Roubar Peter para Pagar Paul - O Gluconato de Clorexidina Demonstra Eficácia A Cu

Reparo e regeneração de feridas / Visualização Antecipada
Artigo Original - Ciência Básica !Acesso Aberto " #
Roubar Peter para Pagar Paul: O gluconato de clorexidina demonstra

e!cácia a curto prazo e citotoxicidade a longo prazo
J. Z. Alex Cheong BS, Aiping Liu PhD, Clayton J. Ferrugem MD, Collin L. Tran BS,
Sameeha E. Hassan BS, Lindsay R. PhD Kalan $, Angela L. F. Gibson MD, PhD $
Publicado pela primeira vez:04 de agosto de 2022

https://doi.org/10.1111/wrr.13044
Informações de !nanciamento: Institutos Nacionais de Saúde, Números de

Subsídios/Prêmios: NIDDK T35 DK062709, NIGMS R35 GM137828; Programa de Pesquisa de
Verão Shapiro, Faculdade de Medicina e Saúde Pública, Universidade de Wisconsin-Madison;
Programa de Parceria de Wisconsin
Resumo
Os agentes de limpeza de feridas são rotineiros no tratamento de feridas e na
preparação pré-operatória. A atividade antisséptica pretende evitar que
micróbios contaminantes estabeleçam uma infecção, ao mesmo tempo em que
levanta preocupações de citotoxicidade e atraso na cicatrização de feridas.
Avaliamos a citotoxicidade de cinco agentes de limpeza de feridas usados
clinicamente (saline, iodo de povidona, sabonetes Dove® e Dial® e gluconato de
clorexidina [CHG]) usando um modelo de camundongo xenoenxerto de pele
humana ex vivo e in vivo, em contraste com os modelos clássicos in Além disso,
estabelecemos um modelo de contaminação de feridas ex vivo inoculado com
~100 células de Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus para avaliar a
e!cácia antimicrobiana. A microscopia eletrônica de varredura e a microscopia
confocal foram usadas para avaliar as características fenotípicas e espaciais das
células bacterianas no tecido da ferida. A CHG reduziu signi!cativamente a
atividade metabólica dos explantes de pele, enquanto todos os tratamentos,
exceto a solução salina, afetaram a viabilidade celular local. A citotoxicidade da
CHG persistiu e progrediu ao longo de 14 dias, prejudicando a cicatrização de
feridas in vivo. Dentro do modelo de contaminação, o tratamento com CHG
resultou em uma redução signi!cativa da contagem de superfície da ferida de P.
aeruginosa 24 horas após o tratamento. No entanto, esse efeito foi transitório e
a aplicação seriada de CHG não teve efeito no crescimento microbiano de P.
aeruginosa ou S. aureus. A microscopia revelou que as células viáveis de P.
aeruginosa residem profundamente dentro do tecido da ferida após a aplicação
de ICC, provavelmente servindo como um reservatório para repovoar o tecido a
uma alta carga biológica. Revelamos a citotoxicidade e a atividade
antimicrobiana limitada da CHG na pele humana usando modelos clinicamente
relevantes, com a capacidade de resolver a localização espacial e a dinâmica
temporal da viabilidade tecidual e do crescimento microbiano.
Abreviaturas
UFC
unidade formadora de colônias
CHG
gluconato de clorexidina
CLSM
microscopia confocal de varredura a laser
DMEM
Meio de Águia modi!cado por Dulbecco
FBS
soro fetal bovino
GFP
proteína "uorescente verde
hpi
horas pós-inoculação
hpt
horas pós-tratamento
LDH
lactato desidrogenase
PBS
solução salina tamponada com fosfato
PVI
iodopovidona
SEM
microscopia eletrônica de varredura
1 INTRODUÇÃO
Durante os cuidados de rotina com feridas, o controle da colonização microbiana e
da biocarga é fundamental para ajudar no reparo tecidual e reduzir o excesso de
in"amação.1-3 A limpeza de feridas com agentes que variam de solução salina a
soluções de compostos antissépticos é rotineiramente empregada em um esforço
para prevenir a colonização microbiana e a subsequente infecções do sítio
cirúrgico.13, 14
Os modelos clássicos usados para avaliar a e!cácia antisséptica e a citotoxicidade

usam abordagens reducionistas que avaliam componentes da pele humana e
micróbios infecciosos individuais em silos, por exemplo, através do uso de cultura
de células puras e cultura bacteriana in vitro.15-28 É importante ressaltar que esses
modelos carecem da heterogeneidade estrutural e composicional da pele humana
e da natureza espaço-temporal do tecido da ferida. Os modelos in vitro são,
portanto, inadequados para avaliar simultaneamente a e!cácia antimicrobiana e a
citotoxicidade de agentes antissépticos em cenários clinicamente relevantes.29 Há
uma necessidade crítica de modelos clinicamente aplicáveis que possam avaliar
simultaneamente a e!cácia antimicrobiana e a citotoxicidade de intervenções
antimicrobianas em contextos relevantes.30-32
Aqui, usamos um modelo ex vivo de ferida excisional de pele humana para avaliar
agentes de limpeza de feridas usados rotineiramente no padrão de atendimento
como pro!laxia para infecção. Para avaliar a e!cácia antimicrobiana,
estabelecemos um modelo de contaminação de feridas inoculando feridas
excisionais com ~100 células de Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus e
avaliamos a biocarga ao longo do tempo após a aplicação tópica de agentes de
limpeza de feridas. Para avaliar simultaneamente a dinâmica espacial e temporal,
usamos coloração histológica da viabilidade celular via atividade da lactato
desidrogenase (LDH) e microscopia para localizar a citotoxicidade e a colonização
microbiana do leito da ferida. Descobrimos que a CHG exibe o maior nível de
citotoxicidade e isso está associado a uma maior e!cácia antimicrobiana logo após
a aplicação. No entanto, em momentos posteriores, mostramos que a CHG é
ine!caz contra P. aeruginosa e S. aureus, mesmo com aplicação serial. Além disso,
demonstramos que a citotoxicidade da CHG persiste ao longo do tempo e inibe a
cicatrização de feridas em um modelo in vivo de camundongo xenoenxerto de pele
humana.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
:
2.1 Modelo de ferida excisional ex vivo
A pele humana foi obtida de pacientes submetidos a cirurgias reconstrutivas
eletivas. As amostras não identi!cadas estavam isentas da regulamentação dos
Conselhos de Revisão Institucional do Comitê de Assuntos Humanos da
Universidade de Wisconsin-Madison. O tecido foi lavado com PBS e feridas de
espessura parcial foram feitas perfurando levemente a epiderme com um punção
de biópsia de 6 mm e removendo toda a epiderme e uma parte da derme com uma
tesoura. Embora a variabilidade doador a doador na espessura da pele seja
esperada, a ferida para cada réplica biológica foi conduzida por um investigador
para evitar a variação interpessoal. Um punção de biópsia de 12 mm foi então
usado para fazer biópsias de espessura total com a ferida. Nos estudos de e!cácia
antimicrobiana antisséptica, as biópsias foram colocadas em placas de 12 poços
contendo 3 ml de um gel de agarose DMEM (0,15:0,85 de agarose a 1% em PBS e
DMEM [Gibco, Thermo Fisher, Waltham, MA] suplementadas com 10% de soro fetal
bovino Nos estudos de viabilidade celular antisséptica, as biópsias foram colocadas
em uma inserção de malha !na em placas p100 para elevar o tecido para a
interface ar-líquido em meios contendo 10 ml de DMEM suplementados com FBS a
10%, 0,625 μg/ml de anfotericina B (Thermo Fisher, Waltham As biópsias foram
incubadas a 37°C com 5% de CO2 e transferidas para um novo meio a cada 48
horas. Os experimentos foram conduzidos dentro de 48 horas após a coleta de
tecidos, com exceção das inoculações de S. aureus, onde as biópsias foram
incubadas por 5 dias (2 passagens de mídia) antes da inoculação para lavar os
antibióticos residuais do paciente.
2.2 Modelo de colonização de feridas ex vivo

Pseudomonas aeruginosa cepa K (presente do Dr. Anna Huttenlocher, Universidade
de Wisconsin-Madison) ou Staphylococcus aureus cepa LAC (presente do Dr. JD
Sauer, Universidade de Wisconsin-Madison; ambos marcados com GFP com
seleção de carbenicilina) foram cultivados durante a noite a 37 °C em placas de
ágar de soja triptona (TSA) suplementadas com 200 μg/ml de carbenicilina. Os
inóculos foram preparados suspendendo colônias de placas de ágar em PBS e
diluindo para uma densidade celular de 1 × 104 UFC/ml. As feridas foram
inoculadas com 10 μl de inóculo para uma densidade celular !nal de 1 × 102
UFC/ferida. Após 4 horas de incubação, as feridas foram tratadas com antissépticos
(veja abaixo), enxaguadas, incubadas por 24 horas e, em seguida, processadas para
microscopia (veja abaixo) ou cortadas e processadas para enumeração de células
:
viáveis. Um subconjunto de biópsias tratadas com PBS e CHG foi imediatamente
processado após o tratamento 4 horas após a inoculação, ou tratado pela segunda
vez 24 horas após o tratamento e incubado por 24 horas antes do processamento.
Todos os bissetos foram vórticeados em 1 ml de PBS com 5% de Tween 80 e 0,6%
de oleato de sódio (como neutralizador CHG) com 0,2 g de contas de vidro estéreis
de 1 mm por 10 minutos a toda velocidade em um Vortex-Genie 2 (Scienti!c
Industries, Bohemia, NY
2.3 Tratamento antisséptico

As biópsias de tecido de ferida ex vivo foram tratadas com cinco antissépticos,
incluindo PBS (Corning, Corning, NY), iodopovidona (PVI; Medichoice, Owens and
Minor, VA), Sabonetes Dial® (Henkel, Scottsdale, AZ) e Dove® (Unilever, Londres,
Reino Unido) e CHG (2%, BD, Franklin Lakes, NJ). Os sabonetes Dial® e Dove®
foram diluídos 1:1 em água estéril 24 horas antes do tratamento e deixados se
misturar. As soluções de limpeza da ferida foram aplicadas na ferida manchando
suavemente com cotonetes estéreis (Medline, North!eld, IL) ao redor da borda da
ferida até que a solução se reunisse no leito da ferida. O tratamento foi deixado
por 30 minutos antes de enxaguar suavemente duas vezes com PBS. Para estudos
de viabilidade celular, as biópsias foram incubadas por mais 24 horas antes do
ensaio MTT e da coloração LDH (veja abaixo). Para determinar se a citotoxicidade
induzida pela CHG persiste ao longo do tempo, um subconjunto de biópsias
tratadas com PBS e CHG foi cultivado a 37°C e 5% de CO2 por até 14 dias. Os
tecidos foram colhidos nos dias 1, 3, 7 e 14 e processados para coloração de LDH.
Para mimetizar os parâmetros de tratamento in vivo com este modelo, as biópsias
foram tratadas diariamente com PBS ou CHG e colhidas no dia 14 para o ensaio
MTT e coloração LDH.
2.4 Teste de concentração inibitória mínima

As cepas K e S. aureus LAC de P. aeruginosa foram cultivadas durante a noite a 37°C
em placas de TSA. Os inóculos foram preparados suspendendo colônias de placas
de ágar em PBS e diluindo para uma densidade celular !nal de 1 × 105 UFC/ml em
caldo de soja triptona para microdiluição em caldo com CHG de concentrações de
1000 μg/ml a 2 μg/ml. A concentração inibitória mínima (CIM) foi interpretada como
a menor concentração de CHG que inibiu o crescimento visual.
2.5 Ensaio de atividade metabólica tecidual

:
24 horas após o tratamento, a viabilidade celular dos tecidos tratados foi
quanti!cada usando um ensaio à base de tetrazólio (MTT).33 Resumidamente, cada
bissecto foi enxaguado em PBS e colocado em um poço individual de uma placa de
6 poços com 2 ml de solução MTT (2 mg/ml, Invitrogen, Thermo Fisher As placas de
6 poços foram colocadas em uma placa rotativa e incubadas a 37°C a 100 rpm por
2 h. Após a aspiração da solução MTT restante, 4 ml de DMSO foram adicionados a
cada poço e incubados a 100 rpm a 37°C por 80 minutos. Exatamente 200 μl de
alíquotas de solução em cada poço foram transferidas para uma placa de 96 poços
com controles em branco DMSO. A densidade óptica da solução foi medida usando
um leitor de placas (FlexStation 3, Molecular Devices, San Jose, CA) em um
comprimento de onda de 540 nm. Para o ensaio MTT, as biópsias teciduais não
tratadas foram imersas em água fervente por 30 minutos como controle negativo,
enquanto as biópsias tratadas com PBS serviram como controle positivo.
2.6 Processamento histológico de tecidos

Os bissetos teciduais foram congelados em composto de temperatura de corte
ideal (OCT) Tissue-Tek (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA) para criosecamento
em cortes de 5 μm antes da coloração da atividade de LDH em células viáveis via
precipitação de um sal de formazan roxo-azul insolúvel Os cortes histológicos de
lâminas foram examinados sob um microscópio invertido Nikon Ti-S e digitalizados
em ×4 usando um scanner de slides (PathScan Enabler 5, Meyer Instruments,
Houston, TX). Os exames de lâminas foram processados no FIJI35 usando as
ferramentas "Linha à Mão Livre" e "Seleção à Mão Livre" para medir o comprimento
epidérmico e a área da biópsia, respectivamente. O canal vermelho foi ajustado
usando a ferramenta "Balanço de Cores" para aumentar o contraste da coloração
LDH antes da medição, e o comprimento e a área viáveis foram normalizados para
o comprimento epidérmico total e a área de corte histológico, respectivamente, de
cada biópsia.
2.7 Microscopia confocal

As biópsias foram montadas em placas de Petri de 60 mm com fundo de vidro
(abertura de 14 mm; MatTek, Ashland, MA) e fotografadas em um microscópio de
varredura a laser confocal Zeiss 780 no canal GFP usando objetivas ×5 e ×40. O
software Zeiss Zen foi usado para analisar pilhas z e gerar projeções de intensidade
máxima. Para imagens CLSM de S. aureus, o canal azul de Hoescht foi usado para
capturar a auto"uorescência tecidual.
:
2.8 Microscopia eletrônica de varredura
O protocolo a seguir foi adaptado de Horton et al.36 Resumidamente, feridas
cutâneas humanas ex vivo foram lavadas com PBS e !xadas durante a noite em 5
ml de glutaraldeído a 1,5% em tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,2) a 4°C. As
amostras foram lavadas, tratadas com tetróxido de ósmio a 1% por 1 hora e depois
lavadas novamente. As amostras foram desidratadas através de uma série de
lavagens de etanol (30% a 100%) seguidas de secagem por ponto crítico (14 trocas
em baixa velocidade) e posteriormente montadas em tocos de alumínio com uma
guia adesiva de carbono e tinta carbono. Tinta prateada foi aplicada ao redor do
perímetro para melhorar a condutividade. As amostras foram deixadas para secar
em um dessecador durante a noite. Após o revestimento por pulverização catódica
com platina a uma espessura de 20 nm, as amostras foram fotografadas em um
microscópio eletrônico de varredura (Zeiss LEO 1530-VP) a 3 kV.
2.9 Tratamento diário in vivo de CHG em camundongos

xenoenxertados na pele humana
Para testar a citotoxicidade da CHG em feridas na pele humana in vivo, usamos um
modelo estabelecido de camundongo xenoenxertado de cicatrização de feridas na
pele humana.37, 38 Todos os procedimentos em camundongos foram aprovados
pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de
Wisconsin e pelo escritório de Pesquisa de Recursos e Conformidade Animal.
Resumidamente, quatro camundongos nus atímicos machos (6 a 7 semanas de
idade, Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME) foram enxertados em "ancos
bilaterais com espessura parcial da pele humana obtida de cirurgia eletiva. Oito
semanas após o enxerto e a normalização da arquitetura da pele, feridas de
espessura parcial de 4 mm foram criadas em cada xenoenxerto (2 por
camundongo - tratamento e controle). 2% CHG foi aplicado diariamente nas feridas
por 2 minutos, seguido de irrigação da ferida tratada com 1 ml de PBS por três
vezes usando uma pipeta. Da mesma forma, as feridas de controle receberam
aplicação e irrigação da PBS. Os xenoenxertos receberam tratamento diariamente
por 14 dias para imitar o cuidado diário de feridas, e imagens digitais foram obtidas
para documentar a presença de infecção e cicatrização macroscópica de feridas.
Entre os tratamentos diários de feridas, as feridas foram cobertas com Cuticerin®
(Smith and Nephew, Londres, Reino Unido) e enfaixadas com CoFlex® de 1
polegada de largura (Andover, Salisbury, MA). No dia 14, os xenoenxertos foram
colhidos e corados para LDH e H&E para avaliar a viabilidade celular e a
:
reepitelização da ferida, respectivamente.
2.10 Dados e análise estatística

As informações sobre o tamanho e a replicação da amostra estão descritas nas
legendas das !guras. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando R.39
Comparações pareadas para fechamento da ferida e viabilidade tecidual foram
realizadas com o teste Wilcoxon Rank-Sum. Comparações múltiplas e estimativa de
diferenças médias entre as condições de inoculação para cada micróbio foram
avaliadas usando uma ANOVA unidirecional entre os indivíduos com o teste Honest
Signi!cant Di$erences de Tukey. Usamos um nível de α de 0,05 para todos os
testes estatísticos.
3 RESULTADOS
3.1 Estabelecimento de um modelo de contaminação ex vivo
de feridas para avaliar a e!cácia antimicrobiana e
citotoxicidade
Feridas de espessura parcial de seis mm foram criadas em biópsias de pele de
espessura total de 12 mm cultivadas em poços individuais de uma placa de cultura
de tecido de 12 poços (Figura 1A). Um modelo de contaminação foi desenvolvido
para avaliar a atividade de soluções comuns de limpeza de feridas usadas
clinicamente em condições em que não havia suspeita de infecção. Cada ferida foi
inoculada com cerca de 100 unidades formadoras de colônias (UFC) de P.
aeruginosa. Após 24 horas de crescimento, 8,4 ± 0,5 (média ± DP) log10 UFC/biseto
de bactérias foram recuperados, um aumento de 6 logs (Figura 1B). As células
bacterianas viáveis não foram recuperadas acima do limite de detecção (50 UFC)
em feridas não inoculadas durante todo o estudo (Figura 1B).
:
FIGURA 1 Abrir no visualizador de !guras %PowerPoint
O modelo de ferida excisional humana ex vivo permite uma avaliação dupla da e!cácia e
citotoxicidade antissépticas. (A) Visão geral do modelo. (B) Estabelecimento de infecção com
cerca de 100 células de Pseudomonas aeruginosa por ferida de 6 mm para representar a
contaminação da ferida. As biópsias foram incubadas por 24 horas antes da enumeração.
Feridas não infectadas tiveram crescimento microbiano indetectável. As barras horizontais
mostram médias de n ≥ 6 repetições de ≥3 doadores de pele. Para o inóculo, n ≥ 4 réplicas
biológicas. (C) Quanti!cação de contagens viáveis de células bacterianas. N ≥ 9 repetições (para
tratamentos) e ≥6 repetições (para controles não tratados) de ≥3 doadores de pele. *P adj.
<0,0001. (D) Quanti!cação da atividade metabólica em relação à média do tratamento com PBS
usando o ensaio MTT. O tratamento fervido representa um controle inviável. N ≥ 12 replica de ≥4
doadores de pele. Tratamentos que não compartilham uma letra comum são signi!cativamente
diferentes uns dos outros; P adj. <0,05. (E) Avaliação histopatológica da viabilidade celular usando
coloração LDH de criosecções. Mancha azul escura indica células viáveis. Linhas tracejadas
:
demarcam regiões com a viabilidade celular esgotada. As microgra!as são representativas de ≥3
doadores de pele. (F) Quanti!cação do comprimento epidérmico viável (LDH+) normalizado para
o comprimento total da epiderme. N ≥ 8 se replica de ≥3 doadores de pele. **P adj. <0,0001. (G)
Quanti!cação da área viável (LDH+) normalizada para a área total do corte histológico. N ≥ 8 se
replica de ≥3 doadores de pele. *P adj. <0,05; **P adj. <0,0001.
A e!cácia de cinco agentes de limpeza de feridas para reduzir ou remover a carga

biológica bacteriana foi então avaliada (ver Seção 2.3). Os limpadores foram
aplicados topicamente em cada ferida 4 horas após a inoculação e depois lavados
após um tempo de exposição de 30 minutos. As contagens quantitativas de células
viáveis 24 horas após o tratamento mostraram que a CHG foi o único limpador
antisséptico, resultando em uma redução signi!cativa das contagens bacterianas
viáveis (~3 log10 UFC redução da carga biológica bacteriana; P adj. <0,0001, Figura
1C) em comparação com feridas controle não tratadas.
Para determinar o grau de citotoxicidade de cada limpador, as biópsias ex vivo de

ferida excisional foram tratadas por 30 minutos na ausência de bactérias. O
metabolismo tecidual foi então medido 24 horas após o tratamento como
substituto para a viabilidade celular. Descobrimos que os tratamentos com sabão
CHG e Dial® resultaram em uma redução signi!cativa do metabolismo tecidual em
comparação com as biópsias tratadas com PBS (P adj. <0,05; Figura 1D). Em
particular, o metabolismo nas biópsias de tecido tratadas com CHG foi
signi!cativamente menor do que o das biópsias tratadas com IVP e Dove® (P adj.
<0,05; Figura 1D). A viabilidade tecidual foi avaliada histologicamente por coloração
quanto à atividade de LDH. Uma região de viabilidade celular esgotada, identi!cada
como uma perda da coloração azul escura indicativa de atividade de LDH, foi
identi!cada na epiderme nas bordas da ferida (Figura 1E,F) e na derme reticular
média da ferida em biópsias de tecido tratadas com CHG, enquanto a perda de
viabilidade celular foi localizada super!cialmente na derme da ferida Tanto o
ensaio MTT quanto a coloração LDH indicam que a CHG é mais citotóxica na pele
humana do que outros produtos de limpeza (Figura 1D-G). O IVP não apresentou
atividade antimicrobiana ou citotóxica signi!cativa em comparação com as feridas
de controle tratadas com PBS.
3.2 A e!cácia antimicrobiana da CHG é transitória

Como nossos dados mostraram que a CHG tem a maior e!cácia antimicrobiana e a
maior citotoxicidade dentro de um período de 24 horas, estávamos interessados
:
em explorar a atividade da CHG ao longo do tempo. Descobrimos que a CHG reduz
efetivamente as contagens viáveis para abaixo do limite de detecção (50 UFC)
imediatamente após a aplicação em comparação com as feridas de controle
tratadas com PBS (≤1,7 vs. 2,4 ± 0,3 log10 UFC/bisect; P adj. <0,05; Figura 2B), com
alguns efeitos com duração de até 24 horas após o tratamento (5,2 ± 1,2 vs. 8,6 ±
0,3 log10 UFC/bisect em feridas tratadas com CHG ou PBS, respectivamente; Figura
1C). No entanto, 48 horas após o tratamento, a contagem de células viáveis
aumentou para um nível consistente com feridas tratadas com PBS (8,8 ± 0,2 vs. 9,0
± 0,2 log10 UFC/biseto, respectivamente; Figura 2C). Para imitar um esquema
clínico de limpeza de feridas uma vez ao dia, um segundo tratamento de CHG foi
aplicado por 30 minutos em cada ferida contaminada 24 horas após o primeiro
tratamento, enxaguado e incubado por mais 24 horas antes do processamento.
Após o segundo tratamento com CHG, observamos que as contagens viáveis não
foram signi!cativamente diferentes de um único tratamento com CHG no mesmo
momento (8,5 ± 0,3 vs. 8,8 ± 0,2 log10 UFC/biseto em feridas tratadas
individualmente; Figura 2C). O tratamento com CHG aplicado 24 horas após a
limpeza com PBS também não resultou em contagens viáveis signi!cativamente
diferentes (8,9 ± 0,2 vs. 9,0 ± 0,2 log10 UFC/biseto em feridas limpas
individualmente com PBS 4 horas após ainoculação; Figura 2C).
:
A e!cácia antimicrobiana CHG é transitória. (A) Cronograma dos experimentos. (B) Biópsias ex
vivo de feridas excisionais humanas foram avaliadas imediatamente após o tratamento 4 horas
após a inoculação com cerca de 100 células de P. aeruginosa. A linha tracejada indica o limite de
detecção (50 UFC). *P adj. <0,05. (C) Contagens viáveis totais 24 horas após o segundo
tratamento. N ≥ 6 repetições (para tratamentos) e ≥4 réplicas (para controles não tratados) de ≥2
doadores de pele. *P adj. <0,05; **P adj. <0,01; ns, não signi!cativamente diferente. (D-G)
Microgra!as eletrônicas de varredura em quatro ampliações diferentes (×100, ×500, ×2000,
×10.000) de feridas ex vivo coletadas 24 horas após o tratamento !nal. Os contornos tracejados
representam a região ampliada. (D) Ferida não infectada. A microgra!a de inserção mostra o
padrão de banda das !brilas de colágeno com ampliação de × 100.000. (E) Tratamento da PBS 4
horas após a inoculação. (F) Tratamento com CHG 4 horas após a inoculação. (G) tratamento com
CHG 4 horas após ainoculação e novamente 24 horas após o tratamento. (H) Imagem viva de
ferida ex vivo usando CLSM 24 horas após o tratamento com CHG 4 horas após a inoculação. Os
:
contornos circulares indicam a borda da ferida. Os contornos quadrados representam a região
ampliada. Áreas escuras dentro do leito da ferida são artefatos de imagem de bolhas de ar. A
projeção de intensidade máxima mostra células únicas e pequenos agregados de bactérias
encontradas dispersas profundamente dentro do tecido.
Em seguida, usamos a microscopia eletrônica de varredura (MEV) para avaliar

qualitativamente a colonização bacteriana e a arquitetura de potenciais bio!lmes,
bem como a topogra!a super!cial das feridas 24 horas após o tratamento. Em
feridas de controle não infectadas, o leito da ferida é um substrato
topologicamente heterogêneo para !xação e crescimento microbiano (Figura 2D).
Grandes feixes de !bras de colágeno compõem o tecido conjuntivo da derme e são
compostos por !brilas de colágeno individuais, como mostrado pelo padrão de
bandas claras nas !brilas (Figura 2D, inserção).40, 41 Descobrimos que as feridas
colonizadas tratadas com PBS às 4 horas após a inoculação foram cobertas com
uma camada densa de As células bacterianas não foram detectadas na superfície
de feridas colonizadas tratadas com CHG 4 horas após a inoculação (Figura 2F),
apoiando nossos achados de que a CHG é e!caz até 24 horas após o tratamento.
Por outro lado, as feridas tratadas com uma segunda aplicação de CHG 24 horas
após o tratamento !cam cobertas com uma densa camada de células bacterianas e
matriz extracelular sobre o leito da ferida (Figura 2G), sugerindo que a e!cácia da
CHG é transitória e incapaz de suprimir o crescimento bacteriano além da redução
inicial, consistente com os dados quantitativos da cultura.
Ficamos intrigados com a falta de células bacterianas visíveis em feridas tratadas

com CHG 4 h após a inoculação (Figura 2F), já que essas feridas tinham uma carga
biológica de 5,2 ± 1,2 log10 UFC/biseto (Figura 1C). Como a MEV mostra apenas
topologia de superfície, levantamos a hipótese de que as bactérias podem estar
localizadas mais profundamente no tecido após o tratamento. Usamos microscopia
confocal de varredura a laser (CLSM) para uma perspectiva resolvida em
profundidade no tecido. Esta técnica revelou que as feridas tratadas com CHG às 4
horas após a inoculação continham células bacterianas únicas e pequenos
aglomerados no fundo do leito e do tecido da ferida (Figura 2H), sugerindo que,
embora as células bacterianas não tenham sido detectadas na superfície com MEV,
a migração para tecidos mais profundos resulta em um reservatório dentro da
ferida para repovoar a superfície da ferida. O CLSM de feridas tratadas com PBS 4 h
pós-inoculação e 24 h pós-tratamento revelou grandes agregados de P. aeruginosa
(Figura S1A), consistente com os modelos de bio!lme publicados deste patógeno
42
:
bacteriano.42
Para determinar se nossos resultados são especí!cos para P. aeruginosa ou

bactérias Gram-negativas, repetimos os experimentos de tratamento com CHG
usando o modelo de contaminação com Staphylococcus aureus, um patógeno de
ferida Gram-positivo comum. Cada ferida foi inoculada de forma semelhante com
~100 UFC de S. aureus. Após 24 horas de crescimento, 8,5 ± 0,3 log10 UFC/biseto de
bactérias foram recuperados, um aumento de 6 logs consistente com o
crescimento de P. aeruginosa (Figura 3B). O tratamento com CHG 4 horas após a
inoculação resultou em uma redução signi!cativa (~6-log UFC) da carga biológica
bacteriana 24 horas após o tratamento (p < 0,05, Figura 3B) em comparação com a
PBS e o controle não tratado. Levantamos a hipótese de que as diferenças na
resposta bacteriana à CHG se devem à concentração inibitória mínima de CHG
contra cada organismo, que determinamos ser de 32 μg/ml para P. aeruginosa e <2
μg/ml para S. aureus.
:
Perda de e!cácia da CHG contra bio!lmes de S. aureus. (A) Cronograma dos experimentos. (B) As
biópsias ex vivo de feridas excisionais humanas foram avaliadas imediatamente após o
tratamento 4 horas após a inoculação com ~100 células de S. aureus. A linha tracejada indica o
limite de detecção (50 UFC). *P adj. <0,05. (C) Contagens viáveis totais 24 horas após o segundo
tratamento. N ≥ 6 repetições (para tratamentos) e ≥4 réplicas (para controles não tratados) de ≥2
doadores de pele. ns, não signi!cativamente diferente. (D,E) Microgra!as eletrônicas de
varredura em quatro ampliações diferentes (×100, ×500, ×2000, ×10.000) de feridas ex vivo
coletadas 24 horas após o tratamento !nal. Os contornos tracejados representam a região
ampliada. (D) Tratamento da PBS 4 horas após a inoculação. (E) Tratamento com PBS 4 horas
após a inoculação, tratamento com CHG 24 horas após o tratamento. (F) Imagem CLSM ao vivo
de feridas ex vivo em baixa ampliação 24 horas após o tratamento. Os contornos pontilhados
indicam a borda da ferida. As imagens mostram S. aureus marcado com GFP no leito da ferida
fundido com a auto"uorescência azul do tecido.
Após a supressão da biosobrecarga da ferida após um único tratamento 4 horas

após a inoculação, um segundo tratamento com CHG 24 horas após o tratamento
manteve contagens viáveis mais baixas, não signi!cativamente diferentes de um
único tratamento no mesmo ponto de tempo (2,4 ± 0,8 vs. 1,7 ± 0,1 log10
UFC/biseto em feridas tratadas individualmente; Figura 3C). O tratamento com CHG
aplicado 24 horas após a limpeza com PBS também não resultou em contagens
viáveis signi!cativamente diferentes (9,0 ± 0,2 vs. 8,9 ± 0,2 log10 UFC/biseto em
feridas limpas com PBS 4 horas após a inoculação; Figura 3C), sugerindo que o
tratamento com CHG não é e!caz contra S. aureus e P. aeruginosa, uma vez
estabelecidos dentro do tecido da ferida.
De acordo com os dados quantitativos da cultura, a MEV de feridas colonizadas por

S. aureus tratadas com PBS 4 horas após ainoculação (Figura 3D) e feridas tratadas
com uma segunda aplicação de CHG 24 horas após o tratamento (Figura 3E)
mostraram aglomerados densos de células bacterianas e matriz extracelular sobre
o leito da ferida consistentes com o fenótipo esperado de um bio!lme
esta!locócico.43, 44 Isso sugere que a CHG não é e!caz contra fenótipos de bio!lme.
Usamos CLSM em baixa ampliação para con!rmar fenótipos binários de biocarga
de feridas (Figura 3F). Feridas tratadas com PBS 4 horas após a inoculação tiveram
ferida visível e colonização da pele, independentemente do tratamento 24 horas
após o tratamento (Figura 3F, !leira superior). Por outro lado, as feridas tratadas
:
com CHG 4 horas após a inoculação não mostraram bactérias detectáveis (Figura
3F, !leira inferior).
3.3 A citotoxicidade da CHG é duradoura

Embora mostremos que a e!cácia antimicrobiana da CHG é transitória, estávamos
interessados nos efeitos citotóxicos a longo prazo da CHG na pele humana. Para
avaliar isso, tratamos feridas ex vivo com CHG ou PBS por 30 minutos, seguidas de
um enxágue estéril da PBS e, em seguida, cultivamos as biópsias teciduais por até
14 dias (Figura 4A). Em vários momentos, biópsias foram coletadas para avaliar a
viabilidade celular. As biópsias de tecido tratadas com PBS permaneceram viáveis
por 14 dias, mostrando coloração azul escuro indicativa de atividade de LDH e
viabilidade celular na epiderme e em toda a derme (Figura 4C-F,K,L). Por outro lado,
o tratamento com CHG resultou em uma progressão contínua da citotoxicidade
(Figura 4G-J,K,L). Consistente com os resultados anteriores (Figura 1D-G),
observamos uma perda de viabilidade celular na borda da ferida epidérmica e na
derme, onde a CHG estava em contato direto com o tecido 1 dia após o tratamento
(Figura 4G). No dia 3, essa perda de viabilidade celular progrediu lateralmente da
ferida através da epiderme e verticalmente para a derme (Figura 4H,K). No dia 7, a
viabilidade celular foi perdida da maior parte do tecido (Figura 4I-L), sugerindo que,
apesar de enxaguar a CHG após o tratamento único de 30 minutos, a citotoxicidade
persiste e leva a uma profunda progressão da lesão celular.
:
CHG exibe citotoxicidade progressiva. (A) Cronograma dos experimentos. (B) Avaliação
histopatológica da viabilidade celular usando coloração LDH de criosecções. Mancha azul escura
indica células viáveis. Linhas tracejadas demarcam regiões com a viabilidade celular esgotada. As
microgra!as são representativas de ≥3 doadores de pele. (C-F) Biópsias tratadas com PBS e
processadas em 1, 3, 7 e 14 dias após o tratamento, respectivamente. (G-J) Biópsias tratadas com
CHG e processadas em 1, 3, 7 e 14 dias após o tratamento, respectivamente. (K) Quanti!cação do
comprimento epidérmico viável (LDH+) normalizado para o comprimento total da epiderme. (L)
Quanti!cação da área viável (LDH+) normalizada para a área total do corte histológico. As barras
horizontais mostram uma mediana de ≥6 repetições de ≥2 doadores de pele.
3.4 CHG exibe citotoxicidade e atrasa a cicatrização de

feridas in vivo
Para determinar se a citotoxicidade associada à CHG em explantes cutâneos ex
:
vivo também está presente in vivo, onde a perfusão normal da ferida está presente,
usamos um modelo de xenoenxerto de pele humana murino. Aqui, a pele humana
foi enxertada nos "ancos bilaterais de camundongos atímicos. Oito semanas após
o enxerto e a normalização da arquitetura da pele, feridas de espessura parcial de
4 mm foram criadas em cada xenoenxerto. Para imitar um procedimento clínico de
tratamento de feridas, a CHG foi aplicada diariamente por 2 minutos, seguida de
irrigação com PBS na ferida de tratamento por 14 dias. A ferida de controle
recebeu aplicação e irrigação da PBS. Imagens macroscópicas das feridas do
xenoenxerto da pele humana ao longo de 14 dias mostraram evidências de
reepitelização com contração mínima (Figura 5A). A coloração LDH de cortes
histológicos coletados no dia 14 mostrou tecido viável nas feridas tratadas com
PBS, enquanto as feridas tratadas com CHG exibiram uma perda distinta de
viabilidade celular através da epiderme e da derme média (Figura 5B). A coloração
H&E de feridas tratadas com CHG revelou comprometimento signi!cativo na
reepitelização em comparação com o controle (Figura 5B,C), enquanto a distância
entre as bordas da ferida neoepidérmica foi signi!cativamente maior nas feridas de
xenoenxerto tratadas com CHG (p < 0,05; Figura 5C). Esses resultados replicam os
achados observados com o tratamento diário e a irrigação de feridas ex vivo (Figura
S2).
:
A CHG é citotóxica e impede a cicatrização de feridas na pele humana em um modelo de
camundongo xenoenxerto de pele humana; feridas de espessura parcial de 4 mm foram criadas
xenoenxertos de pele humana em "ancos bilaterais de camundongos atímicos. (A)
Macrofotogra!as de feridas tratadas com PBS e CHG diariamente por 14 dias. (B) coloração LDH
(coluna esquerda) e H&E (coluna direita) de cortes histológicos da ferida após 14 dias de
tratamento diário com PBS ou CHG. As pontas de seta indicam a borda da ferida não cicatrizada
na ferida tratada com CHG. (D) Quanti!cação das distâncias entre as duas línguas epiteliais a
partir de cortes histológicos corados com H&E. N = 4 feridas por tratamento; N = 4
camundongos; duas feridas por camundongo, com cada ferida recebendo um tratamento
diferente. * p < 0,05.
4 DISCUSSÃO
O manejo da ferida requer estratégias de equilíbrio para reduzir o risco de
infecção, minimizando os efeitos citotóxicos dos agentes aplicados ao tecido da
ferida.8, 45 Aqui usamos um modelo ex vivo de ferida excisional da pele humana
para investigar a localização da perda de viabilidade tecidual induzida por
antissépticos. Descobrimos que a curta exposição ao gluconato de clorexidina
resulta em citotoxicidade signi!cativa que persiste e progride ao longo do tempo.
Mostramos que esses efeitos também ocorrem in vivo usando um modelo de
camundongo xenoenxerto de pele humana com perfusão normal da pele. A
aplicação de CHG na pele humana enxertada em camundongos leva à
citotoxicidade celular e à cicatrização prejudicada de feridas. Esses achados
paralelos em modelos ex vivo e in vivo apoiam a utilidade do modelo ex vivo como
uma plataforma de teste de citotoxicidade da pele humana. Ao mesmo tempo,
demonstramos que a inoculação de tecido da ferida com apenas ~100 células
bacterianas é su!ciente para permitir o crescimento robusto e o acúmulo de
biomassa microbiana por patógenos comuns da ferida, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus. Embora a CHG transmita atividade antisséptica
imediatamente após a aplicação, ela é transitória e a biocarga bacteriana se
recupera rapidamente após 48 horas, mesmo com a aplicação seriada de CHG.
Aqui, optamos por estabelecer um modelo de contaminação de feridas usando

~100 células bacterianas de patógenos comuns da ferida para avaliar a e!cácia
antimicrobiana e a citotoxicidade em um contexto clinicamente mais relevante com
:
resolução temporal (Figuras 1-3). Isso contrasta com os modelos de infecção de
feridas que se inoculam a 105 UFC ou mais.46-48 Além disso, os modelos in vitro
clássicos geralmente expõem culturas de alta densidade ou bio!lmes microbianos
estabelecidos em condições ambientais divorciadas do contexto do hospedeiro.
Por exemplo, componentes de bio!lme derivados do hospedeiro, como !brina e
proteínas associadas a leucócitos, podem alterar a composição e a estrutura do
bio!lme microbiano,30, 49-51 com efeitos potenciais na suscetibilidade, virulência e
patogênese antissépticas. Embora uma limitação dos modelos cutâneos ex vivo
seja a exclusão da resposta imune sistêmica do hospedeiro em comparação com os
modelos animais in vivo, o modelo de pele humana ex vivo apresenta uma
poderosa ferramenta para avaliar a terapêutica enquanto captura o impacto do
microambiente tecidual heterogêneo, como a variação interindividual de células e
estruturas dentro da pele.52-56 Além disso, crescimento.
Modelos clássicos para avaliar a citotoxicidade são tipicamente realizados in vitro e

também carecem de componentes estruturais e polarização celular da pele de
espessura total.17, 18, 22, 58 Descobrimos que a CHG apresentou redução signi!cativa
na atividade metabólica do tecido, enquanto os sabonetes resultaram em
citotoxicidade localizada e progressiva no leito da ferida (Figura 1C,D). O impacto da
CHG nas células epidérmicas na borda da ferida parece irreversível e a morte
celular progride tanto através da epiderme lateral quanto profundamente na ferida
tratada (Figura 4). É importante ressaltar que esses achados foram replicados com
a aplicação in vivo de CHG em um modelo de camundongo xenoenxerto humano,
resultando em citotoxicidade local e cicatrização prejudicada de feridas em
comparação com feridas expostas à PBS (Figura 5). Levantamos a hipótese de que a
citotoxicidade da CHG é afetada pelos gradientes de contato e difusão do
antisséptico que ocorrem em toda a estrutura heterogênea de uma ferida, o que
também pode afetar a e!cácia antisséptica em micróbios contaminantes. Dado o
uso onipresente da ICC na prática clínica, esses achados justi!cam um estudo mais
aprofundado para determinar se uma mudança na prática da CHG no cuidado de
feridas e nos preparativos cirúrgicos pré-operatórios é necessária para evitar
efeitos deletérios na cicatrização de feridas.
Limpadores de feridas e agentes antissépticos são frequentemente usados para

reduzir o risco de infecção e gerenciar a carga biológica microbiana. Aqui
mostramos que a aplicação de CHG é e!caz quando uma baixa carga biológica de
bactérias está presente, como no caso de feridas contaminadas. No entanto, ao
longo do tempo, as populações bacterianas de P. aeruginosa aumentam para uma
:
média de ~105 UFC/biseto 24 horas após o tratamento (Figura 1C). Embora a
quantidade de contagem de P. aeruginosa 24 horas após o tratamento permaneça
signi!cativamente menor do que as feridas tratadas com PBS, esses dados
sugerem que, dentro do nosso modelo, a colonização com menos de 50 UFC (o
limite de detecção) é permissiva para permitir que a infecção prossiga. No
momento em que a biocarga bacteriana atinge ~105 UFC, uma segunda aplicação
de CHG, imitando um esquema de tratamento clínico, não exerce um efeito
mensurável no crescimento microbiano. Observamos a mesma tendência para S.
aureus (Figura 3C) e levantamos a hipótese de que isso provavelmente se deve à
redução da e!cácia antisséptica contra bio!lmes microbianos que podem estar se
formando no ambiente da ferida.47 Em contraste, bio!lmes in vitro e células
planctônicas têm maior suscetibilidade à CHG
Usando MEV, mostramos extensa colonização super!cial do leito da ferida

correspondente a alta carga bacteriana (Figuras 2E e 3D). Observamos um bio!lme
denso composto por células bacterianas e matriz extracelular, que amadureceram
em agregados semelhantes a cogumelos para P. aeruginosa (Figura S1). A estrutura
espacial e física dos bio!lmes microbianos é importante para sua virulência e
patogênese,62, 63 sugerindo que a interrupção física do desbridamento ou irrigação
pode ser sinérgica ao tratamento antisséptico. Curiosamente, as feridas tratadas
com CHG 4 horas após ainoculação de P. aeruginosa não mostraram células
bacterianas visíveis na superfície do leito da ferida usando MEV (Figura 2F). No
entanto, o CLSM revelou células bacterianas únicas e pequenos agregados
dispersos dentro do tecido que podem atuar como um reservatório (Figura 2H).
Este modelo também permite avaliar a heterogeneidade espacial dos micróbios
dentro da ferida. CLSM de baixa ampliação de feridas inoculadas por S. aureus
mostrou bolsas diferenciais e aglomerados de crescimento bacteriano, apesar das
contagens bacterianas consistentes (Figura 3B,C,F). Além disso, foi relatado que a P.
aeruginosa reside profundamente dentro do tecido da ferida do paciente, em
comparação com outros patógenos da ferida, como o S. aureus, que residem mais
perto da superfície.64 Prevemos que estudos futuros integrarão interações
polimicrobianas e ecologia espacial, juntamente com e!cácia e citotoxicidade
antissép
Em conclusão, apresentamos um modelo clinicamente relevante para avaliar a

citotoxicidade e e!cácia antisséptica, com a capacidade de resolver a localização
espacial e a dinâmica temporal da viabilidade tecidual e do crescimento
microbiano. Descobrimos que a CHG antisséptica comum da ferida exibe níveis de
:
citotoxicidade, enquanto a e!cácia antimicrobiana é transitória. À luz de estudos
recentes que sugerem que a ICC pode não afetar a infecção do sítio cirúrgico,
conforme relatado anteriormente e implementado em diretrizes generalizadas
para cuidados pré-operatórios,13, 14 nossos achados devem levantar preocupação
com o uso onipresente da ICC como tratamento cirúrgico pré-operatório e
limpador. Prevemos que este modelo reforçará estudos básicos, translacionais e
pré-clínicos no tratamento de feridas, fornecendo mais informações sobre a
complexa interação entre as respostas do hospedeiro e a dinâmica de crescimento
microbiano no contexto do cuidado avançado de feridas.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
Conceituação: J. Z. Alex Cheong, Aiping Liu, Lindsay R. Kalan, Angela L. F. Gibson.
Curadoria de Dados: J. Z. Alex Cheong, Aiping Liu, Clayton J. Rust, Collin L. Tran,
Sameeha E. Hassan, Lindsay R. Kalan, Angela L. F. Gibson. Análise Formal: J. Z. Alex
Cheong, Aiping Liu, Clayton J. Rust, Collin L. Tran, Sameeha E. Hassan, Lindsay R.
Kalan, Angela L. F. Gibson. Supervisão: Lindsay R. Kalan, Angela L. F. Gibson. Escrita
- rascunho original: J. Z. Alex Cheong, Aiping Liu, Lindsay R. Kalan, Angela L. F.
Gibson. Redação - revisão e edição: J. Z. Alex Cheong, Aiping Liu, Clayton J. Rust,
Collin L. Tran, Sameeha E. Hassan, Lindsay R. Kalan, Angela L. F. Gibson.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer a Nathan Holly, Edgar Ocotl e Lily Meronek pela
assistência técnica. Os autores reconhecem o uso de instalações e instrumentação
nos Centros de Tecnologia em Nanoescala da UW-Madison Wisconsin
(wcnt.wisc.edu), parcialmente apoiados pela NSF através do Centro de Ciência e
Engenharia de Pesquisa de Materiais da Universidade de Wisconsin (DMR-
1720415). As !guras incluem os ícones Skin de Hermine Blanquart, Energy de Alice
Design, Bacteria de Maxim Kulikov, Cotton Swab de Kid Kitaro, Petri Dish de BOYS,
Pipeta de Joseph L. Elsbernd e Skin de Fauzan Akbar, todos do Projeto Noun.
INFORMAÇÕES DE FINANCIAMENTO
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa de Parceria de Wisconsin
[A.L.F.G.], do Programa de Pesquisa de Verão Shapiro da Faculdade de Medicina e
Saúde Pública da Universidade de Wisconsin-Madison [A.L.F.G.] e dos Institutos
Nacionais de Saúde (NIDDK T35 DK062709 [C.J.R
:
CONFLITO DE INTERESSES
Os autores a!rmam não haver con"ito de interesses.
DATA AVAILABILITY STATEMENT

Data supporting the !ndings of this study are available within the article and its
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Filename Description
wrr1304 Figure S1 Pseudomonas aeruginosa forms aggregates in ex vivo wounds. Live

4-sup- imaging of ex vivo wounds using CLSM at 24 h after PBS treatment at 4 h post-
0001- inoculation and PBS treatment at 24 h post-treatment. Maximum intensity
FigureS1 projection shows a large aggregate of GFP-expressing Pseudomonas aeruginosa.

.tif
image/tif,
7.4 MB
wrr1304 Figure S2 Daily CHG treatment exhibits cytotoxicity in ex vivo wounds

4-sup- (a) LDH staining of wound histological sections after 14 days of daily treatment with
0002- PBS or CHG. (b) Quanti!cation of metabolic activity relative to mean of PBS
FigureS2 treatment using the MTT assay. Horizontal bars show medians of six replicates from
.tif two skin donors. *p < 0.05.
image/tif,
5.2 MB
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:
1 Rahim K, Saleha S, Zhu X, Huo L, Basit A, Franco OL. Bacterial contribution in
chronicity of wounds. Microb Ecol. 2017; 73: 710- 721.
Crossref | PubMed | Web of Science® | Google Scholar
2 Wolcott RD. Bio!lms cause chronic infections. J Wound Care. 2017; 26: 423- 425.
Crossref | Web of Science® | Google Scholar
3 Azevedo MM, Lisboa C, Cobrado L, Pina-Vaz C, Rodrigues A. Hard-to-heal wounds,

bio!lm and wound healing: an intricate interrelationship. Br J Nurs. 2020; 29: S6- S13.
Crossref | PubMed | Google Scholar
4 Cambiaso-Daniel J, Boukovalas S, Bitz GH, Branski LK, Herndon DN, Culnan DM.
Topical antimicrobials in burn care: part 1-topical antiseptics. Ann Plast Surg. 2018.
doi:10.1097/SAP.0000000000001297
Crossref | Google Scholar
5 Slaviero L, Avruscio G, Vindigni V, Tocco-Tussardi I. Antiseptics for burns: a review of

the evidence. Ann Burns Fire Disasters. 2018; 31: 198- 203.
CAS | PubMed | Google Scholar
6 Percival SL, Finnegan S, Donelli G, Vuotto C, Rimmer S, Lipsky BA. Antiseptics for
treating infected wounds: e&cacy on bio!lms and e$ect of pH. Crit Rev Microbiol. 2014;
42: 1- 17.
7 Atiyeh BS, Dibo SA, Hayek SN. Wound cleansing, topical antiseptics and wound
healing. Int Wound J. 2009; 6: 420- 430.
Wiley Online Library | PubMed | Web of Science® | Google Scholar
8 Smith RG. A critical discussion of the use of antiseptics in acute traumatic wounds. J
Am Podiatr Med Assoc. 2005; 95: 148- 153.
9 Barreto R, Barrois B, Lambert J, Malhotra-Kumar S, Santos-Fernandes V, Monstrey S.

Addressing the challenges in antisepsis: focus on povidone iodine. Int J Antimicrob
Agents. 2020; 56:106064.
Crossref | CAS | PubMed | Web of Science® | Google Scholar
10 Thomas GW, Rael LT, Bar-Or R, et al. Mechanisms of delayed wound healing by
commonly used antiseptics. J Trauma. 2009; 66: 82- 91.
:
11 Punjataewakupt A, Napavichayanun S, Aramwit P. The downside of antimicrobial
agents for wound healing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019; 38: 39- 54.
12 Allegranzi B, Bischo$ P, de Jonge S, et al. New WHO recommendations on

preoperative measures for surgical site infection prevention: an evidence-based global
perspective. Lancet Infect Dis. 2016; 16: e276- e287.
13 Wade RG, Burr NE, Mccauley G, Bourke G, Efthimiou O. The comparative e&cacy of
chlorhexidine gluconate and povidone-iodine antiseptics for the prevention of infection
in clean surgery: a systematic review and network meta-analysis. Ann Surg. 2021; 274:
E481- E488.
14 Smith SR, Gani J, Carroll R, et al. Antiseptic skin agents to prevent surgical site
infection after incisional surgery. Ann Surg. 2021; 275: 842- 848.
doi:10.1097/SLA.0000000000005244
15 Tatuall FM, Leigh IM, Gibson JR. Comparative study of antiseptic toxicity on basal
keratinocytes, transformed human keratinocytes and !broblasts. Skin Pharmacol Physiol.
1990; 3: 157- 163.
16 Ponec M, Haverkort M, Soei YL, Kempenaar J, Bodde H. Use of human keratinocyte

and !broblast cultures for toxicity studies of topically applied compounds. J Pharm Sci.
1990; 79: 312- 316.
Wiley Online Library | CAS | PubMed | Web of Science® | Google Scholar
17 Borenfreund E, Puerner JA. A simple quantitative procedure using monolayer

cultures for cytotoxicity assays (HTD/NR-90). J Tissue Culture Methods. 1985; 9: 7- 9.
18 McLaughlin M, Gilea MA, Earle MJ, Seddon KR, Gilmore BF, Kelly SA. Characterization
of ionic liquid cytotoxicity mechanisms in human keratinocytes compared with
conventional biocides. Chemosphere. 2021; 270:129432.
Crossref | CAS | Web of Science® | Google Scholar
19 Karpiński TM, Szkaradkiewicz AK. Chlorhexidine—pharmaco-biological activity and

application. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2015; 19: 1321- 1326.
:
CAS | PubMed | Web of Science® | Google Scholar
20 Rembe JD, Fromm-Dornieden C, Schäfer N, Böhm JK, Stuermer EK. Comparing two
polymeric biguanides: chemical distinction, antiseptic e&cacy and cytotoxicity of
polyaminopropyl biguanide and polyhexamethylene biguanide. J Med Microbiol. 2016;
65: 867- 876.
21 Kloth LC, Berman JE, Laatsch LJ, Kirchner PA. Bactericidal and cytotoxic e$ects of
chloramine-T on wound pathogens and human !broblasts in vitro. Adv Skin Wound Care.
2007; 20: 331- 345.
Crossref | PubMed | Google Scholar
22 Muller G, Kramer A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel

assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J Antimicrob Chemother.
2008; 61: 1281- 1287.
23 Niedner R. Cytotoxicity and sensitization of povidone-lodine and other frequently

used anti-infective agents. Dermatology. 1997; 195: 89- 92.
24 Damour O, Zhi Hua S, Lasne F, Villain M, Rousselle P, Collombel C. Cytotoxicity

evaluation of antiseptics and antibiotics on cultured human !broblasts and
keratinocytes. Burns. 1992; 18: 479- 485.
25 Cooper ML, Boyce ST, Hansbrough JF, Foreman TJ, Frank DH. Cytotoxicity to cultured
human keratinocytes of topical antimicrobial agents. J Surg Res. 1990; 48: 190- 195.
26 Cooper ML, Laxer JA, Hansbrough JF. The cytotoxic e$ects of commonly used topical
antimicrobial agents on human !broblasts and keratinocytes. J Trauma. 1991; 31: 775-
784.
27 Rabenberg VS, Ingersoll CD, Sandrey MA, Johnson MT. The bactericidal and cytotoxic
e$ects of antimicrobial wound cleansers. J Athl Train. 2002; 37: 51- 54.
PubMed | Web of Science® | Google Scholar
28 Blenkharn JI. The di$erential cytotoxicity of antiseptic agents. J Pharm Pharmacol.

1987; 39: 477- 479.
:
29 Roberts AEL, Kragh KN, Bjarnsholt T, Diggle SP. The limitations of in vitro
experimentation in understanding bio!lms and chronic infection. J Mol Biol. 2015; 427:
3646- 3661.
30 Besser M, Dietrich M, Weber L, Rembe JD, Stuermer EK. E&cacy of antiseptics in a

novel 3-dimensional human plasma bio!lm model (hpBIOM). Sci Rep. 2020; 10: 1- 9.
31 Roche ED, Woodmansey EJ, Yang Q, Gibson DJ, Zhang H, Schultz GS. Cadexomer
iodine e$ectively reduces bacterial bio!lm in porcine wounds ex vivo and in vivo. Int
Wound J. 2019; 16: 674- 683.
32 Rancan F, Contardi M, Jurisch J, et al. Evaluation of drug delivery and e&cacy of

cipro"oxacin-loaded povidone foils and nano!ber mats in a wound-infection model
based on ex vivo human skin. Pharmaceutics. 2019; 11: 527.
33 Imbert D, Cullander C. Buccal mucosa in vitro experiments. I. Confocal imaging of

vital staining and MTT assays for the determination of tissue viability. J Control Release.
1999; 58: 39- 50.
34 Gibson ALF, Bennett DD, Taylor LJ. Improving the histologic characterization of burn
depth. J Cutan Pathol. 2017; 44: 998- 1004.
35 Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, et al. Fiji: an open-source platform for

biological-image analysis. Nat Methods. 2012; 9: 676- 682.
36 Horton MV, Johnson CJ, Kernien JF, et al. Candida auris forms high-burden bio!lms
in skin niche conditions and on porcine skin. mSphere. 2020; 5: 1- 8.
37 Karim AS, Liu A, Lin C, et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a

murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair Regen. 2020; 28:
812- 822.
Wiley Online Library | Web of Science® | Google Scholar
:
38 Liu A, Long Y, Li J, et al. Accelerated complete human skin architecture restoration
after wounding by nanogenerator-driven electrostimulation. J Nanobiotechnol. 2021; 19:
1- 14.
39 R Core Team. R: a language and environment for statistical computing; 2020.

https://www.r-project.org/
Google Scholar
40 Ushiki T. Collagen !bers, reticular !bers and elastic !bers. A comprehensive

understanding from a morphological viewpoint. Arch Histol Cytol. 2002; 65: 109- 126.
41 Gottardi R, Hansen U, Raiteri R, et al. Supramolecular organization of collagen !brils

in healthy and osteoarthritic human knee and hip joint cartilage. PLoS One. 2016; 11: 1-
13.
42 Klausen M, Aaes-Jørgensen A, Molin S, Tolker-Nielsen T. Involvement of bacterial

migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas
aeruginosa bio!lms. Mol Microbiol. 2003; 50: 61- 68.
43 Wilkinson HN, McBain AJ, Stephenson C, Hardman MJ. Comparing the e$ectiveness
of polymer debriding devices using a porcine wound bio!lm model. Adv Wound Care.
2016; 5: 475- 485.
44 Li T, Zhang L, Han L, et al. Early application of negative pressure wound therapy to

acute wounds contaminated with Staphylococcus aureus: an e$ective approach to
preventing bio!lm formation. Exp Ther Med. 2016; 11: 769- 776.
45 Rodeheaver GT, Ratli$ CR. Wound cleansing, wound irrigation, wound disinfection.
In: D Krasner, L Rijswijk, eds. Chronic Wound Care: The Essentials. HMP; 2018: 47- 62.
Google Scholar
46 Yoon DJ, Fregoso DR, Nguyen D, et al. A tractable, simpli!ed ex vivo human skin
model of wound infection. Wound Repair Regen. 2019; 27: 421- 425.
:
47 Johani K, Malone M, Jensen SO, et al. Evaluation of short exposure times of
antimicrobial wound solutions against microbial bio!lms: from in vitro to in vivo. J
Antimicrob Chemother. 2018; 73: 494- 502.
48 Wolcott RD, Rumbaugh KP, James G, et al. Bio!lm maturity studies indicate sharp
debridement opens a time-dependent therapeutic window. J Wound Care. 2010; 19: 320-
328.
49 Nett JE, Zarnowski R, Cabezas-Olcoz J, et al. Host contributions to construction of

three device-associated Candida albicans bio!lms. Infect Immun. 2015; 83: 4630- 4638.
50 Kwiecinski J, Peetermans M, Liesenborghs L, et al. Staphylokinase control of

staphylococcus aureus bio!lm formation and detachment through host plasminogen
activation. J Infect Dis. 2016; 213: 139- 148.
51 Rembe J-DD, Huelsboemer L, Plattfaut I, Besser M, Stuermer EK. Antimicrobial

hypochlorous wound irrigation solutions demonstrate lower anti-bio!lm e&cacy
against bacterial bio!lm in a complex in-vitro human plasma bio!lm model (hpBIOM)
than common wound antimicrobials. Front Microbiol. 2020; 11:564513.
52 Liu A, Ocotl E, Karim A, et al. Modelling early thermal injury using an ex vivo human
skin model of contact burns. Burns. 2021; 47: 611- 620.
53 Groeber F, Holeiter M, Hampel M, Hinderer S, Schenke-Layland K. Skin tissue

engineering—in vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 2011; 63: 352- 366.
54 Bernard FX, Pedretti N, Rosdy M, Deguercy A. Comparison of gene expression

pro!les in human keratinocyte mono-layer cultures, reconstituted epidermis and
normal human skin; transcriptional e$ects of retinoid treatments in reconstituted
human epidermis. Exp Dermatol. 2002; 11: 59- 74.
55 Wilkinson HN, Kidd AS, Roberts ER, Hardman MJ. Human ex vivo wound model and
whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair. J Vis Exp. 2021; 2021:
:
1- 18.
Google Scholar
56 Andersson M, Madsen LB, Schmidtchen A, Puthia M. Development of an

experimental ex vivo wound model to evaluate antimicrobial e&cacy of topical
formulations. Int J Mol Sci. 2021; 22: 5045.
57 von Müller C, Bulman F, Wagner L, et al. Active neutrophil responses counteract

Candida albicans burn wound infection of ex vivo human skin explants. Sci Rep. 2020;
10: 1- 15.
58 Teepe RGC, Koebrugge EJ, Lowik CWGM, et al. Cytotoxic e$ects of topical
antimicrobial and antiseptic agents on human keratinocytes in vitro. J Trauma. 1993; 35:
8- 19.
59 Vestby LK, Nesse LL. Wound care antiseptics: performance di$erences against
Staphylococcus aureus in bio!lm. Acta Vet Scand. 2015; 57: 22.
60 Hoekstra MJ, Westgate SJ, Mueller S. Povidone-iodine ointment demonstrates in

vitro e&cacy against bio!lm formation. Int Wound J. 2017; 14: 172- 179.
61 Capriotti K, Pelletier J, Barone S, Capriotti J. E&cacy of dilute povidone-iodine against

multidrug resistant bacterial bio!lms, fungal bio!lms and fungal spores. J Clin Res
Dermatol. 2018; 5: 1- 5.
62 Guzmán-Soto I, McTiernan C, Gonzalez-Gomez M, et al. Mimicking bio!lm formation

and development: recent progress in in vitro and in vivo bio!lm models. iScience. 2021;
24: 102443. doi:10.1016/j.isci.2021.102443
63 Nadell CD, Drescher K, Foster KR. Spatial structure, cooperation and competition in
bio!lms. Nat Rev Microbiol. 2016; 14: 589- 600.
64 Fazli M, Bjarnsholt T, Kirketerp-Møller K, et al. Nonrandom distribution of

Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. J Clin
:
Microbiol. 2009; 47: 4084- 4089.
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Reparo e regeneração de feridas / Visualização Antecipada

Artigo Original - Ciência Básica !Acesso Aberto " #

Roubar Peter para Pagar Paul: O gluconato de clorexidina demonstra

Publicado pela primeira vez:04 de agosto de 2022

Informações de !nanciamento: Institutos Nacionais de Saúde, Números de

Os modelos clássicos usados para avaliar a e!cácia antisséptica e a citotoxicidade

2.2 Modelo de colonização de feridas ex vivo

2.3 Tratamento antisséptico

2.4 Teste de concentração inibitória mínima

2.5 Ensaio de atividade metabólica tecidual

2.6 Processamento histológico de tecidos

2.7 Microscopia confocal

2.9 Tratamento diário in vivo de CHG em camundongos

2.10 Dados e análise estatística

cerca de 100 células de Pseudomonas aeruginosa por ferida de 6 mm para representar a

contaminação da ferida. As biópsias foram incubadas por 24 horas antes da enumeração.

Feridas não infectadas tiveram crescimento microbiano indetectável. As barras horizontais

mostram médias de n ≥ 6 repetições de ≥3 doadores de pele. Para o inóculo, n ≥ 4 réplicas

biológicas. (C) Quanti!cação de contagens viáveis de células bacterianas. N ≥ 9 repetições (para

tratamentos) e ≥6 repetições (para controles não tratados) de ≥3 doadores de pele. *P adj.

usando o ensaio MTT. O tratamento fervido representa um controle inviável. N ≥ 12 replica de ≥4

replica de ≥3 doadores de pele. *P adj. <0,05; **P adj. <0,0001.

A e!cácia de cinco agentes de limpeza de feridas para reduzir ou remover a carga

Para determinar o grau de citotoxicidade de cada limpador, as biópsias ex vivo de

3.2 A e!cácia antimicrobiana da CHG é transitória

tratamento. N ≥ 6 repetições (para tratamentos) e ≥4 réplicas (para controles não tratados) de ≥2

Microgra!as eletrônicas de varredura em quatro ampliações diferentes (×100, ×500, ×2000,

projeção de intensidade máxima mostra células únicas e pequenos agregados de bactérias

encontradas dispersas profundamente dentro do tecido.

Em seguida, usamos a microscopia eletrônica de varredura (MEV) para avaliar

Ficamos intrigados com a falta de células bacterianas visíveis em feridas tratadas

Para determinar se nossos resultados são especí!cos para P. aeruginosa ou

biópsias ex vivo de feridas excisionais humanas foram avaliadas imediatamente após o

tratamento. N ≥ 6 repetições (para tratamentos) e ≥4 réplicas (para controles não tratados) de ≥2

doadores de pele. ns, não signi!cativamente diferente. (D,E) Microgra!as eletrônicas de

coletadas 24 horas após o tratamento !nal. Os contornos tracejados representam a região

de feridas ex vivo em baixa ampliação 24 horas após o tratamento. Os contornos pontilhados

fundido com a auto"uorescência azul do tecido.

Após a supressão da biosobrecarga da ferida após um único tratamento 4 horas

De acordo com os dados quantitativos da cultura, a MEV de feridas colonizadas por

3.3 A citotoxicidade da CHG é duradoura

processadas em 1, 3, 7 e 14 dias após o tratamento, respectivamente. (G-J) Biópsias tratadas com

CHG e processadas em 1, 3, 7 e 14 dias após o tratamento, respectivamente. (K) Quanti!cação do

horizontais mostram uma mediana de ≥6 repetições de ≥2 doadores de pele.

3.4 CHG exibe citotoxicidade e atrasa a cicatrização de

A CHG é citotóxica e impede a cicatrização de feridas na pele humana em um modelo de

camundongo xenoenxerto de pele humana; feridas de espessura parcial de 4 mm foram criadas

xenoenxertos de pele humana em "ancos bilaterais de camundongos atímicos. (A)

partir de cortes histológicos corados com H&E. N = 4 feridas por tratamento; N = 4

diferente. * p < 0,05.

Aqui, optamos por estabelecer um modelo de contaminação de feridas usando

Modelos clássicos para avaliar a citotoxicidade são tipicamente realizados in vitro e

Limpadores de feridas e agentes antissépticos são frequentemente usados para

Usando MEV, mostramos extensa colonização super!cial do leito da ferida

Em conclusão, apresentamos um modelo clinicamente relevante para avaliar a

DATA AVAILABILITY STATEMENT

wrr1304 Figure S1 Pseudomonas aeruginosa forms aggregates in ex vivo wounds. Live

0001- inoculation and PBS treatment at 24 h post-treatment. Maximum intensity

FigureS1 projection shows a large aggregate of GFP-expressing Pseudomonas aeruginosa.

wrr1304 Figure S2 Daily CHG treatment exhibits cytotoxicity in ex vivo wounds

.tif two skin donors. *p < 0.05.

3 Azevedo MM, Lisboa C, Cobrado L, Pina-Vaz C, Rodrigues A. Hard-to-heal wounds,

5 Slaviero L, Avruscio G, Vindigni V, Tocco-Tussardi I. Antiseptics for burns: a review of