Purificação de proteínas

ETAPAS PRÉVIAS – DECIDIR:

ƒ Fonte de proteína

ƒ Método para dosar a atividade biológica

ƒ Método para dosar a quantidade total

de proteínas
Extrato bruto
Extrato bruto
Centrifugação
Centrifugação
Centrifugação
Purificação de proteínas
ƒ solubilidade
ƒ tamanho
ƒ carga
ƒ afinidade de ligação
Purificação de proteínas

CADA ETAPA DA PURIFICAÇÃO:

ƒ TESTAR A ATIVIDADE BIOLÓGICA

ƒ DETERMINAR CONCENTRAÇÃO DE
PROTEÍNAS
 SOLUBILIDADE
Solubilidade
“Salting out”

“Salting in”

Força iônica (M)

 Exemplos de fracionamento
“salting out”

Fibrinogênio = 0,8 M de (NH4)2SO4

- Albumina = 2,4 M de (NH4)2SO4
“Salting out”
Diálise
Liofilização
 Cromatografia= separação de
componentes de uma mistura com base nas
diferenças de adsorção à uma matriz
insolúvel
Cromatografia em coluna
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Gel filtração : Sephadex - Agarose
Gel filtração : colunas
GEL FILTRAÇÃO
 GEL FILTRAÇÃO- calibração
Volumen
Glucagon
280
Citocromo c
240

Ribonucleasa
200
Seroalbúmina
160

120 IgG
Tiroglobulina

80

40

3 4 5 6
10 10 10 10
Peso molecular
GEL FILTRAÇÃO
Purificação de proteínas
Cromatografia
 Equipamentos, soluções e resinas
• Soluções tampão de pH
• Coluna de vidro com filtro
• Bomba peristáltica

• Coletor de frações
Espectrofotômetros
 GEL FILTRAÇÃO

• Baseia-se no peso molecular das proteínas da amostra

GEL FILTRAÇÃO
TROCA-IÔNICA
SUPORTES CROMATOGRÁFICOS

HOCH2
HOCH2
O O
H
O
O
OH H
O OH H H O
H CH2
H OH H OH O Dextrano
H H
Celulosa
n OH H O
OH
CH2
H OH O
H H
HOCH2
Agarosa
O OH H
OH O
O OH
H H OH
O H n
H
CH2 O
OH
O O OH
H

H H
n
TROCADOR CATIÔNICO
O
CH2 CH2 S O-
CH2 COO-
O
Carboximetil (CM) Sulfoetil (SE)

O O
CH2 CH2 CH2 S O- O P O-
O O-

Sulfopropil (SP) Fosfo (P)

 TROCADOR ANIÔNICO
CH3
CH2
CH2 CH3 CH2 CH2 N+ CH2 CH3
CH2 CH2 NH+
CH2
CH2 CH3
CH3

Dietilaminoetil (DEAE) Trietilaminoetil (TEAE)

CH3
CH2
CH2 CH2 N+ CH2 CHOH CH3
CH2
Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)
CH3
 TROCA-IÔNICA
- -
+ - + -
+ - -
+ + -
- +
- - + - - -
+
- +
- - -
- -- -
+
+ - +
- - - +
+ +
- + - -
+ - + - -
- - + - - - -
+ - + - - -
+ - + - -
+ -
+ - + -
+ -
-
Proteínas Maiores [SAL]
ligadas Baixas [SAL] Desprendem-se
ao trocador Desprendem-se as proteínas mais
iônico as proteínas menos eletronegativas
eletronegativas
 Bomba peristáltica

Generador
de gradiente

Cromatografia Columna
Resina de
intercambio
de troca- iônica iónico

Colector de
fracciones
 AFINIDADE
Baseia-se na AFINIDADE pelo suporte acoplado à resina

1 2 3
Cromatografia
de afinidade
SDS-PAGE

ELETROFORESE
EM GEL DE
POLIACRILAMIDA
COM SDS
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM SDS
SDS-PAGE

+
Coloração com Coomassie Blue
Coloração por prata