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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Controle de qualidade microbiológico de

produtos estéreis

Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos

Ribeirão Preto - 2020

Diferentemente do que já foi abordado até o momento, agora vamos abordar o controle de
qualidade microbiológico para produtos estéreis. Se antes era permitida a presença de alguns
microrganismos, em certa quantidade, nos produtos farmacêuticos e cosméticos; agora a
exigência é 0 UFC/g ou mL de produto analisado.
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ESTERILIDADE

Total ausência de formas viáveis capazes de reprodução.

Esterilidade absoluta  todas as frações do produto submetidas ao teste.

Teste de esterilidade  destrutivo

Método estatístico de amostragem:

Depende do tamanho do lote e do tipo de produto

Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos

Ribeirão Preto - 2020

Inicialmente é necessário entendermos o conceito de esterilidade. Esterilidade refere-se à

total ausência de formas viáveis, capazes de reprodução.
Segundo os compêndios oficiais, a condição de esterilidade de um produto somente deve
ser considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condições ótimas e
que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste de esterilidade, indique a
ausência de microrganismos viáveis.
A afirmação sobre a esterilidade absoluta de um produto exigiria que todas as suas frações
fossem submetidas ao teste, o que não é aplicável. Outro fator a considerar é que o teste
busca proporcionar condições ideais ao desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras. A
metodologia não abrange condições que permitam o crescimento de vírus; entretanto, quando
da ausência de bactérias e fungos, extrapola-se o resultado negativo também a estes
organismos.
Tratando-se de teste do tipo destrutivo, evidentemente que o teste de esterilidade não
pode ser aplicado a todo o lote. O método baseia-se, portanto, em método essencialmente
estatístico de amostragem. Os resultados são determinados tanto pelo número de amostras
testadas como pelo histórico de incidência de contaminação no lote. Sendo assim, o número
de unidades a ser testado depende, em certo nível, do tamanho do lote e do tipo de produto.
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USP XL

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Nesta tabela, contida na USP XL, encontramos a quantidade a ser analisada, de cada
produto. Essa quantidade depende do tipo de produto a ser analisado e também da
quantidade/volume existente em cada recipiente. Dependendo da quantidade existente em
cada recipiente, todo o conteúdo ou apenas uma porcentagem dele deve ser submetida ao
teste.
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Além disso, a quantidade de itens a serem submetidos ao teste de esterilidade dependerá

do tipo de produto a ser analisado e da quantidade existente em cada lote. É evidente que a
probabilidade de aprovar um lote contaminado é reduzida com o aumento do tamanho da
amostra, porém existem limitações de ordem prática e econômica que impedem que a
quantidade a ser testada seja demasiadamente grande.
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PROBLEMAS INERENTES AO TESTE DE ESTERILIDADE

Escolha do meio de cultura

(Caldo Caseína Soja e Caldo Tioglicolato)

Natureza do produto

(produtos oleosos, com conservantes)

Evitar contaminação da amostra sob teste

(fluxo laminar, materiais e diluentes estéreis, pessoal

adequadamente treinado e paramentado)

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Vamos considerar alguns problemas que são inerentes ao teste de esterilidade:

- Escolha do meio de cultura, uma vez que a identidade de todos os potenciais
contaminantes é desconhecida. Na prática, apenas dois meios são recomendados, embora se
saiba ser o caldo tioglicolato tóxico para as células fragilizadas. Entretanto, ele é utilizado para
a detecção de microrganismos anaeróbicos e microaerófilos, caso estejam presentes.
- Natureza do produto pode se constituir em problema do ponto de vista da amostragem.
No caso de produtos oleosos como as pomadas oftálmicas, as células microbianas podem estar
na matriz do produto, tornando-se necessária a extração com solvente adequado. Por outro
lado, o produto pode apresentar conservantes, necessitando de inativação por meio de
diluição ou inativador específico. Pode-se, também, separar o microrganismo dos conservantes
pela filtração (lavando com diluente estéril – ex. água peptonada ou salina).
- Evitar a contaminação da amostra analisada. Na prática, o teste deve ser feito em capela
de fluxo laminar, usando materiais e diluentes estéreis. O pessoal responsável pelo teste deve
ser adequadamente treinado, vestimenta adequada e não ser envolvido em esquemas
rotacionais. Ainda assim, contaminação acidental do material-teste poderá ocasionalmente
ocorrer e um reteste, ou mesmo um segundo reteste, devem ser considerados.
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OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS

Avaliação da matéria-prima

Processo

Ambiente

Equipamento

 Esterilização após envase

(térmica, química ou irradiação)
 Esterilização (filtração) e envase
 Manipulação asséptica

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Como dito anteriormente, um produto somente poderá ser considerado estéril se ele for
processado em condições ótimas e se o resultado de uma amostra representativa, submetida
ao teste de esterilidade, indicar a ausência de microrganismos viáveis. Portanto, na obtenção
de produtos estéreis, vários aspectos devem ser levados em consideração. Tem início com a
avaliação das matérias-primas, passa pelo processo, ambiente e equipamento de forma a
assegurar condições de reduzido potencial de falha. Neste momento, devem ser considerados
os possíveis caminhos que conduzem aos produtos estéreis. Estes são definidos em função da
característica termolábil dos princípios ativos ou mesmo da embalagem primária, da
estabilidade química, custos, etc.
A produção de estéreis pode subdividir-se em três grandes grupos:
 Quando o produto é envasado e fechado em seu recipiente primário e em seguida
esterilizado.
 Quando o produto é esterilizado através de filtração e envasado, sob condições
assépticas, em recipientes previamente esterilizados.
 Quando o produto não pode ser esterilizado por filtração nem por esterilização final e,
consequentemente, tenha que ser produzido a partir de matérias-primas estéreis e envasado,
de forma asséptica, em recipientes previamente esterilizados.
A esterilização final, quando possível, deve ser o método de primeira escolha para todos os
produtos estéreis.
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PRODUTOS FARMACÊUTICOS ESTÉREIS

Produtos destinados à administração parenteral, contato com a

pele danificada, mucosas ou órgãos internos

 Preparações oftálmicas: gotas, loções (para lavagem e banho dos olhos),

pomadas oftálmicas, soluções de lentes de contato, soluções de limpeza

 Implantes: pequenos dispositivos contendo drogas, inseridos sob a pele ou

tecido muscular

 Hemostáticos absorvíveis: celulose oxidada (gaze branca), espuma de gelatina,

espuma de fibrina humana

 Suturas cirúrgicas

 Injeções

 Fluidos estéreis não injetáveis: água não injetável (água utilizada durante
cirurgia para irrigação da ferida), soluções de diálise peritoneal, soluções de
inalação

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Os produtos farmacêuticos que devem ser estéreis são aqueles destinados à administração
parenteral, contato com a pele danificada, mucosas ou órgãos internos. São eles:
 Preparações oftálmicas: gotas, loções (para lavagem e banho dos olhos), pomadas
oftálmicas, soluções de lentes de contato, soluções de limpeza;
 Implantes: pequenos dispositivos contendo drogas, inseridos sob a pele ou tecido
muscular;
 Hemostáticos absorvíveis: celulose oxidada (gaze branca), espuma de gelatina, espuma
de fibrina humana;
 Suturas e materiais cirúrgicos;
 Injeções;
 Fluidos estéreis não injetáveis: água não injetável (água utilizada durante cirurgia para
irrigação da ferida), soluções de diálise peritoneal, soluções de inalação;
 Instrumentos e equipamentos de uso invasivo.
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MICRORGANISMO É DEFINIDO COMO MORTO

- Não mais prolifera em meios de cultura

- Proliferação de poucas gerações

MORTE DOS MICRORGANISMOS NÃO OCORRE SIMULTANEAMENTE:

SEGUE A CINÉTICA DE PRIMEIRA ORDEM

MESMA FRAÇÃO É MORTA A CADA UNIDADE DE TEMPO

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Antes de se começar a falar em métodos para avaliar a esterilidade de um determinado

produto, é necessário definir o conceito de morte, associado aos microrganismos.
Um microrganismo é definido como morto quando ele não mais prolifera em meios de
cultura, o que pode ser verificado através da turvação em meio líquido ou surgimento de
colônias em meio sólido; ou é capaz de proliferar-se apenas por poucas gerações. Um
organismo único (1 UFC) deve ser capaz de se proliferar através de muitas gerações para ser
detectado; portanto, um microrganismo que não possa se reproduzir, ou possa fazê-lo apenas
por poucas gerações pode, por este critério, ser considerado como morto.
Na prática não se dispõe de meio de cultura que seja ideal ao desenvolvimento de qualquer
cepa microbiana. Além disto, organismos que sobreviveram a um potencial processo letal
apresentam requisitos metabólicos específicos, podendo não ser recuperados em meios de
cultura usuais. Como consequência direta de tais fatos é que a expressão livre de formas
demonstráveis de vida tem sido empregada como sinônimo de estéril.
A morte dos microrganismos submetidos a um processo de esterilização não ocorre
simultaneamente, ou seja, segue a cinética de primeira ordem onde a mesma fração de
microrganismos é morta a cada unidade de tempo. Isto resulta numa linha reta quando o log
do número de organismos sobreviventes é colocado em gráfico contra o tempo. Esterilidade é,
portanto, um estado absoluto e que não pode ser garantido. Ainda assim, todo o esforço é
feito no sentido de assegurar carga inicial extremamente baixa, de maneira que, na sequência
dos tempos crescentes do processo esterilizante, níveis de potenciais negativos elevados
correspondam à condição de probabilidade ínfima quanto à presença microbiana.
O processo de esterilização para inativação microbiana segue efetivamente o critério de
redução logarítmica, embora não se possa dizer o mesmo do processo de filtração, onde todos
os microrganismos são removidos ao mesmo tempo.
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CINÉTICA DE INATIVAÇÃO MICROBIANA

Processo esterilizante:
- população inicial (biocarga)
- cinética de inativação desta população ao agente

Perda da viabilidade
- regular
- velocidade de inativação diretamente proporcional ao número da
população em cada tempo

Expressão de resistência
Valor D
- tempo de exposição necessário para redução de 90 % da
população microbiana
- tempo necessário para reduzir um ciclo logarítmico na curva
sobreviventes
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O planejamento de um processo esterilizante, com uma probabilidade definida de

ocorrência de sobreviventes, depende do conhecimento da população inicial de
microrganismos no produto e da cinética de inativação, desta população, quando exposta ao
efeito letal.
Quando uma população homogênea de organismos é exposta a um processo letal, a perda
da viabilidade ocorre de maneira regular, sendo a velocidade de inativação diretamente
proporcional ao número da população, em cada tempo.
A resistência de uma determinada população de microrganismos a um processo de
esterilização pode ser expressa como o valor D. O valor D pode ser definido como o tempo de
exposição necessário para a redução de 90% da população microbiana, ou seja, é o tempo de
exposição ao agente letal necessário para reduzir um ciclo logarítmico na curva de
sobreviventes. Quanto menor o valor de D, mais sensível é o microrganismo ao processo.
Normalmente, o planejamento dos protocolos de esterilização expressa a inativação
microbiana em termos do valor de D.
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CINÉTICA DE INATIVAÇÃO MICROBIANA

Menor D microrganismo mais sensível

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O valor de D pode ser estimado graficamente. Para a determinação do valor D através da

enumeração direta, uma população conhecida de microrganismos é exposta ao agente letal
em questão, sendo as amostras retiradas após diferentes tempos de exposição ao processo. O
número de sobreviventes é estimado por método de contagem validado (plaqueamento), em
meio de recuperação adequado. Os dados de Unidades formadoras de Colônias (UFC) em
função do tempo são considerados para gerar uma curva de sobreviventes, que permite a
determinação do valor de D.
Quanto menor o valor de D, mais sensível é o microrganismo ao processo.
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CONTROLE NA PRODUÇÃO DE ESTÉREIS

Validação do ambiente
- qualidade do ar
- procedimento de limpeza

Pessoal

Validação do processo

Validação do produto

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Hoje é universalmente aceito que todos os produtos farmacêuticos devem ser produzidos
com condições de higiene e limpeza, variáveis de acordo com suas particularidades. Para os
produtos estéreis, submetidos à esterilização final, torna-se necessário o atendimento a baixos
níveis de bioburden, apenas possíveis em ambiente limpos, para garantir confiabilidade no
processo esterilizante, assim como, garantir baixa contaminação endotóxica no produto
acabado.
Para a produção de produtos estéreis é preciso garantir que o procedimento de limpeza e
de manutenção da qualidade do ar estejam validados. Além disso, o pessoal deve estar
devidamente treinado e paramentado. Com relação à validação do processo esterilizante,
vários aspectos devem ser considerados: qualificação do esterilizador, da instalação e da
operação, sem esquecer da documentação (protocolos completos, relatórios de validação,
etc), que é de fundamental importância. Para cada produto a ser esterilizado, devem haver
cuidadosas considerações à adequação do método de esterilização proposto e validação do
produto, após esterilização. Para produtos estáveis ao calor, o processamento em autoclave,
no acondicionamento final, é usualmente o método de escolha. Para esterilização gasosa, deve
ser dada atenção a possíveis reações do produto com o gás esterilizante. A principal
consideração sobre o processo de filtração envolve velocidade do fluxo e alterações
superficiais do filtro. Interações do produto com o filtro ou seus elementos também dever ser
levados em consideração porque podem se constituir em problema.
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SISTEMA DE CLASSIFICAÇÃO DO AR NA ÁREA LIMPA DESTINADA

À PRODUÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS (WHO)

http://apps.who.int/medicinedocs/pdf/h3009e/h3009e.pdf
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Essas tabelas demonstram a classificação do ar, quanto ao limite de microrganismos e de

partículas, na área limpa destinada à produção de produtos estéreis, de acordo com a
Organização Mundial de Saúde. A classe da área limpa a ser utilizada dependerá do processo a
ser utilizado e se a esterilização ocorrerá no final ou não do processo.
As áreas limpas para a fabricação de produtos estéreis são classificadas de acordo com as
características exigidas do ambiente. Cada operação de fabricação requer um nível de limpeza
ambiental adequado no estado operacional, a fim de minimizar os riscos de contaminação
microbiológica ou particulada do produto ou materiais sendo manipulados. O saneamento de
áreas limpas é particularmente importante. Eles devem ser limpos com frequência, de acordo
com um programa escrito aprovado. O monitoramento deve ser realizado regularmente, a fim
de detectar o surgimento de cepas resistentes de microrganismos. Tendo em vista à sua
eficácia limitada, a luz ultravioleta não deve ser usada como substituto à desinfecção química.
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SISTEMA DE CLASSIFICAÇÃO DO AR NA ÁREA LIMPA DESTINADA

À PRODUÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS

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Nessa tabela podemos verificar a comparação entre diferentes classificações quanto ao

material particulado encontrado nas áreas limpas, destinadas à produção de produtos estéreis.
Abaixo estão as referências de 1 a 4, citadas na legenda da figura.
1. Good manufacturing practices for pharmaceutical products. In: WHO Expert Committee
on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-second report. Geneva, World Health
Organization, 1992, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 823).
2. Airborne particulate cleanliness classes in cleanrooms and clean zones. Federal Standard
209E. Mount Prospect, IL, Institute of Environmental Sciences, 1992.
3. Cleanrooms and associated controlled environments. Part 1: classification of airborne
particulates. Geneva, International Organization for Standardization, 1999.
4. The rules governing medicinal products in the European Union. Vol. 4. Good
manufacturing practices: medicinal products for human and veterinary use. Brussels, European
Commission, 1998.
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QUALIDADE DO AR
Baixa concentração partículas 0,5 m
Ausência de partículas de 5 m
Redução de partículas de 0,1-0,3 m – FILTRAÇÃO

RETENÇÃO DAS PARTÍCULAS PELO FILTRO DEPENDE:

- tamanho da partícula
- velocidade de passagem do ar pelo filtro

ULPA – filtros de ar ultra baixo particulado (99,99996% -

partículas de 0,12 m)

HEPA – filtros de alta eficiência (99,9997% - partículas de 0,3

m)
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A qualidade do ar utilizado nas indústrias farmacêuticas, para permitir obediência aos

padrões descritos, necessita atender a exigências rígidas, com baixas concentrações de
partículas de 0,5 m, além da ausência daquelas com 5 m. A redução das partículas entre 0,1
e 0,3 m é conseguida pelo processo de filtração. A capacidade de retenção das partículas,
pelo filtro, irá depender do tamanho das partículas e da velocidade de passagem do ar, pelo
filtro.
A tecnologia atual permite a produção comercial de filtros de ar ultra-baixo particulados
(ULPA) que tem eficiência de reter 99,99996% das partículas com 0,12 m. Entretanto, mesmo
para as finalidades mais rígidas da área farmacêutica, filtros apresentando 99,9997% de
eficiência partículas de 0,3 m mostram-se inteiramente adequados. Esta especificação
corresponde aos filtros classificados genericamente como HEPA, também conhecidos como
filtros absolutos, constituídos de micro partículas de vidro, repelentes à água, com diâmetro
de fibra de cerca de 0,1 m.
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CONTROLE DA QUALIDADE DO AR

Contador de partículas totais

Monitorização microbiológica (bactérias e fungos)

Amostragem passiva (exposição de placas ou frascos)

Amostragem ativa (por impacto do ar através de fenda ou por

filtração)

VERIFICAÇÃO
- Limpeza da sala
- Falhas no sistema de filtração do ar
- Possível contaminação por intermédio pessoal produção

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O número de partículas no ar pode ser facilmente verificado empregando-se contadores de

partículas, usualmente com sistema a laser, portátil ou não, com ou sem impressoras, e tem
como vantagem a leitura imediata dos resultados.
Tratando-se de área farmacêutica limpa, deve-se realizar a monitorização microbiológica,
que poderá ser realizada por meio de amostragem passiva ou ativa. A contaminação por
bactérias e fungos é verificada utilizando-se meios de cultura adequados, assim como
temperaturas e tempos de incubação. Agar caseína soja, 35°C por 72h e Sabouraud Dextrose
Agar, 22°C por 96h são os meios oficialmente empregados para a contagem de bactérias e
fungos, respectivamente. A amostragem passiva deve ocorrer em posições definidas durante
período de atividade normal na área, podendo ser por processo gravitacional usando meios de
cultura (placas ou frascos de boca larga) abertos por período mínimo de 60 minutos, uma vez
que a sedimentação de partículas estará sujeita à turbulência do ar. O tempo máximo de
exposição das placas deve ser de 4 horas para impedir que a desidratação do meio possa
prejudicar na recuperação dos microrganismos. A amostragem por exposição das placas
abertas é considerada qualitativa.
A amostragem ativa do ar pode ser considerada quantitativa quando um volume conhecido
de ar é amostrado por um período de tempo definido, e o resultado é expresso como o
número de UFC/m3 de ar amostrado. Essa amostragem pode ser realizada colocando-se placas
com meio de cultura, em câmaras fechadas, com o fluxo de ar atingindo-as diretamente. Neste
caso, uma desvantagem seria a agressão a estas células, levando ao risco de dificultar ou
impedir a proliferação dos microrganismos, nas condições usuais. Além disso, pode-se utilizar
membranas para filtrar uma quantidade definida de ar e, a seguir, transferir essas membranas
para a superfície de meios de cultivo sólidos.
O controle da qualidade do ar serve para verificar:
- A limpeza da sala
- Possíveis falhas no sistema de filtração do ar
- Possível contaminação ocorrida por intermédio do pessoal da produção
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CONTROLE DE QUALIDADE DE SUPERFÍCIE

Paredes, pisos, equipamentos

Métodos utilizados:
. Swabs – solução fisiológica  contagem por plaqueamento ou
filtração
. Placas de contato.

VALORES MÁXIMOS SUGERIDOS PELA USP

Superfícies e equipamentos:

Classe 100 - 3 UFC (inclusive piso)

Classe 10.000 – 5 UFC (geral)

10 UFC (piso)

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O monitoramento da qualidade das superfícies (paredes, pisos, equipamentos) fornece

informações a respeito da biocarga presente nesses locais, podendo ser utilizado para avaliar
os procedimentos de limpeza e desinfecção, bem como o potencial de contaminação cruzada.
Dois métodos são rotineiramente utilizados no monitoramento das superfícies:
. Swabs, que permitem amostrar ângulos, fendas e superfícies irregulares onde seria
impraticável o uso da placa de contato. O swab é umedecido em diluente estéril (ex. solução
salina), friccionado sobre a área amostrada e transferido diretamente (deve ser levemente
girado sobre a superfície do Agar) para a placa contendo meio nutriente ou para diluente
estéril que será, posteriormente, submetido a contagem (plaqueamento em profundidade ou
filtração).
. Placas de contato: opção de escolha para superfícies planas devido à facilidade de
utilização. As placas devem ser pressionadas por, pelo menos 10 segundos, no local da
amostragem, tampadas e incubadas. A eficiência de recuperação dos microrganismos pode ser
influenciada pela natureza do acabamento da superfície.
Valores máximos sugeridos pela USP para superfícies e equipamentos:
Classe 100 - 3 UFC (inclusive piso)
Classe 10.000 – 5 UFC (geral)
10 UFC (piso)
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CONTROLE DE QUALIDADE DO PESSOAL

Importantes características: qualificação,

treinamento e motivação

meio cultura sólido - pessoa coloca a mão após a

higienização

número e tipo de bactérias desenvolvidas

ausência de coliformes

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Com relação ao monitoramento do pessoal, as mais importantes características envolvendo

os operários em uma área limpa são: qualificação, treinamento e motivação. Ainda assim,
alguns controles microbiológicos são desejáveis e outros imprescindíveis. Pelo fato das pessoas
serem a principal fonte de contaminação em uma sala limpa, é necessário monitorar a
“superfície” das pessoas, ou seja, monitorar a contaminação das luvas e da paramentação. O
monitoramento das luvas pode dar-se pela pressão da mão com a luva sobre a superfície do
meio de cultura, em uma placa. A placa é incubada e as UFC contadas. O monitoramento da
paramentação inclui áreas de maior risco potencial de contaminação como antebraço e peito.
O número e tipo de microrganismos desenvolvidos irá indicar a possível fonte de
contaminação. A ausência de coliformes é universal, pois são indicadores de maus hábitos de
higiene. Para que os resultados sejam satisfatórios, todos os locais testados devem atender
aos critérios de aceitação estabelecidos para cada tipo de área.
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CONTROLE DO PROCESSO – Produtos envasados

assepticamente

ENCHIMENTO SIMULADO (MEDIA FILL)

- Feito após qualificação do equipamento e validação do

processo de esterilização, treinamento do pessoal e após
monitoração ambiental

- Worst case
. Uso de materiais e componentes que tenham
permanecido na área de processamento asséptico por períodos
extensos;
. Alterar o tempo de enchimento das unidades;
. Empregar meio com capacidade promotora de
crescimento (ao invés de conservantes).
. Tamanho e tempo da corrida devem mimetizar a
condição de produção comercial

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Para uma nova planta ou processo de produção para produtos assepticamente envasados,
o teste de enchimento simulado (Media Fill) é efetuado como parte da validação. A condução
dos testes de simulação do processo para produtos assepticamente envasados abrange do
ponto de esterilização do produto e recipiente, até o término do enchimento. Geralmente 3
simulações consecutivas do processo são efetuadas para qualificar uma nova planta ou linha
de enchimento. Os testes iniciais devem ser conduzidos após ter sido feita a qualificação do
equipamento e validação do processo de esterilização, treinamento do pessoal e após a
monitoração ambiental evidenciar condições adequadas. Em plantas pré-existentes, esse teste
deverá ser efetuado no mínimo duas vezes ao ano.
Uma das técnicas mais prevalentes utilizadas na validação de processos farmacêuticos
adota o cenário de pior caso. Estas situações visam proporcionar o maior desafio ao processo,
sistema ou equipamento sob validação. Sendo assim, utilizam-se materiais e componentes que
tenham permanecido na área de processamento asséptico por períodos extensos; altera-se o
tempo de enchimento das unidades, enchendo-se as unidades menores a uma velocidade
maior (dificuldade de manuseio) e as maiores a uma velocidade menor (maximizando a
exposição); emprega-se meio de cultura, com capacidade promotora de crescimento, ao invés
da formulação com conservantes; ainda, o tamanho e tempo da corrida devem mimetizar a
condição de produção industrial.
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INTERPRETAÇAO DOS RESULTADOS

NÚMERO MENOR QUE 5000 Nenhuma unidade

UNIDADES contaminada

Processo confiável

Uma unidade contaminada deveria

resultar em uma investigação,
incluindo repetir o media fill
5000 A 10000
UNIDADES
Duas unidades contaminadas
revalidação da linha, seguido por
investigação

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Independente do número de unidades enchidas ou de positivos aceitos, o objetivo será

sempre zero de positivos. Se um produto, submetido ao Media Fill, não apresenta organismos
viáveis, o sistema possui elevado nível de confiabilidade. Porém há numerosos problemas
técnicos para se atingir este objetivo. Meio e produto simulado não correspondem
exatamente ao produto real em termos de características de processamento e de
propriedades que permitam o crescimento. Conforme estabelecido pelo FDA, qualquer
unidade contaminada deve ser investigada. A identificação do microrganismo permite
investigar as possíveis causas, bem como a avaliação de seu impacto sobre medicamentos
comercializados, enchidos na mesma linha, desde o Media Fill anterior bem sucedido.
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CONTROLE DO PROCESSO – Produtos obtidos por

processo de esterilização final

- Baixo nível de contaminação

- Confiabilidade no processo esterilizante (validação do

processo)

- Garantir baixa contaminação endotóxica no produto

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Como dito anteriormente, a esterilização final deve ser o método de escolha para a
obtenção de todos os produtos estéreis, sempre que for possível. Entretanto, alguns requisitos
que se fazem necessários serem cumpridos para que o método seja confiável são: - Baixo nível
de contaminação inicial; - Confiabilidade no processo esterilizante a ser utilizado e; - Garantia
de baixa contaminação endotóxica no produto, o que é conseguido através de um baixo nível
de contaminação inicial.
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CONTROLE DE QUALIDADE DO PROCESSO DE

ESTERILIZAÇÃO FINAL - Autoclavação

- Verificar calibração dos sensores de temperatura e pressão

- Distribuir os sensores em diferentes pontos e verificar a

homogeneidade da temperatura e pressão

- Realizar esses testes com a autoclave vazia e com a sua

capacidade máxima – cumpre os critérios de aceitação?

- Utilizar indicadores físicos e biológicos adequados

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Tomando-se como exemplo o método de esterilização por calor úmido, para validar o
método é preciso:
- Verificar calibração dos sensores de temperatura e pressão;
- Distribuir os sensores em diferentes pontos e verificar a homogeneidade da temperatura
e pressão;
- Realizar esses testes com a autoclave vazia e com a sua capacidade máxima – cumpre os
critérios de aceitação?
- Utilizar indicadores físicos e biológicos adequados.
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CONTROLE DA EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE

ESTERILIZAÇÃO

INDICADORES

Indicadores físicos ou químicos: substância susceptível de

alterações irreversíveis ao método de esterilização

Indicadores biológicos: microrganismos específicos,

representados por cepas de elevada resistência ao processo,
na forma esporulada

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O uso de indicadores (físicos, químicos ou biológicos) foi introduzido com o objetivo de

assegurar cada vez mais a eficiência dos processos esterilizantes; visto que o próprio teste de
esterilidade, numa amostra representativa, não tem condição absoluta de informação sobre a
esterilidade do conjunto das unidades submetidas ao processo.
Os indicadores podem ser classificados em:
- Indicadores físicos ou químicos: substâncias susceptíveis a alterações irreversíveis pelo
método de esterilização;
- Indicadores biológicos: microrganismos específicos, representados por cepas de elevada
resistência ao processo esterilizante, na forma esporulada (forma mais resistente do
microrganismo).
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INDICADOR FÍSICO OU QUÍMICO

 Monitoramento químico/físico do processo de

esterilização baseado na capacidade do agente
esterilizante alterar as características químicas e/ou
físicas de substâncias

 Alteração das características químicas ou físicas –

indica que condições satisfatórias de esterilização foram
atingidas

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O monitoramento químico/físico do processo de esterilização é baseado na capacidade do

agente esterilizante em alterar as características químicas e/ou físicas das substâncias. A
alteração das características químicas ou físicas indica que condições satisfatórias de
esterilização foram atingidas.
Os indicadores podem ser colocados externamente ou internamente aos pacotes a serem
esterilizados. Indicadores colocados no interior dos pacotes devem estar posicionados em
locais de difícil acesso ao agente esterilizante; assim poderá se obter informações sobre falhas
na esterilização com relação à penetração do vapor ou concentração de óxido de etileno. Para
cada processo (autoclave, calor seco, radiação, óxido de etileno), existe um tipo de indicador
apropriado.
 Slide 24

INDICADOR FÍSICO OU QUÍMICO

 fitas de papel impregnadas com tinta termocrômica que

mudam de cor quando expostas a temperaturas elevadas,
por certo tempo

 indicadores específicos de temperatura

ponto de fusão – indica que a temperatura foi atingida

 indicadores integradores: indicam a ação de diferentes

componentes como tempo, temperatura e umidade -
integram vários parâmetros de esterilização

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Os indicadores químicos/físicos podem ser fitas de papel impregnadas com tinta

termocrômica que mudam de cor quando expostas a temperaturas elevadas, por certo tempo.
Eles podem indicar a exposição ou não a uma determinada temperatura (indicadores
específicos de temperatura) ou podem indicar a ação integrada de diferentes componentes
como tempo, temperatura e vapor (conhecidos como indicadores integradores).
No indicador integrador, o reagente químico é liberado gradativamente, na medida em que
ocorre a combinação dos parâmetros de temperatura, umidade e tempo de exposição.
Indicada a colocação em pacotes de difícil acesso do vapor.
 Slide 25

Alterações destes indicadores não necessariamente indicam

esterilidade microbiológica

IDEAL: associação indicador químico e biológico

VANTAGENS
Baixo custo
Indicação imediata (não é preciso cultivar o microrganismo)

DESVANTAGEM
Não é representativo das reais condições de esterilização

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Entretanto, as alterações nesses indicadores químicos/físicos não indicam,

necessariamente, a esterilidade microbiológica. O ideal é a associação de um indicador
químico a um biológico.
As vantagens da utilização de indicadores químicos/físicos é o baixo custo e a indicação
imediata do resultados (não é preciso cultivar o microrganismo). Por outro lado, não é
representativo das condições reais de esterilização, ou seja, não diz se o processo foi ou não
capaz de matar o microrganismo.
 Slide 26

INDICADOR BIOLÓGICO

Deve apresentar resistência ao método de esterilização em questão

 Adição do indicador diretamente ao produto a ser utilizado

 Uso de suportes (tiras ou discos de papel)

Utilização: Desenvolvimento, validação e monitoramento dos

processos de esterilização

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O uso de indicadores biológicos permite comprovar a eficiência da esterilização, uma vez

que o crescimento de microrganismos, após ser submetido ao processo de esterilização, é
diretamente testado. Este indicador deve apresentar resistência ao método de esterilização
em questão e, geralmente, são utilizados esporos, ao invés de células vegetativas, por serem a
forma mais resistente do microrganismo. Os indicadores biológicos consistem em uma
preparação padronizada de esporos bacterianos, em suspensões que contêm em torno de 10 a
6 esporos por mL ou unidade de papel.
A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa e, sempre que possível, o
indicador deve ser inoculado no próprio produto, de modo a assemelhar-se ao máximo à
condição em que se encontra o contaminante natural, frente ao processo.
Quando não existe a possibilidade de inocular o bioindicador no produto em questão, estes
microrganismos podem ser veiculados em suportes como tiras ou discos de papel, e colocados
em recipientes de vidro, metal ou plástico (envelopes contendo tiras de papel impregnada com
esporos ou ampolas contendo os esporos em meio cultura líquido). Este recurso deve ser
evitado sempre que possível, visto que as condições são diferentes daquelas em que se
encontra o produto, quando da esterilização, podendo oferecer maior ou menor resistência ao
tratamento.
Após o processo de esterilização, os indicadores biológicos são incubados nas condições
adequadas para o crescimento dos mesmos. A ausência de crescimento é indicação de que o
processo foi eficiente sobre esses microrganismos, podendo-se considerar tal fato abrangente
aos possíveis contaminantes do produto (mais sensíveis ao método de esterilização). Sendo
assim, houve eficiência esterilizante do processo empregado.
 Slide 27

PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DE UM INDICADOR

BIOLÓGICO

O indicador deve ser em número e resistência superior ao

viável natural

Resistência estável e reprodutível, manutenção das

características bioquímicas e genéticas da espécie (constatação
periódica da manutenção da viabilidade)

Crescimento ótimo quando colocado em condições

fisiológicas da espécie

Não ser patogênico, não produzir endotoxinas

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As principais características de um indicador biológico são:

- Deve ser em número e resistência superior ao contaminante natural;
- Resistência estável e reprodutível, relacionada com a manutenção das características
bioquímicas e genéticas da espécie. É necessária a constatação periódica da manutenção da
viabilidade desses indicadores;
- Crescimento ótimo quando colocado em condições fisiológicas da espécie;
- Não ser patogênico e não produzir endotoxinas, pois, embora os métodos de esterilização
sejam capazes de matar os microrganismos, poucos métodos são capazes de eliminar as
endotoxinas. Sendo assim, não queremos microrganismos produtores de endotoxinas em uma
planta destinada à produção de produtos estéreis.
 Slide 28

MONITORIZAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO

 conhecer o produto a ser esterilizado

 conhecer o estado de contaminação em que se encontra

o produto

 tipo e número de microrganismos que normalmente

contaminam o produto

 número de esporos recomendado para cada unidade de

produto varia de 105 a 107 – quanto maior o inóculo, maior a
segurança do resultado

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Para a monitorização do processo de esterilização, utilizando-se indicadores biológicos, é

necessário:
 conhecer o produto a ser esterilizado;
 conhecer o estado de contaminação em que se encontra o produto;
 conhecer o tipo e número de microrganismos que normalmente contaminam o produto,
de modo que o indicador seja em número e resistência superior ao natural.
O número de esporos recomendado para cada unidade de produto varia de 105 a 107 –
quanto maior o inóculo, maior a segurança do resultado obtido.
 Slide 29

CRITÉRIOS NA UTILIZAÇÃO DE INDICADORES

BIOLÓGICOS

Inocular o microrganismo no próprio produto

Veicular o microrganismo em suportes como tiras ou

discos de papel

Localização das amostras inoculadas ou dos suportes

dentro do esterilizador

- densidade dos materiais

- estratificação de gases
- umidade do esterilizador

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Alguns critérios que devem ser definidos quando da utilização dos indicadores biológicos:
- Inocular o microrganismo no próprio produto ou em suportes como tiras ou discos de
papel;
- Definir a localização das amostras inoculadas ou dos suportes dentro do esterilizador;
- A localização das amostras inoculadas ou dos suportes dentro do esterilizador é bastante
crítica, devendo-se lembrar de fatos como densidades maiores de materiais, estratificação de
gases ou na umidade do esterilizador, que podem oferecer condição inadequada de
esterilização.
Após o processamento dos indicadores, eles devem ser incubados para se verificar se as
cepas ainda são viáveis. As condições de incubação e o meio em que os indicadores devem ser
incubados devem ser fornecidos pelo fabricante do indicador biológico. O indicador que foi
submetido ao processo de esterilização é incubado nas mesmas condições e juntamente com
outro indicador que não tenha passado pelo processo, a fim de se verificar a viabilidade das
cepas e se as condições de incubação utilizadas foram adequadas para o crescimento
bacteriano. A realização dos testes biológicos deve ser, no mínimo, semanalmente e após cada
manutenção ou suspeita de mau funcionamento. No processo de esterilização a óxido de
etileno o teste deve ser realizado em cada ciclo de esterilização devido à complexidade do
processo e à maior probabilidade de falhas.
 Slide 30

INDICADORES BIOLÓGICOS: MAIS ACONSELHADOS

Utilização do indicador durante o processo industrial –

provas seguras da eficácia do tratamento

Oferecer aos indicadores condições adequadas de

crescimento

Ausência de crescimento: processo esterilizante eficiente

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A utilização de indicadores biológicos é mais aconselhada porque, durante o processo

industrial, consiste em provas seguras da eficiência do processo esterilizante. Entretanto, é
importante oferecer aos indicadores as condições adequadas de crescimento, após serem
submetidos ao processo de esterilização. As condições ideais são fornecidas pelos
fornecedores dos mesmos. A ausência de crescimento desses microrganismos indica que o
processo esterilizante foi eficiente.
 Slide 31

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO

Indicador biológico

Bacillus subtilis (inóculo inicial > 105 , valor D = 5 - 10 min)

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR CALOR ÚMIDO

Indicador biológico

Bacillus stearothermophillus (inóculo inicial > 105 , valor D = 1,5 min)

Clostridium sporogenes (inóculo inicial > 105 , valor D = 0,8 min)

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Alguns microrganismos são indicados para a monitorização dos processos esterilizantes.

No caso de esterilização por calor seco, embora não exista um microrganismo ideal, Bacillus
subtilis é o mais indicado. Quando o calor seco for utilizado para despirogenização do material,
não há necessidade de usar o indicador biológico porque as elevadas temperaturas requeridas
são suficientes para esterilizar o material.
No caso de esterilização por calor úmido (autoclave), os microrganismos indicados são
Bacillus stearothermophillus e Clostridium sporogenes, ambos utilizados na forma esporulada.
Ambas as cepas apresentam comportamento logarítmico regular e reprodutível, além de
maior resistência aos respectivos processos que os constituintes usualmente isolados no
bioburden ou biocarga.
 Slide 32

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR ÓXIDO DE

ETILENO

Indicador biológico

Bacillus subtilis (inóculo inicial > 106-107 , valor D = 9 min)

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO

IONIZANTE

Indicador biológico

Bacillus pumillus (inóculo inicial 107-108)

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No caso da esterilização por óxido de etileno e radiação ionizante, os microrganismos mais

indicados são Bacillus subtilis e Bacillus pumillus, respectivamente.
 Slide 33

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Teste de integridade (não destrutivo): teste de ponto de bolha,

visualização de bolhas a uma determinada pressão aplicada

Teste de desafio bacteriológico (destrutivo): avalia a retenção do

microrganismo Brevundimonas diminuta (ATCC 19146) - 107 células
por cm2)

FILTRO É ESTERILIZANTE - FDA

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Para o controle do processo de esterilização por filtração, existem dois métodos para
garantir a eficiência do processo. Um deles é um teste não destrutivo (ponto de bolha),
enquanto o outro trata-se de um teste destrutivo (filtração de microrganismo). O teste de
ponto de bolha será discutido no próximo slide.
O teste de desafio bacteriológico irá avaliar a capacidade de retenção do microrganismo
Brevundimonas diminuta na membrana a ser avaliada. A escolha de B. diminuta decorre de sua
característica de crescimento, mantendo células isoladas, da sua dimensão reduzida (0,3 a 0,6
µm), de fácil manutenção e crescimento rápido, atingindo densidade óptica elevada
rapidamente. O teste é realizado filtrando-se uma suspensão com grande quantidade de
células desse microrganismo e avaliando-se a qualidade microbiológica do filtrado. Caso não
ocorra crescimento microbiano no filtrado, considera-se o filtro esterilizante.
 Slide 34

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Teste de integridade (não destrutivo): teste de ponto de bolha,

visualização de bolhas a uma determinada pressão aplicada

A teoria da pressão do ponto de bolha é frequentemente usada em um teste chamado

"teste de ponto de bolha". Esse teste é realizado para determinar a que pressão um fluxo
contínuo de bolhas é inicialmente visto a jusante de um filtro molhado, sob pressão de gás. É
realizado umedecendo, primeiramente, o filtro a ser testado com o solvente apropriado (água
para filtros hidrófilos, álcool para filtros hidrofóbicos). A seguir, o filtro molhado é colocado no
local apropriado e a saída do regulador de pressão de ar comprimido é ligada à entrada do
filtro de teste. Além disso, um pedaço de tubo flexível conecta a saída do filtro de teste a um
copo cheio de água. A partir da pressão zero, a pressão do filtro é aumentada gradualmente
utilizando um regulador de pressão. A extremidade submersa do tubo flexível é analisada
quanto à produção de bolhas, à medida que a pressão é aumentada, lentamente, em
incrementos de 0,03 bar. O ponto de bolha do filtro sob teste é alcançado quando as bolhas
são produzidas a uma taxa constante.
Esse teste é usado para estimar o tamanho dos poros dos filtros microporosos e para
confirmar a integridade dos filtros de membrana de esterilização e sistemas de filtração. O
teste do ponto de bolha determina a pressão mínima necessária para forçar o líquido para fora
dos poros, que é a medida do diâmetro do poro. Realizado o teste, se a pressão for superior ou
igual ao ponto de bolha mínimo esperado, indica resistência do material filtrante e o filtro
passa no teste de integridade. Se a pressão registrada for inferior ao ponto de bolha mínimo, o
filtro falhou no teste de integridade.
Slide 35

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Pinto, T.J.A.; Kaneko, T.M.; Pinto, A.F. Controle biológico de

qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e
cosméticos. 3ª Ed. Ateneu Editora, São Paulo, 2010.

- Farmacopéia Brasileira, 6ª Ed., ANVISA, 2019.

- United States Pharmacopoeia. 40th Ed. Rockville: United

States Pharmacopoeia Convention, 2017.

- www.anvisa.gov.br

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