Universidade de São Paulo- Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Departamento de Farmácia
Programa de Pós Graduação em Fármaco e Medicamentos

TRIAGEM BIOLÓGICA DE INIBIDORES DE SIRTUÍNA 2, CANDIDATOS

A ANTICHAGÁSICOS

Candidata: Ana Carolina Silva Rocha

Orientador: Prof. Dr. Gustavo Henrique Goulart Trossini

São Paulo
2019
 INTRODUÇÃO

• O que são Doenças Negligenciadas? São doenças de grande relevância médica, que não
possuem devida atenção dos governos e indústrias farmacêuticas;

• Doenças extremamente negligenciadas;

• Doença de Chagas e a Leishmaniose Visceral têm alta prevalência no Brasil.

Menos de 1% das pessoas infectadas são diagnosticada e tem acesso ao tratamento adequado.
(DNDI, 2015;WHO, 2016; WILLYARD, 2013;CHATELAIN, 2015)
 INTRODUÇÃO
• Doença de Chagas: A tripanossomíase americana, ou doença de Chagas, é uma endemia infecciosa
causada pelo Trypanosoma cruzi. Comumente a transmissão se dá pela picada de insetos
hematófagos da subfamília Triatominae.

epimastigota tripomastigota amastigota

Outras formas de transmissão:

Transfusão sanguínea
Transplante de órgãos
Transmissão congênita
Infecção em acidentes laboratoriais
Ingestão de alimentos contaminados
(WHO, 1992, 2016; FERREIRA; DE OLIVEIRA; ANDRICOPULO, 2016
 INTRODUÇÃO

Quimioterapia da Doença de Chagas: A quimioterapia disponível para a doença de Chagas é

composta por apenas dois fármacos, o benznidazol e o nifurtimox , ativos quase exclusivamente
na fase aguda da doença.

benznidazol nifurtimox

Efeitos Adversos
Alta toxicidade
Resistência à cepas brasileiras

(DNDI, 2015; FERREIRA, G.M.; MALTAROLLO, G. V; EMERY, F.S. E TROSSINI, 2017; URBINA, 2012)
 INTRODUÇÃO

A pesquisa de fármacos atualmente consiste na busca de um alvo molecular exclusivo do parasita.

SEGUROS E EFICAZES

EPIGENÉTICA
 INTRODUÇÃO
Epigenética
Epigenética: É definida como alterações
genéticas que ocorrem nas células e são
transmitidas às células filhas, sem qualquer
modifiicação da sequência do DNA

Principais mecanismos
epigenéticos: (Alterações Fenotípicas)

Modificações do DNA

Modificações da Cromatina(HISTONA)

(CHATELAIN, 2015; FIDALGO; GILLE, 2011; URBINA, 2012)

 INTRODUÇÃO

Silent Information Regulator

(Sir2): Promovem a
remoção catalítica do grupo acetil Superexpressão de Sir2
de lisinas utilizando o NAD+ como
cofator.
SIRTUÍNA 2 COMO ALVO
BIOQUÍMICO

Evidências indicam que inibidores

Envolvidas na acetilação de Sir2 podem
e metilação de lisinas e serinas ser considerados como
da histona de T. cruzi. alvos biológicos antiparasitários.

(NIGHTINGALE; O’NEILL; TURNER, 2006, CASCORBI; SCHWAB, 2016; TERASAWA et al., 2004; MORETTI et al., 2015)
 INTRODUÇÃO
• Inibidores de Sirtuína 2

(FERREIRA, 2018; MORETTI et al., 2015)

 INTRODUÇÃO
Triagem Biológica de Alta Demanda (HTS- High Throughput Screening)

• Proporciona inovadores modelos de ligação entre o ligante, proveniente destas coleções de

compostos e o alvo bioquímico;
• Elucida propriedades físico-químicas de um determinado composto;
• Este propicia a avaliação biológica in vitro de milhares ou até mesmo milhões de compostos
contra uma proteína alvo;
• Permitem ensaios miniaturizados de forma rápida, eficiente e confiável;

Processo-chave na descoberta de um fármaco

(FERREIRA, OLIVA, ANDRIPOPULO, 2011)

 INTRODUÇÃO

Triagem Biológica

VANTAGENS
Alta Sensibilidade do Ensaio

Respostas Objetivas Custos aceitáveis

Baixa Complexidade de Ensaio

Processamento rápido de dados de resultados

 OBJETIVOS
• Objetivo: Selecionar inibidores de Sirtuína 2 de T. cruzi, por meio de triagem biológica de coleções
de compostos.

• Objetivo Específico:

• Expressar e purificar Sirtuína 2 de T. cruzi;

• Selecionar inibidores da Sirtuína 2 por meio de triagem biológica em larga escala;

• Avaliar parâmetros quantitativos dos compostos selecionados como potência (IC50) e afinidade
(Ki);

• Elucidar os mecanismos de ação enzimática envolvidos.

 MATERIAIS E MÉTODOS

• Espectrofluorímetro Tecan Infinity 200

• Bancos de Dados de Compostos:

- LITEC (Laboratório de Integração entre Técnicas Experimentais e Computacionais no planejamento
de Fármacos (FCF/USP);
- QHETEM (Laboratório de Química Heterocíclica e Medicinal (FCFRP/USP) – Inibidores de alvos
epigenéticos;
- Prof. Márcio W. Paixão (banco de dados de compostos sintetizados pelo grupo do Prof. Márcio W.
Paixão (UFSCAR)) – Derivados peptidiomiméticos;
- ASTERBIOCHEM (Química e Biologia de Asteraceas (FCFRP/USP) – Produtos naturais.

• Enzimas
- Sirtuína 2 de T. cruzi recombinante produzida por técnicas de biologia molecular em colaboração com
o Prof. Sandro R. Marana do IQ-USP;
 Triagem Biológica
ETAPAS
 MATERIAIS E MÉTODOS

• Expressão e purificação da Sirtuína 2 de T. cruzi

Inserção plasmídeo na bactéria

(

E. coli

Expressão Sirtuína 2

(KOWIESKI, LEE, DENU, 2008).

 MATERIAIS E MÉTODOS
• Triagem biológica de inibidores de Sirtuína 2 por fluorimetria

Os compostos serão ensaiados em dose única, a ser determinada para cada coleção, de modo a
avaliar sua capacidade inibitória da enzima. Os testes em dose única serão realizados em triplicata.

Para os compostos que apresentarem capacidade inibitória acima de 50% da

atividade enzimática, serão determinados valores de potência (IC50) e afinidade
(Ki).

(COPELAND, 2013)
 MATERIAIS E MÉTODOS

• Ensaios de inibição e cinética enzimática para Sirtuína 2 por fluorimetria

Será investigado o efeito de pelo menos 7 concentrações de cada composto sobre a atividade
catalítica tcSir2. Os ensaios serão realizados em triplicado em experimentos independentes.

(TELES et al,2018; COPELAND, 2013)

 ATIVIDADES REALIZADAS ATÉ O MOMENTO

➢ Participação em reuniões e seminários de grupo desde Novembro 2018;

➢ Acompanhamento de ensaios de cinética enzimática desde Novembro 2018;

➢ Expressão e purificação de Sir2 parasitárias desde Março de 2019.

 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
Atividade 1°-6° meses 7°-12° meses 13°-18° 18°-24 meses

Revisão bibliográfica

Expressão e purificação da Sirtuína 2 de T.

cruzi

Seleção de bancos de dados de compostos

Ensaios de inibição de Sirtuína 2 em dose

única (ensaio de dose única e determinação de
IC50)

Estudos de cinética enzimática para os

compostos selecionados

Redação de artigos e relatórios