UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
DOUTORADO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

INCIDÊNCIA E PRODUÇAO DE CELULASES POR FUNGOS

FITOPATOGÊNICOS DE FOLHAS E RAÍZES DE MANDIOCA

Doutorando(a): Martival dos Santos Morais

Orientador(a): Dr.a Neiva Tinti de Oliveira

Projeto de pesquisa apresentado em cumprimento

às exigências do controle de arquivamento
documental e de supervisão do Curso de
Doutorado do Programa de Pós-graduação em
Biologia de Fungos - Universidade Federal de
Pernambuco – UFPE.

RECIFE-PE
2010
 1. INTRODUÇÃO

No Estado da Paraíba, Nordeste brasileiro, culturas de tuberosas amiláceas, como a

mandioca (Manihot sculenta Crantz) apresentam grande importância social, contribuindo no auxílio
à sobrevivência de parcela significativa da população de baixa renda do meio rural e da economia
da agricultura familiar (Sousa e Targino, 2009). Vários fatores têm concorrido para o decréscimo da
sua produtividade, dentre estes, doenças provocadas por fungos fitopatogênicos, que ocorrem desde
o comércio das manivas e perduram até a pós-colheita (Oliveira et al., 2008; Mattos et al., 2002).
Foram realizados escassos e antigos estudos acerca da taxonomia e patogenia destes agentes
infecciosos no Estado. No único levantamento realizado, na década de 80, foi registrado o
parasitismo de Phythophtora sp., causando podridão das raízes em plantas cultivadas na região do
Brejo Paraibano (Melo e Tokeshi, 1980).
No tocante às doenças que provocam prejuízos econômicos na cultura da mandioca a nível
de Brasil, destacam-se como as mais importantes: a podridão radicular, bacterioses,
superbrotamento, superalongamento e viroses. Entre os agentes causadores da podridão radicular,
cita-se fungos integrantes do gênero Phytophthora e as espécies Pythium scleroteichum e Fusarium
solani (Mattos et al., 2002). Foram também descritos vários agentes etiológicos causadores de
doenças foliares. Os gêneros Cercospora, Cercosporidium e Phaeoramularia causam as manchas
foliares, enquanto Colletotricum gloeosporioides, Uromyces manihotis e Oidium manihotis são os
agentes da Antracnose, ferrugem e oídio, respectivamente (Kimati e Amorim, 2005).
Em levantamento de doenças realizado no Estado do Maranhão, Sousa e Dias (1991)
registraram que a mancha parda grande (Cercospora vicosae), ocorreu com maior incidência na
época chuvosa, enquanto que a Mancha parda pequena (Cercosporidium henningsii), na época seca,
seguida de outras doenças, como mancha branca (Phaeramularia manihotis). No mesmo Estado,
Serra et. al. (2009) registraram a ocorrência de Scytalidium lignicola, importante patógeno na
cultura que causa a podridão negra em raízes e caule.
No Estado do Pará, Poltronieri et al. (1993; 1997) identificaram, Phytophthora drechsleri, P.
nicotianae, P. richardiae e Pythium scleroteichum, agentes causais da podridão radicular e na
mesma região, no ano 2001, observou-se em Santarém, a primeira ocorrência do fungo Fusarium
solani, o qual causou a morte de 30% de mudas de mandioca naquele ano (Poltronieri et al., 2002).
Embora a Paraíba se destaque como um dos principais produtores do Brasil da mandioca, as
perdas atuais causadas pelos problemas parasitários poderiam ser evitadas, realizando-se o
levantamento dos agentes etiológicos. Segundo Fernandes et al. (2006), a importância da rápida e
correta identificação dos agentes patogênicos presentes em diferentes culturas apresenta-se como
ferramenta primordial para o estabelecimento do correto tratamento a ser empregado, possibilitando
a recuperação da cultura, com diminuição nos prejuízos causados pelas doenças.
Outra importância em se conhecer a diversidade destes agentes biológicos, deve-se a
possibilidade de se obter espécimes com potencial de produção de enzimas de interesse
biotecnológico. Pesquisas envolvendo fungos têm contribuído significativamente neste campo,
sendo empregadas em diversos setores da indústria, tais como: no processamento de alimentos, na
produção de detergentes, na indústria têxtil, de couro e papel, na indústria farmacêutica, na bioquímica,
biologia molecular, em aplicações biomédicas e recentemente na química fina (Ângelo, 2010).
Fungos fitopatogênicos produzem grande variedade de enzimas nos processos de penetração
e colonização do tecido parasitado (Walton, 1994), sendo algumas delas capazes de degradar os
componentes da parede celular (Baer e Gudmestad, 1995; Ryan, 1973), enquanto outras estão
envolvidas na degradação e transporte de nutrientes para a hifa (Bateman & Basham 1976). Vários
estudos têm sido realizados buscando-se enumerar e caracterizar enzimas produzidas no processo de
colonização do tecido hospedeiro e ao mesmo tempo avaliar seu potencial em aplicações
biotecnológicas (Fernandes, et al., 2007; Marchi, et al., 2006; Bastos, 2005; Moreira, et. al., 2005).
Acompanhando este movimento, Maia, et al., (1999) constataram a produção de lipase pelo
fungo fitopatogênico Fusarium solani, Lima Filho et al. (2003), trabalhando com isolados de
Colletotrichum causadores de antracnose em folhas de caju, manga, maracujá, mamão e banana,
verificaram também a produção de amilase, lipase, protease e celulase.
Mais recentemente, a partir do estudo de isolados fúngicos de pinha, manga fruto, manga
folha, graviola, berinjela e eucalipto, Bauermeister et al. (2009) verificaram a produção de lipase e
lacase por Lasiodiplodia theobromae em óleo de mamona como fonte de carbono. Bueno et al.
(2009), também constataram a produção das enzimas extracelulares amilase, lipase, celulase,
caseinase (protease) e lacase (oxidase) por Fusarium solani, agente causal da podridão do colo do
maracujazeiro amarelo.
No tocante aos estudos biotecnológicos dos fungos presentes nos tecidos da mandioca,
Rondon (2003) destacou a ação amilolítica de fungos endofíticos isolados da planta e representados
pelos gêneros: Colletotrichum, Fusarium, Phomopsis, Phyllosticta e Aspergillus.
Neste contexto, entende-se que a obtenção, caracterização e otimização das condições de
produção enzimática dos fungos fitopatogênicos da mandioca, possibilita a avaliação de seu
potencial de exploração na indústria biotecnológica.
2. HIPÓTESE

Fungos fitopatogênicos de folhas e raízes da mandioca produzem enzimas celulolíticas com

potencial de exploração na indústria biotecnológica.

3. OBJETIVOS
3.1 Geral

Selecionar fungos fitopatogênicos da mandioca produtores de enzimas extra-celulares com

potencial para exploração biotecnológica.

3.2 Específicos

 Isolar e identificar fungos fitopatogênicos de folhas e raízes da mandioca;

 Comparar a incidência de doenças entre os locais estudados;
 Selecionar linhagens fúngicas com atividades celulolítica;
 Produzir as enzimas em biorreator de bancada.
 Definir a otimização de atividades de celulases (temperatura, estabilidade da temperatura e
pH) produzida por estes fungos;
 Purificar e caracterizar as enzimas, através de técnicas de eletroforese e espectrometria de
massa.

4. METAS

- Identificar fungos das folhas e raízes afetadas da mandioca a partir da coleta em campo e
enumerar todos os sintomas observáveis até outubro de 2011.
- Realizar testes de determinação da atividade enzimática e definir as melhores condições
físico-químicas para sua produção até dezembro de 2012.
- Verificar por meio de análises laboratoriais, até junho de 2013, as principais características
bioquímicas e estruturais das enzimas selecionadas.
-Analisar estatisticamente os dados coletados dos ensaios, realizar o levantamento
bibliográfico e publicar os resultados até outubro de 2013.
- Redigir a tese e publicar os trabalhos científicos até dezembro de 2013
- Defesa em fevereiro de 2014.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Localização da área de Estudo

A Paraíba está localizada na região Nordeste do Brasil, na sua parte mais oriental, com os
extremos Norte a 6° 02’ 12” de Latitude Norte, Sul, a 8° 19’ 18” de Latitude Sul, Leste a 43º 45’
54” e Oeste a 38° 45’ 45”. O estado possui clima Tropical úmido no litoral, com chuvas mais
abundantes e à medida que se desloca para o interior, depois da Serra da Borborema, o clima torna-
se semi-árido e sujeito a estiagens prolongadas e precipitações abaixo dos 500 mm. As temperaturas
médias anuais ultrapassam os 26°C, com algumas exceções no Planalto da Borborema, onde a
temperatura é de 24°C (Rodriguez, 2002). O material fitopatológico será coletado em quatro
microrregiões paraibanas: Itaporanga (Sertão), Curimataú (Agreste), Guarabira (Brejo) e Sapé
(Zona da Mata Paraibana). Em cada uma destas, serão selecionadas três propriedades agrícolas
produtoras cadastradas pela EMATER-PB (Empresa de assistência Técnica e Extensão Rural)
(Figura 1).
Microrregião de Itaporanga
Microrregião do Curimataú
Microrregião de Guarabira
Microrregião de Sapé
Figura 1. Microrregiões de Itaporanga, Curimataú, Guarabira e Sapé, Paraíba. Melo e Rodriguez (2004).

5.2 Coletas em campo

As coletas serão realizadas durante os meses de março a maio, período chuvoso de outono e
entre os meses de setembro a novembro de 2011, período seco da primavera na região, de acordo
com dados do CPTEC – INPE (2010), em visitas quinzenais, perfazendo o total de 14 coletas em
cada localidade. Serão observadas e coletadas folhas, e raízes apresentando sintomas de doenças
fúngicas.
Para determinação da incidência das doenças radiculares, será considerada a percentagem de
plantas afetadas. Em relação à incidência das doenças foliares será quantificada a percentagem de
folhas atacadas. Destas folhas, serão retiradas 100 amostras para identificação.

5.3 Isolamento e identificação

5.3.1 Folhas

Para o isolamento dos fungos presentes nas folhas, realizar-se-á uma lavagem em água
corrente de quatro amostras sintomáticas. Com auxílio de um estilete esterilizado, serão cortados 15
fragmentos das bordas da área das lesões, com 1,0 cm 2 diâmetro, de cada um dos diferentes
sintomas. A seguir, os discos serão submetidos a lavagens sucessivas, em álcool etílico 70%,
durante 30 segundos, hipoclorito de Sódio 1,5% por 4 minutos e 3 lavagens sucessivas em água
destilada esterilizada. Depois de lavados e secados, os discos serão colocados de modo equidistante,
em grupos de cinco, em três placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar),
meio ágar-malte e meio de cultura EFMA + EMC (Extrato de folha de Mandioca-Ágar + Extrato de
Malte composto), sendo este último produzido segundo a metodologia de Silva (1984). Aos meios
de cultivo será acrescentado o antibiótico cloranfenicol. As placas serão incubadas por 72 horas, a
26°C. Após este período, as colônias ao redor dos discos, serão contadas e transferidas isoladamente
para purificação em novas placas contendo os meios acima. O estudo taxonômico será realizado em
microscópio e serão consultadas as descrições de Barnett e Hunter (1998) e Singh et al. (1991).

5.3.2 Raízes

Serão coletadas 10 amostras de raízes de plantas de mandioca apresentando sintomas de

doença nas unidades produtoras de cada microrregião, perfazendo um total de 40 raízes tuberosas.
As amostras serão embaladas em sacos plásticos, etiquetadas, colocadas em caixas de isopor e
conduzidas para análise ao Laboratório de Fungos Fitopatogênicos da Universidade Federal de
Pernambuco. Destas, serão retirados com auxílio de estilete, 10 fragmentos de 1,0 cm de diâmetro
de regiões do sistema radicular afetadas. Os fragmentos serão lavados em água corrente,
desinfestados em lavagens sucessivas em álcool 70%, por 30 segundos, hipoclorito de sódio a
1,5% por 5 minutos e 3 lavagens sucessivas em água destilada esterilizada. Serão transferidos para
placas de Petri contendo os meios BDA e ágar-malte esterilizados para formação de colônias após
72 horas. Aos meios de cultivo será acrescentado o antibiótico cloranfenicol. Porções do micélio
desenvolvido serão transferidas com auxílio de uma agulha para placas de Petri contendo os meios
de cultivo mencionados acima e então, novamente incubadas a 25° C sob fotoperíodo de 12 horas.
Cada colônia de fungo desenvolvida em BDA será purificada. Após 8 dias de incubação, porções
das colônias serão analisadas em microscópio óptico composto para identificação dos fungos
isolados e, para isso, serão consultadas as descrições feitas por Barnett e Hunter (1998) e Singh et
al. (1991). Serão avaliadas características macro e microscópicas como: aspecto da cultura,
morfologia e identificação dos patógenos.

5.4 Conservação dos isolados

 Os fungos após identificados serão multiplicados e conservado em tubos de ensaio contendo
os meios citados acima, adicionados com cloranfenicol, para posterior utilização nos experimentos.
As culturas serão mantidas a temperatura de 26° C.

5.5 Seleção dos isolados produtores de Celulases

Discos (5mm de diâmetro) contendo micélio dos isolados oriundos do levantamento

efetuado serão transferidos para placas de Petri contendo meio ágar carboximetilcelulose (CMC)
como única fonte de carbono (Agar: 9,0g; CMC: 5,0g e Tampão Acetato de Na +, pH 5,0: 300,0ml)
e mantidos em incubação durante o período de 4 dias a 28º C e em seguida serão submetidas a
choque térmico por 16 hs a 50º C.
Após este período, será adicionado em cada placa 10 ml de uma solução de vermelho-congo
(0,025% em tampão Tris HCl 0,1M, pH 8,0) a qual permanecerá por 30 minutos. As culturas serão
então lavadas com 5 ml de solução de NaCl 0,5M. Após 5 minutos, por meio da exibição de uma
zona de difusão clara ao redor da colônia, será determinada a hidrólise da celulose (Neirotti &
Azevedo, 1988). Os diâmetros das colônias e dos halos produzidos serão medidos com um
paquímetro (Nogueira & Cavalcanti, 1996). As espécies que atingirem os maiores diâmetros serão
selecionadas para a produção.

5.6 Produção de Celulases

A produção das enzimas realizar-se-á no laboratório de biocombustíveis do CETENE

(Centro de Estudos Tecnológicos e Estratégicos do Nordeste).
Para indução, os fungos selecionados do ensaio anterior serão mantidos em tubos de ensaio
rosqueados contendo meio semi-sólido de carboximetilcelulose. O período de incubação será de 7
(sete) dias, com as culturas mantidas à 30º C. Posteriormente, será realizado o repique para o meio
líquido que contém a mesma composição basal excetuando o ágar e adicionando um meio de
micronutrientes com adaptações segundo Mandels e Weber (1969). Este meio será filtrado em tamis
para separação da biomassa micelial.

5.7 Atividade enzimática

O processo de produção será realizado segundo as normas metodológicas do NREL

(National Renewable Energy Laboratory), que determina a medida da atividade celulolítica em
termos de unidades de papel de filtro por mililitro da solução enzimática original (FPU – Filter
Paper Units). Estes ensaios serão realizados em tubos de vidro estéreis de 15 cm de altura, contendo
uma fita de papel de filtro de 10 cm2 como única fonte de carbono e 10ml do meio sintético
(NaNO3: 3,0 g.l-1; K2HPO4: 1,0 g.l-1; MgSO4: 0,5 g.L-1; KCl: 0,5 g.l-1 e FeSO4.7H2O: 10,0 m g.l-1, pH
5,0) cobrindo 2/3 das fitas para determinação da atividade lignocelulolítica e 1 ml de etanol anidro
contendo 0,5% de pNPA ou pNPP com 1ml da solução tampão contendo 100µl (1mg.ml -1), segundo
Mandels e Weber (1969).

5.8 Estudo do Peso seco e proteínas

A biomassa resultante do cultivo submerso será mensurada através da determinação da

matéria seca. No sobrenadante, serão quantificadas proteínas solúveis totais segundo protocolo de
Bradford et al., (1976) modificado.

5.9 Otimização da atividade enzimática

5.9.1 pH

A atividade enzimática em função do pH será verificada incubando o extrato bruto enzimático

em seis sistemas tampões. Para o sistema 0,1M acetato-fosfato-Tris, o valor do pH variará de 3,0 a 9,0,
sendo que para pH 3,0 a 5,0 utilizar-se-à tampão acetato de sódio; para pH 6,0 e 7,0 utilizar-se-à tampão
fosfato de sódio e para pH 8,0 e 9,0, o tampão Tris-HCl. Após o período de incubação de 20 minutos a
40 º C, a reação será interrompida com adição de DNS, e a reação será desenvolvida por aquecimento do
meio reacional em banho-maria de água fervente por 5 minutos. A densidade ótica será determinada em
espectrofotômetro (λ= 540nm).

5.9.2 Temperatura

A determinação da temperatura ótima de hidrólise será verificada incubando as enzimas com os

substratos em diferentes temperaturas, no intervalo de 25 a 50 º C. Os ensaios enzimáticos serão
realizados em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,0 com agitação constante. A reação será
interrompida com adição de DNS e a coloração será desenvolvida por aquecimento do meio reacional
em banho de água fervente por 5 minutos. A densidade ótica será determinada em espectrofotômetro
(λ= 540nm). A atividade especifica será definida como a quantidade de açúcar redutor produzido em
velocidade inicial de 1μmol por minuto e por mg de proteína.

5.9.3 Estabilidade da Temperatura

 As preparações enzimáticas serão pré-incubadas em diferentes faixas de temperatura, em
intervalos de tempo de 30 min, 1, 2, 4, 8 e 16 horas, sendo a atividade residual determinada ao longo
dos tempos pré-definidos.

5.10 Produção em Biorretator

A biomassa micelial será transferida para um biorreator de bancada instrumentado (New

Brunswick Scientific, modelo BioFlo 110). Este material será submetido a processamentos com
operações descontínua e descontínua alimentada, utilizando-se como fonte de carbono a
carboximetilcelulose. Durante os processos de produção, variações das concentrações de açúcares e
de outros componentes do meio (furfural e Hidroximetilfurfural) serão determinadas por CLAE
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência).

5.11 Ponto isoelétrico, Peso Molecular e Eletroforese em gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Para determinação de ponto isoelétrico e peso molecular aproximado das proteínas em

estudo, será utilizado o dodecil sulfato de sódio (SDS) na modalidade contínua na separação das
cadeias polipeptídicas. O perfil das proteínas secretadas pelos isolados, será analizado utilizando-se
o sistema de eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) em condições desnaturantes, segundo
Laemmli (1970). Para a corrida será utilizada uma voltagem inicial de 80v, posteriormente
aumentada para 100v. Os marcadores que serão utilizados para a determinação da massa molecular
serão: β-galactosidase (116,0 kDa), albumina sérica (66,2 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), lactato
desidrogenase (35,0 kDa), β-lactoglobulina (18,4 kDa) e Lisozima (14,4 kDa). Após a corrida
seguir-se-á o protocolo de coloração do gel por prata descrito por Blum et al. (1987).

5.12 Análise por Espectrometria de Massa

A análise por Espectrometria de massa será realizada no CETENE.

O extrato enzimático será precipitado com 80% (p/v) de sulfato de amônio. O precipitado
será recolhido após centrifugação a 4ºC durante 20 minutos por 9000 rpm, ressuspenso em tampão
citrato de sódio a 0,1 M, pH 5,0 e dialisado em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0, sendo
aplicado em coluna de DEAE- Trisacryl (1,0 x 12,5cm), previamente equilibrada com o sistema
solvente. As amostras serão previamente purificadas por diálise e CLAE. A análise de proteínas
será realizada por espectrometria de massa, por meio do método MALDI-TOF (matrix-assisted
laser desorption/ionization - time-of-flight) (Fenselau, 1997). As amostras que foram submetidas ao
método MALDI-TOF serão liofilizadas.

5.12 Análises estatísticas

Os diâmetros médios do halo de hidrólise e das colônias serão realizados em quatro

repetições em delineamento inteiramente casualizado e comparados através da aplicação do teste de
Tukey a 5% de probabilidade. Para o processamento dos dados utilizar-se-á o Software
Sistema STAT (Sistema para Análise Estatística), versão 2.0 do ano 1995.

6. ORÇAMENTO
Item Descrição Quantidade Valor unitário (R$) Valor Total (R$)
01 Placas de Petri 100 7,00 700, 00
02 Sulfato de Amônio 1 frasco 125,00 125,00
03 Soluções tampão 10 frascos 25,00 250,00
04 Acrilamida 250g 168 00 168,00
05 Sacos plásticos 28 x 42 cm 5 kg 1,30 6,50
06 Lamina: caixa 2 caixas 9,00 18,00
07 Lamínula caixa 3 caixa 5,00 15,00
08 Papel de filtro 2 caixa 35,00 70,00
09 Meio de carboximetilcelulose 5 sacos 41,00 205,00
10 Etiquetas 2 tubos 1,00 2,00
11 Combustível 610 L 2,50 1.525,00
12 Batatas 10 Kg 1,50 15,00
13 Agar-agar 2 frascos 100, 00 200,00
14 Agulhas de inoculação 2 5,00 10,00
15 Tesoura 1 10,00 10,00
16 Cadernos 4 3,50 14,00
17 Caixas de isopor 4 5,30 21,20
TOTAL 3.353,70
*Segundo SPLabor: Comércio para produtos laboratoriais
6.1. Viabilidade de execução do projeto

O laboratório de Fungos fitopatogênicos e o Centro de Estudos Tecnológicos e Estratégicos

do Nordeste (CETENE) dispõem dos equipamentos necessários para a execução do projeto. Para o
material de consumo serão utilizados recursos do Programa de Pós-Graduação e o projeto será
submetido a órgãos de fomento para financiamento.

7. CRONOGRAMA
Atividade / Mês 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Obtenção de créditos ∆ ∆ ∆ ∆ ∆ ∆ ∆ ∆ ∆
Coleta, quantificação e ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Identificação
Determinação e □ □ □ □ □ □ □● □● □● □● □●
produtividade
enzimática
Cinética enzimática □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □
Estudos da Bioquímica ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲
e estrutura enzimática
Análises estatísticas ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲
Levantamento ●□▲○ ●□▲○ ●□▲○ ●□▲ ●□▲ ●□▲ ●□▲ ●□▲ ●□▲ ●□▲
bibliográfico e
Publicações
Redação da tese ▲○ ▲○ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲
Entrega da tese para ○
pré-banca
Defesa ○
Ano 2010 =∆ Ano 2011 =●; Ano 2012 =□; Ano 2013 =▲; Ano 2014 =○

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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