Sara Coelho

BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA 2022/23

 1. Modelo Drosophila
A Drosophila é o grande modelo de investigação em genética. O ratinho e a levedura são
importantes, mas a mosca tem um papel destacável pela longevidade que tem e resiliência.

O RNAi é originalmente descoberto em plantas e em C. elegans, mas também funciona em

mosca, sendo transformado numa técnica de manipulação de expressão génica que funciona em mosca.
Há a sorte de haver várias tecnologias, que mesmo não sendo descobertas em mosca, funcionam sempre
neste organismo, como o CRISPR, por exemplo. Como organismo de manipulação genética é sempre
permeável aos desenvolvimentos tecnológicos e parece não haver nada que a mosca não tenha.

Genética – é uma propriedade intrínseca dos organismos que explica os fenótipos que expressam, cuja
base material é o genótipo; tenta compreender esta base material e diz-nos também quais as regras que
determinam o processo de hereditariedade dessas características (como é que se transmite à
descendência).

Desde 1910, o grupo de Thomas Morgan inicia uma série de experiências em que catalogam
mutantes que ocorriam naturalmente nas populações que existiam no laboratório. O primeiro mutante
identificado é para o gene white, no cromossoma X. Este gene permite revelar um dimorfismo sexual,
por ser uma mutação recessiva. Como o macho é XY pode ter olhos brancos, enquanto a fémea tem olhos
vermelhos porque é heterozigótica (tem um alelo selvagem no outro cromossoma X).

Fizeram um mapa genético da Drosophila, mapeando as mutações que iam encontrando e

relacionando cada uma delas e as diferenças fenotípicas com um gene, e por sua vez, como é que essa
entidade física era transmitida de geração em geração, criando os padrões de hereditariedade.
Conseguiram também, através de combinações de pares dessas mutações, que ainda nem sabiam onde
elas estavam porque não se conhecia DNA, criar o mapa genético da Drosophila e perceberam como é
que cada um dos genes se posiciona em relação a outros.

O locus white tem dezenas de alelos diferentes, sendo que alguns são equivalentes
fenotipicamente e outros não. Não existe apenas olhos vermelhos e brancos: existem muitas mais cores
intermediárias. Há uma gradação fenotípica de cores.

Classificação alélica

✓ Alelos de perda de função

Nulo (Amorfo) – uma mutação que elimina totalmente a função do produto génico por inativação ou
eliminação. No caso do gene white forma um olho branco.

Hipomorfo – uma mutação na qual o produto génico está presente e desempenha sua função
normalmente, mas está presente em quantidades menores ou numa forma menos ativa. A perda de
alelos funcionais é geralmente recessiva. No entanto, existem Haplo-insuficientes: uma dosagem do
produto de tipo selvagem não é suficiente para garantir a função do tipo selvagem. O gene white contém
também genes hipomorfos, que estão abaixo do que deviam ser se fossem selvagens (fazem os olhos
com uma cor intermédia).

✓ Ganho de alelos de função

Hipermorfo – o produto génico é funcionalmente equivalente à forma selvagem, mas é produzido em

quantidades maiores ou numa forma mais ativa.

Neomorfo – o produto do gene é funcionalmente diferente do tipo selvagem e/ou é equivalente, mas
entregue num momento ou lugar errado. O ganho de função dos alelos é dominante.

✓ Antimorfo (Dominante Negativo) - O produto do gene antagoniza a função do produto do tipo

selvagem. Mutações em heterozigotia que originam fenótipo mutante (anulam o alelo selvagem).

Como modelo em investigação, a Drosophila tem 2 grandes linhas de referência: Oregon R. e

Canton S. Uma linha de referência é necessária para comparar o que quer que seja: o defeito disto é que
a referência não pode expressar a realidade no conjunto total, ou seja, não existe uma mosca que
corresponde ao genoma de todas as moscas no planeta.

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 Em qualquer posição do nosso genoma há 4 possibilidades de bases em cada posição e nenhuma
delas está errada (excepto se gerar um fenótipo mau). Na maioria dos nossos nucleótidos não há um
nucleótido certo, mas sim uma distribuição estatística do genoma pelo mundo - genoma de referencia
humano.

Estas duas linhas são representantes da Drosophila, mas não são sempre iguais porque estando
em laboratórios diferentes durante muito tempo, de certeza que a mesma espécie de referência já não é
igual: os stocks em locais diferentes acabam por nem ser iguais, apesar de ser a mesma referência.

No final do século XX temos a coroação deste sistema como modelo para grandes descobertas em
Biologia, quando se determinou a base genética da determinação eixo ântero-posterior do embrião da
mosca. À medida que as células do embrião vão proliferando, desde um zigoto inicial até criar uma massa
de células em proliferação, cada uma dessas células vai assumir um papel particular tendo em conta a
sua posição relativa dentro dessa massa crescente. Isto depende da capacidade de fazer mutações e de
determinar efeitos fenotípicos dessas mutações, e depois de poder isolar essas mutação e estudá-las uma
a uma. Neste caso, provoca-se estas mutações e isola-se essas mutações com centenas de milhares de
mutações diferentes (genes alterados independentemente) e tentou-se perceber qual o papel desses
genes num processo, neste caso, no estabelecimento do eixo ântero-posterior da Drosophila.

Se compararmos o selvagem (a) com

o mutante (b) vemos os vários segmentos
abdominais e torácicos, e vemos que a parte
anterior do embrião mutante desapareceu.
Durante o desenvolvimento embrionário da
mosca, o eixo ântero-posterior necessita do
gene bicoid para desenvolver a parte
anterior: este embrião não tem a
informação necessária para a construção da
extremidade anterior do seu plano corporal.

Com este tipo de abordagem,

dissecaram uma cascata que segmenta o
eixo ântero-posterior do embrião e encontram estas 4 classes que,
cronológica e hierarquicamente, transformam o embrião amorfo
(indistinto – bola de núcleos ou células) numa coisa com cabeça, cauda,
barriga, costas, esquerda e direita, através de uma sucessão de atividades
génicas: genes maternos, gap genes, genes de controlo par e gene de
polaridade segmentar. Estes genes vão partindo o animal aos bocados até
que tenha os 14 segmentos.

A Drosophila tem 4 pares de cromossomas, sendo que um deles é um par sexual. Foi neste
sistema que se percebeu a lógica da relação causal entre o tipo de cromossomas e o sexo desenvolvido
pelos animais. Aqui é um sistema XY (embora não seja igual ao dos humanos): o sexo é determinado pelo
rácio entre cromossomas X e autossomas.

Uma das coisas que fizeram foi desenvolver outras ferramenta como os cromossomas
balanceadores – cromossomas especiais que foram construídos combinando pedaços de cromossomas
que ia surgindo espontaneamente. Estes balanceadores são feitos através de recombinação de
fragmentos e depois da recuperação na geração seguinte e novamente o mesmo processo, o que demora
anos a fazer. São cromossomas incapazes de recombinar com um cromossoma selvagem porque são
constituídos por múltiplas inversões. Estão invertidos em relação ao homólogo, pelo que não há
reconhecimento entre os braços dos cromossomas, não há crossing-over e não permite a recombinação.
Estes cromossomas só podem mudar por mutação espontânea, nunca sofrem recombinação, sendo que
há muito mais variabilidade por recombinação do que por mutação. Estes cromossomas balanceadores
não são viáveis em homozigotia, uma vez que têm uma mutação letal recessiva (mata quando 2
cromossomas têm essa mutação, mas quando é só um cromossoma não mata).

Estes cromossomas contêm um ou mais marcadores dominantes e vários recessivos, sendo que
as mutações lhes dão marcadores fenotípicos: na forma da asas, na cor das asas, na cor do olhos, etc,
para se seguir visualmente quem é que herdava o quê e em que padrão.
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Transgénese

Outra coisa importante é a capacidade de transgénese, que é uma técnica relativamente fácil de
aplicar na mosca, abrindo a porta à possibilidade de alterar a informação que um indivíduo contém de
forma controlada para verificar o que que essa alteração vai criar no sistema. Isto faz-se através de uma
descoberta feita no milho de elementos transponíveis, que são pedaços de DNA que saltam de um lado
para o outro no genoma.

Na mosca descobriu-se que também

existem estes elementos, pelo que
transformaram isto numa nova tecnologia. Os
elementos móveis são pedaços de DNA
ladeados por sequências P5 e P3 que são
reconhecidas pela transposase. Cada vez que
temos esta enzima numa célula e no genoma houver estas sequências, a transposase reconhece as
sequências, corta-as e leva o pedaço de DNA entre elas para outro sítio do genoma, integrando-o. A partir
daqui passou a ser possível fazer transformação, que consiste em injetar no ovo da mosca um pedaço de
DNA com as sequência P3 e P5 e no meio delas pomos o que quisermos. Neste caso, colocámos o cDNA
sob o controlo de um promotor à nossa escolha, juntamente com o gene white, que nos permite
reconhecer os transformantes. Na descendência desta mosca, que era mutante para o gene white,
cruzada com uma outra mutante para o gene white, vamos ter moscas com olhos selvagens. Isto
acontece porque foi integrado um novo gene white (terceira cópia que é funcional), que passou a permitir
a síntese de pigmento. Sabendo que a mosca tem os olhos selvagem, sabemos que tem o gene white, e
assim, sabemos também que tem o cDNA que queríamos inserir.

Screen genético clássico

O Screen genético
clássico toma partido dos
cromossomas balanceadores,
identificáveis a olho nu e que
não permitem recombinação.
Induzimos a mutação por
mutagénese química
(introdução de uma molécula
que se intercala no DNA e que
causa mutações – EMS) nos
machos, pelo que vão ter
mutações na linha germinal e
cada espermatozoide foi
mutado em sítios diferentes
(mutações independentes).
Deste cruzamento com uma
fémea que é heterozigótica
(com um cromossoma normal
e um balanceador) podemos
obter machos na F1 que têm o
balanceador vindo da mãe e do lado do macho tem de vir um homólogo que carregará uma mutação (*).
Se pegarmos neste macho e cruzarmos com fémeas com o mesmo genoma que as mães, podemos
retirar deste cruzamento tanto machos como fémeas com o balanceador e com o cromossoma mutado
que vem do avô. Cruzando os machos com as fémeas desta geração, vamos obter na F3 combinações
diferentes:

• 1/4 de moscas com os 2 balanceadores, que não são viáveis porque os balanceadores têm uma
mutação letal recessiva;
• 2/3 serão heterozigóticos (um balanceador e um cromossoma com a mutação);
• 1/4 são homozigóticos para a mutação.

Geração de mutantes homozigotos de maneira específica para o tecido

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 Podemos também fazer outro tipo
de manipulação em mosca que nos permite
criar circunstâncias homozigótica de uma
mutação. A homozigotia é importante de
conseguir, uma vez que a maior parte das
mutações é recessiva, pelo que só vemos o
fenótipo no homozigótico. No entanto, o
homozigótico tem problemas e pode até ser
inviável e impossibilitarmos de ver o que
queremos ver, uma vez que o animal pode
não chegar à fase em que se expressa. Pode
ser um gene pleiotrópico, que influencia a
formação da asa e o desenvolvimento
embrionário, por exemplo, e ao queremos
ver o fenótipo mutante na asa, o animal já
morreu porque a mutação afeta o seu
desenvolvimento embrionário e ele nem chega a ter asas.

Para dar a volta a este problema de não ter os homozigóticos, temos de criar clones
homozigóticos ao forçarmos a recombinação mitótica. Isto não acontece em condições normais,
excepto muito raramente (é uma propriedade da meiose). Através da transforação em tecnologia de uma
descoberta em levedura, é possível induzir recombinação de forma extrínseca no sistema, através do FRT-
FLP. É um sistema em que temos uma sequência de DNA que é reconhecida especificamente por uma
flipase, que promove recombinação a partir do momento em que reconhece os sítios FRT em 2
cromatídeos face a face. Se tivermos um mutante (triângulo) e a sequência FRT estiver presente nesses
mesmos cromossomas junto ao centrómero, ao introduzirmos a ação da flipase, ela vai
promover o crossing-over, reconhecendo os dois FRT e quando esta mitose se resolve
e as células se separam, criamos clones de células que herdam as 2 mutações e outras
que têm os outros dois locais complementares que não tinham a mutação (no meio de
uma população onde a maioria são células heterozigóticas).

Geramos alo como este disco da asa, onde no lugar da mutação foi inserida uma
RFP (Red Fluorescent Protein). Vamos ter clones de células heterozigóticas, que têm
2 cópias de RFP e clones que não têm nenhuma cópia, o que vai corresponder a 3 tipos
de intensidade de fluorescência: os clones que não herdaram RFP ficam pretos; o vermelho mais vivo é o
clone com 2 RFP e depois o vermelho escuro é os que têm 1 cópia (estado heterozigótico inicial do
tecido).As células irmãs que originam uma célula filha sem RFP e outra com 2 cópias de RFP estavam
lado a lado, antes de se separarem e vão
ficando ao lado uma da outra a dividir-se,
pelo que podemos ver os clones irmãos lado
a lado espacialmente.

Podemos também fazer clones na

linha germinal, dando a volta a infertilidades,
por exemplo. Se queremos estudar uma
mutação que é inviável em homozigotia,
uma vez que a mãe nunca existe, geramos a
homozigotia nos ovos das mães, ou seja,
temos uma mãe heterozigótica que põe ovos
homozigóticos. Isto é feito através do sistema
FRT-FLP, mas combinando com uma
mutação que é a ovoD (dominante negativo).
Neste caso, uma mutação dominante
negativa para o gene ovoD (que é importante
na determinação da linha germinal
feminina), faz com que a mosca
heterozigótica seja estéril. Combinamos
uma fémea com FRT e ovoD e cruzamos com

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uma mosca com a mutação de interesse e com a FRT também, sendo que ambos os progenitores são
heterozigóticos têm um cromossoma balanceador. Vamos reconhecer bem a descendência que não tem
balanceador, devido à característica que este cromossoma fornece aos indivíduos, e que tem o
cromossoma com mutação e com ovoD. Quando a flipase atua na oogénese desta mosca e quando as
células se dividirem vamos gerar um óvulo que herda as duas mutações de um lado e outro que herda as
2 ovoD, no meio de um terceiro tipo de células dominante em que a flipase não funcionou (não há uma
penetrância de 100%). Apenas os ovos que a mosca puser servem porque os restantes têm o
dominante negativo pelo que abortam.

Sistema UAS-GAL4

Este sistema retirado de levedura que é constituído por uma sequência de DNA (UAS) e uma
proteína chamada GAL4. É um sistema de regulação transcricional, em que o GAL4, ao reconhecer o seu
enhancer particular (UAS), induz a transcrição do gene adjacente. O GAL80 é um cofator do GAL4
inibitório, ou seja, quando se liga ao GAL4 bloqueia essa ação que ele tem de ativação da transcrição,
excepto a presença de galactose.

Se pusermos uma sequência UAS no genoma da mosca sozinha não acontece nada porque este
só é efetor quando a GAL4 o reconhece. mosca também não tem GAL4. Se fizermos um transgene em
que injetamos um GAL4 na mosca, não acontece nada porque não há UAS. Se pusermos as duas coisas
ao mesmo tempo, o sistema já funciona e só
funciona de acordo com as regras que
definirmos (promotores específicos de tecido
para o GAL4, por exemplo).

Podemos criar um transgene que carrega uma zona regulatória especifica da antena a regular a
expressão do GAL4, ou seja, a proteína GAL4 só existe em tecidos que originaram a antena. Outra
mosca tem a zona UAS e a zona codificante de eyeless, que faz o olho. Do cruzamento destas duas
moscas, originamos uma mosca com UAS e GAL4, sendo que o GAL4 vai, na antena, ligar-se ao UAS e vai
produzir eyeless só nas células da futura antena. Isto vai resultar numa expressão ectópica de um gene
que origina olhos na antena – transformação parcial da antena em olhos.

Esta abordagem bipartida, na qual os dois componentes do sistema, o responder(UAS) e o driver

(GAL4), são mantidos como linhas parentais separadas, tem vários pontos fortes. Primeiro, a inatividade
transcricional da linha responsiva parental significa que linhas responsivas transgénicas podem ser
geradas para produtos génicos que são tóxicos, letais ou têm viabilidade reduzida quando expressos. Uma
força adicional do sistema surge da capacidade de direcionar a expressão de qualquer resposta numa
variedade de formas espaciais e temporais, combinando-a com drivers GAL4 distintos (enhancer-trap).
GETDB é o recurso principal que compreende um banco de dados detalhando a expressão e as
localizações de 4615 GAL4 Enhancer-Trap.

✓ É importante garantir que o processo de interesse não é afetado pela presença do driver GAL4 ou pela
presença de um responder utilizado como
repórter celular.

➢ Enhancer-trap screen

Um enhancer-trap é quando pegamos na

tecnologia de transgénese que introduz os pedaços
entre o P5 o P3, em que a transposase corta e depois
insere aleatoriamente, e vamos bombardear a linha
germinal com esse transgene, que como é aleatório,
cada inserção do transgene é num sítio diferente.
Assim, vamos ter no genoma a zona codificante da
GAL4 inserida por todo o lado, sendo que não se coloca nenhuma zona regulatória. No meio desta
aleatoriedade de integração do Gal4, muitas vezes ele vai aterrar no meio de outros genes (X), ficando
sobre a influencia regulatória da zona regulatória desses genes, pelo que podemos conseguir ter a
expressão de GAL4 que reproduz a expressão endógena do gene onde o GAL4 aterrou. Aqui
conseguimos construir um mutante do gene X e ao mesmo tempo, sabemos onde e quando é que esse
gene é expresso.
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 No meio de todas as linhas que vamos obter podemos escolher, por exemplo, uma linha que é
expressa nas células do intestino e que não seja expressa em mais lado nenhum. Podemos utilizar isto
para estudar coisas nessas células sem efeitos secundários noutro órgão.

Uma das hipóteses é a combinação

com RNAi. Aqui vamos acoplar ao UAS um
RNAi, que tem impacto do ponto de vista
funcional. Se quisermos estudar o papel de um
determinado gene nas células do intestino,
sendo que suspeitamos de um gene que é
importante para que o intestino funcione. Na
coleção de GAL4 procuramos uma linha que
seja expressa nessas células e queremos saber
se este gene tem ou não importância, mas não
conseguimos chegar a esse resultado porque
as mutações são inviáveis.

O que fazemos é um transgénico, que vai ser GAL4 especificamente das células do intestino, e
outro transgénico que tem acoplado à sequência UAS uma sequência que vai induzir o RNAi. Esta
sequência tem de ser um palíndromo da sequência do mRNA que queremos afetar. Quando cruzarmos
as duas moscas, a descendência vai provocar a transcrição de GAL4 só nas células do intestino, pelo que
só nessas células é que vai haver a transcrição do palíndromo do mRNA que queremos afetar, ou seja,
quando chega ao citoplasma vai dobrar-se porque é complementar consigo próprio. Assim, a maquinaria
da célula vai destruir este RNA de cadeia dupla e vai também destruir o mRNA com a sequência
correspondente que queríamos. Fazemos um knockdown muito significativo da proteína desse gene.

➢ Enhancer-supressor screens

Estes screens são mais

complexos, uma vez que implicam
interações epistáticas entre genes e
são muito comuns em genes de
regulação do ciclo celular. Partimos de
uma situação em que em vez de um
wildtype, vamos induzir uma mutação
sobre uma mutação que já existia
anteriormente.

Temos uma mutação que é tumorigénica, que vai gerar

tumores. Pegamos neste mutante e criamos outra mutação e vamos
ver o que pode acontecer na presença das duas mutações: ou o tumor
fica na mesma, ou aumenta ou diminui. Quando aumenta o tumor,
significa que encontramos um segundo gene que atua aditivamente
ou sinergisticamente com o primeiro. Temos também os genes
supressores, que anulam o efeito tumorigénico da primeira mutação.

✓ 75% das doenças monogénicas humanas identificadas têm um gene homólogo em

mosca.

Clarence Little pegou em ratinhos e fez inbreding até conseguir ter linhas monogénicas
(homozigóticas em todos os loci). A grande maioria das linhas morreu, uma vez que estavam todos os
letais em homozigotia, mas no meio de muitas estabeleceram-se as 2 referências de linhas de ratinho no

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mundo. Na mosca fez-se a mesma coisa, criando 200 linhas de
mosca que são homozigóticas em todo o lado (no fundo, são
genótipos). Temos vários tubos, cada um com um tipo de mosca,
que são clones, e temos o genoma de todas elas: isto permite-nos
fazer GWAS (genome wide association studies). O que se faz é
fenotipar as 200 linhas para uma dada característica e relacionar
com o seu genótipo, pelo que vamos detetar se houver algum SNP
ou polimorfismo que esteja fortemente associado com a
diferença fenotípica. É bom ter um background genético muito
estável, uma vez que este gera muito ruído e influencia o fenótipo,
mas tem a fraqueza de que o que se conclui ali não pode ser
extrapolado para a generalidade da espécie.

➢ Controlo espacial e temporal da ativação de GAL4

• Dependência da temperatura de GAL4 – em moscas, a

atividade mínima da GAL4 está presente a 16°C, enquanto
29°C fornecem um equilíbrio entre a atividade máxima da
GAL4 e efeitos mínimos na fertilidade e viabilidade devido ao
crescimento em alta temperatura. Isso é particularmente
vantajoso para aqueles que estudam os estágios pós-
embrionários do desenvolvimento. Como muitos drivers se expressam durante o desenvolvimento,
efeitos letais indesejados nos estágios iniciais podem impedir a recuperação do estágio de
desenvolvimento de interesse. Ao diminuir a temperatura, pode-se reduzir a atividade do sistema e
contornar tais efeitos prejudiciais, proporcionando uma maneira simples de obter o estágio de
interesse para estudo em temperaturas mais altas.
• Uma versão inativa de GAL4-VP16 pode ser
injetada em embriões e ativada por um feixe de luz
UV, controlando assim a expressão de resposta de
uma forma altamente específica. Embora, o valor
desta abordagem no estudo de estágios posteriores
de desenvolvimento seja limitado.
• Quimeras GAL4 responsivas a hormonas –
atualmente existem duas dessas quimeras: uma
quimera do recetor de estrogénio-GAL4 e uma
quimera do domínio de ativação p65 humano do
recetor de progesterona-GAL4. Em ambos os
casos, a adição do ligante apropriado resulta na
indução da atividade GAL4 e subsequente
expressão do responder UAS.
• Uma abordagem combina uma versão modificada do transativador responsivo à tetraciclina
induzível (rtTA M2-alt) com o sistema GAL4. Na ausência de tetraciclina (tet) ou do seu análogo
doxiciclina (dox), rtTA-M2-alt é incapaz
de se ligar às sequências operadoras Tet
(TetO) e ativar a transcrição (sistema Tet-
On). A adição de dox resulta na ligação de
rtTA-M2-alt a TetO e ativação
transcricional do gene alvo. Neste
sistema, coloca-se o gene de interesse
sob o controlo das sequências TetO
(responder-TetO) e, em seguida, cruza-se
tanto o respondente UAS-rtTA-M2-alt
como o driver GAL4 desejado. O GAL4
dirige a expressão do responder UAS-
rtTA-M2-alt, que na ausência de tet ou
dox, está desativada, enquanto a adição

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 de tet ou dox resulta na
indução da atividade de
rtTA-M2-alt e na ativação
transcricional do
responder-TetO.
• Em contraste com este
sistema Tet-On de
indução positiva, um
sistema Tet-Off, no qual
a transcrição é regulada
negativamente pela
presença de tet ou dox,
também foi combinado
com o sistema GAL/UAS.
• Duas opções, ambas
utilizando a capacidade
do FLP de promover a

recombinação in cis entre dois

locais FRT, foram desenvolvidas com
o sistema GAL4/UAS. A primeira
opção coloca um cassete
terminadora flanqueada por
sequências FRT entre o gene GAL4 e
seus elementos reguladores (figura
de cima). A segunda opção coloca
uma sequência terminadora
intermediária flanqueada por
sequências FRT entre o elemento UAS
e o gene responder (figura da direita).
Em ambos os casos, a expressão do
responder em resposta ao driver
GAL4 requer a presença adicional
de FLP para mediar a remoção do
cassete terminador interveniente.

• Um nível adicional de
indutibilidade também foi
gerado com o inibidor do
GAL4 – GAL80. A ligação de
GAL80 à GAL4 impede a
ativação transcricional
mediada por GAL4. Então,
numa combinação
inteligente dos sistemas
GAL80, GAL4/UAS e
FLP/FRT, geraram células
sem expressão de GAL80
por recombinação mitótica
mediada por FLP. Isso
resultou no aparecimento
de atividade GAL4 e
subsequente expressão de
responders UAS nessas
células. Este sistema
permitiu identificar e caracterizar tipos de células genotipicamente distintas em padrões de
mosaicismo.

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CRISPR

Inicialmente identificado como um sistema de defesa bacteriana contra vírus, o sistema CRISPR-
Cas é composto por um CRISPR-RNA (crRNA) contendo uma sequência espaçadora única e uma
nuclease CRISPR-Cas. A hibridização entre o espaçador de crRNA e o alvo complementar
(protoespaçador) leva à ativação da nuclease Cas, que cria um quebra em dupla cadeia no DNA alvo. Uma
sequência curta de 2 a 5 pb localizada próxima à sequência do protoespaçador chamada de motivo
adjacente do protoespaçador (PAM) é essencial para um direcionamento eficiente.

Na presença do crRNA e de um crRNA transativador (tracrRNA), a SpCas9 cliva qualquer DNA

contendo uma sequência alvo de 20 nucleótidos adjacente ao PAM que é complementar à sequência do
crRNA. Um RNA guia único quimérico (sgRNA), que combina o crRNA e o tracrRNA num único transcrito
de RNA, simplifica o sistema.

A quebra é então reparada por non homologous end joining (NHEJ), resultando em pequenas
deleções de inserção (INDELs), ou por HDR, que pode ser usado para gerar modificações genómicas
precisas se uma cadeia homóloga for fornecida. Animais mutantes podem ser produzidos simplesmente
cruzando moscas que expressam sgRNA com moscas Cas9 específicas da linhagem germinativa. Fazer
cortes em células somáticas é possível pela expressão específica de tecido de Cas9 com um promotor
específico ou pelo controlo GAL4/UAS.

▪ Base editing

O base editing é um método baseado em CRISPR/Cas9 no qual uma Cas9 cataliticamente morta
é fundida com enzimas que geram alterações específicas de um único par de bases. Um editor de base
de citosina (C>T, G>A) foi recentemente testado em Drosophila. Isto abre portas para o teste de outros
editores de base, que incluem editores de base de adenina (A>T, T>C), editores de base dual
citosina/adenina, editores de base de citosina para guanina (C>G, G>C) e editores de base de glicosilase.

▪ Prime editing

Para prime editing, a Cas9 é fundida com um domínio de transcriptase reversa (RT) projetado,
juntos referidos como editor principal 2 (PE2). O pegRNA (prime editing guide RNA) direciona o PE2 para
o local alvo, onde causa um corte de cadeia simples e ligação de uma porção do pegRNA ao genoma
exposto. O domínio RT transcreve, então, a edição do pegRNA para o genoma.

▪ Regulação da expressão génica

A ativação de CRISPR (CRISPRa), na qual Cas9 cataliticamente morta recruta maquinaria de

ativação transcricional para uma sequência de DNA a montante do local de início da transcrição (TSS) de
um gene alvo, é um método possível para ativação de genes.

2. Colagem dos cromossomas

Os cromossomas são o mecanismo chave através da qual a informação genética é herdada, pelo
que têm de ser corretamente segregados durante a mitose. Nas nossas células em divisão, temos 46
cromossomas que vão ser segregados sendo que o que é separado na mitose são os cromatídeos (cópias
idênticas) e na meiose os cromossomas homólogos (têm os mesmos genes, mas não têm exatamente a
mesma informação, uma vez que um veio da mãe e outro do pai).

O número de divisões celulares que ocorrem no corpo humano, desde a fase de célula única até à
idade adulta, foi estimado em cerca de 10 000 triliões. Neste processo, podem ocorrer erros: por vezes
ocorrem erros numéricos (em que as células podem incorporar um número errado de cromossomas -
aneuploidia) ou erros estruturais na molécula de DNA (o que acontece quando os cromossomas não
são capazes de se condensar e organizar corretamente, pelo que quando são divididos há uma clivagem
e parte do DNA pode ser perdida). Se tivermos uma quebra de dupla cadeia numa molécula de DNA vai
ocorrer a NHEJ, que se não corrigir o erro corretamente vai originar uma mutação que pode levar a uma
perda de função. Também pode acontecer outra coisa se tivermos várias quebras em dupla cadeia, que
são os rearranjos cromossómicos (inversões, translocações, etc), levando à perda de integridade do
genoma.

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 Na maioria das vezes, a mitose não corre mal, mas quando corre mal está associada a várias
patologias, como o cancro, onde é comum observar erros numéricos, mas também alterações estruturais.
Sabemos também que afeta a fertilidade feminina dependente da idade, trissomias, problemas de
desenvolvimento (como a microcefalia).

Este trabalho é muito focado na disposição e montagem dos cromossomas mitóticos,

principalmente no problema da colagem dos cromossomas, ou seja, como é que as duas moléculas de
DNA estão ligadas. Temos também o problema é como é que os cromossomas se condensam, ou seja,
como é que passam de uma forma difusa na interfase para um cromossoma mitótico bem compactado.
Finalmente, outro problema é o silenciamento, que se relaciona com as mudanças no estado da
cromatina durante a mitose: na interfase o DNA está desconcentrado e codifica a informação genética,
mas quando as células entram em mitose, a transcrição é desligada.

O que mantém os cromossomas juntos é um anel proteico que envolve as duas moléculas de
DNA – coesina. Durante a mitose, este anel é aberto e as moléculas saem deste anel, sendo eu o que dita
a transição entre a metáfase e anáfase na mitose é esta quebra, que permite a separação dos cromatídeos
irmãos. Este anel está ligado à infertilidade feminina relacionada com a idade. Recentemente, descobriu-
se que a coesina está também associada a doenças de desenvolvimento raras, como o síndrome de
Cornelia de Lange, Síndrome de Roberts e Síndrome de Warsaw breakage. A coesina é estabelecida na
fase S, durante a replicação, pelo que qualquer célula que não tenha
coesina não é capaz de restaurar a coesão.

Este gráfico demonstra a incidência de trissomias de acordo

com a idade da mãe. Podemos ver que há um aumento a partir dos
35 anos, o que significa que os oócitos deixam de ser tão bons. REC8
e SMC1B são duas proteínas deste anel que diminuem com a idade
da mulher. A coesina parece ser a principal
causa da infertilidade feminina relacionada
com a idade porque, nos nossos oócitos, é
necessário que a coesina esteja a colar os
nossos cromatídeos durante décadas, uma
vez que é formada na fase embrionária.
Quando chegamos a uma certa idade, ela
deixa de funcionar.

A Drosophila tem uma genética poderosa, um tempo de

geração curto, é ótima para cell-imaging, tem apenas 4 pares de
cromossomas e é ótima para resolver questões biológicas e
relacionar com outros organismos. Cada mitose na mosca dura cerca de 10 minutos e é sincronizada, ou
seja, divide-se num sincício: o núcleo divide-se, mas as células não se dividem. Estas divisões são
sincronizadas porque o que controla a divisão celular são sinais, e uma vez que todos os núcleos partilham
o mesmo citoplasma, funcionam como apenas uma célula, pelo que todos os núcleos recebem os
mesmos sinais. Outra vantagem de haver apenas um
citoplasma é que podemos utilizar ferramentas de
microinjeção. Conseguimos inserir no núcleo proteínas ou
drogas, perturbar o sistema, e observá-lo ao microscópio.

O que se fez foi retirar a proteína verde (que faz parte do

anel de coesina) que é clivada na mitose e engenheirá-la para
que contenha 3 sequências consensos onde vai atuar a
protease TEV, pelo que agora a proteína verde vai ser clivada por esta proteína exógena, o que nos permite
abrir o anel artificialmente: sempre que adicionamos a protease TEV, o anel é aberto e os cromatídeos
irmãos separam-se.

Podemos ter 2 situações:

• Se as células não tiverem esta coesina sensível à

TEV (anéis azuis), as células são selecionadas na
metáfase e e se adicionarmos a protease TEV não vai
acontecer nada.
10
 • Se o anel de coesina for
sensível a esta protease
TEV (anéis vermelhos), vai
funcionar e temos a
separação dos
cromatídeos.

Quanta coesina é precisa para manter os cromossomas unidos?

Temos de usar diferentes

proporções dos anéis vermelhos e azuis:
se tivermos 50% de cada um deles,
quando adicionamos a protease temos
50% de clivagem. Percebemos, então,
que 50% é suficiente para manter os
cromossomas ligados. Com diferentes
proporções vamos perceber quanto é
necessário para sustentar a coesão que
mantém os cromatídeos ligados.

Estabeleceu-se diferentes linhas genéticas com

diferentes construções que codificavam tanto para anéis
sensíveis à TEV como resistentes. Percebeu-se que apenas com
menos de 20% é que houve a separação dos cromatídeos:
temos de remover mais de 80% da coesina para provocar a
separação dos cromatídeos, ou seja, a coesina é muito
resistente à perda de coesina. No entanto, devido ao tamanho
reduzido do cromossoma 4 da mosca, este cromossoma tem
níveis mais baixos de coesina e, portanto, é mais propenso à
disjunção após a perda de coesina.

No entanto, mesmo quando os cromatídeos irmãos não se separavam, muitas coisas durante
mitose são afetadas pela quantidade de coesina. A coesina está relacionada com o estabelecimento de
tensão, que é importante para assegurar a fidelidade da mitose. Apesar de este anel de coesina
conseguir manter os cromatídeos ligados, quando diminuímos a quantidade de coesina, os cromatídeos
estão sob uma menor tensão, o que torna a mitose mais suscetível à ocorrência de erros.

Se olharmos para a fidelidade mitótica nestes embriões e provocarmos a clivagem de 80% dos
anéis de coesina, o que vemos é que a maioria dos núcleos se divide bem, mas por vezes vemos núcleos
que se tornam defeituosos. A mitose é muito importante e
com muitos defeitos mitóticos não há vida.

A inativação induzida por TEV de um grande

subconjunto de complexos de coesina levou a um ligeiro
aumento na duração mitótica. Além disso, também
resultaram numa frequência significativa de erros
mitóticos, incluindo atraso cromossómico e pontes na
anáfase.

Estes anéis de coesina têm uma segunda vida, ou

seja, além deste papel de manter os cromatídeos ligados,
também são importantes em aspetos não relacionados com
a mitose, como a regulação da expressão génica, reparação de danos no DNA e organização da estrutura
do DNA durante a interfase. As síndromes referidas atrás são devidas a defeitos no papel de regulação da
expressão génica da coesina. Quando olhamos para pacientes com estas doenças, não vemos separação
prematura dos cromossomas, mas eles têm uma maior suscetibilidade a erros mitóticos.

A cinase BUB1 tem muitas funções, sendo que uma delas é a proteção da coesina que rodeias os
cromatídeos irmãos. Esta BUB1 é essencial em ratinhos e homozigóticos nulos para esta proteína morrem

11
e a perda de BUB1 abaixo de um limiar crítico causa segregação incorreta dos cromossomos e pode levar
à tumorigénese espontânea. No caso dos humanos, esta proteína está muitas vezes sobrexpressa em
vários cancros e a sua redução está associada a abortos espontâneos.

Para tentar perceber os problemas da coesina no contexto das doenças humanas, testaram-se 2
pacientes com problemas na coesão devido a mutações no gene bub1.

• O paciente 1 é homozigótico
para uma mutação em que
tem um codão AGG em vez do
ATG (codão start).
• O paciente 2 é um
heterozigótico, sendo que
ambos os alelos são
defeituosos, mas são
diferentes. Num alelo temos a
formação de uma proteína
truncada devido a uma
mutação non-sense que criou
um codão STOP prematuro;
noutro alelo existe uma
mutação pontual numa junção
exão-intrão, o que leva a splicing alternativo que promove um salto do exão 21. Mesmo sem o exão
21, vamos ter uma grelha de leitura correta, mas temos uma deleção numa parte da proteína.

A prática comum para estudar células humanas em laboratório é utilizar, por exemplo, fibroblastos,
que são células senescentes e com baixos níveis mitóticos; além disso podem ser utilizadas linhas
celulares imortalizadas. Existem várias estratégias para imortalizar as células, sendo que a maioria das
vezes utilizam-se oncogenes. O que faz é transformar as células numa espécie de linha tumorigénica.

As duas técnicas imortalizadoras mais comuns são utilizando SV40 (que é o antigénio de um vírus,
que faz um controlo dos principais reguladores do ciclo celular) e hTERT (Telomerase reverse
transcriptase).

Se tivermos danos no DNA, o p53 vai levar ao

aumento da expressão de p21 e p16, que vão inibir a
atividade da CDK4/6, pelo que o RB vai ser
desfosforilado e vai funcionar como supressor de
tumores, impedindo que as células entrem no ciclo
celular. O SV40 vai inibir o p53, levando à ocorrência
de ciclo celular.

O hTERT é reverte uma das principais causas

da senescência, que é a encurtamento dos telómeros
à medida que as células dividem. Os telómeros
permitem à célula saber quantas vezes pode dividir-
se, e se passarmos o limite dos telómeros, a célula
entra em senescência. No entanto, nas células germinais este encurtamento não acontece, assim como
nas células cancerígenas. Se transformarmos as nossas células
em células germinais ou cancerígenas, deixamos de ter o
problema dos telómeros a controlar as divisões mitóticas;
podemos também expressar telomerase nas células, que vai
aumentar o tamanho dos telómeros.

Para caracterizar ainda mais o efeito da perda de

coesão parcial, analisou-se o comportamento dos
centrómeros após a remoção repentina da fração de
coesina clivável. Primeiro, observou-se um aumento
significativo na separação do centrómero 10 minutos após a
injeção de TEV. Em segundo lugar, o alinhamento
12
cromossómico foi severamente comprometido, enquanto o
posicionamento da massa cromossómica principal permaneceu
inalterado. Em contraste, a estrutura externa do cinetocóro parecia
inalterada após a perda parcial da coesina. Por fim, o desalinhamento
cromossómico foi acompanhado por movimentos altamente
dinâmicos dos centrómeros, que se envolveram em oscilações ao
longo da placa metafásica, o que pode ser devido a destacamentos
errados após a perda repentina da maioria das ligações coesivas.

Muitas pesquisas apoiam que a quinase de correção de erros

Aurora B é capaz de detetar a quantidade de tensão nos cinetocóros e
desestabilizar as ligações sem tensão, mas a remoção da maioria da
coesina não alterou os níveis de Aurora B no centrómero interno.

Portanto, estimou-se se a perda parcial de coesina poderia

alterar a quantidade de tensão detetada nos cinetócoros. Após a
remoção de aproximadamente 80% dos complexos de coesina, os
cinetocóros de embriões que não se separaram em 20 minutos
exibiram um aumento significativo na quantidade de Bub1 já 10
minutos após a injeção de TEV.

Além disso, a remoção de coesina faz com que o centrómero

interno já comprometido perca a ligação aos microtúbulos. Estas descobertas sugerem que as ligações
são constantemente estabelecidas e eliminadas conforme as reações de correção de erros. Portanto,
concluímos que, após a remoção de uma grande fração dos complexos de coesina, as quantidades
restantes ainda são suficientes para manter a coesão dos cromatídeos irmãos na maioria dos
embriões, mas não a integridade da região interna do centrómero, prejudicando a manutenção das
ligações e alinhamento dos cromossomas.

Aqui temos linhas celulares do paciente 1 e do paciente 2, assim como

um controlo saudável. Fizeram Western Blot e podemos ver que não vemos
proteína Bub1 no paciente 1, como estávamos à espera, uma vez que não tem
codão START. O paciente 2 tem uma quantidade pequena de proteína
truncada, também como estávamos à espera. A parte da proteína que foi
deletada faz parte do domínio de quinase, pelo
que a proteína não deve conseguir executar a
sua função de quinase.

Se olharmos para as células diretamente,

esta proteína está localizada no cinetocoro, e
podemos ver que no paciente 2 temos alguma
proteína localizada no cinetoco, e no paciente 1
não há proteína visível.

Para ver quão eficiente é a atividade da quinase, usámos um histona que é fosforilada pela quinase
como target. No paciente 1, que pensámos não ter proteína, vemos que há alguma fosforilação a
acontecer. Isto pode ser devido a duas razões: podemos ter outra quinase
que tenha a mesma função; ou a proteína que não vemos pode ser incapaz
de expressar algo que permita detetá-la. Mas se tivéssemos outra quinase
que fizesse a mesma função, ela também deveria estar presente no
paciente 2.

Ambos os pacientes têm uma mutação no mesmo gene, mas são

diferentes, que geram fenótipso diferentes. Ambos os pacientes têm
microcefalia e atrasos intelectual.

Depois foi utilizada a Drosophila para fazer screens genéticos. Foi

estabelecida uma condição em que as asas são defeituosas devido a
problemas na coesina. Fez-se cruzamentos entre uma mosca com as asas
e coesina normais com moscas de uma linha de RNAi. Procurou-se

13
condições que tornássem as asas melhores
(supressores), ou que deixássem as asas piores
(enhancers). Perceberam que 19 genes eram
supressores e 10 eram enhancers.

Aneuploidia induzida em células estaminais neurais desencadeia uma resposta de stress retardada
e prejudica a expectativa de vida adulta em moscas

Estudar aneuploidia durante o desenvolvimento do organismo tem fortes limitações porque as

perturbações mitóticas crónicas usadas para gerar aneuploidia geralmente resultam em letalidade.
Foi desenvolvida uma ferramenta genética para induzir aneuploidia de forma controlada no tempo
durante o desenvolvimento da Drosophila, através da depleção reversível da coesina. O sistema permite
uma rápida restauração da coesina logo após sua inativação, restringindo assim as anormalidades
mitóticas a um curto período de tempo, concomitantemente com a geração de altos níveis de
aneuploidia. A natureza controlada da ferramenta permite-nos dissecar a cinética da resposta à
aneuploidia em vários tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento.

Este sistema consiste numa subunidade modificada da coesina que é sensível à TEV. Quando é
adicionada protease TEV, esta vai clivar a coesina. Para reverter a depleção de coesina é ativada a
expressão de uma
subunidade da coesina
que é resistente à TEV
(RAD21-WT). Para tal, a
expressão de RAD21-
WT está sob o controlo
do promotor UAS, que
é induzido pela Gal4,
induzida
concomitantemente
com a protease TEV,
por um promotor de
choque térmico
(HSprom). Dado que a
protease TEV está sob o
controlo direto de
HSprom, enquanto
RAD21-WT depende do
sistema de expressão
Gal4-UAS, o atraso temporal na expressão RAD21-WT
em relação à indução de protease TEV levaria a uma
janela de tempo curta de inativação da coesina.

Para confirmar que o sistema funciona, foram

analisados dois tecidos diferentes da larva: o cérebro
em desenvolvimento e os discos epiteliais das asas.

Na primeira mitose após indução de choque

térmico, 95% das Nbs (células estaminais neurais
chamadas neuroblastos) contêm irmãs sozinhas e
exibem atraso mitótico e embaralhamento
cromossómico. No entanto, na mitose subsequente,
a coesão é restaurada em aproximadamente 80% dos
Nbs, com metáfases claras e um atraso mitótico mais
curto. Finalmente, durante a terceira divisão celular
após o choque térmico, o tempo mitótico e o estado
coesivo de Nbs são comparáveis aos controlos.

14
 Ao contrário do Nbs, nas células epiteliais do
disco da asa observamos a presença de irmãs
sozinhas, mesmo após 48 horas, apesar dos altos
níveis da proteína RAD21-WT. A alta frequência de
células nas
fases S/G2
neste tecido,
suporta que
um alto
número de
células é
afetado,
apesar do
curto tempo
de
inativação
da coesina.

Após 24 do choque térmico no disco da asa, existe uma

grande população de células mortas. No entanto, o número de células que morrem diminui
significativamente se a coesina for trazida de volta, mas não se a depleção de coesina por TEV for de longo
prazo. Esses resultados sugerem que a recuperação tecidual é limitada e só é possível se a rutura
mitótica for restrita no tempo (ou número de ciclos celulares).

Moscas desafiadas com aneuploidia usando esta perturbação mitótica reversível eclodiram em
moscas adultas com alta frequência, mas as moscas são incapazes de voar ou de se mover e têm uma
esperança de vida mais curta. Mesmo quando a aneuploidia é induzida em estágios iniciais, afetando
menos Nbs, os adultos exibem um comportamento “letárgico”, mas apresentam uma morfologia
adulta saudável.

A perda transitória de coesina e a indução de aneuploidia nos Nbs parecem contribuir para a
diminuição gradual do número de Nbs ao longo do tempo, em vez de mecanismos específicos para
eliminação de cariótipos anormais, como postulado anteriormente. Embora os Nbs aneuploides em
divisão possam persistir no tecido, os seus cariótipos têm restrições, pois a perda completa de qualquer
um dos três cromossomos principais (II, III ou X) impede a sua proliferação no cérebro em
desenvolvimento. Em contraste, outras combinações cromossómicas aneuploides são compatíveis com
a proliferação contínua, particularmente quando são ganhos cromossomas. Isso deve levar não apenas à
manutenção de células estaminais aneuploides (devido à autorrenovação de Nbs), mas também à
acumulação de descendência aneuploide diferenciada.

Foram examinados se os cariótipos anormais desencadeiam uma resposta ao stress no cérebro de

Drosophila em desenvolvimento e, em caso afirmativo, qual é a cinética de tal resposta. Foi avaliada a
presença de p53 e do marcador de senescência Dacapo, sendo que a grande maioria das células que
pareciam positivas para esses marcadores não eram células tipo Nbs; células do tipo Nbs coradas com
marcadores para estas moléculas são percetíveis apenas em 48 horas após o choque térmico, sugerindo
que, apesar do seu estado aneuploide, as células estaminais neuronais demoram a exibir uma resposta
evidente ao stress.

Enquanto os tecidos
epiteliais, como os discos das
asas, são capazes de se regenerar
desta lesão, cerca de metade das
células estaminais neuronais são
perdidas, enquanto a metade
restante continua a proliferar e se
torna altamente instável
cromossomicamente. Para testar
esta hipótese, foi criado um
sistema para proteger o cérebro

15
da remoção da coesina e consequente aneuploidia. Para conseguir isso, complementou-se o sistema de
clivagem de coesina reversível com a expressão específica do cérebro de RAD21-WT. Desta forma, a
presença de TEV deve levar à perda de coesina em todos os tecidos larvais que sobrevivem apenas com
RAD21-TEV no momento do choque térmico. Em contraste, as células estaminais neuronais devem ser
resistentes a esse desafio porque expressam RAD21-TEV e RAD21-WT. Como esperado, a presença
constitutiva de RAD21-WT no cérebro previne quaisquer defeitos de coesina nos Nbs.

A proteção cerebral foi suficiente para resgatar o tempo de vida de aproximadamente 70% das
moscas adultas afetadas por aneuploidia em todo o organismo durante o desenvolvimento,
demonstrando que o cérebro é o tecido mais sensível quando desafiado com aneuploidia.

➢ Enquanto a maioria dos tecidos epiteliais em desenvolvimento responde à aneuploidia induzindo a

morte celular, eliminando as células com um número anormal de cromossomas, o mesmo não
acontece com o cérebro em desenvolvimento. A maioria das células estaminais neurais aneuploides
podem continuar a proliferar apesar do seu número cromossómico anormal e instabilidade
cromossómica, sugerindo que estas células são exclusivamente resistentes a stresses associados à
aneuploidia. Isto levou à hipótese de que o cérebro é o tecido limitante no desenvolvimento em
resposta à aneuploidia. Para testá-lo, modificamos o sistema de indução de aneuploidia para proteger
o cérebro da aneuploidia enquanto o restante dos tecidos era afetado. Como resultado, observamos
uma reversão dos defeitos motores anteriores e da redução do tempo de vida, demonstrando que o
cérebro em desenvolvimento é o tecido mais suscetível à aneuploidia.

3. Modelo levedura – Saccharomyces cerevisiae

As leveduras fazem fermentação: consomem açúcar e produzem energia e bioprodutos como CO2
e etanol. S. cerevisiae é um fungo (eucariótico) que está longe de ser parecido conosco, embora seja bom
para estudos em biomedicina. A levedura é encontrada na natureza em frutos, onde existe açúcar. Foram
isoladas diferentes estirpes em todo o mundo, que foram dispersas através de vetores, sendo que a sua
origem foi na China. Foi o primeiro organismo
eucariótico a ser sequenciado, sendo que tem um
genoma pequeno e compacto (sem muitas regiões
não codificantes).

Este é o ciclo de vida da levedura, que

representa uma vantagem uma vez que podemos
propagar linhas de levedura na forma haploide
ou diploide. Existe reprodução sexuada na
levedura, sendo que existe células haploides de
duas formas: a e α. Não existe dimorfismo sexual,
pelo que não podemos distinguir os dois tipos de
células haploides; apenas conseguimos saber se
são de sexos haploides se as juntarmos e elas se
reproduzirem, originando uma levedura diploide. Esta levedura diploide é capaz de se dividir e originar
outras leveduras diploides; além disso, pode voltar a ter um genoma haploide através de uma meiose,
produzindo um núcleo a e um núcleo α. Como ambas as formas, diploide e haploide, são funcionais, pelo
que podemos estudá-las separadamente.

Descobertas em biomedicina:

➢ Ciclo celular

O ciclo celular é o processo através do qual transformamos

uma célula em duas. Para criarmos uma mutação na levedura vamos
mutagenizar as células e vamos procurar um fenótipo. Estamos a
estudar o ciclo celular, cujos genes são essenciais e sem eles o
organismo morre. Se o fenótipo que queremos seguir é uma célula
que não se consegue ,não conseguimos recuperar estas células para
as caracterizarmos. Para conseguirmos estudar, queremos que este
fenótipo se manifeste apenas em certos momentos e não sempre,
ou seja, tem de ser um mutante condicional, que se manifeste apenas
16
sob certas circunstâncias. Se soubermos o genes, podemos por um promotor condicional a controlá-la e
conseguimos isto; no entanto, se não sabemos o gene não podemos fazer isto.

Vamos mutagenizar as células, pelo que vamos acertar em genes que controlam o ciclo celular,
mas mantemos as células em condições em que o fenótipo não se manifesta. Depois, colocamos as
células numa condição em que o fenótipo se manifesta. O mais comum para descobrir mutantes
condicionais é utilizando temperatura. Por exemplo, induzimos uma mutação nas células e depois
fazemos replica plating: vamos ter células a 25ºC, em que a mutação não se expressa, e noutra replica
colocarmos temperaturas mais altas (35ºC), pelo a proteína deixa de funcionar e expressa um fenótipo
mutante. Existem colónias que não vão existir na placa a 35ºC, pelo que essas são as colónias com
mutação, e podemos recuperá-las na outra placa, que contém clones.

A principal vantagem de crescer as leveduras na forma haploide é que mutando apenas um alelo,
o fenótipo já vai ser manifestado, dado que o segundo alelo não vai mascarar a mutação. A segunda
vantagem é o seu ciclo celular.

O ciclo celular começa com uma célula, e depois

começa a formar-se um broto (bud), que coincide com o
início da fase S. O bud começa a crescer e quando acaba a
mitose, o núcleo foi duplicado, sendo que depois ocorre a
citocinese e temos duas células. Através do tamanho do
bud podemos
dizer em que fase
do ciclo celular
uma levedura se
encontra.

Aqui temos
3 mutantes
crescidos a 22ºC e depois foram colocados a 36ºC. No caso do
mutante A, as células permaneceram iguais. Neste caso, o
mutante que criámos pode não ser relacionado com o ciclo
celular, uma vez que as células pararam no tempo. Podemos ter
mutado os ribossomas, pelo que deixou de haver produção de
proteínas, por exemplo. No caso do mutante B, após 2 ciclos
celulares, as células encontram-se sem bud, pelo que devem ter
parado na fase G1. Isto significa que podemos ter mutado um
gene envolvido no início da replicação. No mutante C, o bud está
muito grande, pelo que o gene mutado está envolvido na
mitose.

O ciclo celular é muito controlado, e existem checkpoints que dizem à célula quando não é bom
continuar o ciclo celular. As células tumorais começam a proliferar a uma taxa mais elevada do que as
células normais e, por vezes, o que acontece num tumor é que uma mutação pode levar a que haja uma
maior divisão celular. Os genes supressores de tumores são parte desta maquinaria que controla o ciclo
celular.

➢ Telómeros

Um cromossoma não é apenas uma cadeia

linear de DNA, tem algo que protege as
extremidades – telómeros. Foi feito uma
experiência com células de levedura para saber o
que é necessário para formar um DNA. Foram
introduzidos cromossomas sem telómeros em
levedura e estes não conseguiram manter-se, ou
seja, os cromossomas da células mantiveram-se,
mas os introduzidos foram degradados. Noutra
experiência juntaram os cromossomas de
tetrahymena (que têm telómeros) com os
17
cromossomas da experiência anterior e colocaram em levedura. Estes cromossomas mantiveram-se,
sendo protegidos pelos telómeros dos cromossomas de tetrahymena.

Para clonar estes fragmentos de tetrahymena nos cromossomas inseriram uma sequência de
DNA num vetor e colocaram numa bactéria para que se replique. Depois com uma enzima de restrição
linearizamos o vetor. LEU2 é um marcador de seleção. Se a sequência roxa não for um telómero, o vetor
linearizado vai ser degradado; se a parte roxa for um telómero o vetor mantém-se. Depois transformamos
as células de levedura numa placa com leucina, pelo que apenas as células que mantiveram o fragmento
linearizado vão sobreviver.

Devido à estrutura do DNA, uma das cadeia fica mais pequena sempre que a célula se divide.
Quando deixa de haver telómeros, as células deixam de se dividir ou entram em senescência.

Esta é uma representação

esquemática da evolução do cancro,
que é um processo que infelizmente,
quando descobrimos um órgão já não
funciona muito bem, ou seja, o cancro
é descoberto numa fase mais evoluída
do processo. Numa levedura, os passos
iniciais da transformação das células
ocorre ao longo de anos. O que
conseguimos estudar é apenas a fase
final, pelo que é necessário estudar o
que se passa antes.

Quando as células se estão a dividir muito rápido, a maquinaria de replicação fica sob stress –
stress de replicação. O stress de replicação é uma perturbação geral da replicação do DNA que interfere
no metabolismo dos cromossomas, reduz a viabilidade celular e induz instabilidade genética.

A plasticidade evolutiva do metabolismo cromossómico permite a adaptação ao stress constitutivo

de replicação do DNA

Utilizando a levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, investigaram a plasticidade

evolutiva do metabolismo cromossómico, que consiste numa rede de módulos evolutivos conservados.
As células foram constitutivamente sujeitas a stress de replicação do DNA, causado pela ausência de Ctf4,
uma proteína que coordena as atividades enzimáticas nas forquilhas de replicação. As células ainda eram
capazes de se reproduzir, mas foram prejudicadas por esta mutação. Populações paralelas adaptaram-se
ao stress de replicação, ao longo de 1000 gerações, adquirindo múltiplas mutações que lhes permitissem
compensar os defeitos iniciais. Essas mutações alteraram as características conservadas da replicação do
DNA e da coesão dos cromatídeos irmãos, e inativaram o checkpoint de danos do DNA. Sugerimos que
a plasticidade evolutiva do metabolismo cromossómico tem implicações para a evolução do genoma
em populações naturais e cancerígenas. Estas descobertas mostram como as vias evolutivas podem ser
reproduzíveis num ambiente de laboratório controlado e que as células podem evoluir rapidamente
após processos conservados na célula serem danificados.

Na ausência de Ctf4, as células adquirem vários problemas na

progressão da bifurcação, levando à acumulação de defeitos
comumente associados ao stress de replicação do DNA, como gaps no
DNA de cadeia simples e forquilhas de replicação alteradas. Foram
geradas estirpes ctf4 e do tipo selvagem (WT) por esporulação de um
diploide CTF4/ctf4 heterozigoto. Conforme relatado anteriormente,
as células ctf4 exibem graves defeitos de crescimento, com uma
diminuição da aptidão de aproximadamente 25% em relação ao
WT. De seguida, evoluímos 8 populações paralelas de cada genótipo
por 1000 gerações por diluições seriadas em meio rico, nas quais
mutações espontâneas que aumentam a aptidão celular e
sobrevivência à deriva genética serão selecionadas e espalhadas
assexuadamente dentro das populações. No final da experiência,

18
analisou-se se as células tinham recuperado da diminuição da aptidão, medindo a aptidão das
populações ctf4 e WT evoluídas. A aptidão aumentou cerca de 17%.

Para entender essa adaptação evolutivamente rápida ao stresse de replicação constitutivo,

sequenciou-se todo o genoma de todas as populações evoluídas finais, bem comode 32 clones individuais
isolados das linhagens ctf4. Esta análise revelou um aumento dos genes implicados em vários aspetos
do metabolismo cromossómico.

Foram encontradas várias mutações que afetam os genes envolvidos nos checkpoints do ciclo
celular. Três checkpoints foram caracterizados: o primeiro impede que as células entrem na fase S em
resposta ao dano do DNA que ocorre em G1; o segundo retarda o progresso através da fase S em resposta
a problemas encontrados durante a síntese de DNA; o terceiro atrasa a separação dos cromatídeos irmãos
(anáfase) e a saída da mitose em resposta ao dano ao DNA ocorrido após as células entrarem na fase S.

O gene mutado com mais frequência, RAD9, codifica um componente importante do 3º

checkpoint. A maioria das mutações produziram
codões STOP precoces, ou substituições radicais de
aminoácidos. Concluiu-se, então, que a inativação
de RAD9 é uma adaptação à ausência de Ctf4.

✓ Ignorar alguns defeitos nas células ctf4, como

os que ativam o checkpoint, melhora a aptidão,
enquanto ignorar outros, como defeitos no
alinhamento dos cromossomas no fuso, reduz a
aptidão.
✓ A perda de Rad9 nas células ctf4 não acelerou
a fase S, mas levou a uma passagem mais rápida
pela mitose, conforme revelado por uma fração
reduzida de células 2C.
✓ Embora a diminuição do atraso mitótico nas células ctf4 ancestrais fosse benéfica, uma fase S mais
rápida é altamente prejudicial. Estes resultados mostram que a ausência específica de um atraso da
anáfase induzido por danos no DNA, em vez da aceleração genérica do ciclo celular, é adaptativa em
células ctf4 que sofrem stress de replicação.

Vários clones evoluídos mostraram amplificações segmentares, definidas como um aumento no

número de cópias de um segmento cromossómico definido. As oito populações de tipo selvagem
evoluídas não tiveram amplificações segmentares, sugerindo que as mudanças no número de cópias
foram uma adaptação específica ao stress constitutivo de replicação do DNA.

Entre os genes afetados por essas amplificações segmentares estão o SCC2 e o SCC4, que
codificam as duas subunidades do complexo carregador de coesina, que carrega anéis de coesina nos
cromossomas para garantir a coesão dos cromatídeos irmãos até a anáfase, o que significa que a ausência
de Ctf4 seleciona mutações que afetam a ligação entre os cromatídeos irmãos. A hipótese é que as
amplificações segmentares foram selecionadas para aumentar a quantidade do complexo de
carregamento de coesina. Para testar essa ideia, reintroduziram uma segunda cópia desses genes num
ancestral ctf4. Conforme previsto pela amplificação mais
frequente de SCC2, descobrimos que, embora uma cópia extra
de SCC4 sozinha não afetasse significativamente o
condicionamento físico, uma cópia extra de SCC2 ou uma
cópia extra de SCC2 e SCC4 aumentava o condicionamento
físico em 4 a 5%. A adição de cópias extras das subunidades
do carregador de coesina melhorou a coesão dos cromatídeos
irmãos. Concluímos que o aumento do número de cópias das
subunidades do carregador de coesina é adaptativo e alivia
os defeitos de coesão induzidos pela falta de Ctf4.

Encontraram mutações quatro mutações independentes que alteraram três subunidades da

helicase replicativa. A ligação das subunidades permite que o Ctf4 coordene a progressão da helicase

19
com a primase, que sintetiza os primers para a síntese de DNA da cadeia atrasada. Uma das mutações
aumentou a aptidão da estirpe ancestral ctf4.

O IXR1, um gene que codifica um fator de transcrição que regula a concentração de

desoxirribonucleótidos trifosfatos, foi mutado em várias populações. Esta mutação conferiu uma
vantagem seletiva às células ancestrais ctf4D. Uma hipótese explicativa é que a ausência de Ctf4
reduzir a coordenação das atividades necessárias para replicar o DNA e levar ao aparecimento de grandes
regiões de DNA de cadeia simples, que por sua vez expõe os garfos ao risco de clivagem por nuclease. Se
isto for verdade, retardar a helicase replicativa ou a síntese da cadeia líder reduziria a quantidade de DNA
de cadeia simples perto da forquilha de replicação e melhoraria a capacidade de completar a replicação
do DNA antes da divisão celular. Estes resultados mostram que as células evoluíram com dinâmicas de
replicação de DNA modificadas para compensar defeitos induzidos pelo stress de replicação de DNA.

Seguindo a frequência de alelos dentro

da população e sequenciando clones individuais,
descobriu-se que as mutações nos três módulos
ocorreram em três ondas seletivas
consecutivas: primeiro, as células adquiriram
uma cópia extra do gene SCC2, depois, ixr1-Q332*
e sld5-E130K apareceram, simultaneamente, em
duas linhagens diferentes e, finalmente, rad9-
N876K apareceu independentemente nas duas linhagens contendo ixr1-Q332* ou sld5-E130K.

A ausência de Ctf4 nas células ancestrais causa vários fenótipos observados no stress de replicação
de DNA induzido por oncogenes, incluindo regiões de replicação tardia, taxas de mutação elevadas e
instabilidade cromossómica. As semelhanças entre a tumorigénese e esta experiência leva-nos a
especular que uma grande força seletiva nos estágios iniciais da evolução do tumor é a necessidade
de neutralizar os custos de adequação do stresse de replicação.

A ploidia e a capacidade de recombinação moldam a adaptação evolutiva ao stress constitutivo de

replicação do DNA

Na levedura haploide, a adaptação evolutiva ao stress constitutivo de replicação do DNA altera três
módulos de manutenção do genoma: replicação do DNA, checkpoint de dano do DNA e coesão dos
cromatídeos irmãos. As interações entre mutações benéficas que produzem fenótipos evoluídos
dependem de dois fatores: background, genético e características funcionais do genoma, incluindo a
sua ploidia e taxa de recombinação, que levam à seleção de mutações diferentes e diferentes taxas de
adaptação.

Em S. cerevisiae haploide, a adaptação evolutiva ao stress constitutivo da replicação do DNA é

impulsionada por mutações que afetam três módulos funcionais que contribuem para a manutenção do
genoma: mutações de ganho de função que estabilizam a ligação entre cromatídeos-irmãos, mutações
que melhoram a conclusão da replicação do DNA, provavelmente por estabilizar a progressão de
forquilhas de replicação e mutações que inativam o checkpoint de danos do DNA, acelerando assim o
ciclo de divisão celular. A adaptação total aos defeitos impostos pelo stress constitutivo de replicação do
DNA requer uma combinação de mutações nos três módulos.

Para investigar a influência das características genómicas, desenvolveu-se estirpes diploides e

estirpes haploides deficientes na recombinação (com uma deleção de RAD52, que codifica uma enzima
conservada necessária para emparelhar sequências de DNA homólogas durante a recombinação) e
comparou-se as suas respostas com as de células haploides eficientes na recombinação. Todas as três
estirpes foram sujeitas a stress de replicação de DNA constitutivo causado pela remoção do Ctf4. A
adaptação ao stress de replicação do DNA ocorre em todas as três estirpes e todas elas acumularam
mutações na maquinaria de replicação do DNA, no checkpoint de danos do DNA e na coesão dos
cromatídeos irmãos.

Em comparação com as estirpes haploides ctf4Δ relatadas anteriormente, que manifestaram uma
diminuição de aptidão de ~ 27% em relação às células isogénicas do tipo selvagem, o stress constitutivo

20
da replicação do DNA
causado pela ausência de
Ctf4 foi mais prejudicial
em diploides (~35% de
aptidão reduzida) e em
estirpes deficientes na
recombinação (~ 55% de
aptidão física reduzida).
Após 1000 gerações
experienciando stress
constitutivo de replicação
do DNA, observou-se a
aptidão das populações
diploides evoluídas e
deficientes em
recombinação em
comparação às haploides evoluídas. Independentemente das suas características genómicas, todas as
populações sem Ctf4 aumentaram a aptidão em comparação com seus respetivos ancestrais:
haploides de -27% para -9,6%, diploides de -35% para -14,4% e haploides deficientes em recombinação de
-55% para - 19%.

Curiosamente, percebeu-
se que os valores de ganho de
aptidão dependem
principalmente de diferentes
taxas de adaptação durante
as primeiras 100 gerações,
onde as populações diploides e
deficientes em recombinação
ganharam uma grande fração
da sua aptidão final. Estirpes
ancestrais menos aptas aumentaram a sua aptidão mais rapidamente do que ancestrais mais aptas, um
fenómeno conhecido como "adaptabilidade decrescente": o ganho absoluto de aptidão ao longo de
1000 gerações depende linearmente da aptidão relativa dos ancestrais.

Usando métodos de sequenciação do genoma, um total de 195, 276 e 905 genes ou sequências
regulatórias associadas foram encontrados mutados em populações haploides, diploides e deficientes
em recombinação evoluídas, respetivamente. Os genes que sofreram mutações significativas em todas
as três estirpes incluíam dois que se tinha demostrado serem adaptativos em células ctf4Δ haploides:
mutações em RAD9 inativam o checkpoint de danos no DNA e mutações em SLD5 alteram a função da
helicase replicativa. Todas as três estirpes também mostraram mutações em RAD61 e PDS5, que estão
implicadas na segregação cromossómica, um módulo celular que demonstrou desempenhar um papel
durante a adaptação de populações haploides ctf4Δ.

Muitos clones exibiram um aumento no número de cópias de segmentos cromossómicos

específicos (amplificação segmentar) em comparação com as populações controlo. Apenas uma
amplificação segmentar foi detetada nas populações das três estirpes que evoluímos, que contém SCC2.
O gene que codifica SCC4 encontra-se num segmento que foi amplificado em clones haploides e
diploides, mas nunca foi encontrado amplificado sozinho: sempre em populações que também tinham
SCC2 amplificado. Foi demonstrado anteriormente que cópias extras de SCC2 aliviam os defeitos de
coesão associados à ausência de Ctf4 em células haploides e aumentam sua aptidão.

Embora mutações que afetam a coesão dos cromatídeos irmãos, a replicação do DNA e o
checkpoint de danos ao DNA sejam encontradas nas três estirpes, a frequência com que as detetamos
depende das características genómicas da população em evolução: a amplificação de genes ocorre com
muito menos frequência em populações com deficiência de recombinação, tornando a via para melhorar
a coesão dos cromatídeos irmãos menos acessível, e as mutações nulas recessivas são mais raras em
populações diploides, bloqueando uma via importante pela qual os haploides inativam o checkpoint de
danos do DNA.
21
 O gene que codifica a barreira da forquilha de replicação Fob1 coordena a replicação das repetições
em tandem presentes no locus do rDNA. Na ausência de Ctf4, Fob1 pode induzir o colapso da forquilha
de replicação, resultando em quebras de cadeia dupla que podem ser resgatadas por processos
mediados por recombinação. A inativação de Fob1 é, portanto, especificamente benéfica em células com
deficiência de recombinação que, de outra forma, acumulariam quebras cromossómicas irreparáveis

✓ As mutações que afetam a coesão dos cromatídeos irmãos, a replicação do DNA e o checkpoint
de danos do DNA são benéficas na presença de stress constitutivo de replicação do DNA,
independentemente das características genómicas das estirpes.

4. O ratinho como modelo de estudo

A grande diferença do ratinho (Mus musculus) em relação aos outros vertebrados utilizados como
modelo de estudo é que este é o único mamífero. O facto de ser um mamífero traz algumas limitações,
como o facto de ser difícil de manipular. Utilizando CRISPR podemos fazer genética na maioria dos
modelos, animais ou vegetais, mas no ratinho é onde funciona melhor. Existem 2 tipos de genética:
criamos mutantes de forma aleatória e depois procuramos qual é a mutação que causa um determinado
fenótipo, e podemos saber a mutação que queremos implementar e expressá-la no ratinho.

Existem 2 formas de manipular o genoma:

• Transgénese – introdução de um gene normal no

lugar/momento errado ou introdução de uma versão
mutante de um gene – introdução de DNA exógeno. Pode
ser utilizada em todos os modelos, sendo que não fazemos
o target para um locus específico.

Na transgénese, essencialmente introduzimos no genoma

uma cassete funcional, que vai expressar algo no pâncreas, por
exemplo. Temos o cDNA para essa proteína, um promotor
(elemento genético que vai conduzir a
expressão deste cDNA para uma
região particular) uma cauda poli-A
para terminar a transcrição. Depois da
fertilização nos mamíferos, a
informação genética dos dois pais fica
separada durante um tempo –
pronúcleo. O que se faz é microinjetar
o DNA num dos núcleos e colocar o
zigoto no útero de uma fémea.

A expressão do grupo 6
dos genes Hox leva ao
desenvolvimento de costelas.

• Genética/Recombinação – vamos a um locus particular do genoma e fazemos algo, como

inativação de genes ou outras alterações cromossomais.

A forma clássica de fazer recombinação é utilizando células estaminais embrionárias, através das
quais podemos criar um novo animal. O blastocisto está dividido em duas partes: a parte mais exterior, o
trofoblasto, e a massa celular interna. As células estaminais embrionárias provêm da massa celular
interna. Se colocarmos estas células em cultura sob condições particulares, elas são pluripotentes,
podendo dar origem a células dos diferentes tecidos. Estas células em condições de cultura vão dividir-
se algumas vezes, mas depois morrem, a menos que se transformem em células cancerígenas, e aí podem
durar para sempre.

Se introduzirmos as células estaminais embrionárias num zigoto, elas vão passar a fazer parte da
massa celular interna e vão contribuir para o ratinho que daí vai nascer. O blastocisto que foi injetado

22
provém de um rato preto, e as células
injetadas originam ratos castanhos. O
resultado é uma quimera, com
contribuição dos dois tipos de células.

Neste ratinho temos uma

contribuição das células estaminais na
pele, que é inútil a menos que
também contribuam para a linha
germinal. Para saber se estas células
também contribuem para as células
germinativas temos de cruzar esta
quimera com um ratinho preto
(normal). Se na descendência tivermos
um rato preto, significa que o gâmeta
que a quimera deu veio do blastocisto
e não das células estaminais; se tivermos um rato castanho significa que os gâmetas vieram das células
estaminais embrionárias. Estes ratos são heterozigotos e a cor castanha é dominante, daí ser observável.

Se inativarmos o gene
hox do grupo 10, temos o
desenvolvimento de costelas ao
longo de todo o corpo do animal,
o que significa que estes genes
são essenciais para bloquear a
formação de costelas. Para
sabermos a função de um gene,
temos de inativá-lo, mas temos de ter atenção à redundância, uma vez que mais do que um gene pode
ser responsável pela mesma função.

Este é um dos sistemas que permite alterar o genoma:

CRE/Lox ou FLP/FRT.

As sequências LoxP são sequências palindrómicas que

têm uma parte diferente no meio que lhes dá direccionalidade.
Se as sequências LoxP tiverem a mesma direção, o fragmento de
DNA entre elas é removido pela recombinase CRE. Se as
sequências tiverem direções opostos, o fragmento entre elas é
invertido.

Para fazer um controlo no espaço, podemos por a

recombinase CRE sob a ação de um promotor específico de
um determinado tecido, para que esta só se expresse nesse tecido e apenas aí leve à recombinação.

Para fazer um controlo no tempo com base no recetor de

esteroides, que tem 3 domínios: domínio de ligação ao esteroide, o
domínio que ativa a transcrição e o domínio que se liga ao DNA. Na
ausência de esteroides, este recetor está no citoplasma, uma vez
que se encontra ligado
à hsp90, pelo que não
consegue ativar a
transcrição. Quando existe esteroides, eles ligam-se ao
recetor, alteram a sua estrutura de modo que não fique mais
ligado à hsp90, sendo que o recetor vai para o núcleo e pode
ativar a transcrição. Podemos fazer uma fusão deste recetor
com a recombinase CRE, que para funcionar tem de estar no
núcleo. Assim, a CRE só funciona quando adicionamos
tamoxifen, o que permite um controlo no tempo da
expressão.

23
 Outra coisa que podemos fazer é complementação genética.
Por sequenciação identificamos uma mutação num gene específico;
podemos eliminar essa mutação eliminando esse gene num tecido
específico. A CRE-ERT vai ser expressa apenas nesse tecido, pelo que
na presença de tamoxifen vai haver a deleção da mutação.

CRISPR-CAS9

A Cas9 é uma proteína que corta DNA em cadeia dupla numa

sequência específica, que é determinada pelo guideRNA, que é
complementar à zona que queremos clivar. O gRNA reconhece as
sequências PAM. Quando uma célula tem uma quebra em dupla cadeia
tenta resolver esse problema, através de NHEJ e HDR. Mas os processos
de reparação não são 100% eficientes, pelo que podem induzir erros.

No caso da recombinação homóloga, podemos introduzir uma

sequência homóloga onde introduzimos algo no local do corte para que
a cadeia clivada copie. Podemos introduzir codões STOP ou TAGs, que
nos permitem identificar os mutantes (os TAGs a 3’ são melhores porque
assim temos a certeza de que são expressos). Além disso, podemos ainda
introduzir desta forma sequência LoxP.

Podemos fazer uma fusão entre a Cas9 e um domínio que bloqueia a transcrição, o KRAB, ou com
um domínio que ativa a transcrição, VP64. Temos também a possibilidade de fazer a fusão entre a Cas9
e uma deaminase ou glicosilase, que permiti substituir um nucleótido por outro.

5. Neurogenética da locomoção
Um sistema de locomoção deve ser:

• adaptado ao ecossistema do animal;

• energeticamente eficiente;
• flexível ao terreno e condições de carga;
• estável.

Os sistemas motores são conservados, pelo que podemos simplificar o nosso modelo olhando
para o gafanhoto, ratinho ou para a mosca da fruta.

A mosca passa a maior parte da sua vida a andar e não a voar, pelo que tem uma sistema locomotor
e nervoso sofisticados. Se olharmos para o sistema nervoso, vemos os componentes que existem nos
humanos, como os neurónios motores, que permitem que os músculos se contraiam, CPGs (central
pattern generators), que têm a capacidade de gerar saídas rítmicas de sinais (definem o ritmo dos
movimentos), neurónios sensitivos e interneurónios, que fazem a ligação entre os neurónios motores e
sensitivos. Existem várias condições, como neurodegeneração, idade, drogas, mudanças físicas e defeitos
de desenvolvimento, que marcam o desenvolvimento e a função destes circuitos que afetam a locomoção
coordenada. A coordenação do movimento das pernas também é auxiliada por entradas sensoriais
propriocetivas que relatam a carga e a posição das articulações das pernas. Na pata da mosca existem
diferentes tipos de propriocetores que nos dão
diferentes tipos de informação, como os órgãos
cordonatais – informam o angula da perna; e os
sensílios campaniformes – sensores de
carregamento, ou seja, servem para medir a carga
corporal.

O tamanho pequeno da mosca torna difícil

analisar a caminhada neste sistema. Para superar
esta limitação, usou-se uma combinação de um
sensor ótico de toque, que usa Reflexão Interna Total
frustrada (fTIR), e imagens de vídeo de alta
24
velocidade para seguir o corpo da mosca enquanto ela caminha e também para registar quando e onde
ela coloca cada uma das suas patas na superfície enquanto se move (aparecem pintinhas brancas). Então,
usando um software chamado FlyWalker, foram capazes de extrair um grande número de parâmetros
que podem ser usados para descrever a locomoção em moscas-das-frutas adultas com alta resolução
temporal e espacial. Usando este método, é apresentada uma descrição abrangente de muitos
parâmetros de locomoção, como tipo de marcha, posicionamento tarsal e coordenação intersegmentar
e esquerda-direita para moscas-das-frutas do tipo selvagem.

Foi examinado o comportamento de caminhada de moscas adultas de tipo selvagem andando

livremente numa superfície horizontal plana em linha reta sem parar. As velocidades médias de cada
mosca variaram entre 7,2 e 44,7 mm/s, sendo 28 mm/s a velocidade mais representativa. Conforme
observado anteriormente em várias espécies de insetos, à medida que a velocidade aumenta, a duração
da fase de apoio torna-se mais curta, enquanto a duração da fase de balanço permanece constante; nas
velocidades mais rápidas, as durações das fases de balanço e apoio igualam-se. Consequentemente, o
período do passo varia inversamente com a velocidade média até aproximadamente 30 mm/s, quando o
período do passo atinge um estado estacionário. Também descobriram que o comprimento do passo
aumentou quase linearmente com a velocidade. Como consequência, a velocidade da troca de patas
também segue esta tendência. Mendes e cols. mostram que as moscas-das-frutas não exibem as
transições abruptas na marcha que são tipicamente observadas em vertebrados, dependem sim de um
contínuo de padrões de marcha que se correlacionam com a velocidade de caminhada.

O programa FlyWalker também extrai dados para cada

perna individual para cada um dos três segmentos torácicos.
À medida que a velocidade média aumenta, há uma pequena
diminuição na duração da fase de balanço nas pernas
dianteiras quando comparadas a outros segmentos, o que
apoia a hipótese de um papel importante para as patas
dianteiras na locomoção para a frente.

Além de seguir as seis pegadas, o FlyWalker também

monitora a posição do corpo da mosca. A partir desses dados
podemos reconstruir as posições de apoio em relação ao
centro do corpo. Medindo este parâmetro, animais mais
rápidos apresentam traços de apoio mais retos em
comparação com animais mais lentos, ou seja, os animais têm
passos mais restritos espacialmente à medida que
aumentam sua velocidade.

A marcha trípede é caracterizada por três pernas em

fase de apoio e três pernas em fase de balanço. Cada grupo de
três pernas é composto pelas pernas dianteiras e traseiras de um lado e a perna média do lado contrário.
Em contraste, numa marcha tetrápode, apenas duas pernas estão na fase de balanço, enquanto as
quatro pernas restantes estão na fase de apoio. As duas pernas na fase de balanço estão em lados
contrários e são compensadas por um segmento. O conjunto completo de dados mostra que as moscas
andam preferencialmente usando a marcha trípede, mas também demonstra que, à medida que as
moscas diminuem sua velocidade, elas usam cada vez mais tetrápodes e combinações não
canónicas.

Tipicamente para hexápodes, o toque da perna ocorre perto de onde a perna ipsilateral
imediatamente anterior fez contato, um comportamento denominado “follow the leader”. Este
comportamento depende de feedback sensorial e interneurónios intersegmentares especializados. Em
velocidades lentas (<20 mm/s), os valores de alinhamento da pegada foram relativamente grandes,
enquanto em velocidades rápidas (>34 mm/s) esses valores foram muito menores, sugerindo que o
alinhamento da pegada é altamente restrito. Notavelmente, em velocidades intermediárias (entre 20 e
34 mm/s), não houve correlação entre velocidade e alinhamento da pegada.

Uma das questões do trabalho é quão importante é o feedback sensitivo. Se olharmos para a pata
da mosca, ela tem muitas células sensoriais. Elav-gal4 é um driver que marca as células neuronais, pelo
que na pata da mosca vemos as células neuronais. Uma das primeiras coisas que se fez foi a ablação da
função neuronal na pata. Esta mosca anda, mas de forma muito descoordenada.
25
 Para quantificar o efeito da inativação dos neurónios
sensoriais na pata da Drosophila, testou-se tanto a inativação de
um pequeno subconjunto de neurónios quanto a inativação
sensorial mais ampla nas patas. Primeiramente, testamos a
inativação da perna ChO. O gene nanchung (nan) codifica uma
subunidade do canal catiónico e é expresso exclusivamente nos
cílios sensoriais dos órgãos cordotonais. A perda de função para
nan leva a uma perda de perceção sonora, higrossensação e
defeitos de gravidade negativa, além de um fenótipo
"descoordenado". A este genótipo chamamos nan36a. Em
segundo lugar, testamos a inativação neuronal induzida pela
expressão da toxina tetânica (TNT) num grande subconjunto de
neurónios sensoriais nas patas. Para restringir a expressão de TNT aos neurónios sensoriais da pata,
contamos com uma linha UAS-FRT-stop-FRT-TNT, o driver sensorial 5-40-Gal4 e um fragmento
intensificador cis-regulatório dachshund (dac) para conduzir a recombinase
FLP no disco imaginal da perna. Para simplificar, nos referimos a esse
genótipo como 5-40Leg>TNT.

Moscas de ambos os genótipos (nan36a e 5-40Leg>TNT) andavam mais

lentamente do que as moscas do tipo selvagem, mas, notavelmente,
mantiveram uma típica marcha trípede. Estas moscas também exibiram
coordenação
esquerda-direita e
intersegmentar
normal, no entanto,
os traços de postura
para moscas nan36a e 5-40Leg>TNT destacam vários
defeitos de locomoção.

Observou-se um aumento no
comprimento do passo, um posicionamento
corporal mais vacilante e uma maior variabilidade
no agrupamento da pegada. A duração do
balanço e da postura aumentou, resultando em
um período mais longo. No entanto, as
velocidades de balanço foram minimamente
afetadas, sugerindo que os próprios neurónios
motores não foram comprometidos em moscas
com deficiência de propriocepção. Os valores de alinhamento da pegada também diminuíram em
moscas privadas de feedback sensorial. É importante ressaltar que, embora nan36a e 5-40Leg>TNT afetem
as estruturas sensoriais nas antenas, apenas um aumento na duração do balanço foi observado após a
remoção cirúrgica da antena, argumentando que todos os outros fenótipos são resultado do bloqueio
do feedback sensorial especificamente das pernas.

Curiosamente, várias das diferenças que observamos em moscas privadas de feedback sensorial
foram mais pronunciadas em animais que andavam mais devagar em comparação com moscas mais
rápidas. O índice de trípode também diminuiu em moscas mais lentas. As moscas com deficiência
sensorial posicionam o meio das pernas mais longe do corpo, semelhante à tendência observada nas
moscas rápidas. Essas observações são consistentes com a ideia de que as moscas que andam em
velocidades lenta, média e rápida usam programas neurais distintos, e que as moscas que andam
em velocidades rápidas são menos dependentes do feedback sensorial. Essa observação é consistente
com a ideia de que, quando as moscas andam rápido, elas usam um sistema baseado em CPG
independente do sistema sensorial, onde CPGs individuais comunicam por interneurónios locais para
obter coordenação. Em contraste, em moscas mais lentas, o feedback sensorial seria invocado para
permitir que os animais negociem terrenos mais complexos.

Surpreendentemente, descobriu-se que a inativação dos neurónios sensoriais nas pernas da

mosca, para bloquear o feedback propriocetivo, levou a uma precisão deficiente do passo,
especialmente a velocidade mais baixas, mas a coordenação entre as pernas e a capacidade de
26
executar uma marcha trípede não foram afetadas. Juntos, esses dados revelam os parâmetros
subjacentes da caminhada do tipo selvagem em Drosophila e mostram que o feedback sensorial
propriocetivo é importante, mas não absolutamente necessário, para a locomoção coordenada. Em
vez disso, sugerem que a comunicação entre CPGs, talvez por interneurónios locais, pode ser suficiente
para a coordenação.

Optogenética – conjunto de técnicas que permitem a manipulação de populações neuronais usando luz.
Se queremos saber a função de um neurónio, ou silenciamos ou amplificamos o sinal e vemos o resultado.
A optogenética permite fazer isto de forma não invasiva.

• Colocam-se canais iónicos heterólogos (de cianobactéria) codificados geneticamente num

conjunto de neurónios, que são acionados pela luz através de opsinas (que são sensíveis à luz).
Os efeitos incluem ganho e perda de atividade neuronal.

Fez-se estimulação optogenética para estimular os neurónios dos diferentes elementos com a
mosca parada. O ingrediente magico são as opsinas, que são canais transmembranares sensíveis à luz
que são responsáveis pelo potencial de ação. Expressaram uma das opsinas com GFP e conseguiam ver
um sinal quando elas abria. Quando a luz liga, um grupo de neurónios faz com que o rato esteja sempre
a virar para a esquerda. Existe também um grupo de moscas da fruta que quando ligamos a luz verde
elas colapsam. Isto permite um grande controlo.

Ao estimular células sensoriais quando o animal está parado, no controlo, não acontece nada.
Quando fazemos um target a uns neurónios, a mosca move-se quando recebe a luz. Quando se estimula
diferentes classes de células sensoriais, elas respondem todas. Após estimulação há uma fase
descoordenada e depois uma coordenada.

A questão foi, será que a luz vai ao sistema nervoso central e volta ou fica só nas células sensoriais?
Corta-se a cabeça e vê-se que elas continuam a andar muito bem. Repetiram a experiência em moscas
sem cabeça, e num dos sítios ela anda e no outro não. Há alguns
elementos que respondem sem a informação ir ao cérebro e os
outros não. Como sem cabeça a informação é direta, não há
coordenação no andar. A coordenação entre as pernas foi perdida, assim
como a coordenação entre
os dois músculos na
mesma perna.

Vamos ver, então, a

coordenação entre os dois
músculos, o elevador ou
depressor (flexor ou
extensor). O azul é extensor
e o laranja é flexor. Eles
funcionam em
coordenação e foram ver se
com à luz também havia coordenação. Colou-se a mosca a
uma lamina e marcou-se os músculos de uma perna com
GCamp, uma proteína que fica fluorescente com o cálcio. Há
duas situações em que se liberta cálcio: na despolarização
dos neurónios e na contração muscular. Assim quando o
musculo contrai a proteína emite fluorescência. Com a
estimulação com luz continua a haver contração
alternada. Mesmo nos sem cabeça, os picos não são os
mesmos, mas continua a haver uma resposta antifásica.

Removeram as pernas do meio e foram ver se elas ainda andavam a short term e a long term. Ao
fim de muitas horas após o procedimento elas andam bem e melhoraram o andar em relação a
depois de serem estimuladas. Há uma adaptação. Isto é uma forma de motor learning - aprender a
fazer um dado movimento que não sabíamos fazer antes.

27
 A mosca da fruta, tem componentes de
aprendizagem e de memória.

Há muitas células motoras que estão

direcionadas para um músculo e que enervam sempre
o mesmo músculo. A questão é, como é que isto é
composto. O desenvolvimento dos neurónios motores
ocorre no período de desenvolvimento de larva e depois
durante a transição de pupa para adulto. Quando a larva
cresce os neurónios motores também tem de crescer.
Nas fases finais de desenvolvimento, dentro da pupa,
eles estão a mexer-se, ou seja, há contrações musculares durante a fase de pupa.

6. Movimento celular coletivo durante a morfogénese do tecido

O enrijecimento do tecido coordena a morfogénese desencadeando a migração celular coletiva in
vivo

As células de um cluster respondem melhor em conjunto a um estímulo do que sozinhas. Para

terem direcionalidade ou para passarem de um estado não migratório para migratório, as células têm de
coordenar o seu comportamento, por exemplo, têm de se manter juntas como um grupo, mas também
têm de ter a capacidade de mudar de posição dentro do grupo. O que tem de estar coordenado
também é a atividade do citoesqueleto, ou seja, as células têm de conseguir estabelecer pontes para
passarem informação, por exemplo, através de conexinas. As células a migrar estendem a parte da frente
e depois contraem a parte de trás, como uma minhoca.

A migração celular coletiva é essencial para a morfogênese, regeneração e invasão do cancro.

In vivo, grupos de células movem-se de forma coordenada pelos tecidos, através de interações mecânicas
e moleculares entre as células e o seu ambiente. Embora o papel dos sinais moleculares esteja bem
compreendido, ainda não se sabe como é que a mecânica dos tecidos influencia a migração celular
coletiva in vivo. Foi investigada a importância das interações mecânicas na migração coletiva das células
da crista neural de Xenopus laevis, uma população de células embrionárias cujo comportamento
migratório foi comparado à invasão do cancro. Estas células movimentam-se para formar os diferentes
tecidos do corpo. No geral, demonstraram que as mudanças na rigidez do substrato podem desencadear
a migração celular coletiva, promovendo a transição epitelial para mesenquimal in vivo, ou seja, a
mecânica tecidual combinada com efetores moleculares coordena a morfogénese.

A crista neural migra como uma população de células mesenquimais, e fatores de transcrição
chave são suficientes para promover a transição epitelial para mesenquimal (EMT) in vitro. Durante o
desenvolvimento, esses fatores são expressos muito antes do início da migração da crista neural; no
entanto, não é claro se são suficientes para desencadear a migração celular ou se fatores extrínsecos
adicionais também são necessários. Para testar se o início da migração da crista neural é determinado
por fatores extrínsecos, expôs-se a crista neural não migratória e pré-migratória a ambientes
embrionários em diferentes
estágios de desenvolvimento.
Aqui definimos crista neural não e
pré-migratória como células que
não estão a migrar (estágio 13) ou
estão prestes a começar a migrar
(estágio 20), respetivamente.

Quando enxertado num hospedeiro num estágio migratório, a crista neural não migratória
migrou, enquanto a migração não acontece se a crista neural pré-migratória fosse enxertada num
hospedeiro não migratório. Além disso, quando cultivadas ex vivo e expostas ao quimioatraente da
crista neural Sdf-1 (ou Cxcl12), que controla a migração direcional da crista neural in vivo, as cristas neurais
não e pré-migratórias eram identicamente móveis, indicando que as células são intrinsecamente
capaz de migrar independentemente do seu estágio embrionário e que as mudanças nos fatores
ambientais regulam o início da migração da crista neural.
28
 Como tanto a EMT como a migração celular
demonstraram ser influenciados pelas propriedades
mecânicas do ambiente celular in vitro, caracterizou-se
a rigidez do tecido de embriões Xenopus em
desenvolvimento. Como a crista neural cefálica usa a
mesoderme da cabeça como substrato para migração,
medimos o módulo da elasticidade aparente da
mesoderme removendo a epiderme superficial.
Comparando os estágios embrionários não e pré-
migratórios, a rigidez da mesoderme na frente da crista
neural aumentou gradualmente ao longo do tempo. A
remoção da fibronectina não teve efeito no módulo de
elasticidade, confirmando que a fibronectina não
contribui para a rigidez mesodérmica. Foi encontrada
uma forte correlação
entre o enrijecimento
mesodérmico e o início
da migração da crista
neural, sugerindo que o enrijecimento do tecido pode desencadear a
migração celular coletiva da crista neural (CCM) in vivo.

Para testar se as mudanças na rigidez do substrato in vivo são

suficientes para desencadear a CCM da crista neural, cultivou-se cristas
neurais em hidrogéis revestidos de fibronectina com valores de rigidez
semelhantes aos encontrados na mesoderme não e pré-migratório.
Notavelmente, a crista neural pré-migratória migrou para Sdf-1 quando explantada em substratos
rígidos, mas não quando explantada em substratos moles.
Aglomerados de crista neural, mas não células únicas,
demonstram movimento direcional em direção a Sdf-1 em
substratos rígidos, o que sugere que a rigidez do substrato pode
ser detectada no nível de uma única célula; no entanto, o
movimento direcionado é uma propriedade emergente
decorrente das interações célula-célula.

Um modelo matemático confirmou então que quando o

rácio da elasticidade do substrato/elasticidade da célula era próximo de 1, havia migração (substrato
permissivo); se o rácio fosse menor que 0,55, não havia migração (substrato não permissivo); um rácio
superior a 1 também gera migração. Ao contrário do
que se pensava anteriormente, à medida que o
substrato se torna mais rígido, as células NC
tornam-se menos rígidas; é essa pequena rigidez
que permite que as células migrem.

Além disso, a crista neural cultivada em

substratos rígidos, mas não em macios, tende a
dispersar, uma característica da EMT.
Consequentemente, descobrimos que um substrato rígido reduziu os níveis do marcador epitelial E-
caderina, enquanto a expressão do marcador mesenquimal N-caderina foi aumentada. Portanto, o
enrijecimento ambiental do mesoderma pode estimular a CCM da crista neural, desencadeando a
EMT. Para confirmar a informação anterior, diminuiu-se a rigidez da mesoderme removendo o tecido
circundante, sendo que o
resultado foi a inibição da
migração da crista neural.

Em seguida, realizou-se
a manipulação molecular da rigidez da mesoderme por injeções direcionadas de inibidores da
atividade da miosina, que diminuíram a rigidez do substrato: um morfolino bloqueador da tradução da
29
 cadeia leve da miosina 9 (myl9-MO) ou uma
forma constitutivamente ativa de fosfatase de
miosina (CA-MYPT). Isto levou a uma
diminuição acentuada da rigidez da
mesoderme e bloqueou a migração da crista
neural. Estes dados mostram que uma rigidez
crítica na mesoderme é necessária para
promover a migração da crista neural in vivo.

Em seguida, investigou-se se atingir o limite de rigidez em embriões não migratórios era

suficiente para desencadear a migração prematura da crista neural. A injeção de uma forma
constitutivamente ativa da cadeia leve de miosina (CA-MLC) na mesoderme levou a um aumento
precoce na rigidez do tecido, equivalente ao alcançado em embriões pré-migratórios, e promoveu a
migração prematura da crista
neural. Estes resultados
demonstram que o
enrijecimento mesodérmico é
necessário e suficiente para
desencadear a CCM da crista
neural in vivo.

Para investigar como é que as células da

crista neural detetam o aumento na rigidez
mesodérmica, perturbou-se a sinalização
inibindo o complexo integrina-vinculina-
talina, que medeia a mecanossensibilidade
noutros sistemas. A inibição de qualquer um
destes mecanossensores levou a um forte
comprometimento do início da migração da
crista neural in vivo. Estes resultados mostram
que a crista neural requer integrina-vinculina-
talina para sua migração, sugerindo que esta
via está envolvida na mecanossensibilidade
das células da crista neural.

Pensava-se que modificações na matriz extracelular (por exemplo, um aumento nas fibras de
colágeno) afetavam a rigidez do tecido; no entanto, o colágeno não é expresso no tecido durante a
migração da crista neural. Juntamente com os dados que descartam a fibronectina como uma fonte de
enrijecimento, isto sugere que é improvável que alterações na matriz extracelular sejam a causa do
enrijecimento da mesoderme neste sistema.

A contratilidade da actomiosina não é essencial para controlar a rigidez mesodérmica da cabeça

durante os estágios em que a crista neural migra. No entanto, quando inibimos a miosina em embriões
não migratórios, a rigidez da mesoderme é
reduzida e a migração da crista neural é
prejudicada. Esta diferença temporal na ação
provavelmente ocorre porque a atividade da
miosina é necessária para a migração das células
da mesoderme entre os estágios não e pré-
migratórios, o que, por sua vez, afeta
indiretamente a rigidez subsequente da
mesoderme.

Outro fator que controla a rigidez do tecido

é a densidade celular. Para testar se as células
mesodérmicas se acumulam sob a crista neural,
mediu-se as densidades das células mesodérmicas
desde os estágios não migratórios até aos pré-
migratórios. As densidades celulares aumentaram

30
no início da migração da crista neural e, além disso, a densidade celular mostrou
uma correlação com o enrijecimento da mesoderme em todos os tratamentos
que afetaram a migração. Estas observações confirmam que o principal
contribuinte para a rigidez da mesoderme é a densidade celular.

Para validar o papel da extensão convergente no enrijecimento do

mesoderma, inibimos especificamente a via de polaridade da célula planar
(PCP) na mesoderme com injeções direcionadas do inibidor de PCP DshDEP+, o
que prejudicou a migração da crista neural de maneira não autónoma. De acordo
com a nossa hipótese, as densidades celulares e a rigidez da mesoderme foram
reduzidas em embriões injetados com DshDEP+.

Para confirmar que a inibição da migração da crista neural após o bloqueio

do PCP é consequência de uma alteração mecânica no tecido, resgatamos a
rigidez mesodérmica nos embriões sem PCP mais macios aplicando compressão
extrínseca. Isto foi suficiente para resgatar completamente a migração da crista
neural. Estes resultados indicam que a migração prejudicada da crista neural
observada em embriões sem PCP foi principalmente devido à diminuição da
rigidez mesodérmica.

Quando as células adquirem esta

capacidade de migrar, têm de saber para
onde ir. Se não houver sinais a direcionarem
as células, elas vão dispersar de forma radial. Vários sinais podem guiar as células,
sendo que o que se conhece à mais tempo é a quimiotaxia - guia químico das células (atração ou
repulsão). Além disso, as células podem responder a campos elétricos – galvanotaxis., ou seja, existem
uma células que se vão dirigir ao cátodo e outras ao ânodo.

Começaram a medir as correntes da parte dorsal até à parte ventral. O que descobriram foi que
havia correntes de saída (correntes positivas) na parte dorsal, ou seja, há uma grande mobilidade. Na parte
ventral existiam correntes de
entrada (correntes negativas).
Isto significa que no trajeto
migratório da crista neural
existem campos elétricos. O
ânodo do campo elétrico é na
parte ventral, para onde as
células se vão deslocar. Quanto
maior a intensidade do campo
elétrico aplicado, maior a velocidade de migração das células.

Depois fez-se uma sequenciação de RNA da crista neural, e selecionou-se os canais e bombas que
podem levar a célula a despolarizar. Encontrou-se a proteína VSP1 (voltage sensitive phosphatase 1).
Gerou-se oligonucleótidos antisense, fez-se CRISPR para bloquear a proteína e utilizou-se um dominante
negativo; sempre que se bloqueou a proteína, as células não sabiam para onde se dirigir. Mas este
resultado só se observou na migração celular coletiva dirigida; nos movimentos sozinhas não eram
afetadas.

Durotaxis: o controlo mecânico da migração celular dirigida

Nos seus ambientes nativos, as células e clusters migratórios precisam de se mover de maneira
direcional e persistente, pelo que as células polarizam e orientam a sua polaridade intrínseca e
maquinaria de motilidade em direção a uma polarização extrínseca. Assim, células com baixa
capacidade de polaridade intrínseca respondem mal a sinais de polarização ambiental. Estas células
exibem um tipo de migração chamada “caminhada aleatória”. Por outro lado, células com maior grau
de polaridade intrínseca movem-se eficientemente em direção a sinais externos. Mudanças na
atividade Rac total podem ser usadas como uma mudança entre migração aleatória e direcional, pelo
que o controlo da atividade Rac pelo ambiente migratório é um dos mecanismos que determinam o

31
grau de direcionalidade intrínseca que as células apresentam quando migram persistente e
direcionalmente.

Durotaxis – movimento direcionado ou crescimento de células com base em variações na rigidez da sua
matriz extracelular (MEC).

A durotaxis demonstrou guiar a migração de aglomerados celulares durante a CCM. Células

epiteliais semeadas em gradientes de rigidez exibem migração direcional em direção a regiões mais
rígidas dos géis. O comportamento durotático é uma propriedade emergente de um coletivo de células.

Evidências in vitro sugerem que a durotaxis também está envolvida na fibrose e no cancro. Foi
bem estabelecido que as células cancerígenas colocadas em substratos rígidos exibem fenótipos mais
agressivos do que as colocadas em substratos macios. Esta descoberta destaca a importância de
dissecar os mecanismos subjacentes à durotaxis, a fim de expandir a nossa compreensão do cancro,
fibrose e outras condições patológicas.

Para estudar como se dá a transformação de inputs mecânicos numa resposta celular é necessário
desenvolver estudos em hidrogéis isotrópicos (sem gradiente de rigidez) e, mais importante, em géis
anisotrópicos portadores de um gradiente de rigidez.

Para se adaptarem ao ambiente extracelular, as células migratórias precisam de detetar um

estímulo mecânico e depois responder a esse estímulo, através de mecanismos como
mecanossensação e mecanotransdução, respetivamente. Existem muitas moléculas envolvidas na
resposta a um sinal mecânico que podem atuar como sensores e/ou transdutores. Em vários casos é
desafiador identificar se uma proteína ou estrutura desempenha um papel na deteção ou transdução do
ambiente mecânico de uma célula. Assim, para estabelecer uma definição que nos permita distinguir
entre os processos de mecanossensação e de mecanotransdução, é fundamental que os autores
considerem as escalas de tempo em que esses processos operam. Por exemplo, a mecanossensação
deve ocorrer num regime temporal bastante curto (na ordem de milissegundos) e é caracterizada
por mudanças na estrutura de moléculas específicas, os 'sensores'.

 Mecanossensação

Várias estruturas celulares

têm sido propostas para funcionar
como sensores mecânicos,
incluindo adesões focais (FAs) e a
rede de actomiosina. Sinais
mecânicos do ambiente, como a
rigidez do substrato, podem
modular a composição e as
dimensões dos FAs, que promovem
a reorganização espacial do
citoesqueleto da actomiosina,
mediando assim a tensão sobre o mesmo FA e o córtex celular. Assim, as células em substratos moles
possuem pequenos complexos FA, com baixos níveis de tensão, enquanto células em substratos rígidos
apresentam maiores níveis de tensão. Além disso, em certos contextos, existem exemplos em que as
moléculas de membrana plasmática (PM) e de contato célula-célula também podem atuar como
mecanossensores.

Adesões focais (podem fazer parte do processo de mecanosensibilidade ou mecanotransdução)

As adesões focais são estruturas que conectam as células à ECM do seu substrato migratório. A
força de adesão e tração que as células aderentes exercem sobre seus substratos migratórios depende
quase exclusivamente da sinalização baseada em integrinas, pelo desempenham um papel central na
determinação de como as células percebem e respondem às propriedades mecânicas do seu
substrato migratório. Outras proteínas das adesões focais que se mostraram relevantes são os
adaptadores vinculina e talina, que são as pontes moleculares que transmitem a força baseada em
actina para a integrina nos sítios de adesão e vice-versa.

Rede de actomiosina

32
 O citoesqueleto de actomiosina adapta-se e polariza dependendo dos sinais ambientais
mecânicos. Foi demonstrado que a ordenação do citoesqueleto de actina depende da rigidez do
substrato, sendo que as propriedades mecânicas dinâmicas do citoesqueleto de actina mudam de fluido
para sólido em resposta a substratos de diferente rigidez. Também as isoformas da miosina II cooperam
para funcionar como mecanossensores.

Membrana plasmática

A membrana plasmática deve ser capaz de se ajustar às flutuações de tensão do interior e

exterior da célula, evitando a sua rutura e mantendo a homeostasia, pelo que funciona como uma
estrutura mecanossensorial. Um dos casos mais estudados de como as mudanças físicas na membrana
celular podem afetar o comportamento celular está relacionado com mudanças em canais
mecanicamente fechados. Um dos canais mecanossensíveis mais bem estudados é o Piezo1, um canal
catiónico inespecífico da família dos canais ativados por estiramento de membrana (SACs).

Outra maneira através da qual a membrana plasmática modula os processos migratórios é através
da sinalização lipídica. Neste trabalho, os autores descobriram que a presença de pequenas gotículas
lipídicas pode resultar em uma diminuição na propagação celular induzida pela rigidez,
interrompendo as adesões focais e danificando as fibras, ou seja, as gotículas lipídicas podem prejudicar
a capacidade de sentir a rigidez da matriz.

 Mecanotransdução

A mecanotransdução pode ser mediada por modificações rápidas de proteínas que, por sua vez,
modificam o citoesqueleto e o comportamento celular para, eventualmente, gerar uma resposta
transcricional. Como discutido acima, as adesões focais não são apenas estruturas mecanossensíveis;
também são capazes de mediar a sinalização a jusante por meio da modulação de moléculas de
sinalização, como quinases, fosfatases e proteínas de andaime, como parte da maquinaria
mecanotransdutora. Por exemplo, o envolvimento da integrina pode ativar Rac1 e Cdc42 para promover
a disseminação celular, levando à ativação rápida da quinase ativada por p-21, um efetor downstream de
Rac1 e Cdc42, que está implicado na remodelação do citoesqueleto e na motilidade celular. Além disso,
foi demonstrado que as células podem adaptar-se a novos substratos modulando o tipo de integrina
que expressam nas suas adesões focais, e com isso modulam a tração e a motilidade. As células
cancerígenas também modulam a quantidade e o tipo de integrinas em substratos rígidos, levando ao
aumento da agressividade.

Foi demonstrado que um membro da família de proteínas CAS, conhecido como Nedd9, é
necessário para a migração de células da crista neural aviária in vivo, controlando a dinâmica da actina.
Mais recentemente, foi demonstrado que Nedd9 regula a polaridade celular e a migração da crista neural
através da modulação da atividade de RhoA. Em apoio às nossas descobertas recentes, onde
demonstramos que as células da crista neural são uma população de células mecanossensíveis, uma
possibilidade interessante é que as proteínas CAS possam funcionar como mecanossensores e/ou
transdutores na crista neural.

YAP é uma família de cofatores transcricionais cuja translocação para o núcleo é controlada por
sinais mecânicos do ambiente, como rigidez da ECM, deformação, tensão, área adesiva ou força. Uma vez
no núcleo, YAP liga-se a fatores de transcrição TEAD e induz a transcrição de genes associados à
proliferação e inibição da diferenciação ou migração celular e invasão de células cancerígenas. Neste
estudo, foi elegantemente demonstrado que, sob stress extrínseco, Yap1 pode ser transportada para o
núcleo através de poros nucleares. Nesta linha, a desnaturação da talina em resposta ao aumento da
rigidez da matriz leva à translocação nuclear YAP. Finalmente, dados in vivo revelaram que YAP é
necessário para a migração celular coletiva. Neste artigo, os autores mostraram que o YAP é expresso
predominantemente no tubo neural dorsal e sua perda de função inibe a migração de células da
crista neural, enquanto embriões com ganho de função exibem um aumento na migração da crista
neural a partir do tubo neural.

As cateninas são necessárias para a migração celular e podem ser ativadas por sinais mecânicos
para promover processos como diferenciação, padronização e mudanças específicas na expressão génica.

 Durotaxis: mecanosensoriamento e mecanotransdução em ação

33
 Durante a durotaxis, a migração ocorre num substrato bastante anisotrópico, a partir do qual sinais
mecânicos devem ser diferencialmente "lidos" e transmitidos através da célula ou do cluster. Uma vez
internalizada, a elasticidade diferencial do substrato migratório é traduzida numa cascata que estabiliza
a polaridade celular para influenciar a direção da migração celular, transformando o que é conhecido
como “passeio aleatório” em “migração celular direcionada”.

 Integração da quimiotaxia e durotaxis

Apesar do estabelecimento de um papel para a durotaxis in vivo, um dos desafios é a integração

da orientação mecânica com outros tipos de mecanismos de orientação, como a quimiotaxia. As células
podem realizar um tipo de movimento mais integrador, onde detetam e traduzem múltiplos sinais em
migração direcionada, realizando uma espécie de “mixotaxia”.

Noutros sistemas, mas de acordo com estas ideias, foi proposto que a durotaxis e a quimiotaxia
interagem. Curiosamente, gradientes de moléculas ligadas também podem guiar a migração celular
num processo chamado de haptotaxia, uma forma de orientação coletiva em que as células seguem
gradientes de substratos adesivos, ou seja, matriz extracelular ou moléculas quimiocinéticas. Gradientes
mecânicos podem funcionar in vivo cooperando com sinais químicos para promover a migração celular
direcionada. Um exemplo mais claro de haptotaxia in vivo foi mostrado no cancro de mama, onde um
gradiente de fibronectina permite o movimento direcional de células cancerígenas tanto in vivo como in
vitro.

7. Distrofia Muscular
Matriz extracelular – contém componentes à base de glicoproteínas e proteoglicanos, glícidos, várias
enzimas envolvidas na sua remodelação, moléculas de sinalização e fatores de crescimento. Dá estrutura,
proteção e permite a sinalização. Serve para o transporte e reservatório de moléculas. Contém proteínas
específicas que se vão ligar a recetores transmembranares que permitem a comunicação com o interior
da célula.

• Se alterarmos a estrutura das matriz extracelular, podemos ter a disrupção direta do citoesqueleto
ou da sinalização intra e intercelular.

Distrofia muscular – perda de força e fu4nção dos músculos que compromete o bem estar dos
indivíduos. São causadas por mutações em componentes da matriz extracelular: colagénio, lamininas,
recetores ou proteínas que fazem a ligação os recetores ao citoesqueleto, como a distrofina.

O musculo esquelético é muito importante no nosso corpo, para o movimento e suporte, pelo que
estas pessoas têm dificuldade em movimentar-se e em manter uma postura reta. Está também associado
aos músculos da contração do diafragma, envolvido na respiração, pelo que estes doentes costumam
morrer devido a infeções respiratórias.

No caso da Distrofia Muscular de Duchenne, esta é uma doença que só se revela a partir da
infância/adulto: mas existem doenças (distrofias musculares congénitas) em que o fenótipo é logo
revelado à nascença. A doença que estudamos relacionada com a laminina alfa-2 é uma doença muscular
congénita.

As lamininas são triméricas (constituídas por cadeias alfa, beta e gama), sendo que neste caso são
estudadas mutações no gene que codifica a laminina alfa-2 – LAMA2 e a doença designa-se LAMA2-
CMD. A doença é caracterizada pela falta de força muscular. A designação dada às lamininas é a seguinte:
Laminina211 – cadeia alfa-2, beta-1 e gama-1. A laminina 211 é a laminina com maior predominância no
músculo esquelético, daí que as mutações tenham um impacto tão grande. A ausência de laminina 211
ao redor das miofibras em pacientes com MDC1A causa um stresse constante nessas células, que as
danifica progressivamente, induzindo perda muscular, inflamação e fibrose.

Esta doença é considerada rara. A maior parte dos pacientes não consegue viver após a
adolescência, excepto quando existe um tipo de doença em que o fenótipo não se manifesta logo e vai
se manifestando mais tarde, pelo que sobrevivem mais tempo. A causa de morte mais comum é devido
a efeitos secundários, como infeções respiratórias em crianças.

34
 As mutações que existem no LAMA2 são várias. Existem genes que tem posições no genoma mais
suscetíveis a mutações (hotspots). As mutações não são muito específicas, uma vez que estão sempre a
aparecer novas mutações quando se analisam novos pacientes. Este gene tem 65 exões (é muito
grande), o que levanta problemas em termos de terapia: não é fácil clonar todo o gene utilizando vetores.
A proteína tem cerca de 300kDa, pelo que é muito grande; no entanto, não tem muitas isoformas. Existem
mutações non sense, em que se introduz codões STOP, formando uma proteína truncada muito menor,
e mutações missense que geram variantes que não são funcionais.

O modelo animal de ratinho que se estuda atualmente é o dyW/dyW, que tem uma longevidade
que permite a representação da doença humana. Para fazer este knock-out no ratinho dyW/dyW,
introduziram-lhe um plasmídeo que faz a disrupção do gene, sendo que para selecionar, essa disrupção
é sempre acompanhada de uma cassete ou de resistência a um antibiótico ou de fluorescência. Neste
caso, introduziram uma cassete LacZ que origina uma versão truncada da proteína.

Existem outros dois modelos que são constituídos por uma mutação pontual (mais parecido com
a doença humana), sendo que a sua esperança de vida é maior, o que é importante nos estudos de terapia
génica, em que vão tentar corrigir a mutação. Assim, a mutação gerada nos ratinhos tem de ser específica.
Se o tempo de vida for menor não dá tempo de fazer nada. Estes ratinhos mutantes são sempre mais
pequenos e apresentam menos massa muscular.

Neste gráfico de progressão da LAMA2-CMD, vemos que o onset da

doença ocorre antes do nascimento, período do qual pouco se sabe. Mas
no período entre o nascimento e o aparecimento dos eventos secundários
(como inflamação ou fibrose, ou seja, não são aquilo que origina a doença,
são apenas consequências dela) sabe-se um pouco mais, sendo que o que
se conhece muito bem é a parte do fenótipo da doença.

O que se sabe é que o onset da doença ocorre entre os dias

embrionários 17,5 e 18,5. Através da comparação do desenvolvimento do
músculo dos ratinhos WT e KO, verifica-se que a partir do dia 17,5/18,5 é importante a presença de laminina
alfa-2 no músculo esquelético, sendo que é nestes 2 dias que se encontram os primeiras diferenças: há a
redução do número de células musculares estaminais e as fibras musculares eram menores nos
mutantes.

Os mecanismos que poderiam contribuir para estes fenótipos podem ser uma desregulação no
ciclo celular (redução da capacidade de proliferação) ou um aumento na morte celular.

Olhando para a questão do ciclo celular, analisou-se o músculo no total e observou-se um

aumento da expressão de genes que contribuem para a paragem do ciclo celular, aumento da
expressão de genes que contribuem para a senescência e para
a autofagia (Pim1) e uma diminuição de genes que contribuem
para a proliferação.

Pensou-se que havia uma desregulação numa proteína

que centralize todos estes mecanismos - o p53. Há um aumento
da expressão de p53, em particular a partir de 18,5 dias.

✓ O facto de uns fenótipos se expressarem a 17,5 e outros a 18,5

sugerem que deve haver uma ordem na atuação do genes que
ainda não foi compreendida. No caso do p53, se só se expressa a
18,5, provavelmente não está a controlar aqueles que se
expressam a 17,5.

Existem também outras proteínas que permitem regular

vários destes mecanismos, sendo genes e proteínas envolvidas
como sensores de vários estímulos, como o stress oxidativo e danos no DNA.

Stress oxidativo

O stress oxidativo é gerado principalmente na mitocôndria, através do funcionamento normal da

cadeia transportadora de eletrões, onde há libertação de ROS. Outra fonte é a libertação de ferro livre que

35
é sujeito a reações que geram ROS. No caso do metabolismo do ferro, uma das proteínas que podemos
analisar em termos de stress oxidativo é a HO-1, que converte o grupo Hemo em mais ferro livre.

O FAK é uma proteína de sinalização,

que quando está fosforilada está ativada e
quando não está, está inativa. No mutante
está hiperfosforilada a 17,5, mas já não está
fosforilada a 18,5, ou seja, parece estar a
haver uma sobre ativação de tudo e depois
deixa de exercer o seu papel e de continuar
o desenvolvimento normal do músculo.

Em todos os complexos da mitocôndria não existem alterações significativas, excepto no

complexo I, que sofreu um aumento, o que pode levar a um excesso de ROS no mutante.

O músculo precisa das células musculares estaminais que depois originam as fibras musculares,
que são as células diferenciadas. Ao nível do músculo fetal temos as fibras musculares, que são células
multinucleadas, e um pull de células musculares estaminais que é importante para a regeneração e
crescimento do músculo, e que é mantido no adulto.

Nos modelos de ratinho vamos cruzar os dyW com ratinhos que só expressem GFP nas células
musculares estaminais. Depois as células GFP são sorteadas por FACS. No eppendorf de recolha vamos
fazer uma análise multiómicas.

Temos modelos de estudo in vitro e modelos in vivo (no ratinho). Inicialmente é melhor ter uma
modelo in vitro, uma vez que é mais fácil manipular, e não existe a questão da ética; no entanto, para uma
melhor representação da realidade o ratinho é melhor, porque existem muitos fatores a influenciar além
daqueles que se conseguem mimetizar in vitro.

Neste sentido, o modelo in vitro utilizado é uma linha celular de ratinho de mioblasto – células com
um grande potencial de diferenciação. Estas células foram isoladas de u ratinho no qual foi feita uma
ferida. Nestas células deletou-se o gene LAMA2 (KO) utilizando CRISPR. Utilizando esta linha e
mimetizando o que seriam os mioblastos, tentou-se compreender
se a ausência de LAMA2 tem impacto. Olhando para a proliferação
das células ao longo dos dias, verificou-se que no KO existe
menos proliferação do que no WT.
Existem 2 linhas KO porque não se sabia
como seria a reparação, pelo que se isolou
2 colónias. In vitro, poderíamos estar a criar
mutantes adicionais pelo que queremos
garantir que o que estamos a ver é devido
ao gene LAMA2 e não devido a outra mutação qualquer.

Observou-se também um aumento das células

em G1 nos mutantes KO.

Além disso existe um potencial aumento do

stress oxidativo. Verificou-se o aumento da HO-1 e um
aumento de danos no DNA,
que podem ou não ser
causados diretamente por
este stress oxidativo, uma vez
que um dos mecanismos
que pode levar aos danos no
DNA é o stress oxidativo, que
leva à oxidação de bases.

A redução das fibras

pode ser devido a haver
menos células musculares
estaminais ou por elas terem
36
 menor capacidade de se diferenciar e de gerar novas fibras. No
WT vemos células individualizadas que passado 6 dias vão formar as
fibras. No caso dos mutantes vemos essa formação de forma muito
deficiente.

Para avançar uma pouco mais, estão a fazer-se crescer células

em matrizes despolarizadas, de forma a haver uma estrutura
tridimensional. Os resultados demonstraram que a formação de
microtúbulos não aconteceu nos mutantes KO.

O desenvolvimento muscular fetal prejudicado e a ativação de JAK-STAT marcam o início e a

progressão da doença num modelo de ratinho para distrofia muscular congénita deficiente em
mirosina (MDC1A ou LAMA2-CMD)

Foi utilizado o modelo de ratinho dyW para MDC1A humano para rastrear o início da doença
durante o desenvolvimento no útero.

O desenvolvimento do músculo esquelético do ratinho começa em E8.5, quando as células

estaminais musculares positivas para Pax3 e/ou Pax7 são induzidas a iniciar a diferenciação em miócitos
miotomais. O programa miogénico envolve a expressão de um ou mais dos fatores reguladores
miogénicos (MRFs), os fatores de transcrição Myf5, MyoD, Mrf4 e miogenina. De E11.5 até E14.5, estes
miócitos fundem-se com mioblastos primários em diferenciação, dando origem a miofibras primárias
(embrionárias) dos músculos do tronco, enquanto células positivas Pax3 derivadas de dermomiótomos
migram e diferenciam-se nas miofibras primárias de membros, língua e diafragma. Posteriormente, de
E14.5 até o nascimento, as células estaminais musculares Pax7-positivas dentro das massas musculares
passam por uma segunda onda de diferenciação em mioblastos secundários, que se fundem e geram
miofibras secundárias (fetais) e, subsequentemente, se fundem com as miofibras primárias e
secundárias, aumentando seu tamanho. Assim, o músculo esquelético fetal cresce tanto pela adição de
novas miofibras (hiperplasia) quanto pela fusão de mioblastos com miofibras existentes, aumentando seu
tamanho (hipertrofia mediada por células).

✓ A primeira evidência importante retirada deste estudo é que a miogénese miotomal primária ocorre
normalmente em embriões dyW-/-. É importante também referir que os músculos fetais WT e dyW-
/- diferem apenas no fato de que a cadeia α2 estar ausente no dyW-/-.

Fetos dyW-/- demonstram crescimento muscular prejudicado

Para perceber se as lamininas 411 e 511 são capazes de compensar a falta de laminina 211 funcional
durante os estágios de desenvolvimento fetal e pós-natal precoce, comparou-se o desenvolvimento dos
músculos dyW-/- com o dos músculos WT em E15,5–E18,5 e PN2. Apesar da ausência de laminina 211 em
fetos dyW-/-, o padrão de laminina total em fetos WT e dyW-/- e pupas PN2 é indistinguível. Os
músculos fetais WT e dyW-/- não diferem em tamanho em E15.5 e E16.5, mas a partir de E17.5 os músculos
dyW-/- são menores que os músculos WT. Apesar dessa diferença na área muscular, o número de
miofibras presentes em fetos WT e dyW-/- em E15.5–E18.5 não difere e, embora dyW-/- tenham em média
um pouco menos miofibras em PN2, essa diferença não é significaiva. Estes resultados sugerem que a
laminina 211 é essencial para o crescimento normal dos músculos fetais e que as lamininas 411 e 511
são incapazes de compensar sua ausência.

37
Músculos dyW-/- fetais falham em expandir o seu pool de células estaminais musculares positivas para
Pax7 e geram menos mioblastos diferenciados

Durante a miogénese fetal WT, há um aumento constante no número de células positivas para
Pax7 nas massas musculares entre E15.5 e E17.5, e o número de células positivas para Pax7 permanece
estável entre E17.5 e E18.5 . A quantificação do número de células Pax7 e miogenina-positivas mostra que
estas são inicialmente normais nos músculos dyW-/-, mas entre E17.5 e E18.5 há uma redução dramática
no número de Pax7 e miogenina- células positivas em dyW-/-, o que se correlaciona com a redução
significativa na área dos músculos E18.5 dyW-/-. Além disso, fetos E18.5 dyW-/- mostram uma redução de
47% no número de células positivas para miogenina em comparação com fetos WT.

Em músculos WT, o número de células positivas para Pax7 e miogenina diminui entre E18,5 e PN2.
Os dados quantitativos mostram que o número de células Pax7-positivas nos músculos de pupas dyW-/-
PN2 é semelhante às pupas WT em PN2, sugerindo que o número de células Pax7-positivas diminui
precocemente em dyW-/- em relação aos músculos WT . O número de células positivas para miogenina
também é muito semelhante em dyW-/- em relação aos músculos WT em PN2, e os níveis de proteína
Pax7 e miogenina são realmente aumentados em dyW-/-. No entanto, independentemente dessa
aparente recuperação, a diferença na área dos músculos dyW-/- torna-se
maior, indicando que o aumento dos níveis de proteína Pax7 e miogenina
não se traduzem numa recuperação real. Isto sugere que os músculos dyW-
/- falham em gerar células musculares suficientes para sustentar o
crescimento das miofibras fetais.

Os músculos dyW-/- exibem uma superativação da via de sinalização JAK-STAT

Através de RT-qPCR avaliou-se possíveis alterações nas seguintes vias de sinalização conhecidas
por serem moduladoras do crescimento muscular: Wnt/b-catenina, Notch, JAK-STAT e miostatina
(GDF8), em músculos isolados de fetos E17.5, ou seja, imediatamente antes dos músculos dyW-/- serem
significativamente diferentes dos músculos WT em termos de área e do número de células positivas para
Pax7 e miogenina. Apenas os transcritos para o gene alvo de sinalização JAK-STAT Pim1 foram
significativamente aumentados em músculos dyW-/-, enquanto Bcl6 e Myc permaneceram inalterados.
Também o gene alvo de sinalização da miostatina Akirin1, que é regulado negativamente pela miostatina,
foi significativamente aumentado nos músculos dyW-/- em comparação com os músculos WT. Estes
resultados apontam para a
possibilidade de que uma
superativação da via de
sinalização JAK-STAT e uma
regulação negativa da via de
sinalização da miostatina nos
músculos E17.5 dyW-/- possam
estar por trás do defeito da
miogénese em E18.5.

Foi isolada proteína dos músculos dorsais de pupas PN2 e realizada análise de Western Blot para
pSTAT3 (Tyr 705). Os resultados revelaram um aumento significativo nos níveis de pSTAT3 em dyW-/-
em comparação com os músculos WT. Além disso, os níveis de pSTAT3 permanecem significativamente
mais altos em músculos dyW-/- de 3 semanas de. Estes dados demonstram que os músculos dyW-/-
exibem um aumento significativo na sinalização JAK-STAT desde muito cedo e que a atividade pSTAT3
permanece significativamente maior nos músculos de dyW-/- com 3 semanas de idade.

38
 Curiosamente, miotubos sem integrina a7b1, um
recetor de laminina, também mostram um aumento
significativo nos níveis de pSTAT3 em comparação com
miotubos WT, indicando que a7b1 pode atuar como um
regulador negativo da atividade de STAT3.

MDC1A começa durante o desenvolvimento no útero no

modelo de ratinho dyW-/-

A montagem da laminina em redor dos miotubos

começa em E14.5, no início da miogénese secundária (fetal),
com a montagem das lamininas 211, 411 e 511. A miogénese
primária ocorre normalmente em embriões dyW-/-. A
miogénese fetal é caracterizada por intenso crescimento
muscular, que ocorre de duas formas: (1) pela geração de
miofibras secundárias (hiperplasia) a maioria das quais
ocorre até E18.0; e (2) pelo crescimento dessas miofibras
secundárias, bem como pela miofibras primárias preexistentes, através da sua fusão com mioblastos
(hipertrofia mediada por células). A área dos músculos dyW-/- é 82% da dos músculos WT em E18.5,
indicando que o crescimento muscular começa a ficar para trás em E18.5. A redução da área
transversal da miofibra é uma das características da doença em animais dyW-/-.

Estas observações demonstram que a presença de laminina 211 atua positivamente no

crescimento muscular. Aqui demonstramos que o crescimento do músculo dyW-/- começa a ficar para
trás já no útero, antes que quaisquer sinais de patologia muscular sejam detetados, o que nos leva a
propor que o início da doença MDC1A em ratinhos dyW-/- envolve um defeito na hipertrofia mediada
por células durante a miogénese fetal.

Propomos um modelo para o início do MDC1A em que a ausência de laminina 211 em torno das
miofibras fetais e/ou uma superativação da sinalização JAK-STAT muda o equilíbrio das divisões das
células estaminais musculares para divisões assimétricas, levando a uma redução na taxa de renovação
do pool de células estaminais musculares Pax7-positivas. Além disso, a atenuação simultânea na
sinalização da miostatina inibe a amplificação normal das células comprometidas, levando a uma queda
no número de células positivas para miogenina, formação de menos mioblastos competentes para fusão
e, consequentemente, prejuízo no crescimento das fibras.

Embora as pupas dyW-/- não difiram das pupas WT no número de células Pax7 e miogenina-
positivas, pupas dyW-/- não se recuperaram do crescimento prejudicado durante a miogénese fetal.
Os músculos dyW-/- fetais experimentam uma diminuição prematura no número de células positivas para
Pax7, sugerindo que elas fazem a transição para uma identidade pós-natal muito cedo. Um aumento
simultâneo de pSTAT3 e miostatina é característico do músculo envelhecido e é considerado um fator
importante na perda observada do potencial de regeneração durante o envelhecimento muscular.
Consistente com esta noção, os músculos dos camundongos dyW-/- têm uma redução dramática na
capacidade de regeneração.

Ligação entre stresse oxidativo, danos no DNA e alterações na expressão dos componentes da matriz
extracelular

Um processo que é afetado pelo stress oxidativo e danos no DNA é a remodelação da matriz
extracelular (ECM), que é um mecanismo contínuo e altamente controlado que permite que os tecidos
se reajustem em resposta a diferentes desafios. As mutações nos genes da ECM têm um forte impacto
na homeostase tecidual e podem levar ao aumento do stress oxidativo e à acumulação de danos no
DNA. A remodelação da matriz extracelular é um processo normal que ocorre durante o desenvolvimento
embrionário, permitindo a formação progressiva de tecidos e órgãos, e continua ao longo da vida
adulta, a fim de garantir o equilíbrio da homeostase do organismo. Também desempenha um papel
importante na cicatrização e reparação dos tecidos, mas, quando regulado indevidamente, pode
resultar na perda da estrutura normal do tecido e no desenvolvimento de diferentes condições
patológicas.

39
Impacto do stress oxidativo na remodelação da ECM

A síntese e/ou estabilidade de vários colágenos, incluindo o colágeno I, a proteína fibrosa mais
abundante da ECM, são reguladas pelo stress oxidativo. Na presença de níveis aumentados de ROS,
alguns genes da ECM tornam-se mais expressos, como fibronectina (FN1), cadeia α1 de colágeno
(COL1A1) e cadeia α1 de laminina (LAMA1), enquanto outros apresentam expressão diminuída, como a
cadeia β2 da laminina (LAMB2). O papel do stress oxidativo também é revelado pelo tratamento com
antioxidantes, onde a redução nos níveis de ROS normaliza a composição da ECM.

Fibroblastos derivados do ligamento útero-sacro humano foram tratados com baixa concentração
de H2O2, uma importante ROS, o que levou a uma diminuição na expressão de COL1A1. Em contraste,
quando essas células foram expostas a uma concentração maior de H2O2, a expressão de COL1A1
aumentou. Isso sugere que o stress oxidativo leve, associado ao metabolismo normal ou a pequenos
insultos, pode promover a redução dos níveis de colágeno, enquanto altos níveis de stress oxidativo
podem favorecer a acumulação de colágeno. A deposição de colágeno é necessária para a cicatrização
de feridas, mas se em excesso, pode ser responsável por um estado de lesão tecidual, como fibrose.
Além disso, o tratamento com antioxidantes no contexto da fibrose cardíaca demonstrou reduzir os níveis
de colágeno, sugerindo ainda um efeito direto entre o aumento do stress oxidativo e a deposição de
colágeno.

Células mesangiais glomerulares renais cultivadas com altos níveis de glicose, que causa stress
oxidativo, mostram aumento da síntese de colágeno IV. Além disso, a síntese de colágeno I e III está
aumentada em corações de ratos diabéticos experimentais, condição que foi revertida pelo tratamento
com antioxidantes. A vitamina C (antioxidante) é o cofator da prolilhidroxilase e da lisilhidroxilase,
necessária para modificações pós-translacionais do pró-colágeno e, consequentemente para a correta
formação da tripla hélice do colágeno maduro. A vitamina C, devido ao seu papel como antioxidante,
poderia melhorar a cicatrização associada a doenças musculoesqueléticas, reduzindo os níveis de ROS
associados à resposta inflamatória.

A expressão de fibronectina (FN1) demonstrou ser regulada positivamente na presença de

diferentes fontes de stress oxidativo, como altos níveis de glicose.

Impacto dos dano no DNA na remodelação da ECM

Uma proteína central envolvida na resposta ao dano do DNA é o supressor de tumor p53, que,
quando ativado, induz a paragem do ciclo celular para permitir o reparo do DNA ou para promover a
apoptose. A depleção de p53 mostrou aumentar a expressão do mRNA de FN1, levando ao aumento
da motilidade celular e diminuição da apoptose, enquanto o tratamento com um ativador de p53 causou
uma diminuição nos níveis de fibronectina. Esses estudos indicam que p53 é um regulador negativo da
expressão de FN1.

p21 é um regulador negativo do ciclo celular, que pode ser induzido por p53 e conduzir à
paragem do ciclo celular. Em ratinhos knockout para p21, as células senescentes foram eliminadas e a
fibrose hepática foi aliviada principalmente por meio da regulação negativa da transcrição do colágeno
tipo I α1. Essas observações sugerem que uma das ações de p21 é aumentar a expressão de COL1A1 em
resposta a danos no DNA.

Deficiência de Colágeno

Mutações nos genes COL1A1 e COL1A2, que codificam as cadeias α1 e α2 do colágeno I,

respetivamente, causam osteogénese imperfeita. Um estudo utilizando o modelo ratinho de
osteogénese imperfeita, o ratinho Col1a2oim, também conhecido como camundongo oim/oim, revelou
que os músculos de ratinhos homozigotos para a mutação apresentam uma disfunção mitocondrial.
Além disso, a produção excessiva de ROS no contexto da deficiência de colágeno I também pode
contribuir para a exacerbação da patologia osteogénese imperfeita no osso.

Deficiência de LAMA2

Mutações em LAMA2 levam a uma distrofia muscular congénita. Os músculos de ratinhos com
deficiência de Lama2 e pacientes com LAMA2-CMD exibem um aumento no stress oxidativo, tanto nos
estágios iniciais quanto nos estágios mais avançados da doença, apontando para um papel importante
do stress oxidativo ao longo da progressão da doença. Ratinhos com deficiência de Lama2 apresentam
40
sinais de inchaço mitocondrial e regulação negativa de uma variedade de genes específicos de
mitocôndrias que codificam componentes da cadeia de transporte de eletrões/fosforilação oxidativa.
Juntos, esses resultados suportam a hipótese de que o stress oxidativo e a disfunção mitocondrial são
características do LAMA2-CMD.

➢ Em conjunto, estes estudos sugerem que combater a disfunção mitocondrial e possivelmente

prevenir danos ao DNA pode ser uma estratégia promissora para reverter a patologia causada
por algumas mutações em genes que codificam componentes da ECM, seus recetores ou
moléculas que ligam os recetores da ECM ao citoesqueleto celular.

8. Organoides humanos
Os organoides humanos são sistemas de cultura 3D derivados de células estaminais, que
permitem recriar a arquitetura e a fisiologia dos órgãos humanos com detalhes notáveis. Uma
característica comum a todos os organoides é que eles são gerados a partir de células estaminais
pluripotentes (PSCs) ou células estaminais adultas (AdSCs; também conhecidas como células
estaminais teciduais), imitando o desenvolvimento humano ou a regeneração de órgãos in vitro. Os
organoides humanos podem ser vistos como um novo modelo experimental que preenche a lacuna entre
modelos animais e seres humanos.

As iPSCs humanas são expostas sequencialmente a um conjunto de sinais de diferenciação para

simular os estágios de um processo de desenvolvimento humano. Durante esse processo, as iPSCs
diferenciadas agregam-se para formar primeiro um broto de órgão e, posteriormente, organoides, que
imitam fielmente a estrutura do órgão maduro, incluindo vários tipos de células e as interações entre elas.
Os organoides derivados de AdSCs humanos também surgiram como um sistema organoide alternativo
que consiste em uma estrutura mais simples composta principalmente por tipos de células encontradas
no epitélio. Em contraste com o complicado processo de reprogramação de iPSC seguido de
diferenciação para o tipo de órgão necessário, estes organoides podem ser gerados a partir de biópsias
isoladas diretamente do órgão de interesse ou do tecido do paciente doente. No entanto, o
estabelecimento de organoides humanos derivados de AdSCs é limitado pela acessibilidade ao tecido
e conhecimento prévio das condições de cultura para esse tecido, enquanto uma linha iPSC, uma vez
estabelecida a partir de um paciente, pode ser usada para gerar repetidamente diferentes modelos de
tecido sem qualquer limite de tempo.

A geração de modelos animais para uma doença específica requer uma visão pré-existente sobre
as condições causais ou os genes envolvidos. Os modelos animais são normalmente criados pela
aplicação de condições prejudiciais aos animais ou pela manipulação dos genes responsáveis pelo
distúrbio, enquanto os modelos organoides podem ser gerados diretamente de pacientes afetados
sem conhecimento prévio dos genes específicos responsáveis. Isso é particularmente relevante para
distúrbios multigénicos, como doença inflamatória intestinal, desde que a patologia seja causada pelo
epitélio afetado e para cancros, onde os organoides do cancro podem ser isolados diretamente do
paciente.

Benefícios

• De origem humana: os organoides humanos representam a fisiologia humana, em vez de serem

um sistema "semelhante ao humano".
• Rápido: organoides derivados de células estaminais adultas e pluripotentes podem ser
estabelecidos de forma rápida e fácil.
• Robustez: uma vez estabelecido, o aumento de escala geralmente é possível para rastreio
genómico e rastreio de drogas em larga escala.
• Manipulação genética: as ferramentas de engenharia genética mais modernas podem ser
aplicadas a células estaminais pluripotentes induzidas ou diretamente a sistemas organoides.
• Personalização: células estaminais pluripotentes induzidas e organoides podem ser obtidas de
indivíduos.

Limitações

41
 • Componentes celulares: às vezes falta o microambiente, particularmente em organoides
derivados de células estaminais adultas. Os sistemas de co cultura com outros tipos de células
não estão firmemente estabelecidos.
• Padronização: os protocolos para estabelecimento de organoides e controlo de qualidade não
são padronizados globalmente.
• Relativamente caro: os organoides custam menos do que os modelos de ratinho ou peixes, mas
são relativamente caros em comparação com os modelos tradicionais de linhas de células,
moscas, leveduras ou vermes.
• Escala: estudos ao nível de órgãos inteiros são difíceis.
• Heterogeneidade: devido à diversidade entre indivíduos e protocolos, os resultados podem variar
de grupo para grupo.

9. Tropismo do tecido adiposo em doenças infeciosas

Trypanosoma brucei é um ser unicelular e é um parasita extracelular. Pode viver em vasos no
nosso corpo ou em tecidos. Este parasita é transmitido de uma pessoa para outra, ou para uma vaca ou
chimpanzé (zoonose) através da picada da mosca Tsé-tsé. O ecossistema desta mosca é na África
Subsariana, pelo que só aí existe a transmissão desta doença. Uma pessoa pode ser picada em África, vir
para a Europa e desenvolver a doença do sono, mas como não há moscas, não vai transmitir a doença a
outras pessoas.

A doença existe em humanos ou em animais, sendo que em humanos é conhecida como doença
do sono, que é fatal. Atualmente, o número de casos anual é baixo e está controlado. Não existe vacina,
mas existem 2 fármacos que ajudam a tratar a doença. Como o tecido adiposo é um ambiente rico em
lipídios e a maioria das drogas é hidrofílica, isso pode apresentar algumas limitações à eficácia dos
tratamentos medicamentosos.

Em relação a outro tipo de animais, a mosca pode infetar gado, animais selvagens, etc. No gado, a
doença tem um grande impacto económico, uma vez que existem muitas zonas em África onde as
pessoas dependem do gado economicamente e para se alimentarem. Também não existem vacinas e os
tratamentos são pouco eficazes, estando menos estudada do que a doença humana.

Ciclo de vida do Trypanosoma brucei

A linha separa os 2 hospedeiros: mamífero ou mosca tsé-

tsé. A mosca pica o animal, os parasitas entram na pele,
chegando à corrente sanguínea (BSF) passado 2/3 dias. Existem
2 tipos de formas: formas replicativas (slender) e não replicativas
(stumpy). A passagem de slender para stumpy ocorre por
quorum sensing, ou seja, quando há muitos parasitas slender,
eles sentem que são muitos e alguns vão diferenciar-se na
forma stumpy. Os parasitas podem depois sair do sangue e
acumular-se em vários tecidos, como o tecido adiposo (ATF),
cérebro, pele e pâncreas (não se distribuem de igual maneira
em todos os tecidos). Quando a mosca pica este hospedeiro
infetado, leva para o seu estômago as duas formas, sendo que a
forma slender quando chega ao estômago da mosca morre,
uma vez que não tem uma superfície proteica que suporte o pH
desse meio, enquanto os stumpy sobrevivem. Estas formas, ao
sentir que se encontram num ambiente diferente, diferenciam-se na forma procíclica, que depois
migram para as glândulas salivares da mosca e transformam-se em formas metacíclicas, que estão
preparadas para serem injetadas no novo hospedeiro e diferenciarem-se em slender.

São infetados ratinhos com T. brucei e vemos a curva de sobrevivência, onde vemos que os
indivíduos começam a morrem, em média, à volta do dia 30 pós-infeção. Retirando um pouco de sangue
todos os dias destes animais vemos estes altos e baixos. No dia 5 temos sempre uma grande quantidade
de parasitas no sangue e depois desaparecem da circulação, e voltam a aparecer e a desaparecer. Este
padrão é típico dos parasitas que estão sempre a fugir ao sistema imune através de variação antigénica
(VSG), ou seja, inicialmente apresentam um antigénio A ao sistema imune, que vai produzir anticorpos
42
 contra eles; antes de
morrerem, mudam para
antigénio B, pelo que a
quantidade parasita volta a
aumentar, até que o sistema
imune produza um anticorpo
anti-B; depois começa a
diminuir a quantidade de
parasita até que mudam
novamente de antigénio e assim sucessivamente – resposta imune faseada.

Nesta análise de
imunohistoquímica temos um anticorpo
anti-Trypanosoma. Em todos os cortes de
pulmão, cérebro, coração, etc, onde
tínhamos o tecido e um pouco de tecido
adiposo, estavam sempre a encontrar
parasitas (marcas castanhas). Os órgãos
estavam sempre sem parasitas, excepto a
gordura à sua volta, que tinha sempre
muitos parasitas. Podemos ver que no
tecido adiposo temos um aumento do
número de parasitas ao longo do tempo
de infeção, sendo que nos restantes
órgãos inicialmente têm pouco parasita,
mas passado 28 dias, alguns deles têm
uma quantidade muito grande de
parasitas. Além disso, existem órgãos
onde não se vê parasitas nem no dia 6
nem no dia 28. Isto demonstra uma
acumulação preferencial do parasita em
certos tecidos.

Através de qPCR analisou-se

parasitas transgénicos que expressam
luciferase. Na presença de luciferina,
estes parasitas emitem luz, pelo que
sabemos quantos parasitas temos.
Podemos ver neste gráfico que no dia
6, o órgão que tem mais parasitas é o
sangue (embora o valor do sangue seja
muito variável); já ao dia 28, o tecido
com mais parasitas é a gordura.

Mas isto foi observado com o

parasita injetado na forma slender; a mosca injeta as formas metacíclicas, pelo que para este ensaio ser
validado teria de ser realizado utilizando a mordida da mosca tsé-tsé. Os resultados obtidos foi o mesmo,
sendo que o tecido adiposo é, de facto, o tecido com mais
parasitas.

Este esquema representa o tecido adiposo com um vaso

no meio, com a presença do T. brucei extracelular que se
encontra entre os adipócitos ou no sangue. Algumas espécies de
Plasmodium (malária) e T. cruzei (doença das Chagas), no início
da infeção, também demonstram um tropismo para o tecido
adiposo, mas cada um de forma diferente. Assim, não podemos
excluir a hipótese de que estes parasitas ficam no tecido adiposo acumulados porque aí a resposta imune
não é tão forte, permitindo a sua permanência.

43
 Esta imagem mostra a marcação dos parasitas, dos
macrófagos e das células T. Isto mostra que há imensa resposta
para tentar lidar com o parasita, mas continua a haver muitos
parasitas, pelo que não foi encontrada evidência de que o
sistema imune fosse mais fraco. No entanto, deve existir uma
vantagem seletiva para os
parasitas se encontrarem
em tão grande
quantidade neste tecido.

Foram infetados ratinhos com um parasita com um

repórter para os stumpy e foi feito um estudo longitudinal para
perceber como evolui a população de parasitas ao longo da
infeção. A linha segue o padrão alternado do número de
parasitas típico do sangue, que sobe e desce, sendo que a partir
do dia 13, a quantidade de parasitas chega a um plateau; a
gordura acompanha o que acontece no sangue. No entanto,
inicialmente os parasitas estão menos presentes na gordura,
mas depois quando são eliminados, são menos eliminados na
gordura do que são eliminados no sangue, pelo que a partir daqui se encontram presentes em maior
quantidade na gordura.

No sangue existem as formas slender e as formas stumpy. Quando temos poucos parasitas há uma
predominância de slender e à medida que temos um maior número de parasitas há uma prevalência de
stumpy. Nos primeiros 15 dias há um atraso no crescimento dos parasitas na gordura, ou seja, demoram
um pouco mais a atingir o mesmo número de parasitas que existe no sangue. Em média, o tecido
adiposo tem menos stumpy do que o sangue em qualquer um dos dias.

Podemos assumir como verdadeiro o modelo que considera uma taxa de crescimento diferente
entre o sangue e o tecido adiposo. Esse modelo permitiu estimar, então, a taxa de crescimento, sendo
que a taxa de crescimento dos parasitas no sangue é o dobro da taxa de crescimento no tecido
adiposo.

Depois realizou-se um estudo de proteómica, em que se infetou ratinhos com formas slender. Ao
dia 5 recolheram-se os parasitas e fez-se um estudo da sua proteómica, tanto do sangue como do tecido
adiposo. 6% dos grupos de proteínas identificados estavam diferencialmente
expressos nos 2 tipos de tecidos. Os sobre expressos são proteínas que se
relacionam com diferenças metabólicas, como o facto de os parasitas do
tecido adiposo realizarem β-oxidação. Os grupos proteicos sub expressos
apresentavam processo de tradução e síntese de ribossomas, o que indica
que estes parasitas estão a sintetizar proteínas a uma taxa mais baixa.

Para medir a síntese proteica destes parasitas a técnica click

chemistry. Inicialmente temos um composto (HPG) que é um análogo da
metionina, que tem a alquina marcada, que quando ligada à azida
fluorescente, se torna fluorescente, numa reação catalisada pelo cobre.

44
Depois, temos de verificar qual é a porção de HPG que é incorporada nas proteínas. Um parasita que está
a sintetizar muitas proteínas tem uma maior fluorescência do que um que está a produzir poucas
proteínas. Conseguimos perceber que os BSF estão a sintetizar, em média, mais 24% do que os ATFs, o
que significa que os ATF têm uma síntese proteica mais baixa do que os BSFs. Isto faz-nos pensar que os
ATF devem proliferar menos.

Para confirmar a ideia anterior, começou-se por se analisar o ciclo

celular. Para tal, infetou-se ratinhos com os parasitas e 5 dias pós-infeção
injetou-se Hoechst (marcador de núcleos), para verificar em que fase
do ciclo os parasitas estavam.

• 1 quinetoplasto e 1 núcleo – fase G1/S

• 2 quinetoplastos e 1 núcleo – fase G2/M
• 2 quinetoplastos e 2 núcleos – fase pós-mitótica/citocinese

Comparando populações de BSF e ATF, vimos que no tecido

adiposo há mais parasitas 1K1N e 2K1N do que no sangue; mas no sangue
há mais 2K2N do que no tecido adiposo. Isto corrobora a ideia de que os
ATFs se estão a dividir mais devagar.

Um segundo estudo permitiu avaliar a síntese de DNA destas duas

populações. Utilizou-se um composto (Edu) que é um análogo da timidina,
pelo que sempre que é sintetizada uma noca cadeia de DNA este análogo é incorporado. Percebemos
que a percentagem de Edu que é incorporada nos BSFs é sempre mais do que noas ATFs, o que
demonstra que há uma maior síntese de DNA na população do sangue.

A derradeira experiência foi feita com o marcador CTV, que se liga às aminas dentro da célula, e
cada vez que uma célula se divide, a intensidade deste marcador diminui para metade. Infetou-se um
ratinho com parasitas que estavam marcados com CTV, e depois viu-se a percentagem de marcação. A
população ATF (amarelo) parece ser muito mais heterogénea do que a
população BSF. Podemos ver que os parasitas do
sangue dividiram-se ativamente (estão do lado
esquerdo do eixo dos x), enquanto os parasitas da
gordura se dividiram de forma heterogénea,
incluindo alguns que se dividiram muito pouco e
outros que se dividiram tanto como a população do
sangue.

Se fizermos uma interligação entre o valor da

intensidade média de fluorescência com o
tempo decorrido até à avaliação, conseguimos adquirir o tempo de divisão
destes parasitas. Vemos então que os parasitas do sangue, em média,
dividem-se a cada 6h, enquanto os da gordura, em média, a cada 12h. Isto
demonstra que os parasitas do tecido adiposo dividem-se a metade da
velocidade da população do sangue.

Aqui, utilizando o
marcador PKH26, que
se liga à parte lipofílica da membrana fizeram a
mesma experiência. Após 3/4 dias da infeção, os
parasitas foram isolados e determinou-se a
fluorescência. NC é o contorlo negativo, no qual não
foi observado sinal do marcador (está mais para a
esquerda). No dia 0, os parasitas estão todos
marcados (estão mais no lado direito). Na
população BSF não foi observado mais marcador, o
que singifica que se dividiram; no caso dos ATFs,
no dia 3 ainda existe alguma marcação e no dia
4 já não, pelo que não se dividiram tão rápido.

45
Isto demonstra também que nos ATFs não temos células senescentes, ou seja, todas as célula se estão a
dividir, apenas mais lentamente.

Mas será que os ATFs podem começar a dividir-se a uma velocidade normal? Para testar esta
hipótese injetou-se ratinhos com os parasitas marcados, depois
colheu-se o tecido adiposo, extraiu-se os parasitas e fez-se um sorting
para os parativas CTV+ (ATFs com crescimento lento) ou CTV- (ATFs
com crescimento rápido, semelhante aos do sangue). A experiência
foi dividia em 2 partes: in vitro, onde se realizou a taxa de
crescimento dos ATFs, e in vivo, com a injeção em novos ratos. Em
ambos os casos conclui-se que, depois de um período de adaptação,
ambas as populações CTV+ e CTV- crescem à mesta taxa.

Depois tentou-se perceber como é que a população CTV+

reagia a um tratamento com drogas. Os ratinhos foram infetados e
passados 4 dias foram tratados com pentamidina e melarsoprol. A
densidade de parasitas no sangue foi seguida nos 45 dias seguintes
e não se encontraram nenhuns parasitas, o que permitiu concluir que
o tratamento foi eficiente. Mas quando se olha para a densidade de
parasitas nos dias 3, 5 e 10 pós-infeção observamos que temos uma diminuição da taxa de sobrevivência
e depois há uma recuperação depois do dia 5 (foi observado o mesmo para as duas drogas). Isto
demonstra que há uma parte da população que sobrevive, embora não se saiba ainda se são os CTV+
ou os CTV-. O tecido adiposo permanece como um reservatório após o tratamento, mesmo nos
pacientes em que não se observa sinais da infeção durante anos.

Tecido adiposo: um porto seguro para parasitas

O principal constituinte do tecido adiposo é o adipócito, que contém um grande vacúolo que
ocupa a maior parte do espaço na célula e no qual os triglicerídeos são armazenados.

Existem várias possibilidades de como os parasitas entram no parênquima do tecido adiposo:

• Os parasitas podem atravessar os vasos para dentro e para fora de todos os tecidos, mas somente o
tecido adiposo oferece condições para que eles se repliquem ou evitem a sua eliminação pelo sistema
imunológico.
• A entrada pode ser específica: pode envolver o reconhecimento e a ligação a um recetor específico
dos capilares do tecido adiposo.
• A vasculatura no tecido adiposo está em constante remodelação, mais do que qualquer outro tecido
do sistema. Este alto nível de remodelação constante com estágios intermitentes de vazamento
vascular também pode permitir que os parasitas tenham acesso fácil aos adipócitos.
• Entrada favorecida pela resposta imune montada contra estes parasitas quando eles estão no sangue.
A passagem do T. brucei para o cérebro é facilitada pela presença de vários componentes do sistema
imunológico, como o IFN-ү. O IFN-ү é abundantemente expresso durante a infeção por T. brucei e
promove o crescimento do parasita.

Porquê que estes parasitas constituem os seus reservatórios no tecido adiposo?

• Uma possível explicação é a extrema longevidade dos adipócitos, tanto em humanos como em
ratinhos, que pode permitir que os parasitas permaneçam em estado quiescente por períodos
prolongados de tempo sem a necessidade de passar por outro ciclo infecioso.
• Uma segunda possibilidade é que o adipócito oferece intracelularmente uma fonte constante de
nutrientes, em particular os ácidos gordos, que podem ser facilmente mobilizados da gotícula lipídica
através do recrutamento de lipases intracelulares específicas.

Não é óbvio como é que T. brucei e P. berghei podem beneficiar dos nutrientes disponíveis dentro
dos adipócitos. É possível que os parasitas induzam direta ou indiretamente os adipócitos a libertar
nutrientes armazenados (como ácidos gordos livres e glicerol), que poderiam ser posteriormente
captados pelos parasitas externos a esses organelos.

N6-metiladenosina em caudas poli(A) estabilizam transcritos de VSG

46
 Modificações no RNA são reguladores importantes da expressão génica. Em Trypanosoma brucei,
a transcrição é policistrónica e, portanto, a maior parte da regulação ocorre pós-transcricionalmente.

A infeção pode durar vários meses ou anos, principalmente porque T. brucei escapa do sistema
imunológico alterando periodicamente a sua glicoproteínas de superfície variante (VSG). VSG não é
apenas uma das proteínas mais abundantes em T. brucei, mas também é o mRNA mais abundante em
BSFs. A região 3' não traduzida (UTR) dos genes VSG contém dois motivos conservados, um motivo 9-mer
e um motivo 16-mer, encontrados imediatamente a montante da cauda poli(A). Este estudo revelou que
a m6A está presente nas caudas poli(A) do mRNA, e aproximadamente metade das m6A está
localizada em apenas um transcrito – VSG.

A meia-vida dos transcritos de VSG é de 90-270 min, enquanto a meia-vida média do mRNA em

tripanossomas é de 13 min. Dado que a remoção da cauda poli(A) geralmente promove a degradação do
RNA, levantamos a hipótese de que a presença de m6A na cauda poli(A) poderia contribuir para essa
estabilidade excecional no mRNA VSG. Northern blotting e um ensaio do comprimento da cauda de
poli(A) revelaram que durante a fase de latência de 1h, o comprimento da cauda de poli(A) do VSG foi
estável, mas depois encurtou rapidamente durante a segunda
fase. Aos 120 min e 240 min, a intensidade da cauda VSG poly(A)
decaiu rapidamente, indicando que o transcrito também foi
rapidamente degradado. Os níveis de m6A também diminuíram,
mas, notavelmente, a perda de m6A precedeu o encurtamento da
cauda poli(A) e subsequente decaimento do mRNA. Estes
resultados indicam que m6A é removido do mRNA de VSG antes
da deadenilação da cauda poli(A), que é rápida e
imediatamente seguida pela degradação do transcrito.

A análise computacional revelou uma associação entre m6A na cauda poli(A) e um motivo 16-mer
na região 3' não traduzida dos genes VSG. Usando ferramentas genéticas, mostramos que o motivo 16-
mer atua como um motivo de ação cis que é necessário para a inclusão de m6A na cauda poli(A). A
remoção desse motivo da região 3' não traduzida dos genes VSG resulta em caudas poli(A) sem m6A,
deadenilação rápida e degradação do mRNA.

A função clássica de uma cauda poli(A) é suprimir a degradação do mRNA e promover a tradução.
As proteínas de ligação de poli(A) ligam-se à cauda poli(A) e estimulam a tradução do mRNA por interação
com fatores de iniciação da tradução. A remoção da cauda poli(A) pelos complexos deadenilase é um
pré-requisito para que os mRNAs entrem nas vias de degradação 5' a 3' ou 3' a 5'. Dada a importância
da regulação de VSG para infeção crónica e transmissão de parasitas, espera-se que drogas que
interfiram na incorporação de m6A em caudas poli(A) bloqueiem a virulência do parasita.

10. Avatares Zebrafish para medicina personalizada e evasão imune

inata
Usando linhas celulares
derivadas de pacientes, mostramos
que os xenotransplantes de larvas de
Zebrafish constituem um modelo in
vivo rápido e altamente sensível para
resposta à terapia diferencial, com
resolução para revelar a
heterogeneidade do cancro funcional
intratumoral. O que se faz é retirar
células tumorigénicas de pacientes (através de biópsias ou em cirurgias, por exemplo) e colocá-las em
embriões de Zebrafish, fazendo assim um avatar desse paciente.

Essa heterogeneidade tem sido observada não apenas entre cancros (intertumor), mas também
dentro de cada cancro (intratumor). Mesmo clones de CRC idênticos que compartilham o mesmo
genoma exibem perfis funcionais múltiplos (incluindo respostas distintas a terapias), o que implica que a
base da heterogeneidade não é apenas genética.
47
 PDX (xenoenxertos derivados de pacientes) geralmente podem manter a heterogeneidade
genética e individual dos tumores originais, imitando as respostas da doença em pacientes e, assim,
refletindo a singularidade de cada paciente. No entanto, PDX de ratinhos apresentam duas grandes
desvantagens para ensaios clínicos de rotina: a quantidade de amostra de paciente necessária e o prazo
para enxertia e expansão das colónias (meses), tornando-os inviáveis para a prática clínica. Os
xenoenxertos de Zebrafish oferecem velocidade, resolução celular e a capacidade de realizar um
grande número de transplantes. Eles também permitem a avaliação de características cruciais do
cancro, como potenciais metastáticos e angiogénicos.

Para testar a capacidade dos xenotransplantes de Zebrafish de desvendar a heterogeneidade

funcional intertumoral e intratumoral, selecionamos várias linhagens celulares de CRC (cancro colorretal)
humano isoladas de diferentes pacientes (heterogeneidade intertumoral) e pares isogénicos
(heterogeneidade intratumoral).

SW480 deriva de um tumor primário e SW620 da metástase linfonodal (6 meses depois) do

mesmo paciente. Células tumorais HCT116 KRASG13D foram isoladas de um paciente com carcinoma
colorretal. As células Hke3 foram geradas a partir de HCT116 por uma deleção somática do alelo KRASG13D,
revertendo o fenótipo KRAS oncogénico. Este par é considerado isogénico e constitui um cenário ideal
para estudar a heterogeneidade fenotípica derivada de uma única mutação (heterogeneidade
intratumoral). Finalmente, células HT29 foram isoladas de um tumor metastático bem diferenciado,
pertencente ao subtipo caliciforme, servindo como outgroup.

Aos 4 dias pós-injeção (dpi), avaliamos a eficiência de implantação dessas linhagens celulares. Com
exceção das células SW480, observamos alta eficiência de implantação em todas as linhagens celulares
(>70%). A comparação direta entre pares isogénicos (heterogeneidade intratumoral) revelou que SW620
e HCT116 apresentam maiores taxas de proliferação em relação aos seus pares isogénicos SW480 e
Hke3. Estes dados mostram que as células CRC humanas podem manter a proliferação em Zebrafish
e apresentam diferentes dinâmicas de proliferação em tumores CRC derivados de diferentes pacientes
e tumores isogénicos. Além disso, as células CRC humanas mantêm as suas características celulares
gerais e potencial angiogénicos nos xenoenxertos de Zebrafish.

A eficiência metastática pode variar e depende se uma célula tumoral pode desprender-se do
tumor primário, entrar e sobreviver na circulação e ir para células-semente em locais distantes.
Projetamos um ensaio simples para distinguir entre os estágios iniciais (invasão dos tecidos circundantes
e intravasamento nos vasos sanguíneos) e os estágios posteriores da cascata metastática (sobrevivência
na circulação, extravasamento e colonização) comparando a eficiência da micrometástase quando as
células foram colocadas diretamente na circulação vs. quando não. Para isso, injetamos linhas celulares
de CRC no espaço perivitelino (grupo_a) ou diretamente na circulação (grupo_b). Aos 4 dpi, analisamos o
número de xenoenxertos que apresentavam uma massa de células tumorais (> 20 células) longe do local
de injeção (CHT).

Para que as células tumorais do grupo_a estabeleçam metástases de forma eficiente, elas teriam
de passar por todas as etapas metastáticas (desde as etapas precoces até às tardias), enquanto as células
do grupo_b teriam que passar apenas pelas etapas posteriores. Assim, considerando que a máxima
eficiência metastática é alcançada quando as células são colocadas em circulação (grupo_b), a
redução da colonização no grupo_a refletiria o esforço para passar pelas etapas metastáticas
precoces. Portanto, convertemos nossa frequência de colonização CHT em Potencial Metastático
Precoce (EMP) e Potencial Metastático Tardio (LMP).

Ao comparar as linhagens isogénicas, observamos que

as células SW480 possuem um EMP maior que o SW620,
embora apresentem LMP semelhante. Estes resultados
concordam com observações anteriores de que as células
SW480 são mais invasivas e migratórias do que SW620 in vitro
e apresentam maior potencial de extravasamento in vivo.

O par isogénico HCT116/Hke3 mostrou EMP diferente, ou seja, em xenoenxertos Hke3 KRAS WT, só
pudemos encontrar metástase quando as células foram injetadas diretamente na circulação, destacando
o papel de KRAS ativado em eventos metastáticos precoces. Finalmente, as células HT29 apresentaram
EMP e LMP elevados.
48
 Nossos resultados mostram que é possível discriminar ainda mais o potencial metastático
celular comparando a eficiência das células em metástase quando colocadas diretamente na
circulação ou não.

Para testar se os xenoenxertos de Zebrafish podem medir as respostas à terapia, primeiro

avaliamos as principais opções terapêuticas de CRC: FOLFOX e FOLFIRI. Ambos os tratamentos têm taxas
médias de resposta equivalentes (∼35%) em ensaios clínicos realizados em pacientes naïve.

O tratamento com FOLFIRI induziu uma redução

significativa das figuras mitóticas em todos os tumores. No
entanto, uma indução significativa de apoptose seguida por
uma redução da massa tumoral foi observada apenas em
HCT116 e SW620, mostrando que SW620 e HCT116 são mais
sensíveis do que os seus respetivos pares isogénicos. Estes
resultados sugerem sensibilidades diferenciais à terapia ao
longo da progressão
do cancro (primário vs.
metástase) e em
populações tumorais
heterogéneas.

Somente no
HCT116, o tratamento
com FOLFOX resultou
em indução significativa de apoptose acompanhada de redução do tamanho do tumor.
Surpreendentemente, Hke3 (par isogénico de HCT116) não apresentou indução de apoptose ou redução
da massa tumoral quando tratado com FOLFOX. Para HT29, pudemos observar uma redução
significativa das figuras mitóticas e aumento da apoptose tanto no tratamento com FOLFIRI quanto
com o FOLFOX.

Para confirmar ainda mais os perfis quimiossensíveis opostos de HCT116 (KRASMUT) e Hke3 (KRASWT),
co injetamos no mesmo hospedeiro as duas linhagens celulares (1:1), cada uma marcada com um
corante lipofílico diferente. Os xenoenxertos mistos (HCT116+Hke3) foram distribuídos aleatoriamente em
grupos FOLFIRI e controlo. Como esperado, dado o seu maior potencial proliferativo, as células HCT116
superam as Hke3 e tornam-se dominantes, representando aproximadamente 80% do tumor. No
entanto, após o tratamento com FOLFIRI, o HCT116 reduziu significativamente sua frequência.

Consistente
com a resposta
individual ao
tratamento com
FOLFIRI, observamos
um aumento
significativo na
apoptose e uma
diminuição nas
figuras mitóticas,
acompanhadas por
uma diminuição
significativa no
tamanho do tumor
HCT116. Em contraste,
o tamanho do clone
Hke3 não mudou após o tratamento com FOLFIRI, permanecendo em níveis semelhantes aos controles.

Os dados ilustram que, em tumores heterogéneos, as mutações KRAS podem fornecer um

benefício de proliferação e que a quimioterapia pode interromper essa vantagem, selecionando o
clone menor resistente ao tratamento, que pode ser responsável por reincidências.

49
 De seguida, é explorado o modelo rápido de xenoenxerto de Zebrafish para investigar a
contribuição imune inata para a imunoedição do cancro (processo dinâmico de crosstalk entre células
tumorais e o sistema imunológico).

As terapias de checkpoint imunológico visam remover vias inibitórias que bloqueiam as

respostas de células T anti tumorais no microambiente tumoral (TME). No entanto, a terapia pode falhar
porque as células tumorais não expressam neoantigénios suficientes (não são suficientemente
imunogénicas). Outro grande obstáculo pode ser a presença de um TME supressor composto por
estroma e uma variedade de células imunes, como células T reguladoras (T reg), células supressoras
derivadas de mieloides (MDSC), macrófagos pró-tumorais ativados alternativos (“M2-like”) e neutrófilos
(“N2-like”), que podem bloquear as respostas imunes anti tumorais.

O modelo Zebrafish surgiu como uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do tumor e as
interações com o sistema imunológico, uma vez que tem um sistema imunológico inato de vertebrado
altamente conservado. Outra vantagem é que a maturação completa da imunidade adaptativa ocorre
apenas 2 a 3 semanas após a fertilização, o que permite estudar exclusivamente a resposta imune inata
in vivo nessa janela de tempo. Além disso, a transparência permite imagens em tempo real sem
precedentes das interações célula-célula e a rastreabilidade genética permite a engenharia de linhagens
repórteres e mutantes.

Usando múltiplas linhas celulares de cancro

de mama e colorretal e zAvatars, descobrimos que
alguns tumores (~20%) são eliminados (regressores)
enquanto outros (~80%) enxertam efetivamente
(progressores) em xenoenxertos de Zebrafish.
Enquanto as células SW480 derivadas do tumor
primário apresentam um comportamento
regressor, as células SW620 isoladas de uma metástase linfonodal 6 meses depois apresentam um
fenótipo progressor.

Além disso, paradoxalmente, observamos que

SW480 após quimioterapia (FOLFOX) ou radioterapia
(RAD) podem aumentar sua taxa de enxerto. Dado o
facto de que a quimioterapia/radioterapia pode provocar
um efeito imunossupressor, levantamos a hipótese de
que isso poderia reduzir a resposta anti tumoral do
hospedeiro Zebrafish, originalmente responsável pelo
comportamento do regressor (depuração).

De seguida, um pool de ~30 tumores (incluindo SW480 e SW620 do mesmo paciente) de pelo
menos três experiências independentes foi coletado para extração de RNA. Usou-se apenas amostras de
RNA de experiências em que o enxerto de SW480 foi inferior a ~30% e o enxerto de SW620 foi superior a
90%. Os resultados demonstraram um enriquecimento principalmente em três processos biológicos:
resposta imune, metabolismo e sinalização, e sugerem que os tumores SW480 expressam sinais que
podem estimular a depuração, enquanto os tumores SW620 têm atividade reduzida de vias
relacionadas à rejeição.

A fim de testar se os progressores eram capazes de induzir um

ambiente supressivo e, assim, evitar a eliminação dos regressores, SW620
(verde) foram misturados com SW480 (vermelho), gerando xenoenxertos
policlonais in vivo. Três condições foram testadas em paralelo — SW480
sozinho, SW620 sozinho e MIX (SW480 + SW620) e o enxerto foi
quantificado em 4 dpi. Quando misturado,
o enxerto de SW480 aumentou para mais
que o dobro; em contraste, o enxerto de
SW620 diminuiu ~35% em relação a quando está sozinho. Ambas as
populações estiveram sempre presentes, com SW620 a comportar-se
como clone dominante, perfazendo ~ 70% do tumor. Curiosamente,
quando comparamos o tamanho de cada população (número de
células), descobrimos que o número de células SW480 aumentou em
50
xenoenxertos policlonais, ou seja, SW480 beneficia da proximidade das células SW620, sugerindo
que as células SW620 podem proteger as células SW480 da eliminação, induzindo um ambiente
imunossupressor.

Para avaliar se regressores e progressores são capazes de gerar

diferentes ecossistemas tumorais, analisamos a presença de neutrófilos e
macrófagos nos tumores, as principais células imunes inatas presentes
nessa fase do desenvolvimento. Para este fim, injetamos células tumorais
SW480, SW620 e MIX em hospedeiros Tg(mpx:eGFP) e Tg(mpeg1:mcherry-F),
que possuem neutrófilos e macrófagos marcados, respetivamente. 24 hpi,
pudemos detetar um recrutamento significativamente maior de
neutrófilos e macrófagos para os tumores SW480 em comparação com
SW620. Curiosamente, os tumores MIX mostraram um TME semelhante ao
SW620, com recrutamento significativamente menor de neutrófilos e
macrófagos do que os tumores SW480. Esses resultados sugerem que a presença de SW620 no MIX é
capaz de bloquear o recrutamento de células imunes para o tumor. Estes resultados sugerem que a
imunidade inata desempenha um papel ativo na depuração/enxerto.

A quantificação das populações de células imunes mostrou que o SW480 é capaz de recrutar um
número significativamente maior de células inflamatórias (células positivas para TNFa e TNFa+mpeg+
tipo M1) do que o SW620. Além disso, os resultados sugerem que as células SW620 podem polarizar
macrófagos para um estado pró-tumoral semelhante ao M2. Além disso, os xenoenxertos MIX mostram
novamente uma dinâmica semelhante aos xenoenxertos SW620.

Em seguida, os embriões de Zebrafish foram injetados com misturas de regressores com

progressores em diferentes proporções (1:3, 1:1 e 3:1). Descobrimos que um aumento proporcional no
número de células SW620 em tumores policlonais se correlaciona com maiores taxas de enxerto; e a
presença de SW620, mesmo na proporção de 3:1 (SW480:SW620), foi suficiente para bloquear o
recrutamento de neutrófilos.

Para testar se a imunoedição inata está a ocorrer, realizou-se experiências de retransplante de

tumores SW480 que escaparam à eliminação e mostramos que esses tumores enxertam com mais
eficiência e geram tumores maiores com infiltração de macrófagos reduzida.

Finalmente, o RNA-seq de célula única revela a eliminação in vivo e a expansão de subclones

específicos. A análise do transcriptoma de célula única mostra uma seleção subclonal rápida, com
eliminação de subclones regressores associados à sinalização IFN/Notch e subclones expandidos por
escaper com enriquecimento da via IL10.

11. Compreensão de mecanismos moleculares de doenças genéticas

humanas raras através de transcriptómica
Projeto do genoma humano:

• Identificação de todos os genes humanos

• Desenvolvimento de métodos next generation sequencing
• O sonho do genoma pessoal

A doenças são a consequência da disrupção de redes de

interações entre genes e não a consequência de alterar um
nucleótido num gene (o fenótipo vai muito mais além do que o
gene, ou seja, chega aos tecidos, órgãos, etc). Se soubermos o gene que causa a doença podemos atuar
nele para prevenir, tratar, etc, mas isto por vezes não funciona; se pensarmos nas doenças como uma rede
de interações, o gene onde ocorreu a mutação deixa de ser o único alvo terapêutico e passamos a
poder atuar nas outras estruturas envolvidas nessa rede de interações (alvos compensatórios).

A transcriptómica é uma ferramenta para entender a função desta rede de interações. No entanto,
a expressão génica e a função génica são muito dinâmicas, pelo que têm de se estabelecer módulos para
estudar doenças humanas: culturas celulares humanas de todo o tipo possível e modelos animais.
51
Fibrose Cística

É a doença genética mais prevalente nos caucasianos. Esta doença tem sido tratada até
recentemente com transplantes de pulmão. O gene causador da doença é o CFTR e codifica um canal de
cloro na membrana das células (não apenas nos pulmões). Existem várias mutações que causam o
funcionamento incorreto deste canal; mas estas mutações podem afetar diferentes partes do processo.
Têm sido produzidas 3 diferentes drogas para atenuar as mutações em CFTR: corrigindo a produção de
CFTR, aumentando o folding de CFTR e aumentando a função de CFTR assim que chega à membrana.
Sempre que aparece um novo paciente com esta doença, e uma vez que existem tantas mutações que a
provocam, se a mutação não tiver sido já identificada não sabemos se as terapias que existem vão
funcionar ou não. Esta doença não é rara, mas tem muitas mutações que são muito raras e que não se
sabe como tratar.

O fenótipo desta doença é incapacidade de passar iões através da membrana, o que leva a uma
acumulação de muco espesso nos pulmões, e este muco torna-se infetado e gera uma inflamação que
se torna numa doença sistémica.

O objetivo é encontrar os genes que estão associados à rede de interações que leva a esta doença,
para que se possam explorar novos alvos de terapia que possam ser utilizados para todas as mutações.
Para tal, são geradas linhas celulares do epitélio aéreo humano que contêm diferentes tipos de mutações
pertencentes a diferentes classes de mutações que se sabe que causam esta doença. Um dos problemas
que temos em trabalhar com linhas celulares derivadas dos pacientes é que as linhas celulares dos
pacientes são tipicamente heterozigóticas (apesar de ambos os alelos terem a mutação). Criaram estas 5
diferentes linhas celulares homozigóticas para a mutação no CFTR através da tecnologia CRISPR-Cas9.

▪ A mutação da classe I leva a uma ausência total de proteína. Esta mutação especificamente é a
criação de um codão STOP prematuro, através da alteração do aminoácido 542.
▪ A classe II inclui mutações que impedem
que o CFRT seja transportado
corretamente para a membrana, ou seja, a
proteína é produzida, mas fica retida no
retículo endoplasmático. Esta é a mutação
mais comum, e foram feitas 2 linhas celulares
que geram este tipo de mutação.
▪ A classe III são mutações em que a proteína
é produzida, mas não tem função. Esta
mutação é devida à substituição de apenas 1
aminoácido.
▪ Na classe V foi criada uma mutação relacionada com splicing.

Para avaliar o efeito destas mutações observou-se a

abundância de mRNA em comparação com WT, a expressão de
proteínas e o processamento de proteínas (modificações pós-
transcricionais e a sua capacidade de acumular no citoplasma).

A maioria dos mutantes levaram à produção de mais mRNA,

sendo que o único que levava a uma diminuição de mRNA foi o
mutante com um codão STOP prematura, o que faz sentido, uma vez
que as células têm um mecanismo de sobrevivência que deteta a
presença de codões STOP prematuros e leva à degradação do mRNA.

O impacto ao nível das proteínas é diferente. Temos um gene

normalizador que nos permite verificar que a quantidade de extrato
aplicada no gel é a mesma. A primeira mutação não gera proteína
mRNA, pelo que não há proteína. As duas mutações em que a
proteína não é transportada corretamente para a membrana geram
proteína, mas ela não é modificada de alguma forma, pelo que tem
um perfil diferente no gel. A proteína que vai para a membrana, mas

52
não tem função tem níveis normais de proteína e do seu tamanho. No caso da última mutação (associada
a splicing), esta proteína é produzida na forma intermediária.

A única proteína que é processada de forma correta é a

quarta, em que a proteína é também produzida de forma normal,
mas não tem função.

A transcriptómica é aqui utilizada para saber a função

celular das proteínas, ou seja, é extraído o RNA total destas linhas
celulares e depois é sequenciado. Os resultados destas análises
revelam que a mutação mais
próxima do WT é,
inesperadamente, aquela que gera a ausência da proteína.

Para sabermos se existem genes afetados em comum nestas

mutações, faz-se uma análise de
expressão diferencial, que nos
mostra que apenas 38 genes
estão afetados em comum em
todas as mutações.

Através de um teste estatístico, podemos ver se a

função dos genes que selecionámos está aumentada em
relação ao genoma de referência. Se estiverem sobre
representados, significa que o processo está a ser disrompido
no sistema.

 Uma parte significativa das alterações do transcriptoma/proteoma reflete o tipo de mutação,

não os mecanismos da doença. A análise de vários genótipos no sistema mais fisiológico é
fundamental para a identificação dos processos centrais.

Doenças neuronais motoras

Os neurónios motores degeneram e morrem, levando a uma doença que é a maior causa de morte
em crianças devido a uma doença genética. Os pacientes costumam morrem de falência respiratória.
Existem várias doenças, sendo que o foco são a Atrofia Muscular Espinhal (SMA) e a Esclerose Lateral
Amiotrófica (ALS). Conhecem-se os genes responsáveis por estas doenças, mas não se sabe nada do
mecanismo por detrás delas. O que se sabe é que estes genes estão ligados ao metabolismo do RNA e
que envolvem mutações em proteínas de ligação de RNA (RBPs) conservadas. No caso da SMA a
mutação ocorre no gene SMN1 (proteína essencial no spliceossoma), mas como é um gene pequeno têm
sido desenvolvidos vetores virais que entreguem este gene aos neurónios motores para compensar a sua
falha.

Quatro proteínas multifuncionais envolvidas no metabolismo do RNA (TDP-43, FUS, SMN e

Senataxin) desempenham um papel causal nessas doenças. Das interações funcionais e físicas entre
estas quatro proteínas, destaca-se a sua associação comum com corpos nucleares e a biogénese e função
de pequenas partículas de ribonucleoproteína nuclear. Discute-se como é que estas interações se estão
a tornar particularmente relevantes para o controlo da transcrição e homeostase da cromatina,
incluindo a recente identificação de uma associação entre SMN e Senataxin necessária para garantir a
correta formação do híbrido DNA-RNA e terminação adequada pela RNA polimerase II.

Casos familiares de ALS têm sido associados a mutações em pelo menos uma dúzia de genes, com
predominância de mutações ocorrendo em C9ORF72 (ligado a 40% de todos os casos familiares), SOD1,
FUS e TARDBP.

A SMA é causada por mutações hereditárias recessivas no gene de sobrevivência do neurónio

motor 1 (SMN1), localizado no braço pequeno do cromossoma 5. Existem quatro formas distintas da
doença descritas: SMA1, SMA2, SMA3 e SMA4, definidas clinicamente por um aumento na idade de início
e uma diminuição na gravidade dos sintomas. Estas várias formas de SMA são consequência da presença
de vários números de cópias de um forte gene modificador de doença no genoma humano: SMN2 - uma
duplicação invertida de uma região de 500 kb do cromossoma humano 5 contendo SMN1 e alguns dos

53
seus genes vizinhos . Comparado ao SMN1, este gene contém uma única substituição silenciosa no exão
7 que reduz a eficiência do splicing, resultando numa capacidade reduzida de suportar a síntese da
proteína SMN total.

Para descobrir a rede de interações por detrás destas duas doenças utiliza-se o organismo inteiro
(Drosophila) e backgrounds genéticos diferentes, de modo a perceber o que há em comum entre as duas
doenças. A Drosophila é um bom modelo para estudar o sistema nervoso, uma vez que a maioria das
mutações que causas doenças degenerativas humanas apresentam um
fenótipo na mosca que é comparável.

A hipótese é que a existência de alvos

de RNA compartilhados para Caz, Smn e TBPH
pode estar por trás das semelhanças fenotípicas observadas entre SMA e
ALS. Foram geradas três linhagens transgénicas independentes com
construções marcadas com GFP expressas sob o controlo de sequências
UAS. Para caracterizar especificamente o interatoma de RNA neuronal, as
proteínas de fusão GFP foram expressas em células neuronais adultas
usando o driver elav-GAL4 numa janela de tempo limitada (5-7 dias pós-
eclosão). Este sistema
depende da proteína GAL80
sensível à temperatura, que
inibe GAL4 em baixa
temperatura, permitindo a
regulação temporal de
construções UAS. Quando
expressas em células
neuronais, GFP-Caz e
GFP-TBPH acumularam-
se predominante no
núcleo, embora não
exclusivamente. Como
esperado, GFP-Smn foi
encontrado principalmente no
citoplasma.

Em seguida, caracterizou-se separadamente o interatoma de

RNA em cada compartimento celular. Estas análises revelaram que
Smn e TBPH se associam a uma grande fração do transcriptoma
neuronal e que a maioria de seus alvos de mRNA identificados se
associam no citoplasma e não no núcleo. Embora isto possa refletir
em parte a maior heterogeneidade das amostras suspensas de Caz,
está de acordo com a baixa abundância da proteína GFP-Caz
encontrada no citoplasma em comparação com GFP-Smn e GFP-
TBPH.

A análise de sobreposição dos interatomas de mRNA de Caz,

Smn e TBPH revelou uma notável ausência de transcritos ligados
pelos três RBPs nas frações citoplasmáticas ou nucleares. As
experiências demonstram que Caz, Smn e TBPH não compartilham
alvos de RNA comuns.

Concluindo, os módulos funcionais comuns estão sob o

controlo dos ortólogos de genes associados à doença SMA e ALS Smn,
TBPH e Caz. Este controlo é exercido por genes-alvo distintos que codificam proteínas que colaboram em
consórcios neuronais funcionais. É importante ressaltar que a identificação de disfunções moleculares
convergentes ligadas a genes distintos associados a MND sugere que podem existir estratégias
terapêuticas comuns capazes de ajudar a retardar a progressão da doença ou melhorar os sintomas,
apesar da diversidade de origens genéticas.

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 12. Interações músculo-neurónio-glia
As sinapses são o que permite que o sistema nervoso funcione corretamente. Nos dias de hoje, é
aceite que a estrutura de um neurónio tem um impacto muito grande na sua função (mas isto é verdade
para qualquer tipo de célula).

Existem diferentes fases e períodos em que podemos pensar em crescimento neuronal: durante
o desenvolvimento (embriónico e pós-embriónico), durante a resposta a diferentes experiências
(dependente da atividade) ou durante a regeneração. Mas será que todos estes processos utilizam os
mesmos mecanismos e moléculas?

Aqui mostramos usando ex vivo e por imagens ao vivo que, em resposta à despolarização, os
MNs formam novos botões por bolhas de membrana (blebbing), um mecanismo acionado por pressão
usado na migração 3-D, mas nunca descrito como uma estratégia de remodelação neuronal

O botão sináptico
encontram-se em torno de
especializações da membrana
axonal onde ocorre a
neurotransmissão que contêm
os neurotransmissores. O
botão sináptico é um bom
indicador da existência de
uma sinapse funcional.
Apesar da importância do
botão, há uma falta de
compreensão sobre o
mecanismo da sua formação
nos neurónios. Durante a
embriogénese, os axónios neuronais estendem-se em direção aos seus alvos sinápticos através de
estruturas altamente dinâmicas compostas por filopódios e lamelipódios, chamados cones de
crescimento (GC), que ao chegarem ao seu destino se diferenciam em botões redondos criando
conexões altamente específicas.

A junção neuromuscular (NMJ) é uma sinapse formada

entre os neurónios motores (MNs) e as fibras musculares
esqueléticas e é fundamental para o controlo da contração
muscular. Para estudar a formação de botões no contexto da
remodelação pré-sináptica, usamos a NMJ do terceiro ínstar larval
de Drosophila, onde a adição de botões de desenvolvimento é
quase completa e a formação rápida de novos botões pode ser
solicitada por estimulação padronizada com alto K+. Outra
vantagem de usar Drosophila são os vários sistemas induzíveis que podem ser utilizados para os estudos.
Além do sistema UAS-GAL4, temos também o sistema LexA-LexAOp, que funciona da mesma forma.

Observou-se que os botões emergiam sempre como grandes expansões esféricas da membrana
MN e frequentemente o seu crescimento era um evento rápido, variando de menos de 1 minuto a alguns
minutos. A formação de botões é um processo dinâmico que se assemelha fortemente ao blebbing
celular. O blebbing é uma forma de mobilidade que foi primeiramente observada em amiba. As bolhas
são protuberâncias de membrana redondas extraídas por pressão hidrostática intracelular que algumas
células usam, em combinação ou em alternativa aos lamelipódios, para migrar. A formação de bolhas na
membrana é conservada evolutivamente e é favorecida por condições de alto confinamento e
contratilidade e baixa adesão.

Testou-se se os MNs de Drosophila se adaptavam ao blebbing para remodelar em condições de

intensa atividade neuronal. As bolhas de células imóveis sofrem rápidos ciclos de expansão-retração,
enquanto as células migratórias raramente se retraem e geralmente formam bolhas persistentes e
até sequenciais que eventualmente se estabilizam. De qualquer forma, uma grande diferença entre
bolhas e outras protuberâncias de membrana, como lamelipódios ou filopódios, é que o crescimento da

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 bolha não depende da
polimerização da actina,
mas é impulsionado
principalmente por um
fluxo de fluido citosólico
através de um
enfraquecimento local
(rutura) no córtex celular
de actomiosina. Como
resultado, a principal
característica das bolhas é que elas são inicialmente desprovidas de um citoesqueleto de actina, mas
as bolhas podem subsequentemente montar o citoesqueleto para estabilizar ou retrair.

Usaram animais expressando

CD4-GFP e Lifeact-Ruby em neurónios
para acompanhar a dinâmica da
membrana e da F-actina em tempo real
após estimulação com High-K+. Isto
mostrou que os novos botões têm a
marca registada das bolhas: crescimento
da membrana sem F-actina proeminente.
Esses dados sugerem que a
polimerização da actina não é a
principal força motriz para o
crescimento do botão.

Eles queriam testar se a mudança moderada da actina para um estado menos ou mais
polimerizado alterava a formação de botões dependentes de atividade e, em caso afirmativo, em qual
fase da bolha. Os resultados sugerem que uma interrupção leve da polimerização da actina não é
suficiente para prejudicar a plasticidade estrutural aguda, possivelmente porque a presença da actina
não é essencial durante os estágios iniciais da formação do botão. Da mesma forma, foi demonstrado que
a aplicação local de Latrunculina B (despolimerizador de actina) não altera a frequência da bolha nas
células, mas leva a um aumento global no tamanho da bolha. Em conjunto, os resultados sugerem que
o tamanho da bolha parece ser determinado por um equilíbrio entre a taxa de crescimento inicial (a
taxa de expansão do volume devido ao fluxo do citoplasma) e o tempo necessário para a actina se
repolimerizar na membrana da bolha, que pode ser alterada de acordo com a dinâmica da actina local.

Embora as bolhas possam ser desencadeadas de diferentes maneiras, a sua geração é favorecida
em condições de alta tensão cortical, que é gerada principalmente pela ativação da miosina-II não
muscular (miosina-II). De facto, drogas que relaxam o córtex restringindo fortemente a actina ou a
miosina-II prejudicam a formação de bolhas, sugerindo que o descolamento da membrana e a inflação
da bolha são impulsionados por transientes de pressão intracelular gerados por contrações do córtex
de actomiosina. Curiosamente, após a estimulação com High-K+, a miosina-II torna-se claramente
enriquecida em novos botões, com acumulação percetível na base ou na borda. O recrutamento de
miosina-II para novos botões não está impulsionando o seu crescimento, mas pode perturbar a sua
dinâmica, retardando o crescimento. Isso está de acordo com estudos anteriores sugerindo que o
recrutamento de miosina-II para o córtex da bolha impulsiona sua estabilização/retração. Em
conjunto, nossos dados sugerem que a atividade da miosina-II pode contribuir para regular a
remodelação induzida por atividade na JNM.

Em seguida, expressaram RNAi contra a cadeia leve reguladora, Sqh, e a cadeia pesada, Zip, da
miosina-II sob o controlo do driver neuronal Gal4 NSyb para promover a regulação negativa desse motor
de miosina em MNs. Surpreendentemente, descobrimos que a rutura neuronal da cadeia leve ou
pesada da miosina-II aumentou a capacidade dos MNs de formar novos botões após a despolarização
de High-K+, em vez de bloqueá-la. Além disso, descobrimos que a contração muscular desempenha um
papel mecânico na plasticidade dependente da atividade, promovendo a adição de botões ao aumentar
o confinamento dos MNs. No geral, fornecemos um novo mecanismo pelo qual circuitos estabelecidos
criam novos botões, permitindo sua expansão estrutural e plasticidade, usando forças físicas trans
sinápticas como principal força motriz.
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