BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Lic.en Bromatología
FCA - UNCuyo
SISTEMAS DE CRECIMIENTO Y FERMENTACIÓN

Punte de clase: recopilación bibliográfica Dra. Adriana Giménez

INTRODUCCIÓN

La función principal de un fermentador es la de proporcionar un medio

ambiente controlado que permita el crecimiento eficaz de las células y la formación
del producto.

El fermentador típico moderno de laboratorio se ha diseñado como una unidad

sofisticada con las características y la instrumentación necesarias para llevar a cabo
una gran variedad de procesos de fermentación. Los fermentadores de laboratorio que
requieren volúmenes de hasta 20 litros se fabrican de vidrio o de acero inoxidable .
Para volúmenes más grandes la construcción es de acero inoxidable.

Los fermentadores a escala de producción industrial son usualmente unidades

construidas a medida teniendo en cuenta los costos y objetivos específicos y
diseñadas para un proceso o una serie de procesos relacionados y, en consecuencia,
únicamente tienen las características e instrumentación específicos para un proceso
de producción en particular.

FERMENTADORES

La mayoría de los demás procesos industriales requieren recipientes cerrados,

capaces de operar en condiciones de cultivo puro y se construyen de acero inoxidable
de calidad apropiada, con las juntas enfrentadas (no superpuestas), soldadas y pulidas
meticulosamente en la superficie interna para hacer más fácil y eficaz la limpieza y
esterilización.
Los criterios más importantes a tener en cuenta para el diseño de un fermentador para
fermentación aerobia son los siguientes:

1. El tanque debe funcionar asépticamente durante mucho tiempo, así como para las
operaciones de más larga duración.
2. Debe tener un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las
necesidades metabólicas de los microorganismos.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Debe tener un sistema para el control de pH.
5. Debe tener un sistema para la toma de muestra
6. Debe tener un sistema para el control de la temperatura
7. Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8. Las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y
mantenimiento deben ser mínimas.
9. El tanque debe ser versátil, para la aplicación de diversas modalidades de
procesos.
10. Las superficies internas deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras
en vez de juntas de pestaña.
11. Geométricamente debe ser similar a otros fermentadores más pequeños o
mayores de la misma planta o a los de la planta piloto, para reproducir procesos a
diferente escala.
Los biorreactor es para fermentación aerobia podemos clasificarlos así:

I Con agitación mecánica

 Agitado con turbina
 Agitado con tubo de tiro
 Agitado con tubo de succión automática (Frings)
II Sin agitación mecánica
 Fermentador de ciclón: distribución de gas mediante bombas.
 Fermentador de circulación de aire con ramal externo.
 Fermentador de circulación de aire con ramal interno (ICI)
 Fermentador de chorro de aire.
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BIORREACTORES AGITADOS

Para el uso industrial, especialmente en la Industria Farmacéutica, el

biorreactor más versátil es le fermentador aireado con agitación mecánica . Sin
embargo no es posible construir un sistema único que satisfaga adecuadamente las
necesidades de todos los sistemas biológicos.
La figura corresponde al diseño de un fermentador industrial de turbina
agitadora.
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Figura 1 : Fermentador industrial mostrando la construcción y las instalaciones para la

aireación para el y proceso de control.

Veamos ahora algunos aspectos importantes del equipamiento e instalaciones

de los biorreactores agitados.

Cortacorrientes o deflectores: Son normalmente cuatro placas verticales solidarias a

la pared del tanque, cuyo ancho es de un 10-12% del diámetro del reactor. Modifican
la turbulencia transfiriéndola hasta las paredes y con ello, mejoran la eficiencia de los
intercambios y mezclas. En grandes fermentadores, si existen problemas de disipación
del calor se aumenta el número de deflectores hasta a 12.

Separadores de espuma: La formación de espuma es con frecuencia un problema en

los sistemas aireados de gran escala. La adición de antiespumantes es aparentemente
el método más simple y puede automatizarse mediante un simple sistema de relés
comandado por una sonda, como puede verse en la figura.

Los agentes químicos antiespumantes no pueden siempre ser utilizados ya que

pueden tener efectos inhibitorios sobre la fermentación.
Existen varios métodos que pueden destruir la espuma en el área estéril . El aparato
más sencillo tiene rastrillos montados sobre el agitador . En otros casos (sistema
Frings), la espuma se elimina mediante fuerza centrífuga.

Figura 2. Sistema de sonda aislada para la detección y control de espuma.

Agitadores o impulsores: Los dispositivos de agitación son particularmente

necesarios para romper aglomerados de organismos con micelios. Para los procesos
microbiológicos sólo pueden utilizarse tipos específicos de agitadores. La figura
muestra los más importantes.

El agitador de disco es el tipo más común: desde el eje de un disco de diámetro

apropiado salen 4-8 paletas radiales.
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Los otros dos tipos de agitadores consisten en brazos agitadores con paletas unidas
en ángulo. Comparado con los dos tipos mencionados anteriormente, los agitadores
INTERMIG Y MIG requieren 40% y 25% menos de energía respectivamente para
rendimientos equivalentes.
El soporte del eje del agitador debe ser estéril y evitar el acceso de microorganismos
debido a la rotación del eje.

Figura 3. Sistemas de impulsores para Fermentadores.

Difusores de aire estéril:

Aunque algunas fermentaciones se efectúan anaeróbicamente, la gran mayoría son

procesos aerobios, que requieren grandes volúmenes de aire estéril. El aire se
suministra a través de un difusor adecuado: un difusor de salida múltiple en forma de
anillo o rejilla .

Figura 6.2 – Difusores para recipientes de fermentación. Difusor en anillo (A) , Difusor
de rejilla (B),Conducto abierto simple(alimentación inmediatamente debajo de las
paletas de agitación más bajas) (C).
Las burbujas ascendentes de aire pueden realizar toda la mezcla requerida.
Los organismos multicelulares tienden a cubrir la mayoría de los orificios de los
difusores de anillo o de rejilla y un simple conducto abierto bajo el agitador inferior es
por tanto más eficaz.
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INSTRUMENTACIÓN y CONTROL

Los fermentadores están equipados con instrumentos que se utilizan para

facilitar el análisis y registro de parámetros específicos, para ayudar a establecer las
condiciones óptimas del proceso de fermentación y para optimizar el proceso de
producción.
El control de un parámetro particular se lleva a cabo con un sensor y con un
controlador que compara esta medida con un valor fijo y que activa el equipo hasta
ajustar el valor de la propiedad a éste. El ajuste implica usualmente la modificación del
estado de una válvula de apertura o la velocidad de una bomba dosificadora
Los sensores pueden estar “on line”, es decir, conectados a la instalación del
fermentador o “off-line”, de los cuales se toma asépticamente una muestra para
análisis. Los sensores “on–line” de los fermentadores comunes se utilizan para medir
propiedades físicas como ser temperatura, presión, r.p.m. del agitador y otras
fisicoquímicas como ser pH y las concentraciones de gases en las fases líquida y
gaseosa. Deben ser esterilizables con vapor de agua, fácilmente calibrables y dar una
lectura continua fiable.
El método que nos da más información acerca del estado de fermentación es
probablemente el análisis del gas de salida. Los métodos de análisis del O2 mediante
procedimientos paramagnéticos y del CO2 mediante análisis con infrarrojos tienen las
desventajas de la necesidad de calibrado y de su lento tiempo de respuesta. Los
espectrómetros de masas pueden operar sin atención personal durante largos
períodos de tiempo y medir CO2 , O2 , N2 y otros gases con un alto grado de precisión ,
y cuando se acoplan a una computadora pueden suministrar datos útiles como los
coeficientes respiratorios (CR = CO2 producido / O2 consumido) y la velocidad de
absorción de oxígeno.
Aunque los análisis “off-line” aún se utilizan para medir muchos substratos
metabolitos, enzimas, constituyentes celulares y biomasa, la tendencia actual hacia
procesos de control más automatizados, ha desembocado en una demanda obvia
hacia métodos que puedan medir cuantitativamente moléculas biológicas “on line”. Se
ha desarrollado una nueva generación de biosensores altamente específicos,
destinados predominantemente a aplicaciones clínicas, basados en el establecimiento
de una interfase entre enzimas inmovilizados y sensores electroquímicos.

Por ejemplo, en la actualidad para el control de algunos procesos puede utilizarse un

electrodo de glucosa esterilizable o un electrodo sensible al alcohol. El desarrollo de
biosensores “on line” que aprovechan los cambios confeormacionales producidos en
las proteinas con actividad enzimática a medida que interaccionan con los sustratos, o
las propiedades donor/aceptor de electrones de las moléculas biológicas darán lugar
indudablemente a un mayor nivel de sofisticación en el control de los procesos de
fermentación.
Las computadoras pueden utilizarse pudiendo analizar los datos, presentar el
análisis en dispositivos al efecto, y almacenarlos o utilizarlos para controlar el proceso
mediante señales que activen conmutadores, válvulas y bombas. Las operaciones de
procesado de datos deben incluir el cálculo de velocidades, rendimientos,
productividad, coeficientes respiratorios. Además de mantener los registros de cada
lote con objeto de asegurar la calidad, y para su inspección por las autoridades
reglamentarias.

Instrumentación para medición de Variables de Ing. Química

Temperatura 1.Termómetros (Mercurio)

2. Termocuplas (Resistencias eléctricas)
Presión 1. Válvulas de diagrama que transforman señales
neumáticas en señales eléctricas
Potencia Entregada: 1. Dinamómetros de torsión Se localizan en el
exterior del fermentador

2. Medidor de tensión Son más costosos pero más exactos.

Se colocan en el interior del agitador.
Velocidad Tacómetro de agitación (n)

Espuma : Electrodos de conductancia Control por adición de

antiespumantes o destrucción mecánica.
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Flujo de Gases: 1. Flujómetros

2. Rotámetros -Más económicos
-Su señal se traduce a señal eléctrica

Viscosidad: 1.Viscosímetros (Difícil)

Se puede relacionar con: - El grado de crecimiento de los m.o.
- La morfología de los m.o.

Velocidad del Flujo 1. Flujometro electromagnético de alimentación

Turbiedad 1. Turbidímetros
2. Espectrofotómetros en línea. Permiten conocer el grado de
crecimiento

Instrumentación para medición de Variables Biológicas

Electrodos de:
pH : Los electrodos deben ser resistentes a presencia de proteínas, son de
KCl saturado

O2 disuelto : Operan por métodos electroquímicos.Con cátodo de Ag y ánodo

de Pb
Tienen tiempos de respuesta 10-100 sec. La corriente depende del
tamaño del cátodo, temperatura y O2 disuelto
Electrodos enzimáticos: Urea
Glucosa
Actividad Catabólica (NAD – NADH)
Técnicas Fluorimétricas
Actividad Anabólica (ATP – ADP)
Actividad Deshidrogenasa
Determinación en las corrientes de Salida: O2 : Analizador paramagnético
Espectrometría
CO2: Analizador infrarrojo de masas

Alternativa: Cromatografía gaseosa en línea : Permiten determinar las

capacidad de transferencia de O2 en el fermentador y la velocidad de
respiración del cultivo.
Electrodos específicos para Iones: NH4+, Na++, PO4-3 , Mg++, Ca++

AIREACIÓN Y AGITACIÓN

La mayor parte de los fermentadores están equipados con un

dispositivos de agitación, lo cual es particularmente necesario para romper
aglomerados de organismos con micelio conjunto de paletas verticales planas
colocadas en un disco horizontal para crear un movimiento circular del medio.
La tendencia a la formación de turbulencias se evita mediante deflectores
verticales adaptados a las paredes del recipiente.

Además de proporcionar oxígeno, la aireación es también importante

para limpiar el cultivo de productos metabólicos volátiles e indeseables. La
agitación ya sea directa o como efecto secundario de la aireación es
necesaria, particularmente por cinco razones:

1. Para incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno desde las

burbujas de mayor velocidad gas líquido, los microorganismos no pueden
utilizar oxígeno gaseoso, sino sólo oxígeno en disolución.

2. Para aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y nutrientes de

mayor velocidad desde el medio a las células. Debido al continuo
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movimiento , se evita que las células creen áreas estancadas con bajos
niveles de oxígeno y nutrientes.

3. Para impedir la formación de agrupaciones de células o agregados de

micelio

4. Para aumentar la velocidad de transferencia de productos metabólicos de

las células al medio.

5. Para aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el

medio y las superficies de refrigeración del fermentador.

Todos estos efectos son favorecidos por el movimiento del medio, pero
además, la turbulencia de la agitación mejora la aireación de las formas
siguientes:

1. Dispersando el aire en pequeñas burbujas

2. Provocando que las burbujas tengan que seguir un camino más tortuoso y
retrasando su escape del cultivo

3. Impidiendo la coalescencia de las burbujas

4. Disminuyendo la anchura limitante de la película de líquido en la interfase

gas/líquido.

Así es de particular importancia por lo que afecta al suministro de oxígeno al

cultivo:

1. Tipo de agitación: la forma, número y disposición de los impulsores y

deflectores. Un gran fermentador está provisto normalmente de dos o tres
impulsores a niveles adecuados del eje de agitación y tres o cuatro
deflectores verticales en la pared del recipiente.

2. Velocidad de agitación: En la práctica, el efecto de cizalla en el extremo

de la pala es un factor importante, más que las rpm, igualmente importa la
velocidad en dicho extremo.

3. Profundidad de líquido en el fermentador: las burbujas se mantienen

más tiempo en el medio en un fermentador alto (o profundo) y la gran
presión hidrostática en el difusor mejora la disolución del oxígeno . En la
práctica, es corriente encontrar una relación altura/diámetro de (3:1 ó 4:1)

4. Tipo de difusor: es un compromiso entre numerosos orificios, fácilmente

bloqueables, y una sola abertura que produzca burbujas muy grandes.

5. Flujo de aire: La eficiencia de aireación se incrementa aumentando la

velocidad de flujo del aire. En la práctica, no resulta económico abastecer
los grandes fermentadores con aire a velocidad mayores de (0,5 - 1,0 v/m.).

6. Propiedades físicas del medio: La temperatura, viscosidad, tensión

superficial y la naturaleza del organismo afectan a la disolución del oxígeno
directamente o por tamaño de burbuja y turbulencia, son modificables, un
incremento de presión.

ESTERILIZACIÓN de FERMENTADORES
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En el laboratorio, el método estándar de esterilización es el calor: 120ºC
de calor húmedo durante 15 mín, o 160º de calor seco durante al menos 1 h. A
escala industrial el calor seco es excesivamente caro para todos los usos salvo
para algunos casos, por lo que la esterilización por el método húmedo es lo
más empleado habitualmente.
A medida que la escala de operación se incrementa, la esterilización debe ser
más rigurosa, aumentando el tiempo, la temperatura, o ambos, para mantener
la probabilidad de contaminación en 1 por 1.000, lo que resulta generalmente
aceptable.

Cálculo de esterilización: Para saber si es suficiente la caldera con la que

dispongo o el tiempo que va a demorar la esterilización según su capacidad.

Calor a entregar : calor de calentamiento . Volumen . Δt

 Calor a entregar: por la caldera para comparar con la especificación técnica

de esta.
 Calor de calentamiento: no de vaporización porque yo necesito elevar la
temperatura y no que el medio cambie de estado (se asemeja al del agua –
cálculo aproximado)
 Volumen del medio.
 Δt Variación de temperatura que deseo.

Otro método corriente, utilizado para evitar dañar el valor nutritivo del
medio por reacción de caramelización es esterilizar el componente glucídico del
medio por separado y añadirlo al resto de los nutrientes que han sido
esterilizados en el fermentador

Esterilización del fermentador y el medio conjuntamente

Los ingredientes del medio, la “papilla”, se añaden a través de la boca de

acceso de lo alto del recipiente o se bombean a él desde una unidad de mezcla
independiente, reconstituidos en el agua caliente generada por el enfriamiento
de un lote de medio previamente esterilizado. El calentamiento se consigue
mediante:

1 . Inyección de vapor en el medio ( Vapor vivo): Por lo que el medio se

prepara ligeramente concentrado, y se deben controlar rigurosamente los
aditivos de la caldera, es muy eficaz, debido a la liberación de su calor latente
de vaporización .

2. Conducción: El medio se calienta también por conducción , haciendo pasar

vapor por la camisa de termostatización ( y el serpentín , si lo hay).

El agitador debe estar en funcionamiento durante el ciclo completo de

calentamiento, esterilización y enfriamiento para mejorar la transferencia de
calor y evitar que el medio en contacto con las superficies calientes se cueza.
Cuando el medio alcanza los 100 ºC , se cierra la válvula de escape para
120-150ºC, dependiendo de varios factores, entre ellos el tamaño del recipiente
y la estabilidad térmica del medio. El proceso de esterilización ha sido hasta
ahora esencialmente el mismo que en el autoclave de laboratorio pero para
enfriar un fermentador es esencial evitar la formación de vacío en el interior del
recipiente, la razón principal para evitar presiones por debajo de la atmósfera
dentro del fermentador es que el aire no estéril del entorno podría ser atraído a
través de cualquier pequeña fisura en las junturas soldadas del recipiente o las
tuberías o a través de las juntas o válvulas. Es por lo tanto esencial dejar entrar
su suministro de aire estéril al espacio de cabeza por encima del medio tan
pronto como se detenga el aporte de vapor esterilizante. Por la misma razón el
agua de refrigeración suministrada a través de la camisa o serpentín debe ser
estéril.
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El agua calentada se usa para la preparación del siguiente lote de
medio. Finalmente, se añade el inóculo y se ajusta la aireación y
termostatización.

Esterilización por separado del fermentador y el medio

Este sistema ofrece ventajas, ya que reduce el tiempo en el que el

recipiente de fermentación es improductivo. Una caldera, más sencilla y barata,
puede suministrar medio estéril para varios fermentadores sucesivos. Por otra
parte, un fallo en la caldera deja fuera de servicio a todos sus fermentadores y
pueden existir largas líneas de transferencia estéril hasta los fermentadores
más lejanos.
Se suministra vapor al fermentador limpio a través de una válvula
superior y el aire y el condensado se purgan mediante una válvula en el punto
más bajo de la base del fermentador. Cuando el aire y el agua se han extraído
la alta temperatura del vapor puro cierra la válvula, luego se aumenta la presión
para mantener la temperatura a 120-150ºC . El recipiente puede ser enfriado
bajo presión de aire estéril haciendo circular agua fría a través del serpentín o
la camisa, o bien se puede añadir medio estéril enfriado inmediatamente
después de la esterilización del recipiente.
Se puede esterilizar el medio (1) en una caldera del mismo tamaño que
el fermentador o (2) mediante un breve proceso continuo de alta temperatura a
través de un intercambiador de calor.

1. Esterilización del medio en una caldera del mismo tamaño, esterilizar como
se describió anteriormente. La tubería que une la caldera y el fermentador,
se esteriliza introduciendo vapor en cada una de los puntos superiores del
sistema y purgando el aire y el condensado en los puntos inferiores, se
transfiere el medio estéril al fermentador por una combinación de gravedad
y presión del aire estéril. La caldera se encuentra a un nivel más alto que
los fermentadores a los que atiende y la presión de aire estéril en la caldera
se puede subir a, por ejemplo, 2 bar en la caldera y 0,3 bar (sobre la
atmosférica) en el fermentador. Así, la transferencia se realiza sin bombear
medio estéril, una operación a evitar en lo posible.

VAPOR VIVO
Tanque y Medio
CONDUCCIÓN
ESTERILIZACIÓN

Medio por Separado CALDERA = TAMAÑO

CONTINUO
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Fig. 6.4 (a) Esterilización de medio por lotes en recipientes de calefacción

Fig. 6.4 (b) Esterilización continua de medio

Esterilización en continuo: El medio, preparado no estérilmente en un

mezclador, se hace pasar a través de un intercambiador de calor a una
velocidad de flujo tal que esté en contacto con la parte caliente durante el
tiempo suficiente para la esterilización. La bomba requerida para la
transferencia de medio se encuentra en el lado no estéril la esterilización en
continuo exige más tiempo que la transferencia del medio ya esterilizado
desde la caldera al fermentador estéril vacío, pero causa menor deterioro
térmico al medio.

Esterilización de aire

En fermentadores se necesita suministrar aire a velocidades del orden de 0.5

vvm (volumenes de aire por volumen de fermentador por minuto). Utilizar
calentamiento resulta impracticable.

La concentración standard de m.o en el aire es del orden de 103 a 104 mo/m3.

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Los métodos más utilizados para realizar una esterilización del aire son:

• Filtros profundos

• Filtros de membrana (absolutos)

Filtros profundos

Son filtros que se encuentran rellenos de vibra de vidrio que presenta la

ventaja de:
· No se comprimen mucho
· No retienen humedad
· No son combustibles.

El principio de estos filtros es que se produzca un contacto entre los m.o. y la

fibra, este contacto puede ser de diferentes tipos:

Filtros de membrana (absolutos)

Son membranas que tienen un determinado tamaño de poros, pero

resulta prácticamente imposible construir un filtro para aire donde el
tamaño de poros este controlado.

Generalmente oscilan entre 0.5-1.0 m y 0.22-0.45 m.

 Generalmente son de Polivinilalcohol (PVA)

 Las ventajas son:

•gran eficiencia

 Desventajas

•Resultan frágiles y de corta vida

•Las fuentes de aire deben estar libres de aceite.

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Inoculación de fermentadores

En la mayoría de los procesos fermentativos, los microorganismos se

cultivan especialmente para inocularlos en cada fermentación, siendo
desechados al finalizar la misma. La fabricación de cerveza es excepcional a
este respecto, ya que parte de la levadura se reutiliza como inóculo para la
fermentación siguiente. En otras fermentaciones, la inestabilidad genética del
cultivo, el riesgo de propagar la contaminación a sucesivas fermentaciones o la
baja viabilidad de los cultivos al final de la fermentación, impide tal práctica.

El stock de cultivos se mantiene en el laboratorio en forma liofilizada,

congelados por inmersión en nitrógeno líquido, sobre bolitas de sílica gel o
algún otro sistema adecuado para mantener su viabilidad y las propiedades de
utilidad industrial. El inóculo inicial se añade a un volumen relativamente
pequeño de medio, por ejemplo 1 litro en un Kitasato de 2 litros. El cultivo se
multiplica en condiciones óptimas de crecimiento, que no son necesariamente
las mismas que para el desarrollo del producto, y éste finalizará casi con
seguridad en un tiempo de incubación más corto. Se utiliza una pequeña
muestra del litro de cultivo para comprobar que reúne las especificaciones
industriales; el resto se emplea para inocular un fermentador de 20 litros.

Se hacen crecer entonces los cultivos de forma sucesiva, en cantidades

20 veces mayores cada vez, habitualmente el nivel de inoculación en el estado
final es alto, a menudo 1/10 y en algunas plantas hasta 1/5 del volumen del
fermentador, un gran inóculo tiene mayores posibilidades de crecer y dominar a
los contaminantes, a su vez, se reduce el tiempo necesario para completar la
fermentación.

Fig.6.5 Secuencia de inoculación

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Concentración
Microbiana 1

2
tiempo

1 = inóculo grande
2 = inóculo pequeño

Fig.6.6 - Efecto de un inóculo grande (1) o pequeño (2) sobre el tiempo en

que se alcanza la concentración final total de células.