Therapeutics clínicos / volume], Número 2017],

Eletroestimulação induz um aumento de VEGFR2 em

circulação Células-Tronco Hematopoéticas em pacientes com
diabetes

Asa Hidmark, PhD 1 , * ; Ioannis Spanidis 1 , * ; Thomas H. Fleming, PhD 1 , 2 ;

Nadine Volk, PhD 1 ; Volker Eckstein, PhD 3 ; Jan B. Groener, PhD 1 ; Stefan Kopf, PhD 1 ;
Peter P. Nawroth, Prof. Dr. Med, Dr. HC 1 , 2 , 4 , 5 ; e Dimitrios Oikonomou, PhD 1
1 Departamento de Medicina I e Química Clínica, Hospital Universitário de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha; 2 Centro Alemão de

Diabetes Research (DZD), Dusseldorf, Alemanha; 3 Departamento de Medicina V Hematologia, Oncologia e Reumatologia do

Hospital Universitário de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha; 4 Instituto de Diabetes e Câncer IDC Helmholtz de Munique,

Neuherberg, Alemanha; e
5 Joint Heidelberg-IDC Programa de Diabetes Translational, Departamento de Interior Medicina I do Hospital Universitário de Heidelberg,

Heidelberg, Alemanha

ABSTRATO receptor do factor de crescimento 2 (VEGFR2; de fi Ning o HSCs como

objectivo: estimulação eléctrica do músculo externo (EMS) dos
músculos da coxa foi encontrada para reduzir a dor resultante de
neuropatia diabética (DN), uma complicação vasculares da diabetes.
Este estudo investigou circulante células estaminais hematopoiéticas
(HSC) após tratamento EMS. O mau funcionamento de HSCs e as
células progenitoras endoteliais subpopulação (EPCs), importantes
para a neovascularização e reparação endotelial, tem sido associada
com DN.
Métodos: Vinte e quatro pacientes com dolorosa DN foram tratados 3 vezes
EPCs) aumentou em 36% ( P ¼ 0,011) após o tratamento com EMS. As
proteínas necessárias para a ligação ao endotélio (adesão juncional
molécula A e CD31), homing para tecido hipóxico (CXC tipo receptor de
quimiocina 4), e diferenciação endotelial (CD31) foram aumentadas em
HSCs imediatamente após o tratamento com EMS. Também foi observado
um aumento da frequência de expressão na VEGFR2 HSCs de 6
voluntários saudáveis ​de controlo (34%;
P ¼ 0,046) após o tratamento EMS, mas não após tratamento simulado.

com EMS ao longo de um período de 1 semana. As amostras de sangue foram
recolhidas antes e depois da fi tratamento EMS primeiro. Antes de um quarto
tratamento, a dor neuropática foi avaliado e uma terceira amostra de sangue foi
recolhido. As células foram utilizadas para fl ow citometria.
resultados: Os pacientes com dor DN relatado que a dor diminuiu
após 3 vezes de tratamentos de uma hora com EMS (Neuropatia
Symptom Score: a partir de 8-6,
P ¼ 0,001; Neuropatia Disability Pontuação: 5,5-5,
P ¼ 0,027, n ¼ 24). No final do estudo, a pressão sanguínea
diastólica diminuiu 80-70 mm Hg ( P ¼ 0,043), e plasma de
adrenalina e de noradrenalina e metabolitos Metanefrina
Implicações: Três tratamentos EMS diminuição dos sintomas de
dor causada por DN e reduziu a pressão sanguínea diastólica e
biomarcadores do stress. Um único tratamento EMS aumentada
moléculas que medeiam a ligação e diferenciação na superfície de
HSC em circulação. Nós supomos que o aumento induzido por EMS
em moléculas de ligação de superfície sobre o HSCs causou a
HSCs para deixar a circulação e que o tratamento com EMS
melhora a função de HSCs e EPCs in vivo. ( Clin Ther. 2017;]:]]] -]]]) & 2017
autores. Publicado por Elsevier HS Revistas, Inc.
Palavras-chave: células diabetes, neuropatia, dor, estaminais.

normetanefrina foram reduzidas (tanto P r 0,01; n ¼ 21). Um único

tratamento EMS causou um decréscimo imediato e transiente na
frequência de células CD34 º HSCs em circulação ( - 20%;
Aceite para publicação 9 de maio de 2017.

http://dx.doi.org/10.1016/j.clinthera.2017.05.340
P o 0,001; n ¼ 27). Em 9 dos pacientes com ND, a proporção de
0149-2918 / $ - ver a matéria frente
HSCs expressando endotelial vascular
& 2017 autores. Publicado por Elsevier SH Revistas, Inc. Este é um artigo de acesso aberto
sob a CC BY-NC-ND licença ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).
*
Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.

] 2017 1
 Therapeutics clínicos
INTRODUÇÃO
neuropatia diabética sensorial (DN) é uma complicação tardia comum
de diabetes, causando perda de sensibilidade ou dor neuropática em
aproximadamente 30% das pessoas com diabetes, tornando DN uma
das complicações mais comuns de diabetes. 1 as estratégias
para
tratamento e prevenção de DN, incluindo a redução de glicose no
sangue, foram encontrados para ser INEF fi ciente, particularmente
para pacientes com diabetes tipo 2. 2 DN é uma doença microvascular,
e há evidências de danos acumulados do endotélio vascular durante a
diabetes, causada pela combinação de espécies de oxigénio
reactivas, 3 em fl amação, 4 e metabólitos tóxicos que são aumentadas
na condição diabética. 5 Defeitos nos mecanismos de reparação
endoteliais também podem contribuir para o desenvolvimento de
ambos complicações microvasculares e macrovasculares do diabetes.
Um número baixo de medula óssea - derivada, CD34 circulante º as
células-tronco hematopoiéticas (HSCs) foi classificado como um factor
de risco de complicações cardiovasculares. 6 A diabetes tem sido
relatado para ser associado com a função prejudicada e um número
reduzido de HSCs circulantes. 7 - 12 A frequência mais baixa de HSC em
pessoas com diabetes tem sido associada a um risco mais elevado de
progresso e gravidade das complicações vasculares diabéticas,
incluindo DN 8 , 13 , 14 e feridas do pé diabético. 15 - 18 Diferentes tipos de
HSCs têm sido usados ​com sucesso para tratar modelos animais
diabéticos do DN. 19 - 23
externo (EMS) dos músculos da coxa leva à dor reduzida nos pacientes
HSCs podem diferenciar em hepatócitos, células epiteliais, 24 cardiomiócitos,
células musculares lisas, ou células endoteliais. 25 A diferenciação em
células endoteliais está associada com a sobre-regulação do receptor
do factor de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2; KDR), após
o que o HSC são consideradas células progenitoras endoteliais
(CPE). 26 , 27 A importância de EPCs para a saúde cardiovascular em
diabetes foi recentemente revisto em outro lugar. 27 Os pacientes com
diabetes tipo 1 ou tipo 2 têm sido relatados para ter números EPC
reduzidas. 10 , 28 , 29 Transferir EPCs pode regenerar os vasos em
modelos animais com doenças vasculares, 30
por causa da capacidade de CPE para incorporar em endotélio
hipóxica e a participar na reparação do navio. 31 hipóxia
conduz a estabilização da
fatores de transcrição, induzindo a expressão de
factor derivado do estroma-(SDF) -1 a partir do endotélio hipóxico,
que se liga CXC tipo receptor de quimiocina 4 (CXCR4) sobre a
superfície do EPC, levando a uma adesão a células endoteliais e
de novos vasos
2 Número do volume ]
formação. 32 Na diabetes, EPCs circulantes foram encontrados
falta um su fi cient capacidade de resposta para
hipóxia. 12 , 33 , 34
Outra molécula controlar HSC adesão ao endotélio é a
molécula de adesão de junção A (JAM-A). 35 - 38 JAM-A tem dois
domínios immunoglobulinlike e está localizada na junção
apertado entre as células endoteliais, 39 onde homodímeros se
ligam JAM-A sobre a superfície das células vizinhas. 40 Ligado no fl amação,
JAM-A é distribuído para a superfície do endotélio, que está
virado para a corrente sanguínea e liga-se em fi ltrating células. 41 Verificou-se
que JAM-A medeia a ligação de HSC no fl amed endotélio
shearstressed, com diferenciação em CEPs in vitro e
re-endotelização in vivo. 35 Expressão de JAM-A na HSCs,
portanto, fornece uma capacidade hypoxiaindependent destas
células para aderir a fl endotélio amed.
molécula de adesão celular endotelial plaquetária, CD31, é
expresso na superfície de células endoteliais e várias células
hematopoiéticas. CD31 medeia a adesão entre as células
endoteliais adjacentes e entre o endotélio e leucócitos e apoia a
transmigração endotelial de HSC. 42 Kim et al 43 , 44 sugeriram que a
CD31 º células de melhorar as actividades de formação de vasos de
HSC por meio de vários mecanismos diferentes, para além de ser
apenas um marcador de diferenciação endotelial.
Verificou-se anteriormente que a estimulação do músculo eléctrico
que experimentam dolorosa DN. 45
O objetivo deste estudo foi prospectivo, para determinar os
mecanismos possíveis subjacentes para a melhoria dos sintomas
neuropáticos após o tratamento EMS. Porque baixos números de
HSCs estão associados com DN, foi colocada a hipótese de que
a diminuição dos sintomas dolorosos de DN foi devido a uma
melhoria das funções de reparação endoteliais por HSCs. Um
protocolo de 4 tratamentos EMS foi realizada durante 2 semanas,
e os números de HSC foram ensaiados imediatamente antes e
após um tratamento inicial com EMS e novamente antes do
último tratamento. Verificou-se que o tratamento EMS de
pacientes com diabetes causou um rápido desaparecimento, mas
transitória de HSCs de circulação. Esta observação sugere que
EMS tinha afetado a capacidade do HSC para anexar à parede
endotelial.

Assim, EMS teve um efeito imediato sobre marcadores de superfície em
HSCs, relacionadas com a função de HSC em pacientes com diabetes.
Os participantes PACIENTES E
MÉTODOS Estudo
Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de
Helsinki. O protocolo do estudo foi aprovado pela Universidade de
Heidelberg ' s Comissão de Ética (número S-107/2014), e todos os
participantes assinaram consentimento informado para participar no
estudo. Vinte e oito do tipo 1 e 2 pacientes diabéticos com dolorosa
DN foram incluídos (ver Tabela I para as características dos em uma escala de 0 (sem dor) a 10 (pior dor possível). Neuropatia
participantes). Os pacientes com marca-passo ou de implantado fi brillator sintoma de pontuação foi avaliada antes da fi tratamento primeira e
ou outras causas comuns de neuropatia (ou seja, abuso de álcool,
doença arterial periférica, tumores, ou medicamentos causadores de
neuropatia) foram excluídos do estudo. voluntários saudáveis ​(5
homens e 4 mulheres, 23 - 40 anos de idade, sem condições médicas
gravados, um índice de massa corporal o 25), que relatou o exercício
físico regular, recebeu um tratamento. O desenho do estudo foi
prospectivo e descontrolada.
Protocolo de Tratamento EMS
O tratamento consistiu de quatro tratamentos de 60 minutos com
estimulação eléctrica externa de alta frequência dos músculos da coxa
(referidas como EMS) de ambas as pernas utilizando o HiTop184 (GBO
Medizintechnik, Rimbach, Alemanha), como descrito anteriormente. 45 EMS
foi realizada duas vezes por semana ao longo de um período de 2 semanas
entre 8 e 9 SOU, enquanto que o paciente estava em jejum, com, pelo menos,
2 dias entre cada tratamento. Para os pacientes com diabetes, uma
avaliação clínica foi realizada, e o sangue foi tirado directamente antes da fi EMS Citometria de fluxo
primeiro (linha de base), imediatamente depois de a fi primeiro EMS, e antes
da quarta EMS. As amostras de sangue da linha de base e antes da quarta
tratamento EMS foram avaliadas para alterações nos parâmetros clínicos,
tal como descrito abaixo. voluntários saudáveis ​de controle recebeu apenas
o fi EMS primeiro, de acordo com o mesmo protocolo de tratamento que os
pacientes com diabetes, mas não as amostras de sangue foram tomadas
para a avaliação dos parâmetros clínicos. Todas as amostras de sangue
colhidas a partir de voluntários saudáveis ​de controlo e pacientes com
diabetes foram analisados ​por fl ow citometria.
] 2017
A. Hidmark et al.
parâmetros laboratoriais
Análise de glucose no sangue (armazenado no sio fl uoride),
hemoglobina glicosilada (HbA 1c), HDL, LDL, triglicéridos, creatinina,
metanefrina, normetanefrina, contagem de sangue completo,
albumina na urina, e creatinina foi realizado no laboratório central
na Clínica Universidade de Heidelberg antes da fi EMS primeiro e
antes da quarta EMS.
Grading de neuropáticas Sintomas
Os sintomas neuropáticos foram avaliados usando o Score
Neuropatia Sintoma e neuropatia Disability Score. 46 Para a escala
numérica, os participantes foram solicitados a classificar a sua dor
antes da quarta tratamento ( figura 1 ).
Isolamento de PBMC
As amostras de sangue (9 ml) a partir de tubos de EDTA antes e após o fi primeiro
tratamento de 1 hora foram imediatamente armazenadas a 4 1 C e as células
mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram separadas, dentro de 2
horas da
fi amostra primeiro desenhada, usando Biocoll 1,077 g / mL (Merck
Millipore, Darmstadt, Alemanha) de acordo com o fabricante ' s protocolo.
Após separação, as células foram mantidas em gelo, lavadas duas vezes
em solução salina gelada, foram novamente suspensas em fl -Fluorescência
de células activadas (FACS) tampão (solução salina tamponada com
fosfato contendo soro fetal de vitelo a 10% e EDTA 1 mM), e contadas
(usando um analisador de dif COULTER ACT; Beckman Coulter, Krefeld,
Alemanha). As células (10 7) de cada amostra foram coradas com
anticorpos para fl ow citometria.
As PBMCs de todos os participantes do estudo foram incubadas
em gelo com um anticorpo contra CD34- ficoeritrina (PE). PBMC de
um subconjunto de 9 pacientes com diabetes e 6 voluntários
saudáveis ​de controlo também foram coradas com CD184-APC
(CXCR4), CD31-BrilliantViolet, CD309-PE / Cy7 (VEGFR2), JAM-A - FITC,
ou respectivos controlos de isotipo em tampão de SCAF. Todos os
anticorpos eram do BioLegend (San Diego, Califórnia) e foram
utilizadas em concentrações de acordo com o fabricante ' s instruções,
e coloração foi realizada no prazo de 30 minutos de isolamento de
PBMCs. A citometria de fluxo foi realizada no mesmo dia em ambos
os BD LSR FACS II ou FACS Aria II SORP usando diva
3
 Therapeutics clínicos

Tabela I. Características dos pacientes com diabetes e os valores para os parâmetros clínicos na linha de base (antes de
primeira EMS) e no final do estudo (antes quarta EMS).

Variável Antes da primeira EMS Antes Fourth EMS P* não.

Idade, y 70,5 (15)

Sex, não.

Fêmea 12
Masculino 16
Diabetes, não.
Tipo 1 4
Tipo 2 24
Anos desde o diagnóstico inicial 14,5 (13)
índice de massa corporal, kg / m 2 31,9 (7,1) 32,3 (6,5) NS 22
glucose em jejum, mg / dL 142,0 (124) 134,0 (92) NS 24
HbA 1c NS 24
% 7.1 7.1
mmol / mol 54 54
TFG, mL / min 79,1 (25,1) 76,6 (21,2) NS 24
Neuropatia Symptom Score 8 (3) 6 (4) 0,001 24
Neuropatia Disability Pontuação 5,5 (4) 5,0 (4) 0,027 24
Dor (NRS verbal) 6 (4) 4 (3) 0,026 18
A pressão arterial diastólica, mm Hg 80 (15) 70 (16) 0,043 21
Triglicéridos, mg / dL 122,5 (89) 146,5 (117) NS 24
HDL, mg / dL 49,5 (28) 47,0 (27) NS 24
LDL, mg / dL 101 (41) 99 (36) 0,033 23
Metanefrina, pg / mL 34,3 (14,4) 28,0 (18,6) 0,006 24
Normetanefrina, pg / mL 71,6 (48,6) 52,5 (32,2) 0,007 24
Albumina (urina), mg / l 26,1 (60,1) 20,2 (30,7) NS 23

Os valores são a mediana (IQR; quartil 3 - quartil 1, ou seja, a gama dentro da qual 50% dos valores encontrados são). EMS ¼ estimulação eléctrica do músculo; GFR ¼ glomerular
fi taxa de filtração; HbA 1c ¼ hemoglobina glicosilada; NRS ¼ escala de classificação numérica.

*
análise de erro estatística foi realizada com o teste-rank assinado 2 caudas de Wilcoxon.

software (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New
Jersey). Citômetro Setup & Kit Rastreamento Beads (Becton,
Dickinson and Company) foi utilizada antes de cada análise, de
acordo com o fabricante ' s instruções.
tomada antes do quarto tratamento EMS, se necessário. Foi ajustado para
compensação fi t os três pontos de tempo para cada participante do estudo,
baseado em manchas individuais feitas em cada fl ow sessão de citometria.
EPCs foram de fi definido como CD34 º VEGFR2 º. 27 Pelo menos 5 10 6 leucócitos
foram registados por amostra.

Análise de citometria de fluxo

configurações de tensão detector de citometria de fluxo foram mantidos
constantes ao longo dos experimentos. As amostras antes e depois do fi tratamentos
de primeira EMS foram coradas em paralelo, utilizando a mesma mistura
principal de anticorpos e analisados ​consecutivamente na mesma sessão,
utilizando as mesmas portas, portões e foram ajustadas para a amostra
Análise estatística
GraphPad Prism versão 6.05 para Macintosh (GraphPad Software,
San Diego, Califórnia) foi utilizado para visualizar os dados
experimentais e para calcular a variação. Discrepantes (4
gama interquartil) foram incluídos
em todas as análises estatísticas, mas excluídas de alguns

4 Número do volume ]
 A. Hidmark et al.

UMA B

Frequência de HSC no sangue

10 5
CD34 F5C
P = 0,089
0,072
0.20
diabetes
P = 0,007 P = 0,304
Controle de

% Células CD34 + de PBMC

10 4 0,15
CD34-PE

0,10

10 3
0,05

0.00
10 2
antes de 1 de st EMS antes de 4 º EMS
0 50K 100K 150K 200K 250K

FCS

C D
mudança de frequência HSC após 1 st EMS Mudança no MFI de CD34 no HSC
P = 0,015
P = 0,001

P = 0,015
% mudança

30
% mudança

50

20
- 50 0

0 10

- 100
- 10
Ao controle Diabetes
após 1 st EMS

Figura 1. EMS tratamento resultou numa redução imediata e transiente na frequência de HSC no sangue.
(A) Representante fluxo de citometria de gráfico de pontos de CD34 º HSCs em leucócitos versus dispersão frontal (FSC). (B) A
frequência de HSC em leucócitos circulantes em 9 voluntários saudáveis ​de controlo (caixas brancas) e em pacientes com diabetes
(círculos pretos), antes do primeiro tratamento EMS (n ¼ 27) e em pacientes com diabetes antes do quarto tratamento de EMS (n ¼ 22).
(Análise de erro estatística foi realizada com 2-tailed Mann-Whitney você teste.) (C) Alterações na frequência das HSCs entre as
amostras tiradas imediatamente antes e após o primeiro tratamento de EMS 9 voluntários saudáveis ​de controlo (caixas brancas) e 27
pacientes com diabetes (caixa cinzenta). (D) alteração na média da intensidade de fluorescência (IMF) de CD34 em HSCs de pacientes
com diabetes após o primeiro tratamento EMS (n ¼ 27). Caixas indicam 25 a percentil 75, bigodes indicam 5º ao percentil 95, e a linha
indica mediano. análise de erro estatística foi realizada com o teste-rank assinado 2 caudas de Wilcoxon. EMS ¼ estimulação eléctrica
do músculo; HSC ¼ células-tronco hematopoiéticas; PBMC ¼ células mononucleares do sangue periférico; PE ¼

ficoeritrina.

gráficos de acordo com a fi lendas Gure (exclusão ou inclusão outlier não utilizando o teste não paramétrico de Spearman ' s ρ modelo de correlações
alterar signi estatística fi Cances). IBM SPSS Statistics versão 22 (IBM Inc, bivariadas.
Armonk, Nova York) foi utilizado para análise estatística. Mudanças ao
longo do tempo foram calculados utilizando 2 caudas Wilcoxon ' teste s
signedrank para amostras emparelhadas. Bicaudal de Mann-Whitney você teste RESULTADOS
foi utilizado para a comparação das amostras não emparelhadas para Dos 28 participantes do estudo com dolorosa DN recrutados, 24
analisar as diferenças entre o controlo e o grupo diabético. As correlações completaram os quatro tratamentos EMS, e 23 dos pacientes exibiu
foram analisadas uma melhoria em pelo menos uma medida de sintomas
neuropáticos ( Tabela I ).

] 2017 5
 Therapeutics clínicos

UMA B
105
Frequência CXCR4 + de HSC

P = 0,028

104
JAM-A-FITC

P = 0,767

% mudança
100

103

0 50

102 - 50

101 102 103 104 105 após 1 st EMS antes de 4 º EMS

CXCR4-APC

C
Frequência JAM-A + do HSC
D
Frequência CD31 + de HSC
P = 0,635
P = 0,021
350
300 P = 0,594
150
250
P = 0,021
% mudança
% mudança

100 200
150
0 50
100
0 50
- 50
- 50

- 100 - 100

após 1 st EMS antes de 4 º EMS após 1 st EMS antes de 4 º EMS

Figura 2. JAM-A e CXCR4 foram regulados positivamente na superfície de HSC em circulação após o tratamento de EMS
pacientes com diabetes. (A) representativas de citometria de fluxo de gráfico de pontos de JAM-A e CXCR4 em HSCs em PBMC. foi
calculada a percentagem de variação entre o valor de linha de base (antes da primeira EMS) e depois primeiro EMS (caixas brancas)
ou antes da quarta EMS (caixas cinzentas): alteração na frequência de HSCs expressando (B) CXCR4, (C) JAM-A (1 outlier
excluídos do tratamento após a primeira e quarta antes tratamento) ou D), CD31 (. n ¼ 9. Caixas indicam 25 a percentil 75, bigodes
indicam 5º ao percentil 95, e linha indica mediano. análise de erro estatística foi realizada com o teste-rank assinado 2 caudas de
Wilcoxon. APC ¼ aloficocianina; CXCR4 ¼ CXC tipo receptor de quimiocina 4; EMS ¼ estimulação eléctrica do músculo; FITC ¼ fl
uorescein isotiocianato; HSC ¼ células-tronco hematopoiéticas; JAM-A ¼ adesão juncional molécula A; PBMC ¼ células
mononucleares do sangue periférico.

Os únicos efeitos colaterais reportados foram dor muscular, 1 a 2 dias
após o tratamento EMS; dos doentes tratados, 5 relatada dor muscular com
a gravidade dos sintomas como leve. Sem signi fi alterações cativas foram
encontrados no metabolismo de glucose (tal como medido por HbA 1c e
glucose em jejum), a função renal (como medido pelos níveis de
creatinina), ou quaisquer parâmetros no hemograma completo. No entanto,
a pressão sanguínea diastólica diminuiu signi fi cativamente entre linha de
base (antes fi primeiro EMS) e antes da quarta tratamento EMS ( P ¼ 0,043),
assim como
os níveis de adrenalina e noradrenalina (metabolitos metanefrina P
¼ 0,006) e normetanefrina ( P ¼
0,007) no plasma ( Tabela I ). A análise de correlação Bivariada revelou
uma correlação inversa entre os participantes ' idade e sua glomerular fi
taxa de filtração ( ρ ¼ - 0,58, P ¼ 0,001). A idade dos participantes
correlacionados com os níveis de glicose em jejum ( ρ ¼ 0.394,
P ¼ 0,042). Nem a capacidade antioxidante do plasma (ver
Suplementar Figura 1A na versão on-line em
http://dx.doi.org/10.1016/j.clinthera.2017.05.340 )

6 Número do volume ]
 A. Hidmark et al.

UMA B
EPC frequência de HSC
Frequência VEGFR2 + de CXCR4 + HSC
P = 0,011 P = 0,441
P = 0,008 P = 0,859

100
50
% mudança

% mudança
0 50 25

- 25 0
- 50

- 50
- 100

- 75
após 1 st EMS antes de 4 º EMS

após 1 st EMS antes de 4 º EMS

C D
MFI CD31 em EPC
Tamanho (FSC) de EPC

300 P = 0,028

P = 0,038
200
P = 0,678
% De mudança 30 P = 0,028
de alteração%

100
20

0
0 10

- 100 - 10

após 1 st EMS antes de 4 º EMS após 1 st EMS antes de 4 º EMS

Figura 3. Os marcadores funcionais da activação do EPC foram aumentados em HSCs em pacientes tratados com EMS com
diabetes. As percentagens de variação foram calculados entre as amostras tiradas imediatamente antes e após o primeiro
tratamento EMS (quadrados brancos) ou antes do quarto tratamento EMS (caixas cinzentas). (A) Alteração na frequência de HSCs
expressando VEGFR2 (isto é, a frequência de CPE; um outlier excluída antes do quarto tratamento). (B) Modificação na frequência
de VEGFR2 º em CXCR4 º HSCs. (C) Alterações na intensidade média de fluorescência (IMF) de CD31 em CEPs. (D) Mudança em
tamanho, como medidas por dispers frontal (FSC) de EPCs. n ¼ 9. Caixas indicam 25 a percentil 75, bigodes indicam 5º ao percentil
95, e linha indica mediano. análise de erro estatística foi realizada com o teste-rank assinado 2 caudas de Wilcoxon. CXCR4 ¼ CXC
tipo receptor de quimiocina 4; EMS ¼ estimulação eléctrica do músculo; EPC ¼ células progenitoras endoteliais; HSC ¼ células-tronco
hematopoiéticas; VEGFR2 ¼

vascular receptor do factor de crescimento endotelial 2.

nem a concentração de metilglioxal mudado signi fi cativamente
durante o período de estudo (ver Suplementar Figura 1B na versão
online).
Antes de o fi tratamento primeira EMS, uma média de
0,55% (25 - percentil 75, 0,40% - 0,64%) de PBMCs CD34 expresso
sobre a sua superfície no sangue de pacientes com diabetes, uma signi fi
cativamente frequência menor do que o que foi encontrado em 9 mais
jovens, voluntários saudáveis ​de controle ( P ¼ 0,007) ( Figura 1A e B ).
Embora não signi fi diferença signifi foi encontrado entre as
frequências HSC circulação no início e no
o final do estudo ( A Figura 1B ), a fi EMS primeiro tratamento causou
um signi fi escala e diminuição transitória na frequência de HSCs
circulante tanto em pacientes com diabetes ( P ¼ 0,001) e em
voluntários saudáveis ​de controlo ( P ¼ 0,015) ( Figura 1C ). Depois de fi tratamento
primeira EMS, a frequência foi reduzida para HSC
0,45% (25 de - percentil 75, 0,28% - 0,45%) em pacientes com
diabetes. Significar fl uorescência intensidade (MFI) de CD34 nas
HSCs restantes foi signi fi cativamente superior ( P ¼ 0,015)
directamente após o
fi tratamento primeira EMS ( Figura 1D ).

] 2017 7
 Therapeutics clínicos
100
P = 0,463 P = 0,046
80
% De EPC HSC
60
40
20
0
antes depois depois
Sham Sham EMS
1 h Sham 1 H EMS
Figura 4. tratamento EMS, mas não sham trata-
ment, causou um aumento da frequência de EPCs
entre os HSCs. Seis dos voluntios saudeis foram
recrutados para receber um tratamento simulado de
acordo com o protocolo padrão para o EMS. O
sangue foi coletado antes farsa, depois de farsa, e
após os tratamentos EMS. células vermelhas do
sangue foram lisadas, e leucócitos foram
imediatamente coradas com anti-CD34 e
anti-VEGFR2. Caixas indicam 25 a percentil 75,
bigodes indicam 5º ao percentil 95, e linha indica
mediano. análise de erro estatística foi realizada
com o teste-rank assinado 2 caudas de Wilcoxon.
EMS ¼ estimulação eléctrica do músculo; EPC ¼ células
progenitoras endoteliais; HSC ¼ células-tronco
hematopoiéticas; VEGFR2 ¼ vascular receptor do
factor de crescimento endotelial 2.
Supõe-se que o EMS aumento da adesão ao endotélio dos
vasos do mais diferenciado (CD34 baixo) HSCs, explicando tanto a
redução em HSCs circulantes e o aumento da expressão de
CD34 das HSCs restantes. Para investigar se EMS causou um
aumento em moléculas que medeiam a ligação às paredes dos
vasos, a expressão de receptores para homing (CXCR4), adesão
(JAM-A), e a adesão e diferenciação (CD31) na superfície do
HSCs foi medida em 9 de os pacientes com diabetes ( Figura 2 ). Anteseléctrodos sem corrente, uma amostra foi retirada, e depois eles foram
de o fi tratamento EMS primeira, uma média de 15,2% do HSCs
expressa CXCR4 (25 - percentil 75, 6,6% - 21,6%), 5,6%, expresso
JAM-A
8 Número do volume ]
(25 de - percentil 75, 1,6% - 12,9%), e 4,6% expressa CD31 (25 - percentil
75, 0,8% - 11,95%). Expressão de CXCR4 e JAM-A foram
principalmente sobreposição ( Figura 2A ). As frequências de HSCs
que expressam o CXCR4 ( P ¼ 0,028), JAM-A ( P ¼
0,021), ou CD31 ( P ¼ 0,021) foram signi fi cativamente aumentada
directamente após tratamento EMS ( A Figura 2B, C , e D ). Além disso, as
expressões JAM-A e CD31 superficiais sobre a população de CEH, tal
como medido por IMF, foram signi fi cativamente aumentada ( P ¼ 0,008 e P
¼
0,011, respectivamente) (ver Suplementar Figuras 2A e
B na versão online). CD31 MFI especi fi camente nas subpopulações
de HSCs expressam CXCR4 ou JAMA também foi aumentada (ver Suplementar
Figura 2C e
D na versão online). VEGFR2, um marcador de diferenciação em
HSCs, de fi Ning da célula como um EPC, 26 , 27 foi também aumentado
na superfície de HSCs após o fi tratamento primeira EMS ( Figura 3A ).
Antes de o
fi tratamento primeiro uma mediana de 7,5% do CD34 º HSCs
expressa VEGFR2 (25 - percentil 75, 5,3% -
13,3%), e depois do tratamento a frequência de HSCs expressando
VEGFR2 aumentou signi fi cativamente ( P ¼
0,011) para 8,5% (25 - percentil 75, 7,0% -
22,8%). A frequência de VEGFR2 º na população
CXCR4expressing HSC, capaz de homing para tecido hipóxico,
também foi aumentada por EMS ( P ¼
0,008) ( A Figura 3B ). MFI de CD31 foi aumentada sobre as EPCs após o fi
tratamento primeira EMS ( P ¼ 0,038) ( Figura 3C ), como uma medida da
diferenciação EPC. Apesar de todas as outras alterações foram
observadas apenas imediatamente após a fi tratamento primeira EMS, um
alargamento dos EPCs permaneceu signi fi não pode ( P ¼
0,028) também antes do quarto tratamento de EMS ( Figura 3D ).
Para investigar se o aumento da frequência de EPC na população HSC
foi especi fi c a EMS, 6 dos voluntários de controlo saudáveis ​recrutados a
partir de experiências anteriores ( Figura 2 ) foram submetidos a um
tratamento simulado (um cálculo de energia com base nos resultados em Figura
3
indicaram que 6 os participantes tratados proporcionaria um poder de
80% para uma signi fi aumento de escala de VEGFR2 na superfície de
HSCs). Durante uma hora os participantes do teste sentou ainda com
imediatamente tratados com EMS. A signi fi chanfra aumento da
frequência de EPCs entre o HSCs foi observado após o tratamento
EMS ( P ¼ 0,046), mas não depois de tratamento simulado ( P ¼ 0,463)
( Figura 4 ).

DISCUSSÃO
Em um estudo observacional anterior foi relatado que EMS pode
diminuir os sintomas neuropática em doentes com DN. 45 Embora
não seja possível a realização de um estudo cego controlo do
tratamento por causa da natureza da EMS, o que teria sido
necessário para avaliar a observação anterior, os pacientes que
sofrem DN têm continuado a ser tratados com EMS. Neste estudo
prospectivo, que teve como objetivo investigar as mudanças em
diferentes fatores relacionados com a melhoria dos sintomas de dor
de DN, verificou-se que EMS também causou uma redução de
HSCs em circulação. Esta redução de HSC na circulação apenas
foi observada imediatamente após o tratamento em ambos os
pacientes com diabetes e voluntários saudáveis ​de controle.
Embora evidência directa para indicar que estão HSCs sair da
circulação ligando-se a parede do vaso que falta, verificou-se que
as moléculas necessário para homing, adesão, e diferenciação são
aumentadas por EMS em HSCs de doentes com diabetes. EMS
causou um aumento na proporção de HSCs expressando VEGFR2,
o marcador para EPCs, tanto em doentes com diabetes e em um
pequeno grupo de voluntários jovens, saudáveis ​de controle. Este
aumento foi observado especi fi camente após o tratamento EMS e
não depois de um tratamento simulado.
CD34 é um marcador de actividade progenitora, que se perde em
diferenciação. 47 Supõe-se que a maior MFI de CD34 observada no
HSCs que permanece em circulação após EMS pode re fl ect que CD34
principalmente mais diferenciada baixo HSCs tinha deixado a circulação. A
possibilidade de que o EMS provoca um bloqueio da libertação de HSC
a partir da medula óssea em circulação também foi considerado. No
entanto, o intervalo de uma hora entre o antes e depois de EMS seria
demasiado curto intervalo de tempo para uma restrição da libertação de
HSC a partir da medula óssea a ser evidente, assumindo que a
meia-vida de HSC em circulação é de cerca de 14 horas. 48
Aumentos de VEGFR2 e CD31 sobre a HSCs que permanece em
circulação indicaram que o tratamento EMS tinha tornado estas
células mais capazes de se diferenciarem em células endoteliais.
Além disso, o tamanho da CPE foi aumentada, uma indicação
independente de diferenciação do EPC. 49 O aumento do tamanho do
CPE foi a única signi fi a mudança de escala para o HSCs ainda
observado antes do quarto tratamento de EMS ( P ¼
0,028). Indução de moléculas essenciais para homing, adesão, diferenciação
e sobre HSCs foram encontrados para ser estritamente transiente neste
estudo. Isto não é surpreendente,
] 2017
A. Hidmark et al.
porque a sobre-regulação destas moléculas, directa ou indirectamente
conferem ligação ao endotélio dos vasos e diferenciação adicional, 35 causando
extravasamento das células. O aumento em CXCR4 na superfície de
HSC dos pacientes com diabetes indicaram que estas células
tornaram-se mais capazes de neovascularização, em resposta a um
gradiente de SDF-1 induzida por hipoxia, 32
possivelmente contrariando os defeitos de HSCs de indivíduos
diabéticos. 10 , 12 Em particular, o CXCR4 º HSC exibiram um aumento da
frequência de expressão de VEGFR2. O observada sobre-regulação
de JAM-A também pode indicar que o HSCs de pacientes diabéticos
são mais capazes de se ligarem a em fl endotélio amed. 35
A redução da frequência de HSC em circulação era transitório, o
que é importante, porque uma frequência reduzida de HSCs tem
sido associada com complicações da diabetes. 13 Embora a
frequência de linha de base de HSC no sangue de pacientes com
ND foi signi fi cativamente
mais baixo do que a de o controle
participantes ( P ¼ 0,007), a frequência de HSC não foi signi fi cativamente
diferente da linha base dos participantes de controlo, quando medido
antes da quarta tratamento EMS ( P ¼ 0,089). Embora as alterações na
expressão de marcadores de superfície são indicadores de alterações
na biologia HSC, ensaios funcionais in vitro são necessários para
determinar em que medida EMS afecta a capacidade do HSC de se
diferenciar em tecido vascular.
Não houve evidência de que as alterações observadas em sintomas
de neuropatia e activação HSC foram directamente relacionada; não
houvesse signi fi correlações cativas entre os dados clínicos e as
alterações observadas na população de CEH. Esta falta de correlação
pode ser devido ao pequeno número de participantes analisados ​para a
diferenciação de HSC (n ¼ 9) e que a activação HSC podem não ser
igualmente bene fi cial para todos os tipos de dolorosa DN. o bene fi cial
efeito do tratamento EMS em sintomas de DN não era devido a
alterações no plasma ou metilglioxal capacidade antioxidante, ambos
os quais têm sido noticiados como sendo mediadores da dor e DN. 50 - 53 Nem
EMS fornecer qualquer efeito de curto prazo sobre o metabolismo da
glicose ou função renal.
As pontuações para os sintomas neuropática utilizados neste
estudo são subjetivos; no entanto, o tratamento EMS também foi
observado para diminuir a pressão sanguínea diastólica e as
concentrações plasmáticas de metanefrina e normetanefrina,
metabolitos de adrenalina e noradrenalina, respectivamente. Uma
diminuição nos parâmetros de stress poderia ser uma consequência
directa do alívio da dor e sintomas neuropáticos. a reduzida
9
 Therapeutics clínicos
Os níveis plasmáticos de normetanefrina poderia ser a causa da
pressão arterial diastólica reduzida, que poderia também ser um
resultado da neovascularizao; No entanto, mais estudos seriam
necessários para validar esta
fi nding.
Existem várias possibilidades para o mecanismo de maturação
induzida por EMS em HSCs, tais como a geração de um local de
ambiente isquémico / hipóxico
através de um aumento do consumo de oxigénio no músculo contrair.
Foram encontradas condições hipóxicas para melhorar a capacidade
das células estaminais para se diferenciarem em CEPs in vitro. 54 No
entanto, HSCs de indivíduos com diabetes têm uma capacidade
diminuída para responder à hipóxia. 12 Também é improvável que a
hipóxia local do coxa faria com que os efeitos observados em HSCs
circulantes, porque factor indutível por hipoxia 1- α é rapidamente
degradada 32 como HSCs re-entrar na circulação normóxica. É também
possível que o EMS provoca a libertação de irisine, um Myokine
induzida por exercício, que foi recentemente relatado para aumentar a
migração e proliferação de CPE em ratinhos. 55
Um mecanismo plausível seria que a maturação de HSCs é tensão
regulada. HSCs foram encontrados para expressar ARNm para
dependentes da voltagem dos canais de potássio Kv1.3, Kv7.1, 56 e Kv2.1, 57 tornando
estas células responsivas ao EF de potássio dependentes da voltagem fl UX,
o que resulta em cálcio em fl UX. 58 correntes pulsadas eléctricos activar
homing de CPE e outras células progenitoras para o local da lesão in vivo
e, assim, aumentar a perfusão e unidade de regeneração do tecido
danificado por hipoxia. 59 Um mecanismo para a activação de células
estaminais dependentes da voltagem permitiria a especificação fi c activação
de células circulantes, que passa através do coração num contexto
fisiológico, mas não o reservatório de células estaminais divisão na medula
óssea. as células estaminais mesenquimais (MSCs) são também
conhecidos para responder aos estímulos eléctricos, resultando na
activação e suporte de geração do nervo. 59 , 60 JAMA foi encontrado
recentemente para promover MSC homing de e secreção de citocinas de
cicatrização em feridas de pele de murino. 61 São necessários mais estudos
para determinar se a regulação de JAM-A em resposta a EMS no MSC é
semelhante ao de HSC.
Para o melhor de nosso conhecimento, este é o fi estudo primeira
sugerindo que o EMS pode ser um ef fi ciente e método não invasivo
para a activação in vivo de hsc em indivíduos com diabetes. No
entanto, por causa do tamanho pequeno são necessários novos
experimentos, incluindo repetições independentes, para validar
realmente o potencial de EMS para ativar HSCs. No entanto, o nosso
10
fi nding indica que o EMS ativa as capacidades migratórias das HSCs
estáveis ​de participantes saudáveis, 62 independentemente de lesões
dos vasos e é suf fi caz para o extravasamento. O tratamento está a
actuar rapidamente, bem tolerada, e barata. Embora a melhoria de
sintomas de neuropatia e a activação de HSC pode ser puramente
uma coincidência, a capacidade de activar células estaminais in vivo
em pacientes com diabetes pode ser de valor para outras
complicações vasculares da diabetes, tais como doenças
cardiovasculares. Se a activação de células-tronco EMS-mediada
também se aplica para as MSCs, este tratamento pode ser beneficiar fi cial
para promover a cicatrização de feridas diabéticas pé, que é
atualmente sob investigação. EMS tratamento, em combinação com
estratégias para aumentar os números circulantes de HSCs, pode ser
uma estratégia para melhorar a ef fi eficiência de terapias com
células-tronco em indivíduos com diabetes ou com complicações
cardiovasculares.
tratamento EMS foi relatado para ser um tratamento eficaz para
aliviar os sintomas de DN. Neste estudo, relatam que aumenta a
proporção de HSCs expressando VEGFR2 e outros marcadores
funcionais. Nós supomos que o tratamento com EMS melhora a
função de HSCs, que promove a regeneração de tecido e reduz os
sintomas de dor DN. EMS tratamento pode, como um complemento
para tratamentos farmacológicos, ser uma ferramenta para melhorar
a funcionalidade de CPE em pacientes em risco de doença
cardiovascular.
AGRADECIMENTOS
Reconhecemos Prof. Dr. Heimo Mairbäurl pelo Internal Medicine
VII / Sportsmedicine, Hospital Universitário de Heidelberg, pelas
valiosas discussões e Elisabeth Kliemank,
Internal Medicine I / Clínica
Química, Hospital Universitário de Heidelberg, para assistência
com PBMC puri fi cátions. Reconhecemos Bioestatístico Laura
Kohlhas, Institute of Medical Biometria e Informática, da
Universidade de Heidelberg, para a seleção de métodos
estatísticos apropriados e para a supervisão da análise
estatística. Reconhecemos Dr. Gian Paolo Fadini, Professor
Adjunto de Endocrinologia da Universidade de Padova e Diretor
Associado de Medicina na Divisão de Doenças Metabólicas do
Hospital da Universidade de Padova, para a leitura crítica do
manuscrito e sugestões úteis para abordagens experimentais.
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche
Forschungsgemeinschaft
(DFG; conceder números
Número do volume ]

SFB1118 - S01; a TH Fleming), Dietmar Hopp Foundation (DHS),
a Helmholtz Cruz Programa Tópico metabólica disfunção e GRK
1874 complicações diabéticas microvasculares (DIAMICOM)
(para
N. Volk).
A disponibilidade de dados e materiais: Os conjuntos de dados
utilizados e / ou analisados ​durante o estudo estão disponíveis a
partir do autor correspondente no pedido razoável. Contribuições
Autor: A. Hidmark projetou o fl ow análise de citometria, realizada a fl
ow análise de dados de citometria, feita fi figuras e escreveu o
artigo. I. Spanidis realizados os EMS-tratamentos, dados clínicos
recolhidos, realizada a fl ow análise de citometria, realizada a
análise estatística, feita fi figuras e contribuiu para escrever o artigo.
T. Fleming concebido o estudo, as medições executadas em
metilglioxal, analisou o fi achados e contribuiu para escrever o
artigo. N. Volk realizadas as medições de plasma de capacidade
antioxidante. V. Eckstein efetuados e supervisionados fl ow análise
de citometria. J. Gröner participou do desenho do estudo, o
recrutamento de sujeitos do estudo. S. Kopf participou do desenho
do estudo, o recrutamento de sujeitos do estudo e análise de
dados. P. Nawroth participou do desenho do estudo, o
recrutamento de sujeitos do estudo, a interpretação dos dados e
contribuiu com importante conteúdo intelectual na revisão do
artigo. D. Oikonomou concebido o estudo (isto é, escreveu o
pedido de aprovação ético), recrutados sujeitos do estudo,
participaram na análise de dados e interpretação. Todos os autores
contribuíram com fi aprovação final da versão a ser publicada.
CONFLITOS DE INTERESSE
Os autores declaram que não têm fi interesses financeiros no
resultado deste estudo. O fabricante do equipamento HiTop não
foi informado deste estudo com antecedência. Os patrocinadores
do estudo (ver secção Financiamento) não teve em fl uência sobre
a coleta de dados, análise ou o manuscrito. Os autores indicaram
que eles não têm outra con fl itos de interesse sobre o conteúdo
deste artigo.
MATERIAL SUPLEMENTAR
dados suplementares estão disponíveis na versão online deste artigo
em http://dx.doi.org/10.1016/j.clinthera.
2017.05.340 .
] 2017
A. Hidmark et al.
REFERÊNCIAS
1. Ziegler D, Papanas N, Vinik AI, Shaw JE. epidemiologia
polineuropatia na diabetes e pré-diabetes. Handb Clin Neurol. 2014;
126: 3 - 22.
2. Callaghan BC, Little A, Feldman E, Hughes RA. enchanced
glicose controlo para prevenção e tratamento da neuropatia diabética. Syst
Rev. Dados Cochrane 2012; 6 (6). CD007543.
3. Giacco F, Brownlee M. stress oxidativo e diabética
complicações. Circ Res. 2010; 107: 1058 - 1070.
4. Herder C, et ai. associação diferencial entre bio-
marcadores de subclínica em fl amação e polineuropatia dolorosa:
resultados do estudo KORA F4. Diabetes Care. 2015; 38: 91 - 96.
5. Turkseven S, Ertuna E, Yetik-Anacak L, M. Yasa Metil-
glioxal causa disfunção endotelial: o papel de óxido nítrico sintase
endotelial e da proteína quinase activada AMP- α. J básica Clin Physiol
Pharmacol. 2014; 25: 109 - 115.
6. Colina JM, et al. Células progenitoras endoteliais circulantes,
função vascular, e risco cardiovascular. N Eng J Med.
2003; 348: 593 - 600.
7. Albiero M, et al. Diabetes causa auto-medula óssea
neuropatia nómico e limita haste mobilização celular via
desregulada p66Shc e Sirt1. Diabetes. 2014; 63: 1353 - 1365.
8. Fadini GP, et al. Número e função das células endoteliais
células progenitoras como um marcador da gravidade para a vasculopatia
diabética. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006; 26: 2140 - 2146.
9. Um Orlandi, et al. diabetes a longo prazo prejudica repovoamento
de células progenitoras hematopoiéticas e dysregulates a expressão de
citocinas no microambiente da medula óssea em ratinhos. Básico Res
Cardiol. 2010; 105: 703 - 712.
10. Tepper OM, et al. células progenitoras endoteliais humanas
de diabéticos do tipo II exibem proliferação diminuída, aderência, e
incorporação em estruturas vasculares.
Circulação. 2002; 106: 2781 - 2786.
11. Fadini GP, et al. Stem compartimentação celular em
diabetes e alto risco cardiovascular revela o papel do inibidor de DPP-4 em células
estaminais mobilopathy diabética. Básico Res Cardiol.
2013; 108: 313.
12. Jarajapu YP, et al. disfunção de células CD34 Vasoreparative º
células em indivíduos diabéticos envolve dessensibilização hipóxica e
mecanismos parácrinos autócrinos / deficientes. PLoS ONE. 2014; 9: e93965.
13. Rigato H, Bittante C, Albiero M, et al. circulando progenitor
contagem de células prediz desfechos microvasculares em pacientes diabéticos tipo 2. J
Clin Endocrinol Metab. 2015; 100: 2666 - 2672.
14. Fadini GP. A reavaliação do papel da circulação
(progenitoras) células na patobiologia de complicações diabéticas. Diabetologia.
2014; 57: 4 - 15.
15. Nowak WN, et al. Número de circulação pró-angiogénicos
células, factor de crescimento e pro do gene anti-oxidativo fi les pode
11
 Therapeutics clínicos
ser alterada na diabetes de tipo 2 com e sem
síndroma do pé diabético.
J Investig diabetes. 2014; 5: 99 - 107.
16. Thom SR, et al. medidas de
CD34 º/ células-tronco CD45-dim prever
cicatrização de feridas neuropática do diabético. Diabetes.
2016; 65: 486 - 497.
17. Thom SR, et al. caule vasculogênica
mobilização celular e recrutamento de feridas em
pacientes diabéticos: aumento do número de
células e teor de proteína de regulação
intracelular associado com a terapia de oxigénio
hiperbárico.
Wound Repair Regen. 2011; 19: 149 -
161.
18. Sambataro M, et al. sig- prognóstico
ni fi cance de circulao e marcadores de células
progenitoras endoteliais em tipo 2 pé diabético.
int J Vasc Med.
2014; 2014: 589.412.
19. Jeong JO, et ai. angiogênico dupla
e efeitos neurotróficos de derivadas da medula
óssea as células progenitoras endoteliais na
neuropatia diabética.
Circulação. 2009; 119: 699 - 708.
20. Naruse K, et al. transplante de
derivadas de medula óssea as células
mononucleares melhora a hiperalgesia mecica,
alodinia fria e da função dos nervos na
neuropatia diabética. PLoS ONE. 2011; 6:
e27458.
21. Kim H, et al. mono- medula óssea
células nucleares têm neurovascular tropismo e
melhorar a neuropatia diabética. Células-tronco. 2009;
27: 1686 -
1696.
22. Naruse K, et al. neo- terapêutica
vascularização usando cabo bloodderived
células progenitoras endoteliais para a
neuropatia diabética. Diabetes.
2005; 54: 1823 - 1828.
23. Mizukami H, Yagihashi S. Explorando
uma nova terapia para a polineuropatia diabética -
a aplicação de transplante de células estaminais.
Frente Endocrinol.
(Lausana). 2014; 5: 45.
24. Körbling M, et al. hepatócitos e
células epiteliais de origem do doador, em receptores de
células estaminais de sangue periférico. N Engl
J Med. 2002; 346:
738 - 746.
25. Yeh ET, et ai. transdiferenciação de
CD34 do sangue periférico humano º-
12
população de células enriquecida em
cardiomiócitos, células endoteliais, e células do
músculo liso in vivo. Circulação. 2003; 108:
2070 - 2073.
26. Murohara T, et al. transplantado
células precursoras endoteliais aumentar
neovascularização pós-natal medula derivada de
sangue. J Clin Invest. 2000; 105: 1527 - 1536.
27. Berezin AE. progenitoras endoteliais
disfunção de células e reparação de tecido
prejudicado: a ligação perdida no desenvolvimento
de diabetes mellitus. Diabetes Metab Clin Res Rev.
Syndr 2016: 6 - 11.
28. Tamarat R, et al. prejuízo no
neovascularizao induzida por isquemia em diabetes:
disfunção de células mononucleares de medula
óssea e do potencial terapêutico do tratamento com
o factor de crescimento da placenta. Am J Pathol. 2004;
164: 457 - 466.
29. Loomans CJ, et al. pro- endotelial
A disfunção de células genitor: um novo conceito
na patogénese de complicações
vasculares da diabetes de tipo 1. Diabetes. 2004;
53: 195 - 199.
30. Kalka C, et ai. transplante de
expandidas ex vivo de células progenitoras
endoteliais para neovascularização terapêutico.
Proc Natl Acad Sci US A. 2000; 97: 3422 - 3427.
31. Asahara T, et ai. contribui VEGF
a neovascularização pós-natal através da
mobilização de osso derivadas de medula células
progenitoras endoteliais. EMBO J.
1999; 18: 3964 - 3972.
32. Ceradini DJ, et al. Célula progenitora
TRAF fi cking é regulada por gradientes de hipóxia
através de HIF-1 indução de SDF-1. Nat Med. 2004;
10: 858 - 864.
33. Howangyin KY, Silvestre JS. Diabetes
mellitus e doenças isquémicas: mecanismos
moleculares da disfunção reparação vascular. Arterioscler hematopoiéticas humanas.
Thromb Vasc Biol. 2014; 34: 1126 - 1135.
34. Bento CF, Pereira P. Regulamento de
hipoxia-inducible factor 1 e a perda da
resposta celular hipoxia na diabetes. Diabetologia. celular cardiovascular próxima geração. Regen
2011; 54: 1946 - 1956.
35. Stellos K, et al. adesão juncional
Uma molécula expressa em células CD34 humano º promove
a adesão de células
na parede vascular e a diferenciação em
células progenitoras endoteliais.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010; 30: 1127 - 1136.
36. Sugano Y, et al. adesão juncional
Uma molécula-, JAM-A, é um novo marcador
cellsurface para repovoamento de longo prazo de
células estaminais hematopoiéticas.
Sangue. 2007; 111: 1167 - 1172.
37. Sango K, et al. Alta induzida pela glicose
a activação da via do poliol e alterações de
expressão de gene pró fi les em
rato adulto imortalizada de células de
Schwann IMS32. J Neurochem.
2006; 98: 446 - 458.
38. Chang CH, et al. adhe- juncional
sion molécula-A é altamente expresso em células
hematopoiéticas humanas e associados
repovoamento com o receptor de quimioquinas
CXCR4 hematopoiéticas chave.
Células-tronco. 2016; 34: 1664 - 1678.
39. Martin-Padura I, et al. Juncional
molécula de adesão, um novo membro da
superfamília das imunoglobulinas que
distribui nas junções intercelulares e modula
monócitos transmigração. J Cell Biol. 1998;
142: 117 - 127.
40. Kostrewa D, et al. estrutura de raios-X de
molula de ades de juno: base estrutural para
a adesão homofílica através de um novo
motivo de dimerizao.
EMBO J. 2001; 20: 4391 - 4398.
41. Ozaki H, et al. Cutting edge: com-
tratamento bined de TNF-alfa e IFN-gama
provoca a redistribuição de molula de ades
de juno em células endoteliais humanas. J
Immunol.
1999; 163: 553 - 557.
42. Voermans C, Rood PM, Hordijk PL,
et al. As moléculas de adesão envolvidos na
migração transendotelial de células progenitoras
Células-tronco. 2000; 18: 435 - 443.
43. Kim SW, Kim H, Yoon Y. Advances
na terapia de células derivadas de medula
óssea:-CD31 que expressa culas como terapia
Med. 2011; 6: 335 - 349.
44. Kim H, et al. CD31 º células representam
células altamente angiogénicos e vasculogénicos
na medula óssea: novel papel de CD31 não
endoteliais º células em
Número do volume ]
 A. Hidmark et al.

neovascularizao e os seus efeitos terapêuticos
sobre a doença vascular isquémica. Circ Res. 2010;
107: 602 - 614.
45. Humpert PM, et ai. elétrico externo
estimulação do músculo melhora a
sensação de ardor e distúrbios do sono
em pacientes com diabetes tipo 2 e
neuropatia sintomática. Med dor. 2009; 10:
413 - 419.
46. Jovem MJ, Boulton AJ, MacLeod AF,
et al. Um estudo multicêntrico sobre a
prevalência de neuropatia periférica
diabética na população clínica hospitalar
55. Zhu L, et al. Irisin aumentou a
número e melhorou a função de células
progenitoras endoteliais em ratos com diabetes
mellitus. J Cardiovasc Pharmacol. 2016; 68: 67 - 73.
56. Parque KS, et ai. identi fi cação e
caracterização funcional dos canais de iões em
CD34 ( º) as células-tronco hematopoiéticas a
partir de sangue periférico humano. Células Mol. 2011;
32: 181 - 188.
57. Ye L, et al. Efeitos de Ca2 º- ati-
vados de potássio e interior
59. Spadaccio C, et ai. Na electro-situ
estimulação acciona uma mudança regenerativa
na zona do miocárdio enfartado. Transplante de
células. 2013; 22: 493 - 503.
60. Kobelt LJ, Wilkinson AE, McCormick
AM, et al. duração estimulação eléctrica curto
para aumentar o crescimento de neurites e a
maturação de células-tronco progenitoras
neuronais adultas. Ann Biomed Eng. 2014; 42:
2164 - 2176.
61. Wu, M. et al. JAM-A promove
a cicatrização de feridas através do aumento tanto

Reino Unido. Diabetologia. 1993; 36: 150 - 154. recti fi canal de potássio er sobre a homing e actividades secretoras de células estaminais

diferenciação de células progenitoras mesenquimais. Clin Sci (Lond). 2015; 129: 575 - 588.

47. Sidney LE, Ramo MJ, Dunphy SE, endoteliais a partir de sangue periférico
et al. revisão concisa: evidências para CD34 como humano. Mol Biol Rep. 2014; 41: 3413 - 3423. 62. Brunet de la Grange P, et al. Longo-
um marcador comum para diversas progenitores. Células-tronco. as células-tronco hematopoiéticas repovoamento e

2014; 32: 1380 - 1389. 58. Pillozzi S, canais de iões Becchetti A. duração “ população lado ” no sangue periférico

em células hematopoiéticas e estaminais humano em estado estacionário. Stem Cell Res. 2013;
48. Lemery SJ, et al. Um estudo piloto eval- mesenquimais. Stem Cells Int. 2012; 2012: 11: 625 - 633.

uating a segurança e CD34 º mobilizar células 217.910.

actividade de doses crescentes de plerixafor
em voluntários saudáveis. Br
J Haematol. 2011; 153: 66 - 75.

49. Masuda H, et al. metodológica

desenvolvimento de um ensaio clonogénico para

determinar o potencial de células progenitoras

endoteliais. Circ Res. 2011; 109: 20 - 37.

50. Bierhaus A, et al. methylglyoxal

modi fi cação de Nav1.8 facilita neurônio
nociceptiva fi anel e provoca hiperalgesia
na neuropatia diabética. Nat Med. 2012;
18: 926 - 933.

51. Andersson D, et al. methylglyoxal

evoca dor por estimulação de TRPA1.
PLoS ONE. 2013; 8: e77986.
52. Yowtak J, et al. reativas de oxigênio
espécies contribuem para a dor neuropática,
reduzindo a libertação de GABA espinhal. Dor. 2011;
152: 844 - 852.
53. Premkumar LS, Pabbidi RM. Diabético
neuropatia periférica: papel de espécies reactivas
de oxigénio e de azoto. Cell Biochem Biophys. 2013;
67: 373 - 383.
54. Curral L, et al. combinado intermitentes
tenda hipobárica hipoxia e músculo
Endereço para correspondência: Asa Hidmark, PhD, Departamento de Medicina I e Química
electro-estimulação: um método para aumentar a Clínica, Hospital Universitário de Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 410, D 69120 Heidelberg,
concentração de células progenitoras em circulação? Alemanha. E-mail: asa.hidmark @ med.uni-heidelberg.de
J Med Transl. 2014; 12: 174.

] 2017 13
 Therapeutics clínicos

Determinação material suplementar da análogo, Trolox (Sigma-Aldrich Cat. 238813), e os resultados foram
capacidade antioxidante normalizados para a concentração de proteína total, tal como medida
Figuras complementares S1 e S2 . pelo ensaio de Bradford.
A capacidade antioxidante foi baseado na capacidade do
plasma para inibir a extinção da fl sinal de fluorescência fl uorescein Determinação de plasma Methylglyoxal
por 2,2 '- azobis (2-amidino-propano), dihidrocloreto de (AAPH; Cat A concentração de metilglioxal no plasma foi determinada por
Sigma-Aldrich. espectroscopia de massa em tandem com cromatograf ia líquida
440914) como anteriormente descrito [Ou, B., HampschWoodill, M. & seguinte derivatização com 1,2diaminobenezene, como descrito
Antes, Desenvolvimento RL e validação de um ensaio de capacidade anteriormente [Rabbani,
de absorção de radical oxigénio melhorada usando fl uorescein como o fl N. & Thornalley, PJ Medição de metilglioxal por análise de
sonda uorescente. J. Agric. Chem alimentos. 49, 4619 - 26 (2001)]. Uma diluição isotópica estável LC-MS / MS com predição corroborativa
curva de calibração foi construída usando a vitamina E em amostras fisiológicas. Nat. PROTOC. 9, 1969 - 79 (2014).]

UMA Capacidade Antioxdative B methylglyoxal

ns ns
ns ns
180 250
nmol Trolox equivivalent / mg de protea

170 200
nM Methylglyoxal

130 150

160 100

150 50

140 0
S

S
S
EM

EM
S

S
EM
EM

EM

EM
st

st
de

de

st
st

º
4

4
1
1
1

1
de

de
de

de

ós
ós

s
s

ap
ap

te

te
te

te
an
an

an
an

Figura S1. EMS-tratamento de pacientes diabéticos não signi fi cativamente alterar. plasma capacidade anti-oxidante.
O plasma de doentes com diabetes, imediatamente antes e após a primeira EMS-tratamento foi utilizado para medir a capacidade
antioxidante (caixas mostram percentil 25-75, percentil suiças mostrar 5-95, indica linha mediana) (n ¼ 9) ( uma), ou metilglioxal (barras
indicam média, barras de erro mostram o desvio padrão) (n ¼ 10) ( b). Medição após o tratamento é descrito em barras cinzentas.
análise de erro estatística foi realizada com o teste fileiras assinado 2 caudas de Wilcoxon. ns ¼ não signi fi cativa.

13.e1 Número do volume ]

 A. Hidmark et al.

UMA MFI JAM-A em HSC B MFI CD31 em HSC

200
p = 0,008 p = 0,953

350
100 p = 0,767 300

de alteração%

% De mudança
250 p = 0,011
200

0 150
100
0 50
- 50
- 100
- 100
após 1 st EMS antes de 4 º EMS
após 1 st EMS antes de 4 º EMS

C MFI CD31 em CXCR4 + HSC D MFI CD31 em JAM-A + HSC

p = 0,767
200 p = 0,011

p = 0,011
p = 0,594
150

% De mudança
100
de alteração%

100

0 50
0
- 50

- 100
- 100

após 1 st EMS antes de 4 º EMS

após 1 st EMS antes de 4 º EMS

Figura S2. Expressão da molécula de adesão endotelial CD31 e JAMA aumento no EMS-tratada
indivíduos com diabetes. As alterações de expressão de superfície em HSC entre amostras colhidas imediatamente antes e depois de
1 st o primeiro EMS (caixas brancas) ou antes de quatro º EMS (caixas cinzentas): Alterações na intensidade da fluorescência média
(IFM) de expressão de superfície de JAM-A (um outlier excluídos de diante 4 º tratamento) (a) ou CD31 (b). Mudança de MFI de CD31
em CXCR4 º HSC (c) ou em JAM-A º HSC (d). Por cento mudança é calculada entre o valor da linha de base (antes de 1 de st EMS) e
Depois de um st EMS ou Antes 4 º EMS. Caixas mostrar percentil 25-75, bigodes mostrar 5-95 percentil, linha indica mediano. análise de
erro estatística foi realizada com o teste fileiras assinado 2 caudas de Wilcoxon.

] 2017 13.e2