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Anápolis
2016
AVM Faculdade Integrada
MBA em Gestão da Qualidade
Rogério Pereira Gomes
Anápolis
2016
Dedico este trabalho primeiramente a
Deus, depois minha esposa que sempre
me ajuda a superar a todas as
dificuldades, a todos meus colegas de
curso que me ajudaram muito a concluir
mais essa etapa em minha vida e por
último e não menos importantes a todos
os professores do curso que me
indicaram o caminho para elevar meus
conhecimentos.
Resumo
Este trabalho demonstra uma introdução sobre citologia bacteriana e demonstra
também as vias utilizadas para administração parenteral, e explica os métodos in vivo e
in vitro para o teste de pirogênio e a importância de sua realização. Este estudo explica
o que é pirogênio e também determina os processos de despirogenização para os
materiais utilizados nos testes, evitando possíveis contaminações. Objetivamente,
mostra as diferentes metodologias para detecção de endotoxinas bacterianas
investigadas em produtos farmacêuticos estéreis e em soluções parenterais, e também
qual o método mais eficaz utilizado atualmente.
ABSTRACT
This work demonstrates an introduction to bacterial cytology and also shows
the routes used for parenteral administration, and explains the methods in vivo and in
vitro for the pyrogen test and the importance of his achievement. This study explains
what pyrogen and also determines the depyrogenization processes for the materials
used in the tests , avoiding possible contamination. Objectively shows the different
methodologies for bacterial endotoxin detection investigated in sterile pharmaceutical
and parenteral solutions, and also what the most effective method currently used.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO......................................................................................9
1.1 TEMA.....................................................................................10
1.2. PROBLEMA................................................................................10
1.3. JUSTIFICATIVA...........................................................................10
1.4. OBJETIVOS...............................................................................10
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................11
2.2. HISTÓRICO................................................................................19
2.4.3 OXIDAÇÃO..........................................................................25
2.4.4. ALQUILAÇÃO......................................................................26
2.6.1. LAVAGEM...........................................................................27
2.6.2. DESTILAÇÃO......................................................................28
2.6.3. ULTRAFILTRAÇÃO................................................................28
3. CONCLUSÃO..................................................................................40
4. REFERENCIAS..............................................................................41
9
INTRODUÇÃO
1.1 TEMA
10
1.2. PROBLEMA
Qual o método dentre os utilizados para determinação de endotoxina bacteriana em
medicamentos injetáveis, é o mais eficiente?
1.3. JUSTIFICATIVA
Os medicamentos injetáveis são aqueles aplicados por injeção, por serem injetados
diretamente dentro do organismo de quem o recebe se faz necessário que o mesmo
seja estéril livre da presença de micro-organismos, mais alguns desses micro-
organismos mesmo depois de eliminados ainda podem comprometer a qualidade do
medicamento e a saúde de quem recebe esse medicamento, as endotoxinas
bacterianas, que são toxinas encontradas dentro da célula bacteriana que são liberadas
após sua eliminação, foram apontadas como causadoras de varias mortes de crianças
em 1996 no Brasil, por isso determinar a presença ou não de endotoxina bacteriana em
medicamentos injetáveis é essencial, conhecer os métodos disponíveis no mercado
hoje e através disso determinar qual o mais eficaz é o principal objetivo deste estudo.
1.4. OBJETIVOS
2. REVISÃO DE LITERATURA
A camada externa apresenta como função uma barreira molecular, para prevenir
ou dificultar a perda de proteínas periplasmáticas, e para evitar o acesso de enzimas
hidrolíticas e alguns antibióticos ao peptidioglicano. Possui também receptores para
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Essa membrana atua como barreira osmótica e é permeável aos íons sódio e
aminoácidos. É importante por atuar também em sistemas enzimáticos, biossíntese de
lipídios, transporte de elétrons, além de participar do processo de fosforilação oxidativa
(LONNEMANN ET AL, 1988). As bactérias necessitam de condições físico-químicas
para seu devido crescimento e reprodução. Dentre essas condições, pode-se citar: a
temperatura, o PH, pressão osmótica, concentrações de substrato, dióxido de carbono
e oxigênio (POOLE ET AL, 2001).
A parede das células Gram positivas possuem uma única camada espessa,
quase toda composta de peptidioglicano, que tem como função a manutenção da célula
e sua rigidez. A camada de peptidioglicano é apenas uma camada espessa e frágil. O
componente da parede das células Gram positivas é o peptidioglicano ligado
diretamente de modo covalente ao ácido lipoteicóico. Para ativação celular, pode-se
citar o glicolipídeo e o ácido lipoteicóico, se ligando as membranas celulares (linfócitos
e macrófagos). Ativam também a cascata do complemento, induzindo à inflamação
(DANNER et al, 1990).
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é colocada diretamente na corrente sangüínea é mais difícil de ser retirada). Como esta
forma de administração deve ser estéril, é mais cara e exige profissionais competentes
e treinados (HOFFMANN, 2005).
Emprega-se a agulha curta (0,95 cm) e de calibre fino (23 a 26). Esta agulha é
inserida horizontalmente na pele com o bisel voltado para cima. A injeção é feita quando
o bisel desaparece no cório e, em geral, só 0,1 ml pode ser administrado dessa maneira
(ERSTAD; MEEKS, 1993).
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• Sólidos suspensos em meio líquido adequado e que não devem ser injetados
por via intravenosa ou no canal vertebral e que se distinguem por rótulos do tipo
“Suspensão Estéril”. (Ex: Suspensão de Acetato de Dexametasona Estéril, USP).
A presença do agente antimicrobiano faz com que a água seja usada apenas
para administração parenteral de pequeno volume, pois, para grandes volumes, tem a
presença de muitos agentes antimicrobianos e que talvez sejam tóxicos para esse tipo
de administração (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
Os veículos selecionados não devem ser irritantes, nem tóxicos nas quantidades
administradas, e não sensibilizantes.
são dissolvidas de acordo com as Boas Práticas de Fabricação (BPF) de água para
injeção (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).
As soluções são passadas por um filtro de membrana para ficarem limpas. Após
a filtração, as soluções devem ser passadas com o maior cuidado e assiduidade
possíveis para os recipientes adequados.
2.2. HISTÓRICO
Alguns autores não viam a febre como benéfica; no inicio do século XIX dois
farmacêuticos franceses, Pelletier e Caventue isolaram um antipirético, a quinina. E a
partir disso com estudos em animais foi possível conhecer os efeitos de pirexia e
antitérmicos. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).
Após duas décadas um estudo colaborativo foi desenvolvido pelo U.S. National
institute of Health e 14 industrias farmacêuticas para estabelecer um sistema animal
que pudesse ser usado para avaliar pirogenicidade de soluções. Este estudo resultou
no desemvolvimento do primeiro teste de pirogenio oficial em coelhos, que foi
incorporado na USP (United States Pharmacopeia) XII, em 1942.
Como fonte de pirogenio podemos citar uma grande variedade de fontes, desde
bacteriana, de fungos e vírus, bem como componentes de bactérias Gram (-) e de
bactérias Gram (+), assim como pirogênios não microbianos, como alguns fármacos,
esteroides, frações do plasma, e o adjuvante Sintetico muramil dipeptide.
Os níveis aceitáveis para coelhos e humanos são: 0,1 e 0,14 ng/ Kg para S.
thypi, 1,0 ng/Kg para E. coli e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp (DABBAH et al,
1980).
Os pirogênios podem ser muito difíceis de serem removidos da solução, pois têm
pesos moleculares bem distintos e sua estabilidade e pH são facilmente alterados
(PEARSON, 1985).
A despirogenização pode ser obtida de duas formas, seja pela inativação ou
remoção das endotoxinas (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).
2.4.3 OXIDAÇÃO
2.4.4. ALQUILAÇÃO
O tratamento por calor seco é realizado em estufas específicas para este fim, que
funcionam com gás ou eletricidade, controladas por termostato. Este tratamento é
considerado menos eficaz para matar microrganismos do que o calor úmido, pois utiliza
altas temperaturas por períodos mais longos (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
Esse tipo de metodo tem sido a melhor escolha para materiais termoresistentes,
com ênfase para frascos de vidro e instrumentos metálicos.
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2.5.3 POLIMIXINA B
2.6.1. LAVAGEM
2.6.2. DESTILAÇÃO
É o método mais antigo que efetivamente remove pirogenios da água, Na
destilação, as moléculas de Lipopolisacarideos, permanecem na fase liquida enquanto
à água pela fervura passa ao estado de vapor, molécula de LPS que estiverem em
estado liquido tendem a cair por gravidade, devido ao seu alto peso molecular, tornando
a água recém destilada coletada em frasco apirogena livre de pirogenios.
2.6.3. ULTRAFILTRAÇÃO
Para cada produto, deve-se verificar um tipo de despirogenização, seja ele por
remoção ou por inativação de endotoxinas, pois cada um deles tem um tipo de natureza
diferente. Devem-se aplicar todos os conceitos de Boas praticas de fabricação, de
forma que o produto seja obtido de forma apirogenica desde o começo do processo,
sem se preocupar com maiores tratamentos.
Todas etapas críticas devem ser monitoradas e devem-se validar periodicamente
estufas ou túneis de despirogenização (DING; HO, 2001).
Todas as monitorações de processo, assim como testes de matérias-primas, com
particular atenção a origem natural, e do produto terminado, devem empregar técnicas
analíticas validadas, seja com a metodologia clássica ou métodos empregando técnicas
in vitro. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).
Após este período retire os tubos um a um, virando a 180 graus e verificando a
integridade do gel; se o gel permanecer firme após a inversão dos tubos considere o
resultado como positivo, e se não houver formação de gel ou o mesmo não se
apresentar firme considere como negativo. O teste somente será válido se as seguintes
condições forem obedecidas: Se ambas as réplicas do controle negativo (D)
apresentarem reações negativas; Se ambas as réplicas do controle positivo do produto
(B) apresentarem reações positivas; Se a média geométrica da solução C estiver dentro
da faixa de 0,5 λ a 2 λ. Para calcular a concentração de endotoxina da solução A,
calcule a concentração do ponto final de cada réplica da serie de diluições,
multiplicando cada fator de diluição do ponto final pela sensibilidade rotulada do
reagente LAL (λ) A concentração de endotoxina na solução teste é a média geométrica
da concentração do limite das replicas.
Se o teste é realizado na amostra diluída, determine a concentração de
endotoxina na solução original multiplicando o resultado pelo fator de diluição da
amostra. Se nenhuma das diluições da amostra teste for positiva, expresse o resultado
da concentração de endotoxina como menor que a sensibilidade do LAL (λ) ou menor
do que a sensibilidade do LAL multiplicado pelo menor fator de diluição da amostra.
Se todas as diluições da amostra apresentarem reações positivas, a
concentração de endotoxina é expressa como igual ou maior que λ multiplicado pelo
mais alto fator de diluição da amostra. A amostra encontra os requerimentos do teste se
a concentração de endotoxina for menor do que o limite individual especificado na
monografia.
3. CONCLUSÃO
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Através deste estudo foi possível conhecer sobre a endotoxina bactériana que trata-
se de um lipopolissacárido, abreviado LPS, ou seja, uma forma de um açúcar. Trata-se
de uma estrutura composta por complexos de lípidos e açúcares, que pode causar
varias enfermidades, podendo causar até a morte caso seja injetados medicamentos
contamindados em pacientes como imunidade comprometida.
Os testes para se detectar a endotoxina bacteriana são de extrema necessidade
para detectar a contaminação de fármacos, e materiais de uso hospitalar, Atualmente
as indústrias farmacêuticas tem investido muito nesse tipo de análise.
E cumprindo o objetivo principal desse estudo foram apresentados vários métodos,
dentre eles o método por coagulação em gel e o metodo cinético turbidimetrico, que
hoje são os mais recomendados pela agencia reguladora, para ser utilizado na indústria
farmacêutica.
E dentre esses dois métodos através das informações obtidas neste estudo, foi
possível observar que o metodo de Coagulação em gel que é um método qualitativo é
menos eficaz que o método cinético turbidimetrico, pois vários estudos demonstraram
vários falsos positivos em seus testes, ficou comprovado que o método cinético
turbidimetrico que é um metodo quantitativo, ou seja, com ele possível quantificar com
precisão a quantidade de endotoxina presente na amostra analisada, é hoje em dia o
método mais eficaz para se analisar medicamentos.
4. REFERENCIAS
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ANDRADE, S. S. et al. Comparative evaluation of the human whole blood and human
peripheral blood in tests for pyrogens. International Journal of Pharmaceutics, v. 265, p.
115-124, 2003.
BUTLER, L. D.; MUNSON, J. M.; DELUCA, P. P. Effect of inline filtration on the potency
of low-dose drugs. American Journal Hospital Pharmacy. V. 38, p. 935-941, jul. 1980.
COUPE, A. J.; DAVIS, S. S.; WILDING, I. R. Variation in gastrointestinal transit of
pharmaceutical dosage forms in healthy subjects. Pharmaceutical Research, v. 8, p.
360-364, 1991.
40
DABBAH, D. M. et al. Pirogenicity of E. coli 055: B5 endotoxin by the USP rabbit test; a
HIMA collaborative study. Journal of Parenteral Drugstore Association, Philadelphia,
v. 34, n. 3, p. 212-271, 1980.
DING, J. L.; HO, B. A new era in pyrogen testing. Trends in Biotechnology. v. 19, n. 8, p.
277-281, aug. 2001.
MAN, N. K. et al. Dialysis- associated adverse reactions with high- flux membranes and
microbial contamination of liquid bicabornate concentrate. Contribuition Nephrol. V.
62, p. 24-34, 1988.