos contendo
ágar Sabouraud, os quais serão incubados, um à temperatura de 35°C e o outro à temperatura
ambiente. Para cultura de micobactérias, a urina deverá sofrer um processo de descontaminação
antes de ser semeada em ágar Lowenstein-Jensen e incubado a 35°C.
SECREÇÃO DE FERIDAS
As culturas de secreção de feridas de pele (cirúrgicas ou não) são semeadas em ágar

sangue e ágar MacConkey e caldo Tioglicolato. Geralmente esses materiais biológicos chegam
colhidos em swab estéril. Esfregar o swab contendo o material em uma pequena área do ágar
sangue e introduzi-lo no tubo com caldo Tioglicolato.
Homogeneizar bem e descartar o swab. Voltar ao ágar sangue e, com auxílio de uma alça
pequena, colher uma parte do material e estriar na placa de ágar MacConkey pela técnica de
esgotamento. Voltar novamente ao ágar sangue e estriar também por esgotamento. Colocar em
estufa a 35°C.
Se houver solicitação de pesquisa de bactérias (bacterioscopia) deverá ser feita com swab
diferente daquele utilizado para cultura. Caso não tenha sido colhido dois swabs, cancelar o exame
de bacterioscopia.
Se houver swab para pesquisa de bactérias preparar um esfregaço com o swab fazendo
uma camada fina de material, esperar secar e fixar ao calor. Corar pelo método de Gram (
FRAGMENTOS DE BIÓPSIA
Esse material biológico deve ser fragmentado em partes menores para ser semeado para
cultura de bactérias e, também, para cultura de fungos e micobactérias.
Colocar o fragmento em uma placa de Petri estéril e com auxílio de um bisturi também
estéril, cortar em partes menores. Colocar uma ou mais partes do fragmento em caldo Tioglicolato,
homogeneizar e guardar em estufa a 35°C. Esse frasco será utilizado para cultura para bactérias.
Para cultura de fungos, parte desses fragmentos será introduzida dentro de dois tubos
contendo ágar Sabouraud, os quais serão incubados, um à temperatura de 35°C e o outro à
temperatura ambiente.
Para cultura de micobactérias, essa amostra deverá sofrer uma descontaminação antes de
ser semeada em ágar Lowenstein-Jensen e incubado a 35°C.
Quando for solicitado pesquisa de bactérias, deverá ser feito um esfregaço corado pelo
Gram. Com uma parte do fragmento fazer um “imprint” em uma lâmina estéril, esperar secar e fixar
Data: Data: Data:

ao calor. Corar pelo Gram.

Para pesquisa direta de fungos, pode-se adicionar a uma parte do fragmento de biópsia,
100 µL de KOH 10% deixando por 30 minutos em incubação à temperatura ambiente. Após esse
tempo montar lâmina sob lamínula e observar em microscópio com objetiva de 40x.
Para pesquisa de Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR) fazer um esfregaço com um
pequeno fragmento da biópsia em uma lâmina estéril. Deixar secar e fixar ao calor. Corar pelo
método de Ziehl-Neelsen.
Observação: A pesquisa de bactérias, fungos ou micobactérias, em qualquer material biológico, deverá ser
realizada em lâmina estéril. Utilizar as lâminas que estão imersas em álcool 96°GL em uma cuba de vidro. Com auxílio de
uma pinça retirar uma lâmina, escorrer o excesso de álcool e colocar na chama. O fogo vai esterilizar a lâmina, que será
utilizada imediatamente. Deve-se ter muita atenção a esse procedimento a fim de evitar acidentes.
LIQUOR
Na meningite bacteriana o líquor pode conter pequena quantidade de bactérias e por isso
deve-se centrifugar a amostra antes de semear.
Transferir 1mL de líquor em tubo estéril e centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm.
Desprezar o sobrenadante para outro tubo estéril e enviar para bioquímica ou sorologia.
Homogeneizar bem o sedimento e inocular com alça estéril o meio ágar chocolate suplementado.
Adicionar a todo o sedimento restante 1 mL de caldo BHI e incubar a 35°C. Não esquecer de
colocar a placa com ágar chocolate suplementado dentro da jarra de microaerofilia com a vela
acesa e um chumaço de algodão úmido.
Para cultura de fungos no líquor, utilizar o mesmo sedimento, antes de colocar o caldo BHI.
Semear com alça estéril a superfície de dois (2) ágar Sabouraud. Após a semeadura incubar um
tubo a 35°C e outro em temperatura ambiente.
Para cultura de micobactérias, também semear o sedimento em ágar Lowenstein- Jensen.
Estriar a superfície do ágar com cuidado, pois ele é semi-sólido. Incubar a 35°C.
A pesquisa de bactérias e micobactérias deverá ser realizada após coloração de Gram e
Ziehl-Neelsen. Sempre confeccionar os esfregaços em lâmina utilizando a citocentrífuga, sem diluir
a amostra, independentemente do número de leucócitos.
A pesquisa de fungos no líquor deverá ser feita utilizando a técnica da Tinta da China.
LÍQUIDO ASCÍTICO E ABDOMINAL
O Líquido Ascítico deve ser semeado somente em caldo tioglicolato. Colocar assepticamente
entre 1 e 3 mL de amostra, homogeneizar e incubar a 35°C.
Quando for solicitado cultura para fungos deverá ser utilizado dois (2) frascos de ágar
Sabouraud. Semear 1 mL de amostra em cada tubo e incubar a 35°C um dos tubos e o outro
deverá ficar à temperatura ambiente.
Data: Data: Data:

Para cultura de micobactérias, a amostra também deverá ser descontaminada de acordo

com a técnica do item 3.15. Após esse procedimento semear em ágar Lowenstein-Jensen. Estriar
a superfície do ágar com cuidado, pois ele é semi-sólido. Incubar a 35°C.
A pesquisa de micobactérias pode ser feita centrifugando uma porção do material
(aproximadamente 5 mL). Preparar uma camada fina a partir do sedimento, esperar secar e fixar
ao calor. Corar pelo Ziehl-Neelsen.
LÍQUIDO PLEURAL, PERICÁRDICO E SINOVIAL
Esses materiais nobres deverão ser semeados nos frascos utilizados para hemocultura
pediátrica, quando for solicitado cultura para bactéria. Homogeneizar e colocar no equipamento DL
BIOTECH.
A etiqueta de identificação do paciente deverá ser colada ao lado do código de barras do
frasco de cultura. Ao abrir a porta do equipamento aparecerá um feixe de luz para leitura dos
códigos de barras. Proceder a leitura dos códigos de identificação do paciente e do frasco,
escolher um local vazio, colocar o frasco e fechar a porta do equipamento.
A pesquisa de micobactérias pode ser feita centrifugando uma porção do material. Utilizar a
citocentrífuga para preparar as lâminas a partir do sedimento, esperar secar e fixar ao calor. Corar
pelo Ziehl-Neelsen.
A pesquisa de bactérias pelo Gram também deverá ser feita do mesmo, utilizando a
citocentrífuga, e corando pelo Gram.
Para pesquisa direta de fungos, adicionar a uma parte do material, 100 µL de KOH 10%
deixando por 30 minutos em incubação à temperatura ambiente. Após esse tempo montar lâmina
sob lamínula e observar em microscópio com objetiva de 40x.
LAVADO BRONCOAOVEOLAR
A técnica de coleta desse material não permite uma assepsia total, portanto, a cultura deve
ser realizada de forma quantitativa. Para isso, deve-se semear a amostra utilizando uma alça
calibrada de 1 µL.
Homogeneizar o frasco, introduzir a alça calibrada e semear de forma quantitativa,
exatamente igual à semeadura de urina. Semear em ágar Sangue e ágar MacConkey por
estriamento quantiativo. Incubar a 35°C. Seguir com análise como detalhado no POP.LB.027 –
MICROBIOLOGIA: PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS RESPIRATÓRIAS;
Para cultura de micobactérias, a amostra também deverá ser descontaminada de acordo
com a técnica de descontaminação de material biológico, (NaOH 4%). Após esse procedimento
semear em ágar Lowenstein-Jensen. Estriar a superfície do ágar com cuidado, pois ele é semi-
sólido. Incubar a 35°C.
Data: Data: Data:

Para cultura para fungos deverá ser utilizado dois (02) frascos de ágar Sabouraud.
Centrifugar aproximadamente 5 mL de amostra a 1500 G, desprezar a sobrenadante e semear o
sedimento nos dois tubos. Incubar a 35°C um dos tubos e o outro deverá ficar à temperatura
ambiente.
A pesquisa de bactérias e micobactérias pode ser feita centrifugando uma porção do
material (aproximadamente 5 mL). Utilizar esse sedimento na citocentrífuga para preparar um
esfregaço concentrado. Esperar secar e fixar ao calor. Corar pelo Gram e Ziehl-Neelsen.
Para pesquisa direta de fungos, centrifugar aproximadamente 5 mL de amostra a 1500 G,
desprezar a sobrenadante adicionar 100 µL de KOH 10% deixando por 30 minutos em incubação à
temperatura ambiente. Após esse tempo montar lâmina sob lamínula e observar em microscópio
com objetiva de 40x.
ESCARRO
Esse material biológico é considerado ruim para realização de cultura para bactérias, pois ao
passar pela cavidade oral, traz uma parte da microbiota existente, a qual vai crescer nos meios de
cultura e prejudicar o crescimento de possíveis patógenos. Contudo, a cultura para bactérias é
frequentemente solicitada e assim realizamos de forma quantitativa.
Semear a amostra com alça calibrada de 1 µL em ágar Sangue e ágar MacConkey. Incubar
a 35°C.
A cultura para fungos é realizada semeando diretamente a amostra na superfície do ágar
Sabouraud, incubando um dos tubos a 35°C e o outro a temperatura ambiente.
Para cultura de micobactérias o material deverá ser descontaminado de acordo com o
protocolo. Após a descontaminação semear em ágar Lowenstein-Jensen e incubado a 35°C.
A pesquisa de bactérias e micobactérias pode ser feita fazendo um esfregaço diretamente
da amostra. Preparar um esfregaço delgado, esperar secar e fixar ao calor. Corar pelo Gram e
Ziehl-Neelsen.
Para pesquisa direta de fungos adicionar 100 µL de KOH 10% a uma porção da amostra
deixando por 30 minutos em incubação à temperatura ambiente. Após esse tempo montar lâmina
sob lamínula e observar em microscópio com objetiva de 40x.
ESPERMA
Assim como a urina, o esperma pode conter bactérias da uretra distal, as quais vão crescer
nos meios utilizados. Assim, devemos semear essa amostra de forma quantitativa com alça
calibrada de 1 µL.
A cultura do esperma é bastante solicitada para o diagnóstico de prostatite crônica e um dos
agentes causadores mais frequentemente encontrados é a Neisseria gonorrhoeae. Portanto, toda
Data: Data: Data:

amostra de esperma deverá ser semeada em ágar Thyaer Martin.

Com uma alça calibrada de 1 µL semear no meio de forma quantitativa como na figura
3. Incubar em jarra de microaerofilia com vela acesa e um chumaço de algodão úmido.
PONTA DE CATÉTER
A ponta de cateter deve chegar ao laboratório dentro de um frasco estéril medindo cerca de
5 cm. Essa cultura é semi-quantitativa e é realizada da seguinte forma. Acima de 15 colônias
individuais considera-se o resultado como positivo, prosseguindo para identificação e antibiograma.
Em uma placa de ágar sangue colocar o cateter na superfície e rolar de um lado ao outro
com auxílio de uma alça estéril. Retirar o cateter e desprezar. Incubar a 35°C.
A cultura para fungos, quando solicitada, deve ser realizada no mesmo inóculo para
bactérias, já que não é possível semear duas vezes o material.
SWAB RETAL
Cultura de vigilância epidemiológica destinada a detectar microrganismos multirresistentes

em pacientes internados no hospital, principalmente nas Unidades de Terapia Intensiva (UTIs).
Chegarão ao laboratório dois swabs; um para pesquisa de Enterococcus resistente à
vancomicina (VRE) e Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenens (KPC). Atualmente, os
swabs para pesquisa de VRE e pesquisa para KPC são semeados em meios cromogênicos e
seletivos correspondente e incubados a 35°C. Com 24 horas algumas amostras já apresentam
crescimento, possibilitando a realização das provas posteriores para confirmação de KPC (Teste
de Hodge e Teste de Ertapenem e Meropenem) e VRE (PYR, Bile esculina, NaCl, Xilose, Manitol e
Arabinose), porém quando não há crescimento, para que o resultado seja realmente negativo são
necessárias 48 horas de incubação.
O meio utilizado para pesquisa de VRE permite o crescimento de microrganismos
resistentes à vancomicina, porém as colônias de interesse – VRE, são pequenas e apresentam
uma coloração rosa. Já o meio utilizado para pesquisa de KPC permite o crescimento de
microrganismo resistentes aos carbapenens, e as colônias de KPC são grandes e com coloração
verde escuro.
Na falta dos meios cromogênicos, o swab para pesquisa de VRE deverá ser colocado no
caldo Bile Esculina Azida (BEA). Homogeneizar bem e incubar a 35°C. Esse meio contém
vancomicina e azida que impedem o crescimento de bactérias Gram positivas e Gram negativas,
respectivamente.
O swab para pesquisa de KPC deve realizada por teste de Hodge Triton Modificado.
FEZES
Data: Data: Data:

A coprocultura deve ser realizada preferencialmente em amostras líquidas ou pastosas. Ao

semear, escolher as partes onde há muco e sangue para aumentar a chance de detectar os
patógenos. Com uma alça estéril estriar em ágar MacConkey e ágar SS. Incubar a 35°C.
REFERÊNCIAS
David R. Caprette. Preparing and using agar slant tubes. Laboratory Studies in Microbiology. Rice
University.
Kathryn Wise. Preparing Spread Plates Protocols. American Society for Microbiology.
Nazzy Pakpour e Sharon Horgan. Lab 2: Aseptic Technique. General Microbiology Lab Manual.
California State University.
Joan Petersen e Susan McLaughlin. Introduction to Aseptic Techniques and Growth Media.
Laboratory Exercises in Microbiology. Queensborough Community College.
Aloysio de Mello e Raquel de Souza. Apostila de Aulas Práticas – Bacteriologia. UFF 2007.
Henry J.B., Diagnósticos Clínicos Tratamento por Métodos Laboratoriais, 20ª ed., 1680 p., 2008.
Moura R. A., Técnicas de laboratório. 3ª ed., Rio de Janeiro, Atheneu, 511 p., 1987.
Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML):

boas práticas em microbiologia clínica. -- Barueri, SP: Manole: Minha Editora, 2015.
Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Carmen Paz Oplustil, Cássia Maria Zoccoli.
Editora Savier, 2020.
Empresa Brasileira de Serviços Hospitalares. Todos os direitos reservados www.Ebserh.gov.br
ANEXOS
POP.LB.006 – BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO CLÍNICO;

POP.LB.017 – UROCULTURA;
POP.LB.018 – COPROCULTURA;
POP.LB.020 – SEMEADURA DE HEMOCULTURAS;
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Padronizar o procedimento de semeadura de Amostras biológicas em meios de cultura.

Este POP aplica-se ao setor de laboratório do Hospital dos Acidentados.

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Fig1: Semeaduras em ágares inclinados.

A semeadura em ágares inclinados é realizada com agulha bacteriológica, fazendo uma

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Fig2: Picada em ágares inclinados.

A picada é realizada com agulha bacteriológica, no centro do ágar e, ao chegar na superfície

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Fig3: Picada em profundidade em ágares semissólidos ou sólidos sem inclinação.

A picada em profundidade é realizada com agulha bacteriológica, no centro do ágar.

MEIOS LÍQUIDOS (CALDOS)

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Transferir 1 mL da cultura para placa de Petri vazia, colocar 20 mL do meio fundido (e

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Fig7: Semeadura por esgotamento.

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