ATIVIDADE DE EPIDEMIOLOGIA

Você foi contratado por uma empresa multinacional para avaliar a resistência de 2
genótipos de Dendê a uma doença de etiologia desconhecida e de ocorrência no estado
do Pará. A partir dos dados de incidência da doença (em anexo), solicita-se:
1. Plotar as curvas de progresso da doença e Dy/Dt ao longo do tempo.
Genótipo 1

Genótipo 2

2. Descrever a curva de progresso da doença e todas as informações provenientes.

Para genótipo 1
 Severidade do genótipo I
120

100

80
Incidência

60

40

20

0
0 50 100 150 200 250 300 350

Dias

Genótipo 1
Y0= - 0,326
Início da epidemia = 30 26,67 de incidência
Término da epidemia = 310 99% de incidência
Taxa da epidemia = 0,01660
Yt50% = 89%
Ty50% = ± 85 dias

Para genótipo 2

Severidade do genótipo II
60
50
40
Incidência

30 inc
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350

Dias

Y0= 0,179
Início da epidemia = 30 20,83% de incidência da doença
 Término da epidemia = 310 55% de incidência da doença
Yt 50% = 41%
Ty50% = 200 dias

3. Para esses genótipos, existe diferença para o progresso da doença ao longo do

tempo (ANAVA – Análise de regressão)?
Sim. Os valores obtidos através da análise de regressão realizados no programa
estatísticos R e segue abaixo os resultados obtidos da ANAVA.
Modelo Genótipo 1 Genótipo 2
Monomolecular 0,00356** 0,00768**
Logístico 0,00461** 0,01190*
Gompertz 0,00375** 0,00927**
4. Se houver (Conferir o teste F da análise de regressão), ajustar e selecionar um
modelo para o progresso da doença ao longo do tempo. (Modelos
Monomolecular, Logístico e Gompertz)
5.
Genótipo 1
R2 Intercept Taxa=r Yo QM Coeficient Curva de
(coeficient o corrigid e de progresso
e de o correlação
variação)
0,9591 - 0,28208 0,0166 - 0,325 0,571 0,965 Monomolecula
r
0,9515 - 1,4323 0,02109 0,192 1,111 0,9928 Logístico
8
0,9576 - 0,8026 0,01862 0,107 0,752 0,983 Gompertz
4 3

Dados lineralizados
 Gráfico Real x estimado

Resíduos

Dy/dt

Genótipo 2
Genótipo 2
Coeficiente Intercepto Taxa=r Yo QM Coeficiente Curva de
de corrigido de progresso
variação) correlação
0,9321 0,1971019 0,002204 0,179 0,017352 0,9785 Mon
0
0,9094 -1,326883 0,005712 0,21 0,1591 0,9551 Lo
0,9231 - 0,003662 0,201 0,05477 0,9658 Gomp
0,4736784 6

Dados lineralizados

Gráfico Real x estimado

Resíduos
 Dy/dt

6. Para os dois genótipos, calcular:

a) A taxa de progresso da doença;

Modelos Genótipos 1 y0 Genótipos 2 y0
Monomolecular 0,0166 0,002204
Logísticos 0,02109 0,005712
Gompertz 0,0186 0,0036626

b) O inóculo inicial;

Gen 1 = - 0,0325 e Gen 2= 0,0179

c) AACPD;
Área Genótipo 1 Genótipo 2
A1 2980,833 1901,67
A2 5372,5 2747,5
A3 6755 3535
A4 6895 3885
Atotal 22003,33 12069,16

d) Quantidade de doença no tempo 365 dias.

Genótipo 1 Genótipo 2
Dias Yt= 1 –(1-y0)*exp(r*t) Yt= 1 –(1-y0)*exp(r*t)
365 0,99690,824 0,632742547
Yt = 1 – (1 – y0)*exp(-r*t) Yt= 1 – (1-y0)*exp(-r*t)
Yt = 1 – (1 – (- 0,326)*exp (-0,0166*365) Yt= 1 – (1 – 0,179)*exp(-
0,002204*365)
Yt= 99, 69% Yt= 63,27 %
 7. Existe diferença entre os 2 genótipos quanto à taxa (r) e AACPD? (Sugestão:
item 8.5.1.1, pág. 195, de Campbell e Madden (1990)).
Taxa ® AACPD
Genótipo 1 0,0166 22003,33
Genótipo 2 0,002204 12069,2

Comparando os dados acima observa-se que genótipo 1 ocasionou maior taxa e

área da AACPD, podendo ser que este genótipo apresente uma maior severidade em
relação ao outro genótipo.

8. Qual modelo se ajusta aos dados (para os 2 genótipos)?

De acordo com os dados apresentados foi observado que genótipo 1 e 2
representam o modelo monomolecular, porque apresentam maior R2, menor quadrado
médio dos desvios, maior coeficiente de correlação e o bom senso e forma da curva
dy/dt em comparação aos demais modelo, representados nas figuras abaixo e
representado nas questões anteriores principalmente no 4º.

Genótipo 1

Genótipo 2

9. Classifique o padrão da doença conforme proposto por Vanderplank.

 De acordo como foi observado que os genótipos 1, apresenta um comportamento
policíclico. O processo policíclico que envolve vários ciclos superpostos de infecção. A
epidemia, ou o policíclico, constitui-se na superposição de ciclos de infecção, dando
origem à cadeia de infecção. Cadeia de infecção implica na ocorrência de diversos
ciclos de infecção do patógeno durante um único ciclo de cultivo do hospedeiro.
Doenças que exibem essas características foram chamadas por Vanderplank (1963)
como doenças de juros compostos. As plantas infectadas no início de seu ciclo servirão
de fonte de inóculo do patógeno para posteriores infecções neste mesmo ciclo.
O genótipo 2 apresentou o processo monocíclico se faz dentro do escopo de
tempo de um único ciclo de infecção. Vanderplank (1963) deu o nome de doença de
juros simples ao patógeno que só completa um ciclo de infecção durante o ciclo de
cultivo do hospedeiro, de tal modo que plantas infectadas no início do ciclo da cultura
não servirão de fonte de inóculo para infecções futuras dentro do mesmo ciclo
(Bergamin et al., 2014).

10. Quais estratégias de manejo você recomendaria (Lembre-se dos princípios de

Whetzel) para reduzir o y0, r e t?
De acordo com os princípios de Whetzel et al (1925; 1929) são baseadas
exclusão, erradicação, proteção, imunização e terapia. Sendo que destes visando para
inóculo inicial são exclusão, erradicação e proteção.
A exclusão visa a prevenção da entrada e estabelecimento de um patógeno em
área indene e o seu modo de aplicação através da proibição, fiscalização e interceptação
de plantas e/ou partes vegetais, quando necessário e visa, essencialmente, impedir a
entrada de patógenos de alto potencial destrutivo. Essa erradição deve-se ser feita
através de medidas quarentenárias e legislações fitossanitárias promulgadas por órgãos
governamentais. Como medida de erradicação, eliminação de plantas doentes e
hospedeiro selvagens, roguing e desinfestação física e química do solo.
A proteção também é uma forma de prevenção do contato do patógeno com o
hospedeiro mediante de uso de fungicidas, bactericidas. Outro fator é a evasão Visa a
prevenção de doenças através de táticas de fuga dirigidas contra o patógeno e/ou contra
o ambiente favorável ao desenvolvimento da doença na ausência de variedades
resistentes, constitui-se na primeira opção de controle de doenças. Principais medidas
evasivas escolham de áreas geográficas, escolha do local de plantio, modificações de
práticas culturais. Deve-se levar em conta quantidade relativa de inóculo e condições
ambientais.

11. Compare, com exemplos, os valores de y0 e r para as duas situações hipotéticas:

a) Doenças causadas por patógenos que apresentam fácil dispersão, mas que não
tem fase de sobrevivência.
As doenças monocíclicas são plantas que infectam durante o ciclo da cultura não
servem de fonte de inóculo para novas infecções no mesmo, mas são de fácil
propagação e se enquadram Murchas de Fusarium, murchas de Verticillium,
Monilipthera perniciosa e roreri podridão dos frutos Phytophthora palmivora e heveae
doenças radiculares, tais como, Rhizoctonia solani, Pythium spp., Phytophthora sojae e
capsici.

b) Doenças causadas por patógenos do solo que produzem estruturas de

sobrevivência.
As doenças policíclicas são plantas infectadas durante o ciclo da cultura servem
de fonte de inóculo para novas infecções no mesmo ciclo. Produzem estruturas de
sobrevivência são ferrugens, oídios, míldios, manchas foliares: mancha amarela
(Drechslera tritici-repentis), mancha salpicada (Septoria tritici), manchas de
mycosphaerella (Mycosphaerella fragariae).
11. Relacione conteúdo da aula sobre análise temporal com seu projeto de
dissertação/tese e elabore:
Hipótese(s), Objetivo(s), Metodologia e Resultado(s) esperado(s).

Hipótese
Inoculação e seleção de fungos endofíticos isolados de frutos de cacaueiro retarda a
incidência de phytophthora ssp.
A incidência da doença ao longo dos 2 anos houve um progresso em função do tempo e
severidade da doença.

Objetivos
 Selecionar e identificar fungos endofíticos dos frutos de cacau coletados em
áreas de produção;
 Avaliar a sensibilidade de isolados de Phytophthora ssp. em contato com
 fungos endofíticos;
 Caracterizar o progresso temporal da phytophthora ssp. do cacau, com a
finalidade de servir de um modelo para a doença na cultura.

METODOLOGIA
Os experimentos será realizado em diferentes regiões produtoras da cultura do
cacau localizada no estado do Espírito Santos.

1. Obtenção dos isolados de fungos endofíticos

A seleção das árvores de cacau deverá ser baseada em quatro critérios: aparência
saudável, estado nutricional/ fisiológico bom e livre de qualquer tipo de aplicação de
produto químico/ biológico e escolhendo ao acaso aproximadamente 60 árvores. Após
as escolhas, os alvos para isolamento dos fungos serão tecidos internos de ramos e
galhos ( 1,5 a 2,5 cm de diâmetro) e casca do caule, deverá ser coletados com o uso de
um bisturi esterilizado de cada planta, em seguida, transferindo-se para placa de Petri
contendo meio de cultura batata-dextrose-ágar. Com auxílio de bisturi flambado serão
retirados cinco fragmentos com aproximadamente 25 mm2 retirados dos referidos
órgãos da planta transferindo-se para placas de Petri contendo 20 ml de meio de
batata-dextrose-agar (BDA) acrescentando 25 µg.mL-1 do antibiótico cloranfenicol.
Com o término, as placas ficaram mantidas em incubadoras a 25 0C no escuro.
Diariamente faz-se monitoramento visando observar estruturas fúngicas emergindo dos
fragmentos. Ao ser constatado o crescimento de micélio, ocorrerá a realização da
replicação, para isso inserindo os discos para as novas placas de petri contento meio de
BDA e incubadas nas mesmas condições descritas anteriormente. Após o crescimento
dos fungos devem ser enumerados, identificados e armazenados em sílica gel, conforme
a metodologia descrita por Dhingra & Sinclair (1995).

2. Identificação dos fungos endofíticos

Os fungos endofíticos isolados foram cultivados em BDA deverão permanecer

em uma incubadora a uma temperatura de 25 ºC, em 12 h de ciclo de luz e 12 h de ciclo
de escuridão com lâmpadas fluorescentes do tipo do dia (40 w) colocados a 40 cm
acima das placas permanecendo deste modo em torno de 5 a 8 semanas para indução
completa da esporulação. Os isolados que esporularem sob as condições descrita,
deverão ser classificados com base nas características de suas culturas e estruturas
reprodutivas. Taxa de crescimento, textura micelial, cor da colônia, formação e
produção de pigmentos serão as características das culturas observadas. Em relação aos
aspectos microscópicos de hifas e esporos, como também tamanhos e formas, bem
como a cor dos conidióforos e conídios.
Lâminas semipermanentes com essas estruturas serão preparadas de acordo com
a metodologia descrita por Hanada et al., (2010), para observação em um microscópio
de luz de forma aleatória, a observação das seguintes estruturas: hifas, conídios,
conidióforos, células conidióforos, células conióforos, células conidiogênicas e
picnídios. Todas essas características serão avaliadas para a identificação em chaves
taxonómicas (Carmichael et al. 1980; Sutton, 1980; Kiffer & Morelet, 1997; Barnet &
Hunter, 1998).

3. Obtenção e preservação do isolado de Phytophthora ssp

Phytophthora ssp. serão isolado a partir de frutos de cacaueiro, apresentando
sintomas e sinais de podridão-parda, coletadas em cidades produtoras de cacau. A partir
dos sinais do patógeno se sucederão o isolamento direto para placas de Petri contendo
BDA acrescidos de 25 µg.ml-1 de cloranfenicol. As placas serão mantidas a 25 0C, por
10 dias, no escuro. Posteriormente, discos de 3 mm de diâmetro cortados, com vazador
de cortiça esterilizado, e transferindo-se para frascos contendo água destilada
esterilizada. Os frascos contendo os discos de micélio de Phytophthora ssp. Deverão ser
armazenados em refrigerador a 5 0C.
A identificação se baseará nos características morfológicas e biométricas
observadas com auxílio de microscópio óptico. Deve-se levar em consideração os
sintomas da doença nos frutos, as características culturais do patógeno crescido em
meio, formato e tamanho do esporângio e comprimento do pedicelo. Comparando com
os descritos por Cerqueira et al. (1999).

4. Teste de patogenicidade

As mudas de cacau sadias serão plantadas em vasos e acondicionadas em casa

de vegetação. Utilizando-se quatro mudas por vaso e quatro repetições por isolado
aos 45 a 60 dias após a emergência (DAE), inocula-se 5 mL de suspensão no
substrato com 200 zoósporos mL-1 por muda após a inoculação, acondicionados em
bandejas com água. Três dias após a inoculação, as avaliações medindo-se o
comprimento e a largura das lesões no colo da planta e o número de desfolha. As
avaliações serão realizadas a cada 3 dias por um período de 30 dias (SOUZA, 2015).

5. Seleção dos fungos endofíticos

A avaliação do potencial dos fungos endofíticos no controle da podridão-

parda foi conduzida em campo e realizada em duas etapas. Na primeira etapa,
denominada preliminar, cada isolado deve ser inoculado em três frutos de cacaueiro,
não destacados da planta, aparentemente sadios, livres de ferimentos visíveis ou
outros defeitos, com aproximadamente quatro meses de idade. Para a inoculação
deverá utilizar pulverizador até o ponto de escorrimento.
Após a inoculação, os frutos são identificados e cobertos com sacos de
polietileno transparentes, umidecidos e amarrados com arame ao redor do
pendúnculo (câmara úmida), 24 horas antes e após a inoculação. Sete dias após a
inoculação dos endofíticos, os mesmos frutos são inoculados com uma suspensão de
Phytophthora ssp na concentração de 2,0 x 105 zoosporos.ml-1. Os tratamentos
controle serão considerados frutos inoculados somente com Phytophthora ssp.) e
 frutos pulverizados somente com água estelirizada. Oito dias após a inoculação do
patógeno, avalia a severidade da doença, conforme a escala de nota especialmente
desenvolvida: 1 – fruto livre de sintomas; 2 – lesões localizadas distinguíveis com
aproximadamente 2 cm de diâmetro ou 5 mm em estrias; 3 - lesões em expansão que
variam de 0,2 mm a 2 cm de diâmetro; 4 – lesões expandidas e/ou coalescidas com
diâmetro próximo a 25% da área inoculada, envolvendo outras lesões menores; 5 –
lesões expandidas e coalescidas acima de 25 % da área inoculada.
A segunda fase é a de seleção, oito fungos endofíticos que apresentarem ser
promissores no controle da doença foram submetidos a avaliação em 20 frutos. Para
a análise da variância, os dados do controle foram excluídos e as demais notas de
severidade foram transformadas em raiz quadrada. A comparação das médias foi
feita utilizando o teste Dunnett a 5% de probabilidade.

6. Curva do progresso da doença

A mudas de cacau foram adquiridas em viveiros certificados com 4 meses de

idades foram instaladas em uma áerea com espaço 3, 0 x 3,0 selecionandos 100
plantas dividos em 4 blocos sendo que desta 50 seram identificadas de forma
aleatória para a avaliação da intensidade da doença. Para que houvesse inóculo na
área, mudas de cacau com auxílio de um atomizador portátil com suspensão de (105)
de zoosporos de phytophthora palmivora conhecida como a podridão dos frutos e
após 24 horas de camara úmida foram plantada.
Semanalmente após a semeadura, avaliou a severidade da podridão nas plantas
demarcadas, com auxílio de uma escala diagrámtica no intervalos regulares de 7 dias.
Os modelos não lineares que utiliza para representar o crescimento das epidemias
como Logístico e o Gompertz serão usados para ajuste com os dados observados com
a utilização do software R 2.15.1. Os críterios estabelecidos para a comparação dos
modelos devido a função da qualidade do ajustamento dos dados:
a) Erro padrão da estimativa
b) Estabilidade dos parâmetros
c) Erro padrão dos resíduos
d) Visualização da distribuição dos resíduos ao longo do tempo
e) Pseudo R2

RESULTADOS ESPERADOS
Espera-se que os fungos endofíticos isolados dos frutos do cacaueiro retarda o
crescimento da doença Phytophthora ssp.
Adequação do melhor durante o ciclo da cultura que servirá de modelo para
trabalhos futuros de manejo da doença.