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Procedimento: TESTE DE CÉLULAS FALCIFORMES ASI Nº do documento:

6004-200 CLSI

Data Efetiva: 08/11 Substitui Revisão/Data: 05/11 Revisão: 08/11

Substitui o Procedimento # Preparado por: ASI Data de Adoção:

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Assinatura:

PARA USO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO

Gato. Não. 200025 25 testes

200100 100 testes
200500 500 testes

Código CPT: 85660

1 USO PREVISTO: O Teste de Células Falciformes ASI destina-se a ser usado como auxiliar na detecção qualitativa de hemoglobina S
(Hb-S) em sangue total anticoagulado. O teste não distingue entre doença falciforme (HbS/S) e traço falciforme (HbS/A). Este teste não é recomendado para uso em
recém-nascidos com menos de 3 meses de idade. Estes materiais destinam-se a ser adquiridos, possuídos e utilizados apenas por profissionais de saúde.

2 RESUMO E EXPLICAÇÃO: A doença falciforme é uma doença hereditária que se caracteriza pela presença de uma hemoglobina anormal (Hb-S). Em adultos normais,
95% ou mais da hemoglobina está presente como hemoglobina A (Hb-A). Lactentes com menos de 3 meses de idade podem ter baixos níveis de Hb-S, que podem
não ser detectáveis por esta metodologia. A hemoglobina S pode ser herdada no estado homozigoto (S/S), que resulta em anemia falciforme, ou no estado heterozigoto
(A/S), que geralmente é o traço falciforme benigno e assintomático. A hemoglobina S também pode ocorrer na presença de outra hemoglobina anormal, ou seja,
Hb-C (S/C), talassemia (S-thal) ou Hb-D (S/D). Estes são referidos como as variantes falciformes e podem produzir sintomas de gravidade variável.

3 PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO: Os eritrócitos são lisados por saponina e a hemoglobina liberada é desoxigenada por ditionito em um tampão fosfato concentrado.3
A Hb-S, quando desoxigenada, é insolúvel em tampão fosfato concentrado e produz turbidez visível. Como quase todas as outras hemoglobinas (isto é, Hb-A, -F,
-C, -E, -D) são solúveis, amostras de sangue contendo Hb-S são facilmente identificadas.

Quando uma amostra positiva é identificada, a adição de ureia à mistura de reação fará com que a solução fique límpida se houver Hb-S presente. Se a solução
permanecer turva após a adição de ureia, um não Hb-S é indicado. O ensaio de eletroforese é necessário para uma identificação conclusiva.

O método aqui apresentado é baseado em um procedimento Nalbandiano modificado.4,5

4 REAGENTES

4.1 Tampão Falciforme – contém Fosfato de Potássio, Saponina e Azida Sódica. É estável até a data de validade indicada no rótulo quando armazenado a 15o - 30o C.
Um Tampão de Trabalho para Células Falciformes deve ser preparado antes do teste. Adicione todo o conteúdo de um frasco de Reagente de Lise de Células
Falciformes a 50 ml de Tampão de Células Falciformes e misture completamente girando. O Tampão de Trabalho para Células Falciformes é estável por 30
dias a partir da data de preparo quando armazenado entre 2o - 8o C.

4.2 Reagente de Lise de Células Falciformes – contém pó de Hidrossulfato de Sódio. É estável até a data de validade indicada no rótulo quando armazenado entre 15o -
30o C.

4.3 Reagente de ureia para células falciformes – contém ureia e azida sódica. É estável até a data de validade indicada no rótulo quando
armazenado a 15o - 30o C.

5 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

Para uso em diagnóstico in vitro

5.1 Não pipetar com a boca.

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5.2 Os reagentes ASI para células falciformes contêm azida sódica. As azidas em contato com encanamentos de chumbo e cobre podem reagir para formar
azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar reagentes contendo azida, jogue no ralo grandes quantidades de água para evitar o acúmulo de azida.

5.3 Em caso de contato com os reagentes, lave a área afetada com água em abundância. Se a irritação persistir, procure um médico
atenção.

5.4 Qualquer turvação observada no Tampão de Células Falciformes, que não se dissolverá prontamente após a mistura, pode indicar
deterioração.

5.5 Se o pó do Reagente de Lise de Células Falciformes ficar úmido e com grumos antes do uso, ele deve ser descartado.

5.6 O Reagente de Lise de Células Falciformes contém Hidrossulfato de Sódio, que é um sólido inflamável e um forte agente redutor. Em caso de contato com os olhos
ou a pele, lave imediatamente as áreas expostas com água em abundância por pelo menos 15 minutos. Procure atendimento médico se a irritação persistir.

5.7 Não fume, coma, beba ou aplique cosméticos em áreas onde amostras de plasma/soro são manuseadas.

5.8 Quaisquer cortes, escoriações ou outras lesões cutâneas devem ser devidamente protegidas.

5.9 Todas as amostras devem ser consideradas potencialmente perigosas e manuseadas da mesma forma que um agente infeccioso.

6 MANUSEIO E NOTAS DE PROCEDIMENTO

6.1 Para obter resultados confiáveis e consistentes, as instruções contidas na bula devem ser rigorosamente seguidas. Não
modificar as condições de manuseio e armazenamento de reagentes ou amostras.

6.2 Não utilize após o prazo de validade indicado no kit.

6.3 Não troque componentes de um kit com os de outro kit.

7 INSTRUÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Antes de usar, armazene o kit a 15o - 30o C. Após adicionar o reagente de lise, armazene o Tampão Falciforme a 2o - 8o C. Armazene o Reagente de Lise Falciforme
a 15o - 30o C. Armazene o Reagente de Ureia Falciforme a 15o - 30o C. Traga todos os reagentes à temperatura ambiente antes
usar.

8 COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS

O sangue total pode ser coletado por punção venosa ou de tubos de picada no dedo contendo anticoagulante (heparina, EDTA, ACD).
As amostras podem ser mantidas por 1 a 2 semanas a 2o - 8o C. Sangue coagulado e sangue coletado em papel de filtro não é apropriado para
usar.
Nota: Os glóbulos vermelhos embalados podem ser usados em vez de sangue total para minimizar falsos positivos e reações falso negativas.14

9 REALIZAÇÃO DO TESTE
Materiais Fornecidos:

25 testes 100 testes 500 testes

REAGENTE DE LISE DE CÉLULAS FALCIFORMES 1g 4g 20

REAGENTE DE UREIA PARA CÉLULAS FALCIFORMES 4,0 ml 17,0 ml gramas 85,0 ml

TAMPÃO DE CÉLULA FALCIFORME 50ml 200ml 1000 ml

Material Adicional Necessário 9.1

Pipetas 9.2
Tubos de Ensaio 12 x 75 mm 9.3
Temporizador
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10 PREPARAÇÃO DO TAMPÃO DE TRABALHO DAS CÉLULAS FALCIFORMES

Adicione todo o conteúdo de um frasco de Reagente de Lise de Células Falciformes a 50ml de Tampão de Células Falciformes e misture completamente girando.
O tampão de trabalho pode ser utilizado por 30 dias a partir da data de preparo, desde que armazenado entre 2o - 8o C.

11 PROTOCOLO DE ENSAIO

11.1 Transfira 2,0 ml do Tampão de Trabalho para Células Falciformes para um tubo de 12 x 75 mm.
11.2 Adicione 20 µl de sangue total bem misturado ou espécime de controlo e misture cuidadosamente e cuidadosamente. Se testar uma amostra com hemoglobina
abaixo de 7 g/dl, adicione 40 µl de sangue total.
11.3 Deixar repousar 5 minutos mas não mais de 30 minutos à temperatura ambiente (15o - 30o C).
11.4 Leia os resultados olhando através do tubo de ensaio na Escala de Linha (fornecida neste folheto). Segure o tubo de ensaio na vertical e
perpendicular a aproximadamente 3 cm da Escala de linha. Iluminação adequada é necessária.

12 CONTROLE DE QUALIDADE
Os requisitos de controle de qualidade devem ser executados de acordo com os regulamentos locais, estaduais e/ou federais aplicáveis ou os requisitos de
credenciamento e os procedimentos de controle de qualidade padrão de seu laboratório. Controles com reatividade graduada devem ser incluídos. Se as amostras de
controle não produzirem a resposta esperada, o ensaio deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. Se a repetição do ensaio não produzir os resultados
esperados para as amostras de controle, interrompa o uso do kit e entre em contato com o Suporte Técnico da ASI pelo telefone 800.654.0146.

13 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Resultados positivos – Se Hb-S ou qualquer hemoglobina falciforme estiver presente, a solução será turva o suficiente para impedir a leitura da escala de linha
através do tubo de ensaio. Todos os testes duvidosos, bem como todos os testes positivos, devem ser confirmados por eletroforese.
Os resultados positivos podem ser verificados seguindo os seguintes passos: 13.1 Transfira 2,0 ml
do Tampão de Trabalho para Células Falciformes para um tubo de ensaio de 12 x 75 mm.
13.2 Adicionar 5 gotas de Reagente de Ureia Falciforme e misturar.
13.3 Adicione 20 µl de sangue total positivo e agite suavemente para misturar.
13.4 Deixe repousar por 5 minutos, mas não mais que 30 minutos. Leia contra a escala de linha.

A presença de Hb-S será indicada se a solução ficar límpida na presença do Reagente de Ureia Falciforme. A única variante conhecida que também esclarecerá
com o reagente de uréia é HbS/C (Harlem).4 Esta etapa não substitui o teste de confirmação para resultados positivos.

Resultados negativos – Se a hemoglobina falciforme não estiver presente, a solução será clara o suficiente para permitir que a escala de linha seja vista através
do tubo de ensaio.
13.5 Resultados negativos podem ser interpretados em até 5 minutos.

14 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

14.1 A anemia grave pode causar falsos negativos. Se o médico suspeitar desta condição, uma determinação de hemoglobina é necessária antes do teste. Se a
hemoglobina do paciente estiver abaixo de 7 g/dl, o teste deve ser feito com 40 µl da amostra. A duplicação do volume de sangue anêmico em um
esforço para obter uma amostra adequada da hemoglobina está bem documentada.10,11,12 A necessidade de determinar os níveis de hemoglobina
antes do teste deve ser estabelecida por diretrizes laboratoriais individuais.

14.2 Resultados falsos negativos podem ocorrer quando: a) a concentração de Hb-S for inferior a 20% da hemoglobina total. b) quando
testar bebês com menos de 3 meses de idade. Recomenda-se não usar este teste em bebês com menos de 3 meses de idade.

14.3 Este teste não é adequado para uso em triagem neonatal ou teste de hemoglobinopatias usando sangue seco
espécimes.

14.4 Hemoglobinas falciformes raras relatadas também fornecem resultados de teste positivos com este procedimento. Alguns deles incluem
Hemoglobina C (Harlem), Hemoglobina C (Georgetown), Hemoglobina H (um corpo de Heinz formando hemoglobina) e outras hemoglobinas de baixa
solubilidade, como King's County e Stanley II.4,5 Em pacientes que fizeram esplenectomia e têm hemoglobinas instáveis, o teste pode parecer positivo devido
à presença de numerosas inclusões de eritrócitos insolúveis.7

14.5 Em todos os casos em que há suspeita ou indicação de anormalidades, a confirmação eletroforética é recomendada e
necessários para identificar genótipos específicos.

14.6 As amostras altamente lipêmicas ou limítrofes positivas devem ter o seguinte procedimento: Centrifugar a amostra de sangue total a 1500 xg por 10 minutos e
remover cuidadosamente o plasma sobrenadante e descartar.
Repita o teste usando 20 µl dos eritrócitos embalados.
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14.7 Elevações anormais dos níveis totais de proteína sérica supostamente causam floculação grosseira, que pode ser incorretamente
interpretado como positivo para Hb-S.12 Quando isso ocorrer, lave a amostra uma vez com soro fisiológico normal e centrifugue. Decantar o
sobrenadante e ressuspender as células para o volume original usando soro compatível com o grupo normal. Teste novamente com a amostra
lavada.

15 VALORES ESPERADOS

Amostras contendo HbS/S, HbS/A, HbS/C, HbS/D, HbS-talassemia e HbS/N (Baltimore) supostamente produzem resultados positivos.10 Amostras contendo
hemoglobina normal e HbA/C, HbC/C, HbA/F , e a talassemia supostamente produzem resultados negativos.13 No entanto, variantes de baixa solubilidade,
como Hb-H, King's County e Stanley II, podem apresentar resultados falsos positivos.4,5

A forma homozigótica da Doença Falciforme afeta 0,3% da população negra. Na América e na África, a HbS/A é a variante de hemoglobina mais comum,
aproximadamente 8% em afro-americanos (forma heterozigótica) e 30% em negros africanos. A mutação provavelmente se originou na África Central e se
espalhou para os países que fazem fronteira com o Mar Mediterrâneo, incluindo os não negros dessas áreas, por exemplo, Itália, Grécia, Turquia e
algumas das nações árabes. O estado heterozigoto não causa anemia ou redução do tempo de vida das hemácias, mas 1 em 6.000 afro-americanos são
homozigotos para Hb-C.

16 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

Um total de 166 amostras clínicas consecutivas foram testadas em espécimes submetidos ao teste de células falciformes. As amostras foram analisadas com o
teste ASI Sickle Cell e outro teste comercialmente disponível de acordo com o respectivo procedimento de ensaio. Ambos os métodos identificaram
42 amostras positivas e 124 negativas. Os resultados demonstraram uma concordância de 100% entre ambos os testes para todas as amostras testadas.
A eletroforese de hemoglobina foi realizada em 22 espécimes, que identificaram 11 espécimes positivos e 11 negativos. O teste de células falciformes
ASI identificou corretamente todas as amostras. Um estudo cego foi realizado para determinar a reprodutibilidade e repetibilidade dos resultados do teste
com o ASI Sickle Cell Test. O teste foi realizado com um painel de amostras, que incluiu 8 amostras negativas conhecidas e 10 amostras positivas
conhecidas contendo Hb-S variando de 20 a 68%. O teste foi realizado usando 3 lotes diferentes, em 3 dias diferentes, por 3 investigadores diferentes em um
local.
Os resultados mostraram uma correlação de 100% dentro das execuções, de execução para execução e entre os investigadores para todas as amostras. Foi feito
um estudo de limites de detecção que descobriu que este teste pode detectar com segurança níveis de 20% de Hb-S.

17 REFERÊNCIAS

1. Widmann, FK; Interpretação Clínica de Testes Laboratoriais, FA Davis Co., Filadélfia, pp. 57-60, 1983.
2. Neel, JV; Blood The Journal of Hematology, 6:389, 1951.
3. Itano, HA; Arco. Bioquim. Biophys., 47:148, 1953.
4. Nalbandian, RM, e outros; Teste de tubo de ditionito - uma técnica rápida e barata para a detecção de hemoglobina S e
Hemoglobina Falciforme Não-S. Clin Chem., 17:1028-1032, 1971.
5. Nalbandian, RM, e outros; Teste automatizado de ditionito para detecção rápida e econômica de hemoglobina e falcização não S
Hemoglobina. Clin Chem. 17:1033-1037, 1971.

6. Calam, RR; Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol.9, Eds. Por WR Faulkner e S. Meites, AACC Pub.,
Washington, pp.3-10, 1982.
7. Fairbanks, VF e Klee, GG; Tratado de Química Clínica, Ed. NW Tietz, WB Saunders Co., Filadélfia, pp1540-
1541, 1986.
8. Whitehead, TP; Controle de Qualidade em Química Clínica, John Wiley & Sons, Nova York, 1977.
9. Kaplan, LA, Pesce, AT; Química Clínica, 2ª ed. O CV Mosby Co. Missouri, 1989.
10. Ballard, MS, e outros; Um novo teste de diagnóstico para hemoglobina S. Jour. of Pediatrics, Vol 76, pp. 117-119, 1970.
11. Diggs, LW, Walker, R.; Pontos Técnicos na Detecção da Hemoglobina Falciforme pelo Teste do Tubo. Amer. Dia. do Med.
Tech, Vol 37, pp.33-35, 1971.
12. Loh, WP; Avaliação de um Teste Rápido de Turbidez em Tubo de Ensaio para Detecção de Hemoglobina Falciforme. Amer. Dia. de Clin.
Path., Vol 55, pp.55-57, 1971 13.
Canning, DM, Huntsman, RG; Uma avaliação do Sickledex como uma alternativa ao método falciforme. Amer. Dia. de Clin.
Path., 23(8): pp.736-737, 1970.
14. Comitê Nacional de Padrões de Laboratórios Clínicos: Teste de Solubilidade para Confirmação da Presença de Hemoglobinas Falciformes:
Padrão Aprovado. NCCLS, Publicação H10-A. Villanova, PA: NCCLS, 1996.
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Distribuído por: Arlington Scientific, Inc. (ASI)

SUPORTE TÉCNICO ASI: (800) 654-0146

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