Biocatalise

BOMMARIUS, A. S.; RIEBEL, B. R. Biocatalysis: Fundamentals and Applications

1 Introdução à Biocatálise 1
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador 19
3 Isolamento e Preparação de Microrganismos 43
4 Ferramentas de Biologia Molecular para Biocatálise 61
5 Engenharia de Reação Enzimática 91
6 aplicações de enzimas como ativos em massa:
Detergentes, Têxteis, Papel e Celulose, Alimentação Animal 135
7 Aplicação de Enzimas como Catalisadores: Produtos Químicos Básicos, Químicos Finos,
Alimentos,
Proteção de Cultivos, Produtos Farmacêuticos a Granel 159
8 etapas de processamento biotecnológico para fabricação de enzimas 209
9 Métodos para Investigação de Proteínas 2
10 Engenharia de Proteínas 281
11 Aplicações da Tecnologia de DNA Recombinante: Evolução Dirigida 309
12 Biocatálise em meios não convencionais 339
13 Aplicações Farmacêuticas da Biocatálise 373
14 Bioinformática 413
15 Biologia de Sistemas para Biocatálise 433
16 Evolução da Função Biocatalítica 457
17 Estabilidade de Proteínas 487
18 Enzimas Artificiais 511
19 Projeto de Processos Biocatalíticos 539
20 Comparação de Catalisadores Biológicos e Químicos para Novos Processos 569
1 Introdução à Biocatálise 1
1.1 Visão Geral: A Situação da Biocatálise na Virada do Século 21 2
1.1.1 Estado de Aceitação da Biocatálise 2
1.1.2 Vantagens e Desvantagens Atuais da Biocatálise 4
1.1.2.1 Vantagens dos Biocatalisadores 4
1.1.2.2 Desvantagens dos Biocatalisadores Atuais 5
1.2 Características da Biocatálise como Tecnologia 6
1.2.1 Disciplinas Contribuintes e Áreas de Aplicação 6
1.2.2 Características das Transformações Biocatalíticas 7
1.2.2.1 Comparação da Biocatálise com outros Tipos de Catálise 8
1.2.3 Aplicações da Biocatálise na Indústria 9
1.2.3.1 Indústria Química do Futuro: Ambientalmente Benigna
Manufatura, Química Verde, Desenvolvimento Sustentável no
Futuro 9
1.2.3.2 Medicamentos Enantiomericamente Puros ou Produtos Farmacêuticos Avançados
Intermediários (APIs) 10
1.3 Penetração Atual da Biocatálise 11
1.3.1 O Passado: Resumo Histórico da Catálise Enzimática 11
1.3.2 O Presente: Situação dos Processos Biocatalíticos 11
1.4 A amplitude da biocatálise 14
1.4.1 Nomenclatura de Enzimas 14
1.4.2 Biocatálise e Química Orgânica, ou
“Precisamos esquecer nossa química orgânica?” 14

2 Caracterização de um (Bio-)catalisador 19
2.1 Caracterização da Catálise Enzimática 20
2.1.1 Base da Atividade das Enzimas: O que é Catálise Enzimática? 20
2.1.1.1 Reação Enzimática em um Diagrama de Coordenadas de Reação 21
2.1.2 Desenvolvimento da Cinética Enzimática a partir da Ligação e Catálise 21
Biocatálise. Andreas S. Bommarius e Bettina R. Riebel
Direitos autorais © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.
ISBN: 3-527-30344-8
X Conteúdo
2.2 Fontes e Razões para a Atividade das Enzimas como Catalisadores 23
2.2.1 Cronologia das Teorias Mais Importantes da Atividade Enzimática 23
2.2.2 Origem da Atividade Enzimática: Derivação da Equação de Kurz 24
2.2.3 Consequências da Equação de Kurz 25
2.2.4 Eficiência da Catálise Enzimática: Além do Postulado 28 de Pauling
2.3 Critérios de Desempenho para Catalisadores, Processos e Rotas de Processo 30
2.3.1 Critérios Básicos de Desempenho para um Catalisador: Atividade, Seletividade e
Estabilidade de Enzimas 30
2.3.1.1 Atividade 30
2.3.1.2 Seletividade 31
2.3.1.3 Estabilidade 32
2.3.2 Critérios de Desempenho para o Processo 33
2.3.2.1 Rendimento do Produto 33
2.3.2.2 Produtividade do (Bio)catalisador 34
2.3.2.3 Estabilidade do (bio)catalisador 34
2.3.2.4 Produtividade do Reator 35
2.3.3 Ligações entre Parâmetros de Desempenho de Reação Enzimática 36
2.3.3.1 Aceleração da Taxa 36
2.3.3.2 Razão entre a Constante Catalítica kcat e a Constante da Taxa de Desativação kd
38
2.3.3.3 Relação entre Constante de Taxa de Desativação kd e
Número de faturamento total TTN 38
2.3.4 Critérios de Desempenho para Esquemas de Processo, Economia Atômica e
Quociente Ambiental 39
Consulte os detalhes

3 Isolamento e Preparação de Microrganismos 43

3.1 Introdução 44
3.2 Triagem de Novas Atividades Enzimáticas 46
3.2.1 Taxas de crescimento na natureza 47
3.2.2 Métodos em Ecologia Microbiana 47
3.3 Desenvolvimento de Deformação 48
3.3.1 Gama de Produtos Industriais de Microrganismos 48
3.3.2 Melhoria de Deformação 50
3.4 Extremófilos 52
3.4.1 Extremófilos na Indústria 54
3.5 Triagem Rápida de Biocatalisadores 56

4 Ferramentas de Biologia Molecular para Biocatálise 61

4.1 Noções básicas de biologia molecular: DNA versus proteína nível 62
4.2 Isolamento e Purificação de DNA 65
4.2.1 Quantificação de DNA/RNA 66
4.3 Isolamento, Detecção e Verificação de Genes 67
4.3.1 Reação em Cadeia da Polimerase 67
4.3.2 Otimização de uma reação de PCR 69
4.3.3 Técnicas Especiais de PCR 71
4.3.3.1 PCR aninhado 71
4.3.3.2 PCR Inverso 71
4.3.3.3 RACE: Amplificação Rápida de cDNA Termina 71
4.3.4 Mancha Sul 74
4.3.4.1 Projeto e Rotulagem da Sonda 76
4.3.4.2 Hibridização 76
4.3.4.3 Detecção 76
4.3.5 Sequenciamento de DNA 77
4.4 Técnicas de Clonagem 77
4.4.1 Mapeamento de Restrições 78
4.4.2 Vetores 78
4.4.3 Ligadura 80
4.4.3.1 Propagação de Plasmídeos e Transformação em Hosts 81
4.5 (Sobre)expressão de uma função enzimática em um hospedeiro 81
4.5.1 Escolha de um Sistema de Expressão 81
4.5.2 Tradução e uso de códons em E. coli 82
4.5.3 Escolha do Vetor 84
4.5.3.1 Geração de Órgãos de Inclusão 85
4.5.3.2 Expressão de Proteínas de Fusão 85
4.5.3.3 Expressão de Superfície 87
4.5.4 Expressão de Genes Eucarióticos em Leveduras 87

5 Engenharia de Reação Enzimática 91

5.1 Modelagem Cinética: Justificativa e Propósito 92
5.2 O Mundo Ideal: Cinética Ideal e Reatores Ideais 94
5.2.1 O Caso Clássico: Equação 94 de Michaelis-Menten
5.2.2 Projeto de Reatores Ideais 96
5.2.3 Equação Integrada de Michaelis-Menten em Reatores Ideais 96
5.2.3.1 Caso 1: Sem Inibição 97
5.3 Enzimas com Ligação Desfavorável: Inibição 97
5.3.1 Tipos de Inibidores 97
5.3.2 Equação Integrada de Michaelis-Menten para Substrato e Produto
Inibição 99
5.3.2.1 Caso 2: Equação Integrada de Michaelis-Menten na Presença de
Inibidor de Substrato 99
5.3.2.2 Caso 3: Equação Integrada de Michaelis-Menten na Presença de
Inibidor 99
5.3.3 A relação KI –[I]50: outra aplicação útil do mecanismo
Elucidação 103
5.4 Engenharia de Reatores 105
5.4.1 Configuração de Reatores Enzimáticos 105
5.4.1.1 Números Adimensionais Característicos para Projeto de Reator 107
5.4.2 Reator Enzimático Imobilizado (Reator de Leito Fixo com Plug-Flow) 108
5.4.2.1 Equações de Projeto de Reator 108
5.4.2.2 Imobilização 109
XII Conteúdo
5.4.2.3 Condições Ótimas para um Reator Enzimático Imobilizado 110
5.4.3 Reator de Membrana Enzimática (Reator de Tanque de Agitação Contínua, CSTR)
110
5.4.3.1 Equação de Projeto: Equação e Retenção do Reator 110
5.4.3.2 Classificação de Reatores de Membrana Enzimática 111
5.4.4 Regras para Escolha de Parâmetros de Reação e Reatores 113
5.5 Reações Enzimáticas com Transferência de Massa Incompleta: Influência de
Imobilização 113
5.5.1 Difusão Externa (Difusão de Filme) 114
5.5.2 Difusão Interna (Difusão de Poros) 114
5.5.3 Métodos de Teste para Limitações de Transferência de Massa 116
5.5.4 Influência da Transferência de Massa nos Parâmetros de Reação 118
5.6 Enzimas com Estabilidade Incompleta: Cinética de Desativação 119
5.6.1 Estabilidade de Repouso 119
5.6.2 Estabilidade Operacional 120
5.6.3 Comparação de Estabilidade de Repouso e Operacional 122
5.6.4 Estratégia para a adição de enzima fresca à enzima desativada em
Reatores Contínuos 124
5.7 Enzimas com Seletividade Incompleta: E-Value e sua Otimização
126
5.7.1 Derivação do Valor E 126
5.7.2 Otimização da Separação de Racematos por Escolha do Grau de
Conversão 128
5.7.2.1 Otimização de uma Reação Irreversível 128
5.7.2.2 Enantiosseletividade de uma Reação de Equilíbrio 129
5.7.2.3 Determinação da Pureza Enantiomérica a partir de um Gráfico de Tempo de Conversão
130
5.7.3 Otimização da Razão Enantiomérica E pela Escolha da Temperatura 130
5.7.3.1 Derivação da Temperatura de Isoinversão 130
5.7.3.2 Exemplo de Otimização de Enantiosseletividade por Escolha de
Temperatura 131

6 aplicações de enzimas como ativos em massa:

Detergentes, Têxteis, Papel e Celulose, Alimentação Animal 135
6.1 Aplicação de Enzimas em Detergentes para Lavanderia 136
6.1.1 Visão Geral 136
6.1.2 Proteases contra manchas de sangue e ovo 138
6.1.3 Lipases contra manchas de graxa 139
6.1.4 Amilases contra sujeira de grama e amido 139
6.1.5 Celulases 139
6.1.6 Enzimas de Alvejante 140
6.2 Enzimas na Indústria Têxtil: Jeans Stone-washed, Algodão Brilhante
Superfícies 140
6.2.1 Acúmulo e Modo de Ação de Enzimas para a Indústria Têxtil 140
6.2.2 Celulases: a aparência mais brilhante 141
Conteúdo XIII
6.2.3 Lavagem de pedra: Biostonagem de jeans: a aparência desgastada 143
6.2.4 Peroxidases 144
6.3 Enzimas na Indústria de Celulose e Papel: Branqueamento de Celulose com
Xilanases ou Lacases 145
6.3.1 Introdução 145
6.3.2 Madeira 146
6.3.2.1 Celulose 146
6.3.2.2 Hemicelulose 147
6.3.2.3 Lignina 147
6.3.3 Fabricação de Papel: Processo de Polpação Kraft 149
6.3.4 Pesquisa sobre Enzimas na Indústria de Papel e Celulose 150
6.3.4.1 Lacases 150
6.3.4.2 Xilanases 151
6.3.4.3 Celulases no Processo de Fabricação de Papel 152
6.4 Fitase para Alimentação Animal: Utilização de Fósforo
6.4.1 O Negócio de Animais de Fazenda e o Meio Ambiente 152
6.4.2 Fitase 153
6.4.3 Eficácia da Fitase: Redução do Fósforo 154
6.4.4 Eficácia da Fitase: Efeito sobre Outros Nutrientes 155

7 Aplicação de Enzimas como Catalisadores: Produtos Químicos Básicos, Químicos Finos,

Alimentos,
Proteção de Cultivos, Produtos Farmacêuticos a Granel 159
7.1 Enzimas como Catalisadores em Processos para Produtos Químicos Básicos 160
7.1.1 Nitrila Hidratase: Acrilamida de Acrilonitrila, Nicotinamida de
3-Cianopiridina e 5-Cyanovaleramida de Adiponitrila 160
7.1.1.1 Acrilamida de Acrilonitrila 160
7.1.1.2 Nicotinamida de 3-Cianopiridina 162
7.1.1.3 5-Cyanovaleramida de Adiponitrila 162
7.1.2 Nitrilase: 1,5-Dimetil-2-piperidona de 2-Metilglutaronitrila 163
7.1.3 Tolueno Dioxigenase: Índigo ou Prostaglandinas de Substituídas
Benzenos via cis-Dihidrodióis 163
7.1.4 Oxinitrilase (Hidroxi Nitrila Liase, HNL): Cianoidrinas de
Aldeídos 167
7.2 Enzimas como Catalisadores na Indústria de Química Fina 170
7.2.1 Quiralidade e as Regras de Cahn – Ingold – Prelog e Pfeiffer 170
7.2.2 Aminoácidos Enantiomericamente Puros 172
7.2.2.1 O Processo de Aminoacilase 172
7.2.2.2 O Processo Amidase 174
7.2.2.3 O Processo Hidantoinase/Carbamoilase 174
7.2.2.4 Aminação Redutiva de Cetoácidos (l-terc-Leucina como Exemplo) 177
7.2.2.5 Aspartase 180
7.2.2.6 l-Aspartato-β-descarboxilase 180
7.2.2.7 Ácido l-2-aminobutírico 181
7.2.3 Hidroxiácidos, Álcoois e Aminas Enantiomericamente Puros 182
7.2.3.1 Fumarase 182
7.2.3.2 Aminas Enantiomericamente Puras com Lipase 182
7.2.3.3 Síntese de Aminas Enantiomericamente Puras através de Transaminação
183
7.2.3.4 Hidroxi ésteres com carbonil redutases 185
7.2.3.5 Álcoois com ADH 186
7.3 Enzimas como Catalisadores na Indústria Alimentar 187
7.3.1 HFCS com Glicose Isomerase (GI) 187
7.3.2 Aspartame®, adoçante artificial por meio de síntese enzimática de peptídeos
188
7.3.3 Hidrólise da Lactose 191
7.3.4 “Nutracêuticos”: l-Carnitina como Nutriente para Atletas e
Convalescentes (Lonza) 191
7.3.5 Descarboxilases para melhorar o sabor da cerveja 194
7.4 Enzimas como Catalisadores para Produtos Químicos de Proteção de Cultivos 195
7.4.1 Intermediário para Herbicidas: Ácido (R)-2-(4-Hidroxifenoxipropiônico
(BASF, Alemanha) 195
7.4.2 Aplicações de Transaminases em Agentes de Proteção de Cultivos:
l-Fosfinotricina e (S)-MOIPA 196
7.5 Enzimas para Intermediários Farmacêuticos em Grande Escala 197
7.5.1 Penicilina G (ou V) Amidase (PGA, PVA):
Precursores de β-lactâmicos, β-lactâmicos semissintéticos 197
7.5.2 Efedrina 200

8 etapas de processamento biotecnológico para fabricação de enzimas 209

8.1 Introdução ao Isolamento e Purificação de Proteínas 210
8.2 Noções básicas de fermentação 212
8.2.1 Requisitos Médios 213
8.2.2 Esterilização 214
8.2.3 Fases de uma Fermentação 214
8.2.4 Modelagem de uma Fermentação 215
8.2.5 Modelos de Crescimento 216
8.2.6 Cultura Fed-Batch 216
8.3 Fermentação e seu Principal Desafio: Transferência de Oxigênio 218
8.3.1 Determinação da Demanda de Oxigênio Necessária das Células 218
8.3.2 Cálculo do Transporte de Oxigênio na Solução Fermentadora 219
8.3.3 Determinação de kL, a e kLa 220
8.3.2.1 Métodos de Medição do Produto kLa 221
8.4 Processamento Downstream: Purificação Bruta de Proteínas 223
8.4.1 Separação (Centrifugação) 223
8.4.2 Homogeneização 225
8.4.3 Precipitação 226
8.4.3.1 Precipitação em Solventes Orgânicos Miscíveis em Água 228
8.4.3.2 Construindo Modelos Quantitativos para a Série Hofmeister e Cohn–
Equações de Edsall e Setschenow 228
8.4.4 Extração Aquosa Bifásica 229
Conteúdo XV
8.5 Processamento Downstream: Concentração e Purificação de Proteínas
231
8.5.1 Diálise (Ultrafiltração) (adaptado em parte de Blanch, 1997) 231
8.5.2 Cromatografia 233
8.5.2.1 Teoria da Cromatografia 233
8.5.2.2 Diferentes Tipos de Cromatografia 235
8.5.3 Secagem: Secagem por Pulverização, Liofilização, Estabilização para Armazenamento 236
8.6 Exemplos de Purificação de Biocatalisador 237
8.6.1 Exemplo 1: Álcool Desidrogenase [(R)-ADH de L. brevis (Riebel,
1997)] 237
8.6.2 Exemplo 2: l-aminoácido oxidase de Rhodococcus opacus (Geueke
2002a,b) 238
8.6.3 Exemplo 3: Xilose Isomerase da Cepa Thermoanaerobium JW/SLYS 489 240
9 Métodos para Investigação de Proteínas 243
9.1 Relevância do Mecanismo Enzimático 244
9.2 Métodos Experimentais para a Investigação de um Mecanismo Enzimático
245
9.2.1 Distribuição de Produtos (Princípio Curtin-Hammett) 245
9.2.2 Métodos Estacionários de Cinética Enzimática 246
9.2.3 Relações Lineares de Entalpia Livre (LFERs): Brønsted e Hammett
Efeitos 248
9.2.4 Efeitos de Isótopos Cinéticos 249
9.2.5 Métodos Não Estacionários de Cinética Enzimática: Titulação de Sítios Ativos
249
9.2.5.1 Determinação da Concentração de Sítios Ativos 249
9.2.6 Utilidade do Mecanismo de Elucidação: Analógico do Estado de Transição
Inibidores 251
9.3 Métodos de Determinação de Enzimas 253
9.3.1 Quantificação de Proteína 253
9.3.2 Determinação do Ponto Isoelétrico 254
9.3.3 Determinação da Massa Molecular do Monômero Proteico: SDS-PAGE 254
9.3.4 Massa de uma Proteína Oligomérica: Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC)
256
9.3.5 Determinação de Massa: Espectrometria de Massa (MS) (após Kellner,
Lottspeich, Meyer) 257
9.3.6 Determinação da Sequência de Aminoácidos por Degradação Tríptica, ou
Digestão Ácida, Química ou Enzimática 258
9.4 Mecanismos Enzimáticos: Catálise Ácido-Base Geral 258
9.4.1 Anidrase Carbônica II 258
9.4.2 Vanádio Haloperoxidase 260
9.5 Catálise Nucleofílica 261
9.5.1 Serina Proteases 261
9.5.2 Cisteína no Ataque Nucleofílico 265
XVI Conteúdo
9.5.3 Lipase, Outro Mecanismo da Tríade Catalítica 266
9.5.4 Metaloproteases 268
9.6 Catálise eletrofílica 269
9.6.1 Utilização de íons metálicos: ADH, uma tríade catalítica diferente 269
9.6.1.1 Mecanismo Catalítico da Álcool Desidrogenase do Fígado de Cavalo,
uma Desidrogenase de Cadeia Média 269
9.6.1.2 Mecanismo de reação catalítica de Drosophila ADH,
uma desidrogenase de cadeia curta 271
9.6.2 Formação de uma Base de Schiff, Parte I: Acetoacetato Descarboxilase, Aldolase
274
9.6.3 Formação de uma Base de Schiff com Piridoxal Fosfato (PLP):
Alanina Racemase, Aminoácido Transferase 275
9.6.4 Utilização de Pirofosfato de Tiamina (TPP): Transcetolase 277
10 Engenharia de Proteínas 281
10.1 Introdução: Elementos de Engenharia de Proteínas 282
10.2 Métodos de Engenharia de Proteínas 283
10.2.1 PCR de Fusão 284
10.2.2 Método Kunkel 285
10.2.3 Mutagênese específica do local usando o kit QuikChange da Stratagene
287
10.2.4 Reação em Cadeia Combinada (CCR) 288
10.3 Glicose (Xilose) Isomerase (GI) e Glicoamilase: Aprimoramento de
Termoestabilidade 289
10.3.1 Melhoria da termoestabilidade na glicose isomerase (GI) 289
10.3.2 Resolvendo o Mecanismo de Reação da Glicose Isomerase (GI):
Isomerase de glicose com difusão limitada? 292
10.4 Melhoria da Estabilidade de Proteases Contra Oxidação e Térmica
Desativação 293
10.4.1 Melhoria da estabilidade de oxidação da subtilisina 293
10.4.2 Termoestabilidade da Subtilisina 295
10.5 Criando Novas Enzimas com Engenharia de Proteínas 295
10.5.1 Redesenho de uma Lactato Desidrogenase 295
10.5.2 Peroxidases Sintéticas 297
10.6 Desidrogenases, Alterando a Especificidade do Cofator 298
10.7 Oxigenases 300
10.8 Mudança de Enantiosseletividade com Mutagênese Específica do Local 302
10.9 Técnicas que conectam diferentes técnicas de engenharia de proteínas 303
10.9.1 Mutantes Quimicamente Modificados, um Casamento de Modificação Química
e Engenharia de Proteínas 303
10.9.2 Expansão da Especificidade do Substrato com Engenharia de Proteínas e
Evolução Dirigida 304
11 Aplicações da Tecnologia de DNA Recombinante: Evolução Dirigida 309
11.1 Antecedentes da Evolução das Proteínas 310
Conteúdo XVII
11.1.1 Objetivo da Evolução Dirigida 310
11.1.2 Evolução e Probabilidade 311
11.1.3 Evolução: Conservação de Componentes Essenciais da Estrutura 313
11.2 Etapas do processo na Evolução Dirigida: Criando Diversidade e Verificando
para acessos 314
11.2.1 Criação de Diversidade em uma Biblioteca de DNA 315
11.2.2 Teste para Acertos Positivos: Triagem ou Seleção 318
11.3 Protocolos Experimentais para Evolução Dirigida 319
11.3.1 Criando mergulho
11.3.2 Criando Diversidade: Métodos de Recombinação 319
11.3.2.1 Embaralhamento de DNA 320
11.3.2.2 Processo de Extensão Escalonado (StEP) 321
11.3.2.3 RACHITT (Quimeragênese Aleatória em Modelos Transientes) 322
11.3.3 Verificação de Acertos: Ensaios de Triagem 323
11.3.4 Verificação de Acertos: Procedimentos de Seleção 324
11.3.5 Técnicas Adicionais de Evolução Dirigida 325
11.4 Exemplos de sucesso da aplicação da evolução dirigida 325
11.4.1 Aplicação de PCR propenso a erros: Ativação de Subtilisina em DMF 325
11.4.2 Aplicação de DNA Shuffling: Recombinação de p-Nitrobenzil
Genes Esterase 326
11.4.3 Melhoria da Termoestabilidade: p-Nitrofenil Esterase 328
11.4.4 Seleção em vez de Triagem: Criação de um Corisma Monomérico
Mutase 329
11.4.5 Melhoria da Enantiosseletividade: Lipase de Pseudomonas aeruginosa
329
11.4.6 Inversão de Enantiosseletividade: Hidantoinase 330
11.4.7 Redesenho do sítio ativo de uma enzima: KDPG Aldolase 331
11.5 Comparação de Técnicas de Evolução Dirigida 331
11.5.1 Comparação de PCR propenso a erros e embaralhamento de DNA:
Aumento da resistência contra antibióticos 331
11.5.2 Engenharia de Proteínas em Comparação com Evolução Dirigida:
Aminotransferases 332
11.5.2.1 Evolução Dirigida de Aminotransferases 332
11.5.3 Evolução Dirigida de uma Via: Carotenóides 333
12 Biocatálise em meios não convencionais 339
12.1 Enzimas em Solventes Orgânicos 340
12.2 Evidências das Vantagens Percebidas dos Biocatalisadores em Meios Orgânicos
341
12.2.1 Vantagem 1: Melhoria da Solubilidade dos Reagentes 341
12.2.2 Vantagem 2: Mudança de Equilíbrio em Meios Orgânicos 342
12.2.2.1 Reatores Bifásicos 342
12.2.3 Vantagem 3: Separação Mais Fácil 343
12.2.4 Vantagem 4: Estabilidade Aprimorada de Enzimas em Solventes Orgânicos 344
12.2.5 Vantagem 5: Seletividade Alterada de Enzimas em Solventes Orgânicos 344
XVIII Conteúdo
12.3 Estado do Conhecimento do Funcionamento de Enzimas em Solventes 344
12.3.1 Gama de Enzimas, Reações e Solventes 344
12.3.2 A Importância da Água nas Reações Enzimáticas em Solventes Orgânicos
345
12.3.2.1 Troca de moléculas de água entre a superfície da enzima e
Solvente Orgânico a Granel 345
12.3.2.2 Relevância da Atividade Aquática 346
12.3.3 Química Física Orgânica de Enzimas em Solventes Orgânicos 347
12.3.3.1 Local Ativo e Mecanismo 347
12.3.3.2 Flexibilidade de Enzimas em Solventes Orgânicos 347
12.3.3.3 Polaridade e Hidrofobicidade do Estado de Transição e Local de Ligação 348
12.3.4 Correlação do Desempenho da Enzima com Parâmetros do Solvente 349
12.3.4.1 Controle através da Variação da Hidrofobocidade: log P Conceito 350
12.3.4.2 Correlação da Enantiosseletividade com a Polaridade do Solvente e
Hidrofobicidade 350
12.4 Manuseio Ideal de Enzimas em Solventes Orgânicos 351
12.4.1 Memória Enzimática em Solventes Orgânicos 352
12.4.2 Baixa Atividade em Solventes Orgânicos Comparados à Água 353
12.4.3 Aumento da Seletividade de Enzimas em Solventes Orgânicos 354
12.5 Novos Meios de Reação para Transformações Biocatalíticas 355
12.5.1 Substrato como Solvente (Substratos Puros):
Acrilamida de Acrilonitrila com Nitrila Hidratase 355
12.5.2 Solventes Supercríticos 356
12.5.3 Líquidos Iônicos 356
12.5.4 Emulsões [Fabricação de Fosfatidilglicerol (PG)] 357
12.5.5 Microemulsões 358
12.5.6 Cristais Líquidos 358
12.5.7 Misturas Gelo-Água 359
12.5.8 Suspensões Eutéticas de Alta Densidade 361
12.5.9 Suspensões de Sal de Alta Densidade 362
12.5.10 Síntese Sólido para Sólido 363
12.6 Solvente como Parâmetro para Otimização de Reação (“Médio
Engenharia”) 366
12.6.1 Mudança de Especificidade do Substrato com Mudança de ReaçãoM:
Especificidade das Serina Proteases 366
12.6.2 Mudança de Regiosseletividade por Meio Solvente Orgânico 367
12.6.3 Controle de Solvente de Enantioespecificidade de Nifedipinas 367
13 Aplicações Farmacêuticas da Biocatálise 373
13.1 Inibição Enzimática para o Combate a Doenças 374
13.1.1 Introdução 374
13.1.2 Procedimento para Desenvolvimento de Medicamentos Farmacologicamente Ativos
Compostos 376
13.1.3 Processo para Registro de Novos Medicamentos 377
13.1.4 Medicamentos Quirais versus Não Quirais 379
XIX
13.2 Cascatas Enzimáticas e Biologia de Doenças 380
13.2.1 Antibióticos β-lactâmicos 380
13.2.2 Inibição da Biossíntese do Colesterol (em parte após Suckling, 1990)
382
13.2.3 Enfisema Pulmonar, Osteoartrite: Elastase Leucocitária Humana
(HLE) 385
13.2.4 AIDS: Transcriptase Reversa e Inibidores da Protease do HIV 389
13.3 Aplicações Farmacêuticas da Biocatálise 393
13.3.1 Antiinfecciosos (ver também Capítulo 7, Seção 7.5.1) 393
13.3.1.1 Cilastatina 393
13.3.2 Medicamentos Anticolesterol 393
13.3.2.1 Inibidores de Absorção de Colesterol 395
13.3.3 Medicamentos Anti-AIDS 396
13.3.3.1 Abacavir Intermediário 396
13.3.3.2 Lobucavir Intermediário 397
13.3.3.3 cis-Aminoindanol: Bloco de Construção para Indinavir (Crixivan®) 397
13.3.4 Tratamento de Hipertensão Arterial 398
13.3.4.1 Biotransformações em direção ao Omapatrilat 398
13.3.4.2 Reações de Lipase a Intermediários para Terapia Cardiovascular 400
13.4 Aplicações de Reações Biocatalíticas Específicas em Pharma 402
13.4.1 Redução de Compostos Ceto com Células Inteiras 402
13.4.1.1 Trimegestona 402
13.4.1.2 Redução do Precursor do Carbono Inibidor de anidrase ic L-685393 404
13.4.1.3 Montelucaste 404
13.4.1.4 LY300164 404
13.4.2 Aplicações de Pen G Acilase em Pharma 406
13.4.2.1 Loracarbef® 406
13.4.2.2 Xemilofibrano 406
13.4.3 Aplicações de Lipases e Esterases em Pharma 407
13.4.3.1 Antagonista LTD4 MK-0571 407
13.4.3.2 Tetrahidrolipstatina 407
14 Bioinformática 413
14.1 Ponto de partida: da consequência (função) à sequência 414
14.1.1 Caminho Convencional: da Função à Sequência 414
14.1.2 Caminho Novo: da Sequência à Consequência (Função) 414
14.2 Bioinformática: o que é, por que precisamos dela e por que agora? (NCBI
Página inicial) 415
14.2.1 O que é Bioinformática? 415
14.2.2 Por que precisamos da bioinformática? 416
14.2.3 Por que a bioinformática agora? 416
14.3 Ferramentas de Bioinformática: Bancos de Dados, Alinhamentos, Mapeamento Estrutural
418
14.3.1 Bancos de Dados Disponíveis 418
14.3.2 Banco de Dados de Proteínas (PDB) 418
Conteúdo
XX Conteúdo
14.3.3 Explorador de Proteínas 419
14.3.4 Servidor ExPASy: Caminhos Bioquímicos da Roche Applied Science 419
14.3.5 GenBank 419
14.3.6 SwissProt420
14.3.7 Informações sobre uma enzima: o exemplo das desidrogenases 420
14.3.7.1 Informações de Sequência 421
14.3.7.2 Informações Estruturais 422
14.4 Ferramentas de Bioinformática Aplicada, com Exemplos 422
14.4.1 EXPLOSÃO 422
14.4.2 Alinhando diversas sequências de proteínas usando ClustalW 425
14.4.3 Tarefa: Análise do Genoma Completo 427
14.4.4 Árvore Filogenética 427
14.5 Bioinformática para Informações Estruturais sobre Enzimas 429
14.5.1 O Status da Previsão da Estrutura Tridimensional da Proteína 430
14.6 Conclusão e Perspectivas 431
15 Biologia de Sistemas para Biocatálise 433
15.1 Introdução à Biologia de Sistemas 434
15.1.1 Abordagem Sistémica versus Reducionismo 434
15.1.2 Conclusão dos Genomas: Homem, Minhoca e Outros 435
15.2 Genômica, Proteômica e outras -ômicas 435
15.2.1 Genômica 435
15.2.2 Proteômica 436
15.3 Tecnologias para Biologia de Sistemas 438
15.3.1 Eletroforese em Gel Bidimensional (PÁGINA 2D) 438
15.3.1.1 Separação por Cromatografia ou Eletroforese Capilar 439
15.3.1.2 Separação por Marcação Química 440
15.3.2 Espectroscopia de Massa 441
15.3.2.1 MALDI-TOF-MS
(MS de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz) 444
15.3.2.2 ESI-triplo-quadrupolo MS 444
15.3.2.3 ESI-MS usando um analisador Ion Trap 445
15.3.3 Microarranjos de DNA 446
15.3.4 Microarranjos de Proteínas 447
15.3.5 Aplicações de Genômica e Proteômica em Biocatálise 448
15.3.5.1 Bactérias do Ácido Lático e Proteômica 448
15.4 Engenharia Metabólica 449
15.4.1 Conceitos de Engenharia Metabólica 449
15.4.2 Exemplos de Engenharia Metabólica 451
16 Evolução da Função Biocatalítica 457
16.1 Introdução 458
16.1.2 Congruência de Sequência, Função, Estrutura e Mecanismo 460
16.2 Características de Pesquisa para Relacionamento em Proteínas 461
16.2.1 Classificação de parentesco de proteínas: a família -log 461
XXI
16.2.2 Classificação em Famílias de Proteínas 464
16.2.3 Domínio de Diferentes Mecanismos 465
16.3 Evolução da Nova Função na Natureza 466
16.3.1 Proteínas de Dupla Funcionalidade 469
16.3.1.1 Proteínas do Moonlighting 469
16.3.1.2 Promiscuidade Catalítica 469
16.3.2 Duplicação de Genes 470
16.3.3 Transferência Horizontal de Genes (HGT) 471
16.3.4 Permutação Circular 474
16.4 Proteínas α/β-Barrel como Modelo para a Investigação da Evolução 474
16.4.1 Por que estudar proteínas de barril α/β? 474
16.4.2 Exemplo de Duplicação Genética: Vias Mandelato e a-Cetoadipato
475
16.4.2.1 Descrição da Função 480
16.4.3 Troca de Função nas Vias de Biossíntese Aromática: Trp e
Seus Caminhos 481
17 Estabilidade de Proteínas 487
17.1 Resumo: Dobramento de Proteínas, Decaimento de Primeira Ordem, Lei de Arrhenius 488
17.1.1 O Problema do Dobramento de Proteínas 488
17.1.2 Por que as proteínas se dobram? 489
17.2 Modelo de Dois Estados: Estabilidade Termodinâmica de Proteínas (Desdobramento)
491
17.2.1 Desdobramento e Desativação de Proteínas 491
17.2.2 Termodinâmica de Proteínas 491
17.3 Modelo de Três Estados: Equação de Lumry-Eyring 493
17.3.1 Desativação Enzimática 493
17.3.2 Modelo de Desativação Empírica 494
17.4 Modelo de Quatro Estados: Agregação de Proteínas 496
17.4.1 Dobragem, Desativação e Agregação 496
17.4.2 Modelo para contabilizar a competição entre corpo dobrável e de inclusão
Formação 498
17.4.2.1 Caso 1: In Vitro – Síntese de Proteínas Sem Importância 498
17.4.2.2 Caso 2: In Vivo – Síntese de Proteínas Incluída 499
17.5 Causas de Instabilidade de Proteínas: ∆G < 0, γ(t), A 501
17.5.1 Inativação Térmica 502
17.5.2 Desativação sob Influência de Agitação 503
17.5.3 Desativação sob Influência de Bolhas de Gás 504
17.5.4 Desativação sob Influência de Interfaces Aquosas/Orgânicas 505
17.5.5 Desativação sob Influência de Sais e Solventes 505
17.6 Relevância Biotecnológica do Dobramento de Proteínas: Órgãos de Inclusão 505
17.7 Resumo: Estabilização de Proteínas 506
17.7.1 Correlação entre Estabilidade e Estrutura 507
Conteúdo
XXII
18 Enzimas Artificiais 511
18.1 Anticorpos Catalíticos 512
18.1.1 Princípio dos Anticorpos Catalíticos: Conexão entre Química e
Imunologia 512
18.1.2 Seleção de Reação de Teste, Haptenos, Mecanismos, Estabilização 514
18.1.2.1 Mecanismo de Rea Catalisada por Anticorpos ações 516
18.1.2.2 Estabilização de Estados de Transição Carregados 517
18.1.2.3 Efeito de Anticorpos como Armadilhas de Entropia 517
18.1.3 Amplitude das Reações Catalisadas por Anticorpos 518
18.1.3.1 Reação Catalisada por Anticorpos Mais Rápida em Comparação com Enzimas
518
18.1.3.2 Reações Catalisadas por Anticorpos sem Enzima Correspondente
Equivalente 518
18.1.3.3 Exemplo de reação pericíclica: rearranjo de Claisen 518
18.1.3.4 Catalisadores de Anticorpos com Atividades Duplas 518
18.1.3.5 Aumento de Escala de uma Reação Catalisada por Anticorpo 520
18.1.3.6 Perspectiva para Anticorpos Catalíticos 520
18.2 Outros Catalisadores Proteicos: Ribozimas e Mimetizadores de Enzimas 521
18.2.1 Ribozimas: Mundo do RNA antes do Mundo das Proteínas? 521
18.2.2 Mimetizadores de Enzimas Proteicas 521
18.3 Projeto de Nova Atividade Enzimática: Modelos Enzimáticos (Sinzimas) 523
18.3.1 Introdução 523
18.3.2 Modelos Enzimáticos com Base na Etapa de Ligação: Reação Diels-Alder
523
18.3.3 Modelos Enzimáticos com Efeitos de Ligação e Catalíticos 525
18.4 Catalisadores Químicos Quirais Heterogeneizados/Imobilizados 526
18.4.1 Visão Geral de Diferentes Abordagens 526
18.4.2 Imobilização com Poliaminoácidos como Catalisadores de Polímeros Quirais
526
18.4.3 Imobilização em Resinas ou outros Carreadores Insolúveis 527
18.4.4 Heterogeneização com Dendrímeros 528
18.4.5 Retenção de Catalisadores Químicos Quirais Heterogeneizados em uma Membrana
Reator 529
18.4.6 Recuperação de Catalisadores Organometálicos por Mudança de Fase: Líquido-Líquido
Extração 531
18,5 Catalisadores Organometálicos Enzimáticos em Tandem 532
19 Projeto de Processos Biocatalíticos 539
19.1 Projeto de Processos Enzimáticos: Xarope de Milho Rico em Frutose (HFCS) 540
19.1.1 Fabricação de HFCS a partir de Glicose com Glicose Isomerase (GI):
Detalhes do Processo 540
19.1.2 Modelo Matemático para Descrição da Cinética Enzimática de
Glicose Isomerase (GI) 541
19.1.3 Avaliação do Modelo da Reação GI no Reator de Leito Fixo 543
19.1.4 Produtividade de um Reator Enzimático de Leito Fixo 547
Conteúdo
XXIII
19.2 Processamento de Produtos Químicos Finos ou Intermediários Farmacêuticos em um
Reator de membrana enzimática 549
19.2.1 Introdução 549
19.2.2 Determinação dos Parâmetros do Processo de um Reator de Membrana 550
19.2.2.1 Caso 1: Vazamento através da Membrana, sem Desativação 551
19.2.2.2 Caso 2: Vazamento pela Membrana e Desativação da Enzima 552
19.2.2.3 Critério de Projeto para EMRs 552
19.2.3 Aplicações em Grande Escala de Reatores de Membrana 553
19.2.3.1 L-Aminoácidos Enantiomericamente Puros para Soluções de Infusão e como
Blocos de Construção para Novos Medicamentos 553
19.2.3.2 Reatores de Membrana Aquoso-Orgânica 554
19.2.3.3 Outros Processos em Reatores de Membrana Enzimática 554
19.3 Produção de Álcoois Hidrofóbicos Enantiomericamente Puros:
Comparação de diferentes rotas de processo e configurações de reatores
556
19.3.1 Abordagem de Enzima Isolada 556
19.3.2 Abordagem de Célula Inteira 559
19.3.3 Abordagem de Catalisador Organometálico 561
19.3.4 Comparação de Diferentes Estratégias de Redução Catalítica 563
20 Comparação de Catalisadores Biológicos e Químicos para Novos Processos 569
20.1 Critérios para Julgamento de Processos (Bio-)catalíticos 570
20.1.1 Discussão: Os Cinco Critérios 570 de Jacobsen
20.1.2 Comentário sobre os Cinco Critérios 572 de Jabobsen
20.2 Posição da Biocatálise em Comparação com Catalisadores Químicos para Novos
Processos 575
20.2.1 Condições e Estrutura para Processos do Futuro 575
20.2.2 Ibuprofeno (analgésico) 577
20.2.3 Índigo (Corante Azul) 578
20.2.4 Mentol (Agente Aromatizante de Hortelã-Pimenta) 580
20.2.4.1 Separação de Pares de Sal Diastereomérico 580
20.2.4.2 Catálise Homogênea com Rh-BINAP 580
20.2.4.3 Resolução catalisada por lipase de ésteres racêmicos de mentol 582
20.2.5 Ácido Ascórbico (Vitamina C) 583
20.2.5.1 A Síntese Tradicional Reichstein-Grüssner 584
20.2.5.2 Processo de fermentação em duas etapas para ácido 2-cetogulônico com produto químico
Passo para Ácido Ascórbico 584
20.2.5.3 Fermentação em uma etapa para ácido 2-cetogulônico com etapa química para
Ácido Ascórbico 585
20.3 Engenharia de Caminhos através da Engenharia Metabólica 586
20.3.1 Engenharia de Vias para Produtos Químicos Básicos: 1,3-Propanodiol 586
20.3.2 Engenharia de Vias para Intermediários Farmacêuticos:
cis-Aminoindanol 588
Índice 593