Fotocolorimetria

Uso da luz para a descoberta da concentração

de uma determinada substância em uma
amostra. Esta aula é uma construção.

Frederico Lemos
14/12/2021
 Provocação ! Vamos considerar o seguinte
experimento:
Tentativa de descobrir a concentração pela
tonalidade da cor. Quanto mais escuro
mais concentrada está a amostra(?).
25%
100% 50%

Solvente 1 gota 2 gotas

~ Se para uma gota chega 50% da luz, se chegar

apenas 25% significa que temos duas gotas nesta
amostra (?).
1. Por que usamos a luz vermelha e não a branca ?

2. Quanto mais escura for a mostra mais concentrada

ela está ?

3. Onde ficou a parte da luz que não chegou ao outro

lado ? A que não foi transmitida ?

4. A relação entre a quantidade de gotas e a

coloração da amostra é linear conforme sugere o
exemplo ?

5. Existe alguma lei que fundamenta a provocação ?

6. Com implementar um equipamento para isto ?

 Para responder estas questões
vamos aprender:
●
Propriedades da luz refletida e luz absorvida
em termos de cores;
●
A interação da luz monocromática com as
substancias de uma amostra;
●
A leis que fundamentam a fotocolorimetria;
●
Aplicação destas leis a exemplo hipotético;
●
A construção de um fotocolorímetro;
●
Demostração de um experimento.
Examinemos o fenômeno da
reflexão e absorção da luz !

… Necessitamos compreender
a necessidade da luz
monocromática.
 Reflexão da luz:
“Roses are red, violets are blue”.

Por que ?
https://www.youtube.com/watch?v=MVTqPkOgLUU
Luz é refletida !
A luz não atravessa a rosa !

Luz Branca
Lu ca
z n
Br ra
an
uzB
ca L

A rosa reflete a Cor Vermelha

E as outras cores ???
Na reflexão cor que vemos é a cor da
luz refletida que chega aos nossos
olhos.

https://www.filipeflop.com/blog/sensor-de-cor-tcs3200-rgb-arduino/
 Vejam se realmente entenderam !!!

Iluminando o mesmo cartão com a luz

branca e depois com a luz azul. (?)
Agora, que cor
eu vejo nesse
cartão ?

Luz Luz Azul

Branca

Eu poderia dar meio ponto pra quem acertasse...

Agora ilumine um copo de cerveja
com luz branca. Por que você vê
laranja ?

Luz Branca

Reflete a cor laranja ? NÃO !!! Então, como a cor

laranja é produzida ? A taça é transparente !!! Assim,
trata-se do fenômeno de ABSORÇÃO da luz.
Se a luz branca é RGB e vemos a
cerveja amarela, qual a cor que está
sendo absorvida ?

Assim, a cor que nos interessa é a… (?)

 Exemplo: Atravessando meios
transparentes coloridos: cor(es)
absorvida(s). R

m elho
ver
o rv eo
Abs eflete ?
ou r Composição
de verde com azul

R
G
B
Ciano ???

A cor da solução é determinada pela cor da luz

transmitida.
 Então, na interação da luz
com a matéria, se um um
comprimento de onda for
absorvido, haverá a
mudança da cor
observada.
~ Este comprimento de luz absorvida é que tem toda a
importância para a fotocolorimetria !!!. Vejamos mais um
exemplo: Vamos não !!! Já basta /:
 Gerando “cores” usando o sistema
RGB

https://phet.colorado.edu/pt_BR/simulation/color-vision

/run/media/fred/KINGSTON/Aula totais/Biomedical/13 Fotocolorimetria/color-vision_pt_BR.

html
 Conclusão: Sensibilidade das
substâncias
●
Cada substância tem sua forma particular de
interagir com a luz.

●
Para se realizar uma análise fotocolorimétrica é
necessário conhecer o espectro de absorção da
amostra que se quer determinar e escolher o
comprimento de onda da luz incidente (cor) que
causará o máximo de absorção pela espécie a
ser determinada e com isto obter a melhor
sensibilidade na absorção. A clorofila mostra isto:
Espectro da clorofila vista por
um espectrofotômetro

azul vermelho
Gráfico da clorofila vista pelo
fotocolorímetro.

0,9 Folha verde

Folha roxa
Absorbância

0,6

0,3

0
450 500 550 600 650
Comprimento de onda (nm)
Cores absorvidas x transmitidas
Tabela com a relação entre a cor absorvida versus a cor
complementar transmitida quando a amostra é iluminada
com a cor branca (RGB).
Comprimento de onda Cor da luz absorvida Cor complementar
absorvido transmitida
400-435 Violeta Amarela-esverdeada
435-480 Azul Amarela
480-490 Azul-esverdeada Laranja
490-500 Verde-azulada Vermelha
500-560 Verde Púrpura
560-580 Amarela-esverdeada Violeta
580-595 Amarela Azul
595-650 Laranja Azul-esverdeada
560-750 Vermelha Verde-azulada
Leis que fundamentam a
fotocolorimetria
 Lei de Beer-Lambert-Bouguer
Bouguer em 1729: Quando um feixe de luz
monocromático atravessa um meio transparente
homogêneo, cada camada desse meio, absorve igual
quantidade de energia luminosa...

Lambert em 1760: ...independente da intensidade da

luz incidente.

Beer em 1852: …A intensidade decresce

exponencialmente a medida que a concentração da
substância absorvente aumenta aritmeticamente.
 Transmitância

Transmitância T = (P / P0)
Transmitância (%) T = 100 (P / P0)
Onde P é a intensidade luminosa que chega.
 Exemplo de transmitância

A luz vermelha de comprimento de onda 633nm

exita um eletrofotômetro que apresenta uma
leitura de 30mv. A passar por uma amostra essa
leitura cai para 10mV. Calcule a transmitância.

T = (P / P0).100% ==> T = (10mv / 30mV).100%

==> T = 1/3 x 100%
 Absorbância

Absorbância: A = log (1/T) “T” Não em percentuais

ou
A = - log (P/ P0) => log(P0/P) sem o menos.
Exemplo numérico da Absorbância

Calcule a absorbância para a transmitância

encontrada na questão anterior.

A = log (1/T) ==> A = log (1/1/3) ==>

A = log (3) ==> A = 0,48
Para um melhor aprendizado,
vamos aplicar a lei de Bouguer a
uma situação hipotética e
descobrir a equação.
 Aplicação da lei de Bouguer
Suposição: Cada camada absorve 50 % da emissão de luz.
Cubeta
1 cm

100% 3,125%

P0
P

0,2 cm

Comprimento ótico da cubeta (b) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Transmitância T = 100.(P/P0) 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125%

Absorbância A= log (P0/P) 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

Construindo o gráfico da transmitância
em função das camadas atravessadas.

1 cm

0,2 cm
Fazendo-se uma regressão exponencial
encontramos a função para T.
O xmgrace nos da a função 1 cm
na base “e”.

T = 100. e-3,46.b

0,2 cm

Onde para este caso a constante é 3,46. Transformando a

transmitância em absorbância temos uma reta –>
Traçando o gráfico da Absorbância
A lei de Beer
Lei de Beer: A intensidade decresce exponencialmente a
medida que a concentração de uma substância aumenta
aritmeticamente para um comprimento “b” fixo.
100

80

60
T(%)

40

20

0
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
Concentração (mol/L)
Transformarmos a transmitância em absorbância, vemos
que a concentração fica diretamente proporcional a
absorbância.
2,0

1,5 A = a.b.C
Absorbância

1,0

0,5

0
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
Concentração (mol/L)
Os fótons interagem com os cromóforos de maneira que a luz diminui
de intensidade em quantidades infinitesimais dP onde P é a intensidade
radiante e b a quantidade infinitesimal. A redução da intensidade da luz
é proporcional a quantidade de cromóforos. Quanto maior a quantidade
e cromóforos maior a probabilidade de haver um choque fóton-
cromóforo.

dP ∝ C P db (I) e então dP = -k C P (II),

Onde C é a concentração de cromóforos, db é a quantidade

infinitesimal do caminho ótico a ser percorrido, necessário para um
foton encontrar um cromóforo e ser absorvido. K é a constante de
proporcionalidade e o sinal negativo significa que a luz está diminuindo.

Se o que nos interessa é a luz absorvida ao longo do caminho ótico

devemos somar todas as d P’s em todos os d b’s, o que
matematicamente significa uma integral.

O resultado desta integral é: ln P/P 0 = - k. b. C ==>

-log P/P0 = k/(2,303). b. C ==> A=a.b.C

 Lei de Beer e a linearidade
A aplicação da lei de Beer possui uma limitação. É que para
concentrações maiores que C > 0,01 mol/L a relação a absorbância
e a concentração não é mais linear.

Concentração diretamente
proporcional absorbância.
Até um certo valor !!!

A = a.b.c onde:

a = absorvidade molar (L / mol . cm)

b = comprimento do caminho da amostra (cm)
c = concentração da amostra (mol / L )
 Resumo da ópera
→ Existe uma relação exponencial entre a intensidade da luz que
atravessa uma substância e sua concentração. (Lei de Beer).

→ Se conhecermos a absorvidade molar de uma substância dada

por “a” e o tamanho do percurso que a luz irá atravessar dado por
“b”, a absorbância “A” se torna diretamente proporcional a
concentração “C” dessa substância.

Assim, a lei de Beer-Lambert (corrigindo Lambert-Beer) fica:

A = a.b.C Onde: A = absorbância

a = absorvidade molar (L / mol . cm)
b = comprimento do caminho da amostra (cm)
C = concentração da amostra (mol / L )

Se b e a forem conhecidos, então c ~ A

 Condições físico-químicas para o uso
da lei de Beer
- As partículas (átomos, moléculas ou íons) da solução devem
absorver a luz de forma independente entre si;

- O meio absorvente deve ser homogêneo e não dissipar a radiação;

- A radiação incidente deve estar colimada (raios paralelos entre si)

para atravessar a mesma distância enquanto interagem com as
partículas da solução;

- A radiação deve ser monocromática e no comprimento de onda

para o qual a absorção da amostra é máxima;

- A radiação incidente não pode desestabilizar os átomos, moléculas

ou íons da solução. Ex: Não poderá provocar fluorescência ou
fosforescência.
Como implementar fisicamente
a lei de Beer-Lambert ?

1) Luz monocromática;

2) Percurso luminoso transparente e de

tamanho fixo;

3) Medir a quantidade de luz absorvida.

 Atualizando nossa provocação:

- É possível de descobrir a concentração pela

tonalidade da cor.
- Quanto mais escuro mais concentrada está a
amostra.
25%
100% 50%

Solvente 1 gota 2 gotas

- Existe a linearidade entre a absorbância e a

concentração A=a.b.C => C =A/ab
Experiência com a lei de Beer

https://phet.colorado.edu/pt_BR/simulations/beers-law-lab

https://phet.colorado.edu/pt_BR/simulation/legacy/beers-law-lab

https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_pt
_BR.html
Vamos construir juntos um
fotocolorímetro ?
Três formas de gerar cores
(comprimentos de onda)
 1) Luz monocromática:
O Monocromador

Uso de filtros: Uso de prismas:

Fotocolorímetros Espectrofotômetros

Grades de difração:
espectrofotômetros
 O Prisma – gerando cores.

As ondas de diferentes frequências tomam diversos

ângulos na refração o que faz surgir várias cores. Dentro do
vidro as velocidades são diferentes.
Grade de difração
 Gerando radiações com filtros.

Passagem seletiva: Filtro vermelho deixa passar

apenas a irradiação vermelha. Isto acontece se a
luz incidente for branca. E o que acontece com as
outras ?
2) Percurso luminoso transparente de tamanho fixo:
Usa-se uma cubeta de tamanho “b” fixo.

b
3)Medir a quantidade de luz absorvida.

Procura-se a fotocélula !!!

Photoeletric-cell

? Sensor luminoso de resposta linear, sem histerese, sensível as variações de

intensidade luminosa. Qual o componente eletrônico que atende essas necessidades
nos dias de hoje ? Resposta em corrente.
 50
0 100

R P0
G I1 = 100mA
B

50
0 100

R
P
G I1 = 50mA
B

T = 100. 50/100 = 50% A = log (100/50) = 0,3

 IF1
IF1

F1
50
60
70 0
80 + -
90
100
I1 I2 IF2

R2 F2
I1t
I2t
Esquema do Klett-Summerson
Espectrofotômetro
 Espectrofotômetro

FIM
Uma previa da prática de
fotocolorimetria:
Determinar a quantidade
de glicose no sangue
usando fotocolorimetria
Esperando o sangue coagular
Separado o soro do sangue
pela centrifuga
Retirado o soro do sangue para
o tubo teste.
Retirado o sangue para o tubo
teste.
Aspecto do soro sanguíneo
Marcando os tubos
Os três tubos: Branco,
Teste e Padrão.
Tubo Teste

Tubo Teste: Adicionando 2mL de

reagente de cor aos 20uL de
soro do sangue.
Tubo Branco

●
Tubo Branco: 2mL de reagente
de cor mais 20uL de água
destilada.
Não temos a foto do tubo
padrão

20ul de padrão de glicose e 2mL de

reagente de cor
 Teste: Padrão: Branco:
2mL de reagente de 2mL de reagente de 2mL de reagente de
cor cor cor
+ + +
20uL de soro 20uL do Padrão 20uL água destilada
sangue

Padrão: 100mg/dL de glicose

Homogeneizando e levando ao
banho maria.
Espera de dez minutos para que
a reação ocorra.
Tudo Pronto !!!
Branco Teste
Água destilada + Sangue +
reagente de cor reagente de cor
Depois de descobrir o
comprimento de onda mais
absorvido...

Zera-se o equipamento com o

Branco.
Reagente de cor e padrão
 Leitura do tubo Padrão

O tubo padrão apresentou

uma leitura em transmitância
de T = 55%

A = log (1 / T)

A = log (1 / 0,55)

A = 0,25

Portanto, 100mg / dL de glicose tem 0,25

de absorbância
Leitura para o Teste

O Teste apresentou uma

leitura em transmitância
de T = 40%

A = log (1 / T)

A = log (1 / 0,40)

A = 0,39

0,25 ---> 100mg / dL

0,39 ----> x mg / dL
 Conclusão

Conc = (ABS do Teste / ABS de Padrão) x Conc do Padrão

Conc = ( 0,39 / 0,25 ) x 100 mg / dL

Conc = 156 mg / dL

ét i c o
Diab
A lógica da regra de três..

0,25 ------→ 100 mg / dL

0,39 ------→ x

X = [0,39 (T) x 100 mg / dL ] / 0,25

X = 156 mg / dL