MOSTRATEC – MOSTRA INTERNACIONAL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA –

FUNDAÇÃO ESCOLA TÉCNICA LIBERATO SALZANO VIEIRA DA CUNHA

CENTRO TECNOLÓGICO UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – ESCOLA DE
ENSINO MÉDIO E TÉCNICO

ANA LÍVIA MACHADO MORELLI

DIEGO LUIZ DALL’AGNOL
JÚLIA SQUIZZATO

ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (CAPIM- LIMÃO) ATRAVÉS DE

NANOTECNOLOGIA NO CONTROLE DA PODRIDÃO OLHO DE BOI EM FRUTOS DE
MACIEIRA

CAXIAS DO SUL/RS
NOVEMBRO
2020
 ANA LÍVIA MACHADO MORELLI
DIEGO LUIZ DALL’AGNOL
JÚLIA SQUIZZATO

ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (CAPIM- LIMÃO) ATRAVÉS DE

NANOTECNOLOGIA NO CONTROLE DA PODRIDÃO OLHO DE BOI EM FRUTOS DE
MACIEIRA

Trabalho apresentado como requisito parcial

para avaliação na MOSTRATEC 2020 – Mostra
Internacional de Ciência e tecnologia –
Promovida pela Fundação Escola Técnica
Liberato Salzano Vieira da Cunha, de Novo
Hamburgo/RS.

__________________________________________________
Orientador (a) 1: Professor Gustavo Rubbo Siqueira

__________________________________________________
Orientador (a) 2: Professor Doutor Murilo Cesar dos Santos
 RESUMO

A cultura da macieira tem grande importância nos Estados do Rio Grande do Sul e
Santa Catarina, sendo que o Brasil passou de consumidor a exportador de frutos de
macieira em aproximadamente 50 anos. A doença podridão Olho de Boi é uma das mais
preocupantes, consumindo várias pulverizações de fungicidas para seu controle. O objetivo
do trabalho foi buscar alternativa segura aos trabalhadores e consumidores através do uso
de óleo essencial de capim limão, associado a nanotecnologia. O trabalho foi realizado no
laboratório de Fitopatologia da Universidade de Caxias do Sul, UCS. Para o ensaio in vitro,
utilizou-se Óleo essencial de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração
0,25%; Óleo essencial de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração
0,50%; Óleo essencial de C. citratus na concentração 0,25%; Oxicloreto de Cálcio na dose
0,008g/L; Testemunha sem tratamentos. O patógeno na concentração de 1,0x106 ufc/ml foi
adicionado aos tratamentos por 15 minutos, e depois em Placas de Petri contendo meio
V8, e então mantidos em BOD à 25ºC, por 7 dias para determinação do efeito dos
tratamentos sobre o patógeno. Para o ensaio in vivo, os frutos foram banhados nos
tratamentos citados e acomodados em frascos plásticos umedecidos e fechados por 15
dias em temperatura ambiente. Os frutos foram inoculados com disco de papel filtro
esterilizado, embebido do inóculo, na concentração de 10x106 (conídios/ml), posicionado
sobre uma lenticela, na região peduncular, em quatro posições equidistantes, após o
tratamento dos frutos. Avaliou-se a quantidade de colônias em placa de Petri, para ensaio
in vitro e a porcentagem de incidência e severidade para o ensaio in vivo. Os dados foram
submetidos a análise de variância e as médias foram comparadas pelo Teste de Tukey a
5% de probabilidade. Os frutos tratados com óleo essencial de capim limão associado a
nanotecnologia a 0,50% apresentou a menor incidência e severidade da doença por 7 dias.
O tempo de 15 minutos de contato entre o patógeno e as soluções dos tratamentos não foi
suficiente para controle do mesmo

Palavras-chave: Malus domestica, Cryptosporiopsis perennans, pós-colheita, maçã

 ABSTRACT

The cultivation of apple tree is of great importance in the states of Rio Grande do
Sul and Santa Catarina, being that Brazil went from consumer to exporter of apple fruit in
approximately 50 years. Ox's Eye rot disease is one of the most worrying consuming several
fungicide sprays to control it. The objective of the work was to seek a safe alternative for
workers and consumers through the use of lemongrass essential oil, associated with
nanotechnology. The work was carried out Phytopathology laboratory at the University of
Caxias do Sul, UCS. For the in vitro assay, lemongrass essential oil associated with
nanotechnology, at a concentration of 0.25%; Lemongrass essential oil associated with
nanotechnology, of 0.50% concentration; Essential oil of C. citratus at a concentration of
0.25%; Calcium oxychloride at dose 0.008g / L; Witness without treatment. The pathogen at
a concentration of 1.0x106 cfu / ml was added to the treatments for 15 minutes, and then in
Petri dishes containing V8 medium, and then kept in BOD at 25ºC, for 7 days to determine
the effect of the treatments on the pathogen. For the in vivo test, the fruits were bathed in
the aforementioned treatments and accommodated in moistened, closed plastic bottles,
moistened for 15 days at room temperature. The fruits were inoculated with a sterile filter
paper disc, soaked in the inoculum, at a concentration of 10x106 (conidia / ml), positioned
on a lenticel, in the peduncular region, in four equidistant positions, after the treatment of
the fruits. We valuated the amount of colonies on a petri dish for in vitro assay and the
percentage of incidence and severity for the in vivo assay. The data were submitted to
analysis of variance and the means were compared using the Tukey test at 5% probability.
Fruits treated with lemongrass essential oil associated with 0.50% nanotechnology showed
the lowest incidence and severity of the disease for 7 days. The 15-minute contact time
between the pathogen and the treatment solutions was not enough to control it.

Keywords: Malus domestica, Cryptosporiopsis perennans, postharvest, apple.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fruto da macieira com o sintoma da podridão olho de boi ................................. 13

Figura 2: Frutos da macieira fechados, com inóculo e o tratamento ................................. 20
Figura 3: Frutos da macieira fechados, com o inóculo e o tratamento .............................. 20
Figura 4: Plaquetas com as colônias a partir do tratamento de óleo essencial de capim limão
associado a nanotecnologia na concentração 0,25% ....................................................... 24
Figura 5: Plaquetas com as colônias a partir do tratamento óleo essencial de capim limao
associado a nanotecnologia na concentração 0,50% ....................................................... 24
Figura 6: Plaquetas com as colônias a partir do tratamento de óleo essencial de capim limão
na concentração 0,25% .................................................................................................... 24
Figura 7: Plauqetas com colônias a partir do tratamento de Oxicloreto de Cálcio ............ 24
Figura 8: Plaquetas com a testemunha ............................................................................ 24
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Porcentagem de incidência e severidade da podridão Olho de Boi em frutos de

macieira, cv. Fuji Suprema, dos óleos de capim limão associados ou não a nanotecnologia
em comparação com desinfetante. Caxias do Sul, RS. .................................................... 22
Tabela 2: Número médio de colônias de Cryptosporiopsis perennans em meio de cultura
V8, sob efeito dos óleos de capim limão associados ou não a nanotecnologia em
comparação com desinfetante. Caxias do Sul, RS. .......................................................... 23
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BOD Demanda Biológica de Oxigênio

Embrapa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
LAFIT Laboratório de Fitopatologia
LNNA Laboratório Nacional de Nanotecnologia para o Agronegócio
m Metro
mil Mililitro
nm nanômetro
POB Podridão Olho de Boi
UCS Universidade de Caxias do Sul
ufc Unidade de Formação de Colônias
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 10
2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................... 12
2.1. A cultura da maçã .................................................................................................... 12

2.2. Podridão olho de boi ............................................................................................... 12

2.3. Óleos essenciais ..................................................................................................... 14

2.3.1. Óleo essencial de Capim-Limão ............................................................................. 15

2.4. A nanotecnologia .................................................................................................... 15

2.4.1. A agricultura e a nanotecnologia ............................................................................ 16

3. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ..................................................................... 18

3.1. Caracterização da pesquisa.................................................................................... 18

3.2. Local ......................................................................................................................... 18

3.3. Ensaio in vitro .......................................................................................................... 18

3.3.1. Inóculo .................................................................................................................... 18

3.3.2. Ensaios dos óleos essenciais in vitro...................................................................... 18

3.3.3. Tratamentos ........................................................................................................... 18

3.3.4. Delineamento estatístico ........................................................................................ 19

3.3.5. Avaliação ................................................................................................................ 19

3.3.6. Análise estatística ................................................................................................... 19

3.4. Ensaios in vivo ........................................................................................................ 19

3.4.1. Tratamentos: .......................................................................................................... 19

3.4.2. Inoculação .............................................................................................................. 20

3.4.3. Delineamento estatístico ........................................................................................ 20

3.4.4. Avaliações .............................................................................................................. 21

3.4.5. Análises estatísticas ............................................................................................... 21

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 22

5. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 26
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 27
7. ANEXOS ...................................................................................................................... 31
1. INTRODUÇÃO

A Malus domestica (Macieira) tem sua origem em uma região denominada

Cáucaso, que se localiza entre a Ásia e leste da China. Pesquisas apontam que essa
espécie tenha surgido há mais ou menos 20.000 anos.
O cultivo da macieira iniciou-se na década de 70 no Brasil a partir de um projeto
criado pelo estado de Santa Catarina, o “Projeto de Fruticultura de Clima–Temperado
Profit”, o qual teve o propósito de ampliar e desenvolver o plantio de macieira.
Atualmente a cultivo da fruteira está nos seguintes estados: RS, SC, PR, SP, MG e BA,
sendo Santa Catariana o maior produtor entre eles (51,7%). A cultura da maçã constitui
uma importante atividade econômica na região Sul, cuja produção corresponde a 99%
do total produzido no país.
Nos últimos anos, a produção de maçã tornou-se autossuficiente,
principalmente devido a expansão das áreas cultivadas e a adoção de novas
tecnologias. Com isso o país passou de importador para exportador, e atualmente ocupa
a 7ª posição entre os produtores mundiais da fruta (KIST, 2015; AGRIANUAL, 2016;).
A maçã está entre as quatro frutas mais consumidas no mundo. No Brasil, é
comercializada os doze meses do ano e distribuída em todo o País. Afora o consumo in
natura é utilizado para purês, geleias, fruta desidratada, suco concentrado e bebidas
fermentadas (PETRI e LEITE,2008). Atualmente se faz uso de desinfetantes durante a
classificação dos frutos para reduzir as perdas de pós-colheita tanto para frutas
armazenadas quanta para frutas comercializadas e em prateleira. Entretanto é limitada
a eficiência destes desinfetantes. A ocorrência de doenças reduz drasticamente o
retorno econômico da cultura da macieira. Entre essas doenças pós-colheita, a podridão
olho de boi ocasiona as maiores perdas durante o armazenamento das frutas, sendo a
principal doença pós-colheita em diversas regiões do mundo, como relatada na
Austrália, Brasil, Chile, Estados Unidos, Itália, Polônia e República Tcheca (BONFIM,
2017).
A podridão olho de boi é causada pelo fungo fitopatógeno Cryptosporiopsis
perennans. Fungos fitopatogênicos causam perdas significativas na agricultura,
podendo atingir todas as partes da planta e até sobreviver no solo (MARI; BAUTISTA-
BAÑOS; SIVAKUMAR, 2016). O controle desses fitopatógenos requer o uso de produtos
químicos, os quais estão principalmente associados a danos ambientais e à saúde

10
(BARROS, 2016). Por outro lado, seu controle é necessário para garantir a sanidade
das plantas e dos alimentos (ANTONIOLI, 2019).
A podridão olho de boi ocorre em todas as áreas produtoras de maçã no Brasil.
Embora a incidência da doença seja maior em regiões de temperaturas baixas, como
São Joaquim-SC e Vacaria-RS, a incidência da doença tem aumentado em regiões de
clima ameno, como Fraiburgo-SC (SANHUEZA, 2002; ARAÚJO et al., 2016).
Dessa forma, métodos alternativos de controle de fitopatógenos estão sendo
considerados. Entre eles, o uso de óleos essenciais está crescendo por serem produtos
naturais, biodegradáveis, ecológicos, econômicos e seguros (SIVAKUMAR;
BAUTISTABAÑOS, 2014).
O óleo essencial de capim-limão e outros óleos essenciais ricos em citral são
conhecidos por suas características que permitem seu uso como pesticidas naturais,
incluindo ação antifúngica já identificada para vários microrganismos (SILVA et al., 2008;
MOHAN et al., 2011; PEREIRA et al., 2012; TOMAZONI et al., 2017). No entanto, os
óleos essenciais são formados por compostos voláteis, uma característica que dificulta
sua aplicação e viabilidade econômica (ANTONIOLI, 2019).
Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar a atividade de aplicação do óleo
essencial de capim-limão incorporado à nanotecnologia contra o fitopatógeno C.
perennans em ensaios in vitro e in vivo pós-colheita.

11
2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. A cultura da maçã

A macieira pertence à família das Rosaceae, subfamília Maloidae (Pomoidae),

gênero Malus, espécie Malus domestica. O início da pesquisa no Brasil, com macieira,
ocorreu em 1928, com a introdução de 72 cultivares na Estação Experimental de São
Roque, do Instituto Agronômico de Campinas. Inúmeras outras tentativas foram
desenvolvidas, visando ao cultivo comercial da cultura ao longo dos anos, porém pode-
se dizer que, em escala comercial, tenha iniciado no final da década de 60 e início de
70 (PETRI e LEITE, 2008).
Atualmente são conhecidas aproximadamente 7.000 cultivares de maçãs, no
entanto, somente algumas são de interesse comercial. As cultivares ‘Golden Delicious’,
‘Red Delicious’, ‘Granny’, ‘Braeburn’, ‘Smith’, ‘Fuji’, ‘Gala’, ‘Pink Lady’, ‘Elstar’, e
‘Jonagold’ são as mais plantadas mundialmente, enquanto os grupos ‘Gala’ e ‘Fuji’
representam 60% e 30%, respectivamente do total da produção nacional (PETRI et al.,
2011).
A cultura da macieira é um exemplo de como o setor público e a iniciativa privada
podem atuar juntas e contribuir para o desenvolvimento econômico e social de uma
região. Duas regiões de Santa Catarina, São Joaquim e Fraiburgo, e uma do Rio Grande
do Sul, Vacaria, têm sua base econômica na cultura da macieira. Esta importante cadeia
produtiva gera emprego e renda, sendo também responsável pela introdução de
tecnologias, como, por exemplo, o desenvolvimento da cadeia de frio, sendo a pioneira
no Brasil no que concerne ao uso da atmosfera controlada, que permite a conservação
de maçãs por longos períodos. O setor é um importante empregador e já representa um
dos mais importantes segmentos do agronegócio da fruticultura brasileira (PETRI e
LEITE, 2008).

2.2. Podridão olho de boi

O fungo Cryptosporiopsis perennans foi constatado no Brasil em 1996 e,

atualmente, encontra-se disseminado em todas as regiões produtoras de maçã do Rio
Grande do Sul, de Santa Catarina e do Paraná (AGROLINK).

12
 Além da podridão, o patógeno causa também sintomas de cancros em ramos
de um e dois anos de idade, o que, além de debilitar a planta, constitui-se na principal
fonte de inóculo do patógeno para as infecções nos frutos (GROVE et al., 1992).
Segundo Sharples (1958), o patógeno pode ainda sobreviver saprofiticamente em frutos
caídos no chão ou mumificados nas plantas.
As infecções em frutos podem ocorrer em qualquer fase do seu desenvolvimento
entre a queda das pétalas e a colheita, porém com pico de suscetibilidade nas fases
finais de maturação do fruto (SPOTTS, 1985). Sintomas de POB são mais
frequentemente observados na pós-colheita e, raramente, vistos em frutos no campo,
exceto naqueles com ferimentos. Devido ao longo período de incubação da doença,
resultante de infecções latentes iniciadas em qualquer fase de desenvolvimento dos
frutos (EDNEY et al., 1960), as estratégias de manejo da POB são enfocadas na
aplicação de fungicidas no período final de maturação dos frutos (BYRK, 2001;
HENRÍQUEZ et al., 2008). Para essa situação, o uso de fungicidas deve visar à redução
da densidade de inóculo na superfície dos frutos nos períodos de maior risco de
infecções (SPENCER; WILKINSON,1958)
A podridão “olho de boi” nas maçãs é marrom-clara com o centro amarelo-
pálido, de forma mais ou menos circular, às vezes com margens marrom-escuras ou
avermelhadas, deprimida, de textura firme e desenvolvimento lento (Figura 1).
Internamente, os tecidos são de cor marrom amarelado e firme (AGROLINK).

Figura 1: Fruto da macieira com o sintoma da podridão olho de boi

13
 As margens entre os tecidos doentes e sadios são bem definidas. As podridões
iniciadas em lesões causadas por ferimentos no campo são mais amareladas que as
que se desenvolvem em pós-colheita, têm halo avermelhado e apresentam a polpa
desidratada e com cavernas. Elas surgem a partir dos ferimentos e/ou em outras áreas
da podridão como resultado da compactação de áreas afetadas. Sob condições de
umidade, no centro das lesões, podem se formar estruturas subepidermais escuras ou
alaranjadas que produzem no centro, massas esbranquiçadas de conídios. Sintomas da
doença são observados ao redor de lenticelas e ferimentos, na cavidade peduncular e
calicinar e ao redor dos carpelos (AGROLINK).
As estratégias de controle recomendadas para esta doença incluem a redução
de inóculo com a eliminação dos cancros, visto que neles se desenvolvem as estruturas
do patógeno e a remoção dos ramos de poda, dos frutos do raleio e de poda de inverno
e verão. No controle químico se recomenda o uso de fungicidas cúpricos no inverno e
de benzimidazois e protetores em pré-colheita (AGROLINK).

2.3. Óleos essenciais

As doenças alimentares de origem microbiológica constituem um problema

crescente em saúde pública e uma causa importante na redução da produtividade
econômica, tanto em países desenvolvidos como em vias de desenvolvimento (WORLD
HEALTH ORGANIZATION,2007). Os vários fatores que, inter-relacionados, contribuem
para agravar o risco de ocorrência dessas doenças incluem as inovações na
agropecuária, mudanças nos hábitos alimentares, evolução tecnológica e demais
alterações no plano ambiental, econômico e social (GANDHI; CHIKINDAS, 2007).
Os microrganismos apresentam uma enorme facilidade de evoluir por mutação
e recombinação genética, conduzindo ao aparecimento de espécies ou linhagens com
maior virulência e com grande capacidade de sobrevivência perante antimicrobianos e
fatores ambientais adversos (BRANDL, 2006).
Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas,
com baixo peso molecular, geralmente odoríferas e líquidas, constituídos na maioria das
vezes, por moléculas de natureza terpênica. Frequentemente apresentam odor
agradável e marcante. São frequentemente extraídos das partes vegetais através de
arraste à vapor d’água, hidro destilação ou expressão de pericarpo de frutos cítricos,

14
porém há outros métodos de extração como a enfleurage ou enfloração, extração por
CO2 supercrítico (muito utilizado na indústria) e por solventes orgânicos apolares (não
apresentam valor comercial) (MORAIS,2009).
A composição química dos óleos essenciais é determinada por fatores
genéticos, porém, outros fatores podem acarretar alterações significativas na produção
dos metabólitos secundários. De fato, os metabólitos secundários representam uma
interface química entre as plantas e o ambiente. Os estímulos decorrentes do ambiente,
no qual a planta se encontra, podem redirecionar a rota metabólica, ocasionando a
biossíntese de diferentes compostos. Dentre estes fatores, podem-se ressaltar as
interações planta/microrganismos, planta/insetos e planta/ planta; idade e estágio de
desenvolvimento, fatores abióticos como luminosidade, temperatura, pluviosidade,
nutrição, época e horário de coleta, bem como técnicas de colheita e pós-colheita
(MORAIS, 2009).

2.3.1. Óleo essencial de Capim-Limão

Os óleos essenciais de planta têm sido muito utilizados como agentes

flavorizantes em alimentos, bebidas, produtos de confeitaria, entre outros. Sua versátil
composição e o grande espectro antimicrobiano, associados à sua baixa toxicidade, os
tornam possíveis agentes naturais para a conservação de alimentos (OUSSALAH et al.,
2006).
A espécie Cymbopogon citratus, pertencente à família Poaceae, é originária da
Índia e largamente distribuída por vários países tropicais, entre eles o Brasil, onde
assume diferentes sinonímias como capim limão, capim-santo, erva-cidreira, entre
outras. A medicina popular utiliza o chá ou abafado, preparado a partir de suas folhas,
como calmante, analgésico, antipirético, antirreumático, diurético e em distúrbios
digestivos (FERREIRA e FONTELES, 1989).

2.4. A nanotecnologia

De acordo com a Embrapa (2020), ao passar dos anos surgiram, e ainda

surgem, diferentes e inovadores métodos de estudos científicos, em conjunto com
modernos equipamentos de investigação cientifica e revolucionários e ousados modos
de percepção sobre o mundo. Tudo ao nosso redor está evoluindo gradativamente, a
15
partir disso a concepção sobre o estudo da matéria, similarmente, o procedimento de
nano manipulação dos átomos e/ou moléculas de forma individual, agregado com a
utilização de escalas nanométricas, é um tanto quanto recente em relação as outras
áreas de estudos científicos.
A nanotecnologia pode ser classificada como um agrupamento de intervenções
e/ou ferramentas que ocorrem em escalas extremamente pequenas, entretanto que
geram desencadeamentos significativos dentro do mundo de real. Estes tipos de
mecanismos vão surpreendentemente muito além da percepção de visão dos olhos
humanos, eles atuam em uma escala denominada de escala nanométrica, onde um
nanômetro (nm) caracteriza se como a bilionésima parte de um metro (m). Esse tipo de
inteligência ainda se encontra com diversas viabilidades, se tornando um dos principais
caminhos de estudo dos incompreendidos fenômenos e manuseamentos de materiais
em escalas atômicas, moleculares e macromoleculares. Por ser uma ciência integrada,
em pouco tempo ela estará presente até mesmo nos aspectos singulares da vida
cotidiana (EMBRAPA, 2020).

2.4.1. A agricultura e a nanotecnologia

Conforme a Embrapa (2020) inúmeras nações onde a suas bases econômicas

são baseadas na agropecuária, já adotaram em variados setores, a utilização da
nanotecnologia. Acreditasse que a implantação desse método, além de gerar benefícios
no ponto de vista econômico, melhorará a qualidade dos produtos, do monitoramento, a
visível diminuição dos danos ambientais, e a aprimoração da imissão humana.
Embora o agronegócio brasileiro ocupe hoje uma posição de líder mundial é
essencial o investimento contínuo em novas tecnologias, para o país poder continuar
crescendo e abrir novos mercados neste setor tão dinâmico da economia (BANCO DO
BRASIL, 2004; ALVES, 2001).
Assim a nanotecnologia oferece oportunidades extremamente promissoras
para melhoria da competitividade e do desempenho de processos e produtos
agropecuários em várias áreas, agregação de valor a produtos, e aproveitar nichos de
mercado que pelas nossas características tropicais teremos vantagens competitivas
(MATTOSO, 2005; DURÁN et al., 2005).

16
 A importância da nanotecnologia no agronegócio começa já desde o início das
cadeias produtivas, contribuindo de forma significativa na melhoria do desempenho,
eficiência e economia de insumos (fertilizantes, pesticidas, etc.), através do
desenvolvimento de nanopartículas e nano encapsulação para liberação controlada de
fertilizantes e pesticidas em solos e também de fármacos para uso veterinário
(MATTOSO, 2005; DURÁN et al., 2005)
Além da ampliação do mercado, pela disponibilização e valorização de novos
produtos, o desenvolvimento de tecnologias que revertam o conceito de resíduo para o
de matéria prima, como a extração de nano fibras vegetais ou nanopartículas de sílica
de resíduos da agroindústria para a produção de nano compósitos plásticos, ou
produção de outros produtos de interesse industrial, é imprescindível para otimizar a
eficiência da indústria, podendo contribuir para agregação de valor e rentabilidade de
produtos agrícolas, e melhorar a competitividade e estabilidade econômica do país
(MATTOSO, 2005; DURÁN et al., 2005).
De acordo com a Embrapa, o LNNA (Laboratório Nacional de Nanotecnologia
para o Agronegócio) é um marco na consolidação de uma infraestrutura de
equipamentos avançados e dedicados a Nanotecnologia, que tem possibilitado e ainda
dará mais condições ao nosso país de avançar e gerar inovações nesta área tão
promissora.
Suas principais linhas de pesquisas são o desenvolvimento de sensores e
biossensores, aplicados ao controle de qualidade, certificação e rastreabilidade de
alimentos; desenvolvimento de novos usos de produtos agrícolas, caracterização e
síntese de novos materiais, como polímeros e materiais nano estruturados com
propriedades específicas, filmes finos e superfícies para fabricação de embalagens
inteligentes, comestíveis e superfícies ativas; nanopartículas, compósitos e fibras para
o desenvolvimento de materiais reforçados, usando produtos naturais, como fibras de
sisal, juta, coco e outras para aplicações industriais; nanopartículas orgânicas e
inorgânicas para liberação controlada de nutrientes e pesticidas em solos e plantas, de
fármacos para uso veterinário; desenvolvimento de metodologias de nano manipulação
e nano caracterização de materiais; nano biotecnologia para caracterização de material
genético e nano manipulação gênica; caracterização de materiais de interesse do
agronegócio para obtenção de informações inéditas sobre partículas de solos e plantas,
bactérias e patógenos de interesse agrícola (EMBRAPA, 2020).

17
3. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS

3.1. Caracterização da pesquisa

A pesquisa de natureza aplicada, apresenta dados de forma quantitativa e

desenvolvida em caráter experimental.

3.2. Local

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia (LAFIT), bloco 74,

na Universidade de Caxias do Sul, em Caxias do Sul/RS.

3.3. Ensaio in vitro

3.3.1. Inóculo

O patógeno foi gentilmente cedido pela micoteca do laboratório de Fitopatologia,

da Universidade de Caxias do Sul.

3.3.2. Ensaios dos óleos essenciais in vitro

Para avaliar o efeito dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus incorporado

com nanotecnologia, diferentes alíquotas dos tratamentos foram colocadas em
ependorf’s contendo o patógeno na concentração de 1,0x106 ufc/ml por quinze minutos,
e depois depositadas em Placas de Petri contendo meio V8 e espalhadas com uma alça
de Drigalski, e então mantidos em BOD à 25ºC, por 7 dias para determinação dos efeitos
dos tratamentos sobre o patógeno.

3.3.3. Tratamentos

Para realização do ensaio utilizou-se os seguintes tratamentos: Óleo essencial

de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração 0,25% mais tween a 1%;
Óleo essencial de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração 0,50%

18
mais tween a 1%; Óleo essencial de C. citratus na concentração 0,25% mais tween a
1%; Oxicloreto de Cálcio na dose 0,008g/L; Testemunha sem tratamentos.

3.3.4. Delineamento estatístico

Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado com 5 tratamentos e 5

repetições, sendo cada parcela constituída por uma placa de Petri.

3.3.5. Avaliação

Avaliou-se a quantidade de colônias produzidas por placa através de contagem

das mesmas.

3.3.6. Análise estatística

Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas

pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

3.4. Ensaios in vivo

Foram adquiridos frutos de Fuji Suprema, calibre 135, em packing-

house comercializador de frutos de macieira, no município de Caxias do Sul.
Os frutos foram desinfectados através de uma solução de álcool 70%, hipoclorito
de sódio 3% e água, na proporção (1:1:1). Cada fruto foi secado com papel toalha.

3.4.1. Tratamentos:

Para realização do ensaio utilizou-se os seguintes tratamentos: Óleo essencial

de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração 0,25% mais tween a 1%;
Óleo essencial de Capim-limão associado a nanotecnologia, na concentração 0,50%
mais tween a 1%; Óleo essencial de C. citratus na concentração 0,25% mais tween a
1%; Oxicloreto de Cálcio na dose 0,008g/L; Testemunha sem tratamentos.
Os frutos foram banhados em solução, respectiva de cada tratamento por
aproximadamente 30 segundos e acomodados em frascos plásticos umedecidos,

19
fechados e contendo algodão, também umedecido com água destilada autoclavada por
15 dias em temperatura ambiente.

3.4.2. Inoculação

Os frutos foram inoculados com disco de papel filtro esterilizado, embebido do

inóculo, na concentração de 10x106 (conídios/ml), posicionado sobre uma lenticela, na
região peduncular, em quatro posições equidistantes, após o tratamento dos frutos. Os
foram mantidos em sala não climatizada, durante 14 dias (Figuras 2 e 3). Diariamente,
os discos de papel filtro foram umedecidos com água esterilizada, para manter a
umidade necessária para infecção.

Figura 2: Frutos da macieira fechados, com Figura 3: Frutos da macieira fechados,

inóculo e o tratamento com o inóculo e o tratamento

3.4.3. Delineamento estatístico

Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, com 5 tratamentos e 10

repetições, sendo cada parcela constituída por 1 fruto acondicionado em frasco plástico.

20
3.4.4. Avaliações

Os frutos foram avaliados quanto a porcentagem de incidência da doença e a

severidade da doença, através da porcentagem da área sensibilizada pelo patógeno
após 14 dias da inoculação.

3.4.5. Análises estatísticas

Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas

pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O ensaio realizado gerou informações importantes sobre o controle de doença

Podridão de Olho de Boi, em frutos de macieira, os quais estão apresentados nas
Tabelas 1 e 2.
Os dados apresentados na Tabela 1 revelam diferenças significativas
importantes para o entendimento do uso de nanotecnologia associado a óleo essencial
de capim limão. Para a primeira avaliação com 7 dias, observa-se diferenças
significativas tanto para incidência quanto severidade da doença, destacando o óleo
essencial de capim limão associado a nanotecnologia, na dose de 0,50% do volume
como o único tratamento diferindo da testemunha. Entretanto, o mesmo não se confirma
para a avaliação de 14 dias, a qual revela que não houve diferenças significativas entre
os tratamentos. Esta perda de controle da doença após 7 dias da inoculação deve-se a
característica de volatilidade dos óleos essenciais, reduzindo o efeito sobre o patógeno.
O tratamento óleo essencial de capim limão apresentou a queima dos frutos.

Tabela 1: Porcentagem de incidência e severidade da podridão Olho de Boi em

frutos de macieira, cv. Fuji Suprema, dos óleos de capim limão associados ou não a
nanotecnologia em comparação com desinfetante. Caxias do Sul, RS.

Doses 1ª Avaliação 2ª Avaliação

Tratamentos Incidência Severidade Incidência Severidade
v/v (%)
(%)
Óleo essencial
de capim 0,25 0,7 ab 17,5 ab 0,7 a 15,0 a
limão nanotecnologia
Óleo essencial
de capim 0,50 0,2 b 5,0 b 0,9 a 22,5 a
limão nanotecnologia
Óleo essencial
0,25 0,4 ab 10,0 ab 1,2 a 30,0 a
de capim limão
Oxicloreto de cálcio¹ 0,008 1,2 ab 30,0 ab 1,3 a 32,5 a
Testemunha --- 1,3 a 32,5 a 1,4 a 35,0 a
F p/ Trat. 3,52* 3,52* 1,03NS 1,36NS
DMS 1,03 25,85 1,15 28,17
¹ Dose em g/L. * Média seguida de mesma letra, na coluna, não difere entre si pelo Teste de Tukey a 5%
de probabilidade. NS: Não significativo.

Segundo Carriconde et al. (1996), o óleo essencial do C. citratus tem como

22
propriedades terapêuticas ação antifúngica e antibacteriana, e que o principal
componente do óleo essencial do C. citratus é o citral. Com isso, percebe-se a eficácia
do óleo essencial C. citratus em efeito in vitro sobre importantes patógenos de plantas,
como no caso do C. gloeosporioides, em que obteve 100% de inibição na sua
germinação.

A utilização de plantas no controle de patógenos apresenta alguns entraves,

pois, a composição química e a quantidade são variáveis, dependendo da idade da
planta, do tipo de tecido, do tipo de solo e do seu hábitat. Isso explica, em parte, a
discrepância encontrada entre as pesquisas realizadas em diferentes locais com a
mesma metodologia e a mesma espécie de planta (SILVA, 2006).
Os óleos essenciais são muito complexos, além do mais os mecanismos de
ação não são conhecidos exatamente. Desta forma a inibição do patógeno pode ter
ocorrido pela desnaturação de proteínas, inibição de enzimas, ou ainda pela
desintegração de membrana (KUMAR, 2008).
Os resultados obtidos na Tabela 2 revelam diferenças significativas entre os
tratamentos, porém todos os resultados mostram crescimento de colônias em meio de
cultura provavelmente pelo pouco tempo de contato entre patógeno e a solução dos
tratamentos, 15 minutos.

Tabela 2: Número médio de colônias de Cryptosporiopsis perennans em meio

de cultura V8, sob efeito dos óleos de capim limão associados ou não a nanotecnologia
em comparação com desinfetante. Caxias do Sul, RS.

Doses
Número médio de
Tratamentos
v/v (%) colônias/placa
Óleo essencial de capim limão nanotecnologia 0,25 767,0 b
Óleo essencial de capim limão nanotecnologia 0,50 1500,0 a
Óleo essencial de capim limão 0,25 475,80 bc
Oxicloreto de Cálcio¹ 0,008 86,00 c
Testemunha --- 1451,00 a
F p/ Trat. 15,84**
DMS 654,10
¹ Dose em g/L. ** Média seguida de mesma letra, na coluna, não difere entre si pelo Teste de Tukey a 1%
de probabilidade.

23
Figura 4: Plaquetas com as colônias a Figura 5: Plaquetas com as colônias a
partir do tratamento de óleo essencial de partir do tratamento óleo essencial de
capim limão associado a nanotecnologia capim limão associado a nanotecnologia
na concentração 0,25% na concentração 0,50%

Figura 6: Plaquetas com as colônias a Figura 7: Plaquetas com colônias a partir

partir do tratamento de óleo essencial de do tratamento de Oxicloreto de Cálcio
capim limão na concentração 0,25%

Figura 8: Plaquetas com a testemunha

24
 Deve-se destacar a baixa quantidade de colônias para o tratamento Oxicloreto
de Cálcio, dose de 0,008 g/L, utilizado em packing-house de frutos de macieira, como
desinfetante registrado. Novamente, o baixo tempo de contato com o patógeno
proporcionou a redução do controle do mesmo.
O melhor controle em frutos, pode ser facilmente entendido pelo maior período
de contato entre os tratamentos e o patógeno, o que não ocorreu no ensaio in vitro.
Desta forma novos estudos para tempo de contato patógeno tratamento deve ser estudo
em novas pesquisas.
A redução do potencial de inibição pode ser atribuída à volatilização dos
constituintes dos óleos e/ ou à instabilidade na presença de ar, luz, calor, umidade e
metais (SIMÕES & SPITZER, 2000). Halos de inibição formaram-se, quando ocorreu o
contato de Glomerella cingulata com os óleos essenciais de camomila, gengibre e folhas
de goiabeira e de Colletotrichum gloeosporioides com camomila, goiaba e tagetes,
provavelmente devido à presença de compostos fixos com ação fungitóxica.
A exploração da atividade biológica de compostos secundários presentes no
extrato bruto ou óleo essencial em plantas medicinais pode constituir-se em mais uma
forma potencial de controle alternativo de doenças de plantas cultivadas, ao lado da
indução de resistência (SCHWAN-ESTRADA et al., 2000).
É importante salientar que a utilização de uma planta medicinal é tão complexa
quanto a sua composição, pois, do cultivo à comercialização, alterações consideráveis
podem ocorrer, comprometendo a qualidade e a quantidade dos princípios ativos. A
concentração de princípios ativos não se apresenta uniforme durante o ciclo de vida da
planta, variando com o habitat, a colheita e a preparação, sendo fundamental a
observação de fatores como procedência, identificação botânica, colheita (estágio de
desenvolvimento da planta, época e horário de coleta), tratamentos fitossanitários e
qualidade. Assim, além dos fatores acima citados, a forma de aproveitamento do
material vegetal (seco ou fresco), os métodos de extração, bem como as concentrações
utilizadas, resultarão em maior eficiência e credibilidade dos resultados (ROZWALKA,
2008).

25
5. CONCLUSÃO

De acordo com os dados obtidos conclui-se que:

Frutos banhados com óleo essencial de capim limão associado a
nanotecnologia a 0,50% apresentou a menor incidência e severidade da Podridão olho
de boi durante 7 dias.
O tempo de 15 minutos de contato entre o patógeno e as soluções dos
tratamentos não foi suficiente para controle do mesmo.
Os frutos tratados com capim limão, na concentração de 0,25% apresentaram
queimadura dos frutos.
Novos estudos devem ser realizados para aprimorar os resultados obtidos.

26
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30
7. ANEXOS

Anexo A – Frutos sendo inoculados

Anexo B – Frutos mantidos em câmara úmida

31
Anexo C – Sintoma inicial de Podridão de Olho de Boi, em fruto de macieira, cv. Fuji
Suprema.

Anexo D – Sintoma em desenvolvimento da Podridão Olho de Boi, em frutos de

macieira, cv. Fuji suprema.

32
 Anexo E – Execução do ensaio in vitro

Anexo F – vedação das placas de Petri, para ensaio in vitro.

Anexo G - Avaliação das placas de Petri repicadas com patógeno

33