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Andrographolide: um diterpenóide deCymbopogon schoenanthus Identificado

como um novo composto de sucesso contraTrypanosoma cruziUsando
aprendizado de máquina e abordagens experimentais
Henrique Barbosa, Gabriel Zarzana Espinoza, Maiara Amaral, Erica Valadares de Castro Levatti,
Mariana Babberg Abiuzi, Gabriel Correa Vereusimo, Philipe de Oliveira Fernandes, Vineucius
Gonçalves Maltarollo, André Gustavo Tempone, Kathia Maria Honorio,* e João Henrique Ghilardi
Lago*

Cite isto:https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410 Leia online

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Baixado via FUNDACAO UNIV FED DO ABC em 15 de março de 2024 às 14:02:34 (UTC). Consulte https://

ACESSO Métricas e mais Recomendações de artigos *siInformações de Apoio

ABSTRATO:A tripanossomíase americana, também conhecida como doença de Chagas, é causada
pelo protozoárioTrypanosoma cruzie apresenta opções limitadas de tratamento. Os produtos
naturais oferecem vários metabólitos estruturalmente complexos com atividades biológicas,
incluindo aqueles com ação anti-T. cruzipotencial. A descoberta e o desenvolvimento de protótipos
baseados em produtos naturais frequentemente apresentam múltiplas fases que poderiam ser
facilitadas por técnicas de aprendizado de máquina para fornecer um método rápido e eficiente
para a seleção de novos candidatos a sucesso. Utilizando Random Forest e k-Nearest Neighbours,
dois modelos foram construídos para prever a atividade biológica de produtos naturais de plantas
contra amastigotas intracelulares deT. cruzi. O diterpenóide andrographolide foi identificado a
partir de uma triagem virtual como um composto de sucesso promissor. A partir de então, foi
isoladoCymbopogon schoenanthuse caracterizado quimicamente por análise de dados espectrais. A
andrographolida foi avaliada contra as formas tripomastigota e amastigota deT. cruzi, mostrando CI
50valores de 29,4 e 2,9μM, respectivamente, enquanto o medicamento padrão benznidazol
apresentou IC50valores de 17,7 e 5,0μM, respectivamente. Além disso, o composto isolado exibiu
uma citotoxicidade reduzida (CC50= 92,8μM) contra células de mamíferos e proporcionou um índice
de seletividade (SI) de 32, semelhante ao do benznidazol (SI = 39). Deem sílicoanálises, podemos
concluir que
andrographolide atende a muitos requisitos implementados pelo DNDeupara ser um composto de sucesso. Portanto, este trabalho obteve com sucesso
modelos de aprendizado de máquina capazes de prever a atividade de compostos contra formas intracelulares deT. cruzi.

■ INTRODUÇÃO
A Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) define a
fluxo de trabalho rotineiro.8Neste contexto, métodos de aprendizado de
máquina podem facilitar esse processo, permitindo uma triagem rápida
e eficiente de compostos em bibliotecas e bancos de dados com custo
Tripanossomíase Americana (TA) como uma doença negligenciada
reduzido e revolucionando o processo.9,10As últimas décadas
conhecida principalmente pelas dificuldades e limitações envolvidas
introduziram técnicas de inteligência artificial, como processamento de
no seu diagnóstico e tratamento e pelo baixo investimento em
linguagem natural e algoritmos de aprendizado de máquina, para
recursos humanos/financeiros que afetam principalmente as
facilitar estudos sobre descoberta de medicamentos.11,12
populações mais pobres do mundo.1-3AT é causada pela infecção
Considerando a prospecção de compostos à base de produtos naturais
pelo parasita protozoárioTrypanosoma cruzi,e apenas dois
para o desenvolvimento de novos anti-T. cruzimedicamentos, vários
medicamentos estão disponíveis em seu arsenal terapêutico:
estudos relataram o uso de abordagens de aprendizado de máquina
benznidazol e nifurtimox. Ambas as drogas foram introduzidas há
integradas com ensaios fenotípicos ou alvos de medicamentos validados,
aproximadamente 60 anos e apresentam eficácia limitada apenas como a cruzaína.13-16Com base nesses aspectos, este
na fase aguda da doença.4,5
Com base neste cenário, o desenvolvimento de novos medicamentos para o
Questão especial:Aprendizado de Máquina em
tratamento da TA é crucial, e os produtos naturais são uma fonte essencial
Bioquiminformática
para a descoberta de novos protótipos moleculares.6,7Contudo, o processo de
descoberta de medicamentos baseados em produtos naturais é trabalhoso e Recebido:13 de setembro de 2023
frequentemente proporciona compostos com potencial biológico conhecido. Revisado: 6 de dezembro de 2023
Assim, novas estratégias para aumentar a eficiência na busca de protótipos de Aceitaram:6 de dezembro de 2023
medicamentos devem ser implantadas no

© XXXX Sociedade Química Americana https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410

A J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem pubs.acs.org/jcim Artigo

trabalho focado na construção de um conjunto de dados de treinados usando uma validação cruzada externa estratificada de 10
produtos naturais comem vitroanti-T. cruziatividade. O conjunto de vezes e testados com 20% do conjunto total, a parte isolada do processo
dados obtido foi utilizado para construir e validar dois modelos de de validação cruzada.
aprendizado de máquina capazes de prever se um produto natural Desempenho do modelo.As seguintes métricas estatísticas
será ativo contra formas intracelulares deT. cruzi.A abordagem foram usadas para medir o desempenho do modelo
citada anteriormente identificou o diterpenóide andrographolide
PT
como um sucesso promissor. Conforme relatado na literatura,17este VP = + FP
PT (1)
diterpenóide foi previamente isolado deAndrographis paniculatae
apresentou diversas ações terapêuticas como antiinflamatória, TN
antioxidante, anticancerígena, antimicrobiana e anti-hiperglicêmica. VP = + FN
TN (2)
Mais recentemente, o uso deA. paniculataextratos para tratamento
de pacientes leves com COVID-19 na Tailândia foram relatados.18 PT
Além disso, o efeito da andrographolida contraT. bruceitambém foi RP = + FN
PT (3)
relatado na literatura,19,20mas sua potência contraT. cruzi não foi
avaliado anteriormente. Para comprovar os efeitos biológicos da TN
NR = + FP
andrographolide, ela foi isolada deCymbopogon schoenan- TN (4)

■
por issofolhas e testado contra formas amastigotas deT. cruzi.
MATERIAIS E MÉTODOS
Conjuntos de dados.O conjunto de dados utilizado para treinamento
dos modelos de aprendizado de máquina foi construído em Instant
JChem através de uma extensa revisão de literatura sobre produtos
naturais com anti-T. cruziatividade entre os anos de 2012 e 2021.21O
conjunto de dados inclui atividade do parasita contra formas
epimastigotas, tripomastigotas e/ou amastigotas, cepa do parasita,
citotoxicidade contra células de mamíferos e o tipo de célula
correspondente. O conjunto de dados para triagem virtual foi uma
combinação de dados de ID e SMILES, disponíveis no banco de dados de
alvo de atividade de composto anticâncer baseado em plantas naturais
(NPACT), contendo 1.574 compostos.
Curadoria de dados.O IC50os valores foram padronizados emμM, e os
compostos foram classificados em duas classes: IC50valores≤
10,0μM como “ativo” e > 10,0μM como “inativo”. Os protocolos
foram seguidos conforme proposto por Fourchese outros.22-24para
curadoria de dados: por exemplo, compostos inorgânicos, sais e
misturas foram excluídos do conjunto de compostos.
Impressão digital molecular.Para construir o modelo de
aprendizado de máquina, foram utilizados descritores como impressões
digitais moleculares, e as configurações das impressões digitais foram
baseadas na literatura.25Morgan,26pares de átomos,27MACCS (versão de
166 bits),28e PubChem29as impressões digitais foram calculadas a partir
da representação simbólica do SMILES como uma forma binária de
representação da estrutura molecular usando RDKit (http://www.
rdkit.org) implementar.30
Balanceamento de dados.A proporção de dados ativos/inativos para
formas amastigotas foi desequilibrada, apresentando 69 e 94 entradas,
respectivamente. Uma maneira de equilibrar esses dados foi usar SMOTE
(Synthetic Minority Oversampling Technique),31,32uma técnica específica
para valores nominais desequilibrados.
Modelos de aprendizado de máquina.Devido à natureza binária dos
dados, foi utilizado o algoritmo classificador k-Nearest Neighbours (kNN)
variando tipos de impressões digitais, com e sem SMOTE para construir
oito modelos diferentes. O modelo kNN classifica um exemplo com base
nos vizinhos mais próximos sendo este modelo construído com Scikit-
learn33utilizando módulos GridSearchCV, kNeighborsClassifier, sendo
treinado no algoritmo ball tree utilizando n_neighbors = 1, 3, 5,..., 23,
peso = distância, uniforme; tamanho da folha = 15, 30, 45, 60 e métrica
Minkowski para distâncias comp=2. Para evitar overfitting, este modelo
foi calculado com validações internas e externas.34O método classificador
Random Forest (RF) também foi empregado como técnica auxiliar/
complementar. Este modelo combina previsões de uma série de árvores
de decisão para classificar os dados. O modelo RF foi
TRP
RC = VPP +
2 (5)
PT×TN FP×FN
MCC =
(TP + FP)(TP + FN)(TN + FP)(TN + FN) (6)
PPV×TPR
1 pontuação = 2×
PPV + TPR (7)
TPR + TNR
bACC =
2 (8)
p pe
=0
1 pe (9)
com valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo
(VPN), sensibilidade ou recall (taxa de verdadeiro positivo, TPR),
especificidade (taxa de verdadeiro negativo, TNR) e taxa de
classificação correta (CCR), verdadeiro positivo (TP) em relação a
positivoe previstopositivo, verdadeiro negativo (TN) em relação
ao fato negativoprevisto negativo, falsopositivo(FP) valores que
são negativomas esperado comopositivoe falso negativo (FN)
em relação apositivovalores indicados comonegativo. Por fim,
foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Matthews (MCC),
uma métrica de desempenho amplamente utilizada que mede a
associação entre variáveis binárias e suas matrizes de
confusão. Outra forma de medir a precisão do modelo é a
pontuação F1, que combina pontuações de precisão (PPV) e
sensibilidade (TPR) para expressar quantas previsões corretas o
modelo faz em todo o conjunto de dados. Além disso, foram
calculados a acurácia balanceada (bACC), o escore kappa de
Cohen e a área sob a curva ROC (característica operacional do
receptor) para avaliar a acurácia do modelo.35-37
Domínio de aplicabilidade.Dada a dificuldade de encontrar um
método promissor para o cálculo do domínio de aplicabilidade para
dados binários, este trabalho adaptou o kNN descrito por Roy, Kar e
Das.38No modelo kNN, o domínio de aplicabilidade foi avaliado
calculando diferentes distâncias (1, 3, 5, ..., 23) entre cada molécula
do conjunto de teste e todas as moléculas do conjunto de
treinamento. Essas distâncias foram então avaliadas usando três
componentes do PCA (Principal Component Analysis) no conjunto de
dados descritores do modelo39(esses componentes retêm 28% das
informações do conjunto completo de dados). Para o modelo RF, a
similaridade Tanimoto/Jaccard foi calculada entre cada NPACT e
molécula de treinamento e entre moléculas de treinamento. Depois
disso, a similaridade média dos cinco vizinhos mais próximos foi
usada para

B https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
obter uma pontuação de similaridade, definindo o valor mínimo da pontuação do
conjunto de treinamento (0,328) como limite inferior.
Triagem Virtual.Após a construção e validação dos modelos
foi realizada a triagem virtual utilizando dados estruturais
NPACT40uma plataforma on-line (https://webs. iiitd.edu.in/
raghava/npact/index.html) com dados sobre compostos
bioativos contra diferentes tipos de câncer. Este banco de dados
foi selecionado porque consiste exclusivamente em produtos
naturais bioativos vegetais.
Procedimentos Computacionais.Este trabalho foi realizado em
Python com NumPy, Pandas e Scikit-learn para processamento de dados.
O RDKit foi empregado para obtenção de impressões digitais e o
OriginPro para visualização dos dados. Instant JChem foi usado para
gerenciamento, pesquisa e previsão de banco de dados de estrutura,
Instant JChem 20.19.3, ChemAxon (http://www.chemaxon.com).
Em sílicoEstudo ADMET.Oem sílicoO estudo ADMET foi
realizado usando duas ferramentas online: SwissADME41
(disponível emhttps://www.swissadme.ch) e ADMETlab 2.042
(disponível emhttps://admetmesh.scbdd.com).
Procedimentos Cromatográficos e Espectrométricos. Sílica gel
60 e sílica gel 60 PF254(da Merck, Darmstadt, Alemanha) foram
utilizados para cromatografia em coluna e cromatografia em
camada fina (TLC), respectivamente. A análise por HPLC foi realizada
em um modelo Thermoscientic Ultimate 3000 com um detector DAD
(modelo UVD-170) com um Kinetex C18coluna analítica (5μm−250×
4,6 mm) e usando MeOH:H2O (1% de ácido fórmico) 65:35 como
eluente a 1,0 mL/min. A rotação óptica foi registrada em um
polarímetro JASCO P-2000 (filtro Na,λ= 589 nm) a 25°C. O espectro
UV foi registado utilizando um espectrofotómetro HP 8452 A de
conjunto de díodos 357. Os espectros de RMN foram registrados em
um Varian Unity INOVA (500 MHz
1H e 125 MHz13C) usando CD3OD como solvente e TMS como padrão
interno. Mudanças químicas (δ)
são dados em partes por milhão com constantes de acoplamento (J.)
em Hz. O espectro HRMS foi adquirido com ionização por
electrospray (ESI) em modo de íon positivo em um espectrômetro
Bruker Daltonics MicroTOF QII.
Material vegetal.Folhas deCymbopogon schoenanthus
foram coletados na cidade de Campinas, Estado de São Paulo,
Brasil, em fevereiro/2023. Um exemplar de voucher foi
comparado com aquele de número SP042740 do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Este estudo
foi registrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio
Genético e Conhecimentos Tradicionais Associados (SisGen) do
Ministério do Meio Ambiente, Brasil, sob o código A483B45. A
investigação experimental e os estudos de campo sobre plantas
(cultivadas ou silvestres), incluindo a recolha de material
vegetal, têm cumprido as directrizes e legislações institucionais,
nacionais e internacionais relevantes.
Isolamento de Andrographolide.Folhas secas e em pó
deC. schoenanthus(45 g) foram secos e extraídos
sequencialmente comn-hexano (5×100ml). Após a
eliminação do solvente sob pressão reduzida, onExtrato de
hexano (765 mg) foi obtido. Parte deste extrato (250 mg) foi
submetida a cromatografia em coluna de sílica gel eluída
comn- hexano:EtOAc (6:4 e 3:7) e EtOAc 100% para dar dez
grupos (A-J). Parte do grupo J (20,0 mg) foi purificada por
cromatografia em coluna de sílica gel eluída comn
-hexano:EtOAc 1:1 para gerar 11,9 mg de andrographolide.
Andrographolida.Sólido amorfo branco (99% de pureza por
HPLC). [α]25D= −64,5 (c0,15, MeOH). UV (MeOH)λmáx.
(registroε) 225 (4,38)nm.1RMN de 1H (500 MHz, CD3DO):δ
6,85 (t,J.=6,8 Hz, H-12), 5,01 (d,J.=6,0 Hz, H-14), 4,88 (s,
H-17a), 4,66 (s, H-17b), 4,46 (dd,J.=10,2 e 6,1 Hz, H-15a),
C https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
pubs.acs.org/jcim Artigo
4,14 (m, H-15b e H-19a), 3,41−3,36 (m, H-3), 3,31 (s, H-
19), 2,63−2,52 (m, H-11), 2,42 (m, H-7a), 2,03 (m, H-7b),
1,92 (m, H-9), 1,89−1,75 (m, H-1a, H-2 e H-6a), 1,43−
1,26 (m, H-1, H-5 e H-6b), 1,22 (s, H-18), 0,75 (s, H-20).
13C RMN (125 MHz, CD3DO):δ171,2 (C-16), 147,9 (C-12),
147,4 (C-8), 128,4 (C-13), 107,8
(C-17), 79,5 (C-3), 74,7 (C-
15), 65,2 (C-14), 63,6 (C-19), 56,0 (C-9), 54,9 (C-5), 42,3
(C-4), 38,6 (C-10), 37,6 (C-7 ), 36,7 (C-1), 27,6 (C-2), 24,3
(C-11), 23,8 (C-6), 22,0 (C-18), 14,1 (C-20). ESI-HRMSeu/z
373,1988 [M + Na]+(calculado para C20H30Ó5Na 373.1991).
Animais.Todos os animais usados para manterT. cruzi
parasitas e macrófagos peritoneais foram obtidos do
Instituto Adolfo Lutz em seu biotério. Os procedimentos
foram aprovados pelo comitê de ética43(Projeto CEUA-IAL
05/2018) observando o Guia para Cuidado e Uso de Animais
de Laboratório da Academia Nacional de Ciências.
Manutenção de linhagens de tripomastigotas e células de
mamíferos.T. cruzitripomastigotas (cepa Y) foram mantidos
usando células renais de macaco Rhesus (LLC-MK2-ATCC) em
meio RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal (FBS, 2%)
mantido em 5% de CO2atmosfera umidificada a 37°C. As células
LLC-MK2 de mamífero e conjuntivas murinas (NCTC clone L929,
ATCC) foram mantidas com meio RPMI-1640 suplementado com
10% de BFS a 5% de CO2aos 37°C.44
Ensaios Antitripomastigotas.Os tripomastigotas obtidos de
culturas LLC-MK2 infectadas foram contados em hemocitômetro
Neubauer, semeados a 1×106células/poço (em placas de 96 poços)
em diluições seriadas de andrographolide (150-1,17 μM) usando
meio RPMI-1640 e incubado em 5% de CO2- atmosfera umidificada a
37°C por 24h. O benznidazol foi utilizado como medicamento
padrão e a viabilidade do parasita foi avaliada no ensaio de
resazurina.45
Ensaios Antiamastigotas.Macrófagos peritoneais
(camundongos BALB/c) foram plaqueados em lâminas de
câmara de 16 poços (NUNC, Thermo Fisher Scientific) a 1×105
células/poço e incubadas por 24 h 5% CO2-atmosfera
umidificada em 37°C. Os tripomastigotas usados para infectar
as células foram lavados em meio RPMI-1640 e semeados a 1×
106/bem por 2 h. Após esse período, a placa foi lavada com meio
RPMI-1640 para remoção dos parasitas não internalizados.
Andrographolide foi incubado (1,25-20μM) com macrófagos
infectados por 48 h às 37°C e 5% CO2, usando benznidazol como
controle positivo. Os macrófagos foram fixados com MeOH e
corados com Giemsa. CI50os valores foram obtidos após
contagem de células infectadas em microscópio óptico (EVOS
M5000) e calculados de acordo com a literatura.44
Ensaio de Citotoxicidade e Determinação do Índice de
Seletividade.Os ensaios de citotoxicidade foram realizados
contra células NCTC (clone L929). As células foram semeadas e
incubadas a 6× 104/poço em 5% de CO2incubadora umidificada
com andrographolide (1,56-200μM) por 48h às 37h°C. O ensaio
MTT determinou a concentração citotóxica de 50% (CC50).46A
densidade óptica foi obtida em FilterMax F5 (Molecular Devices)
a 570 nm. O SI foi determinado usando a razão CC50contra
células NCTC/IC50contra parasitas.
Análise Estatística.Os ensaios foram realizados em duplicata
e repetidos em três ensaios independentes. CI50e CC50os valores
foram calculados usando curvas sigmóides dose-resposta no
Graph-Pad Prism (software GraphPad Prism 6.0, San Diego, CA,
EUA).
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
Figura 1.Análise da distribuição do conjunto de dados. A: Distribuição das classes e subclasses químicas; B: Distribuição dos dados por cepas; C: Distribuição
■
entre ativo/inativo por forma de parasita.
b RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise de distribuição de dados.Inicialmente, 363 entradas
(metabólitos vegetais) foram distribuídas entre epimastigotas,
tripomastigotas e amastigotas IC50valores. Esse conjunto de dados foi
filtrado, visando remover duplicatas, o que resultou em 324 compostos
únicos. O IC50os valores cobriram um intervalo entre 0,02 e 1630μM; um
limite foi definido com base nas recomendações do Drug for Neglected
Diseasesiniciativa(DNDeu), onde todos os compostos com IC50valores
inferiores a 10μM foram classificados como ativos e aqueles que não
atenderam a esse critério foram classificados como inativos. Este
conjunto de dados mostrou predominância de terpenóides (48%),
seguidos de alcalóides (26%) e fenilpropanóides (14%), conforme
mostrado emfigura 1A. Sesquiterpenóides (22%), diterpenóides (15%) e
alcalóides quinolina (8%) representaram a maioria das subclasses
químicas de produtos naturais neste conjunto. Os dados de atividade
estão distribuídos por oito cepas de parasitas, com as cepas Tulahuen e Y
representando 95% do total de dados, conforme mostrado emfigura 1B.
Finalmente, os compostos ativos e inativos foram agrupados por formas
parasitárias (Figura
D https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
pubs.acs.org/jcim Artigo
1C), onde foi possível observar um desequilíbrio significativo destes
dados para as formas epimastigota e tripomastigota.
Por outro lado, existe uma pequena lacuna entre dados ativos e
inativos para formas amastigotas, o que possibilita a aplicação de
técnicas de aprendizado de máquina a dados desequilibrados. O
conjunto de dados tem 165 compostos inativos e 25 ativos (os nomes,
SMILES, classe e subconjunto de compostos no conjunto de dados de um
total de 190 compostos estão disponíveis emInformações de Apoio,
Tabela S1.) antes do SMOTE e 165 compostos inativos / 135 ativos (300 no
total) após o SMOTE. Considerando a divisão treinamento/teste, a
distribuição de compostos foi de 152 no conjunto de treinamento antes
do SMOTE e 262 compostos após o SMOTE, e o conjunto de teste teve 38
compostos em ambos os cenários (o SMOTE foi usado apenas no
conjunto de treinamento). Por fim, a biblioteca utilizada na triagem
virtual possui 1.565 compostos.
Modelos de aprendizado de máquina.Os modelos kNN foram
construídos usando dados de impressões digitais Morgan, AtomPairs,
MACCS e PubChem para compostos com atividade antiamastigota para
cepas Tulahuen e Y.Figura 2A compara o desempenho deste
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem pubs.acs.org/jcim Artigo

Figura 2.Resultados da análise do modelo kNN. A. Comparação entre modelos construídos com/sem balanceamento SMOTE e diferentes impressões digitais; B.
Avaliação do modelo após balanceamento SMOTE; C. Pontuações métricas para o modelo kNN; D. Comparação entre o modelo kNN e outros modelos com variáveis
embaralhadas, mostrando que o modelo não é obtido aleatoriamente; E. Um PCA tridimensional mostrando o domínio de aplicabilidade para todos os compostos
em conjuntos de treinamento e teste; F. A influência dos fragmentos (bits) na capacidade preditiva do modelo, ligações tracejadas representam átomos aromáticos;
G. Disposição de fragmentos de contribuição positiva e negativa na estrutura de acertos.

modelo utilizando quatro tipos diferentes de impressões digitais em balanceamento por arredondamento (somente caixas), k = 3 e peso =

conjuntos desequilibrados e balanceados com SMOTE, mostrando que, distância, conforme mostrado emFigura 2B. Este modelo foi validado interna e

em geral, os modelos balanceados com SMOTE são mais preditivos, externamente; na validação interna o conjunto de dados foi dividido em

principalmente aquele construído com o Morgan Fingerprint. Desta conjunto de treinamento e conjunto de teste enquanto na validação externa

forma, é possível concluir que o melhor modelo utiliza SMOTE todo o conjunto de dados foi utilizado para treinar o modelo e

E https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
validado com um conjunto de dados independente.Figura 2C mostra os
resultados de sete métricas de avaliação de desempenho, incluindo TPR,
TNR, bACC, AUC, kappa de Cohen, MCC e pontuação F1. As duas
primeiras métricas representam a proporção de verdadeiros positivos e
negativos classificados corretamente e apresentam valores acima de 0,7
para validações internas e externas. Este resultado significa que positivo
e negativo foram classificados corretamente em mais de 70% das vezes.
O parâmetro bACC representa a média aritmética de especificidade (TNR)
e sensibilidade (TPR) e avalia o desempenho do modelo. Neste caso,
tanto as validações internas como externas foram superiores a 0,8. AUC
indica a separabilidade em uma curva de probabilidade (ROC); valores
mais altos de AUC significam que o modelo pode distinguir entre as
classes. Para este modelo, a AUC apresenta valores em torno de 0,9 e 1,0
para validação externa e interna, respectivamente. O coeficiente kappa
de Cohen avalia a concordância de duas taxas, sendo que os resultados
reais e previstos sendo que valores kappa mais elevados representam o
melhor desempenho. O modelo obtido apresentou valores de kappa
superiores a 0,6 para validações internas e externas. O MCC fornece
valores mais altos se o modelo puder prever corretamente dados
positivos e negativos.
Considerando as validações internas e externas, o modelo atinge
valores superiores a 0,6. O escore F1, diferente do bACC, é a média
harmônica de sensibilidade e especificidade e minimiza o impacto
de valores elevados neste cálculo. O modelo kNN atinge valores em
torno de 0,7 e 0,9 nas validações externa e interna,
respectivamente. Sequencialmente, para verificar se esse modelo foi
obtido aleatoriamente, foram construídos mais modelos com
variáveis embaralhadas, conforme mostrado emFigura 2D, e estes
não obtiveram bons resultados, sugerindo que o modelo não foi
obtido de forma aleatória. Na próxima etapa, um modelo RF foi
construído usando impressões digitais de Morgan e os mesmos
dados utilizados no modelo kNN. O modelo RF teve precisão de 0,73,
sensibilidade de 0,73, taxa de classificação correta de 0,78 e
pontuação MCC de 0,53 (uma tabela com métricas estatísticas do
modelo RF está disponível emInformações de Apoio, Tabela S2.).
Triagem Virtual.A seleção do banco de dados para a triagem virtual
baseou-se na necessidade de limitar a diversidade molecular para ser melhor
representada pelo conjunto de treinamento, ou seja, um conjunto de banco de
dados contendo apenas compostos derivados de plantas. Inspirado pelo
crescente movimento de reaproveitamento de medicamentos,47,48
um conjunto de dados contendo compostos naturais bioativos
(NPACT) para triagem de novos anti-T. cruzicandidatos foi usado.
Após validação, o modelo kNN foi utilizado para triagem do banco
de dados NPACT, visando identificar compostos ativos contra
formas amastigotas deT. cruzi. A triagem virtual do modelo NPACT
kNN indicou 47 compostos como potencialmente ativos contra
amastigotas deT. cruzi. Posteriormente, o modelo RF foi utilizado
para corroborar os resultados obtidos no modelo kNN, chegando a
423 compostos atingidos.
Os compostos incluídos em ambos os resultados foram então
selecionados, resultando em 20 produtos naturais (o nome e ID NPACT
de 20 compostos Hit obtidos após filtragem usando NPACT e uma figura
com estruturas de compostos1-20estão disponíveis em Informações de
Apoio, Tabela S3 e Figura S1.). Em seguida, essas substâncias foram
filtradas por regras de semelhança com medicamentos (regras de
Lipinski, Pfizer, GSK e Triângulo Dourado). Pela remoção de compostos
de interferência Pan-ensaio (PAINS) e toxóforos, aqueles com atividade já
conhecida contraT. cruzi, acessibilidade às plantas e propriedades de boa
absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET)
foram selecionadas. Esta abordagem proporcionou um composto - o
diterpenóide andrographolide - conhecido por apresentar diferentes
potenciais biológicos, incluindo
F https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
pubs.acs.org/jcim Artigo
citotoxicidade contra linhas celulares de câncer e atividades
antiinflamatórias, antivirais e antiparasitárias.49-51A confiabilidade
desse resultado foi avaliada verificando se esse composto se
enquadra no domínio de aplicabilidade, ferramenta importante para
identificar a consistência de uma previsão.52,53EmFigura 2E, é
possível observar que a andrographolida está dentro do domínio de
aplicabilidade comparando sua posição nos três componentes
principais do PCA com o conjunto de treinamento. Abordagem
semelhante foi feita utilizando os descritores do modelo RF,
indicando que o acerto selecionado está dentro do domínio de
aplicabilidade. (Uma representação gráfica do domínio de
similaridade é representada em Informações de Apoio, Figura S2.).
Além disso, o andrographolide está dentro do domínio de
aplicabilidade e pode ser considerado semelhante ao conjunto de
treinamento, tendo, em média, 67,5% de similaridade usando a
impressão digital 2D do AtomPair (uma tabela com estatísticas de
similaridade de Tanimoto comparando o andrographolide e todo o
conjunto de dados usando AtomPair, MACCS, Morgan , e as impressões
digitais PubChem são exibidas emInformações de Apoio, Tabela S4.). O
coeficiente médio de Tanimoto (Tc) varia de 0,131 (impressão digital de
Morgan) a 0,675 (AtomPair 2D), com valores máximos de Tc iguais a
0,412 e 0,917, respectivamente. A lista completa de valores de Tc para
andrographolide em comparação com cada composto do conjunto de
treinamento é apresentada emInformações de Apoio, Tabela S5.
A importância das subestruturas para o modelo treinado também
foi avaliada como o quinto princípio das recomendações da OCDE
para validação de modelos QSAR para fins regulatórios.54É calculado
com base em como a ausência de um bit influencia o valor da
métrica escolhida, onde cada bit pode representar diferentes
fragmentos moleculares em outras moléculas. Desta forma, os
valores negativos impactam positivamente na capacidade preditiva
do modelo. Foi possível observar uma baixa correlação entre a
frequência dos bits e a importância das variáveis, tanto ativas
quanto inativas. Para este modelo, oito bits contribuíram
positivamente e sete negativamente para a capacidade preditiva,
conforme mostrado emFigura 2F.
Os pares de bits 781/171, 1060/638 e 918/787 exibiram uma
colisão de bits, o que significa que um bit representa mais de uma
subestrutura em moléculas diferentes; neste caso, ambos os bits
(cada par) concordam com a importância positiva ou negativa das
subestruturas. Para contribuições negativas, os quatro bits que mais
contribuíram negativamente foram mais prevalentes nos compostos
inativos. Em contrapartida, fragmentos compostos exclusivamente
por três (bit 875/1088) e cinco (bit 1199) carbonos aromáticos
contribuíram negativamente para o modelo. Para contribuições
positivas, o bit que mais contribuiu positivamente (bit 307) foi o
único que necessitou de carbono tetraédrico, possivelmente
associado a algumas classes de produtos naturais. Com exceção do
bit 1154 (CO), todos os bits com átomos de nitrogênio ou oxigênio
contribuíram positivamente para o modelo, com distinção entre
átomos aromáticos e alifáticos; parece estar correlacionado com
propriedades físico-químicas favoráveis. Comparando o bit 918 ou
787 (C�CC), que contribui positivamente, e o bit 171 ou 781 (C�
C(C)C), que contribui negativamente, observou-se que a adição do
segundo carbono à insaturação é prejudicial à capacidade preditiva
do modelo. No entanto, uma sensibilidade ao padrão de ramificação
em grandes fragmentos compostos por carbonos alifáticos pode ser
observada comparando-se a broca 1060 ou 683, que contribui
positivamente, e a broca 807, que contribui negativamente.Figura 2
G destaca fragmentos na estrutura de acertos: mais quatro
fragmentos essenciais que contribuem positivamente e três
fragmentos menos importantes
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem pubs.acs.org/jcim Artigo

Esquema 1. Fluxograma de Processo Computacional Usado para Descobrir Composto de Acerto contraT. cruzi

que contribuem negativamente. Um fluxo de trabalho de todos os processos
computacionais usados na identificação de ocorrências é mostrado emEsquema 1.
Isolamento e avaliação de anti-T. cruziAtividade de
Andrographolide.Com base na identificação de compostos pelos
modelos de aprendizado de máquina, realizamos uma busca
bibliográfica de plantas nas quais a andrographolida foi previamente
detectada.49,55,56Considerando queCymbopogon schoenanthusL. Spreng
estava disponível para coleta, o extrato hexânico das folhas desta planta
foi preparado e submetido à desreplicação por meio de análise de RMN.1
Espectro de H NMR de hexano bruto
extrato indicou a presença de andrographolide devido aos seguintes
sinais: dois singletos emδ4.88 e 4.66, atribuídos para dois
hidrogênios não equivalentes de uma ligação dupla exocíclica
(H-17a e H-17b, respectivamente), um tripleto emδ6,85 (J.=6,8 Hz),
atribuído ao H-12 de umα,β- sistema lactona insaturado, um dupleto
emδ5.01 (J.=6,0 Hz), atribuído ao hidrogênio oximetina H-14, e dois
singletos emδ1,22 e 0,75, atribuídos aos grupos metila H-18 e H-20,
respectivamente. O andrographolide foi assim purificado após
sucessivas etapas cromatográficas. Sua estrutura química (Figura 3)
foi confirmado

G https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
Figura 3.Estrutura do andrographolida isolada deCymbopogon
schoenanthus.
pela análise de seus dados espectrais, incluindo RMN, MS e
rotação óptica específica57,58(Espectros de RMN e informações
de MS estão disponíveis emInformações de Apoio, Figuras S3 a
S6.), em comparação com aqueles relatados anteriormente na
literatura.59-61
Para investigar a eficácia da andrographolida contra
T. cruziparasitas, este composto foi inicialmente avaliado para
formas tripomastigotas, resultando em um IC50valor de 29,4μM. O
controle positivo benznidazol apresentou potencial superior, com IC
50de 17,7μM. No entanto, como os modelos de aprendizado de
máquina foram construídos para formas amastigotas, a
andrographolida foi avaliada em relação à forma intracelular deT.
cruzi, mostrando um IC50de 2,9μM, indicando eficácia superior ao
medicamento padrão benznidazol (IC50= 5,0μM). A citotoxicidade
contra células NCTC também foi avaliada, mostrando CC50valores de
92,8 e 190,6μM para andrographolida e benznidazol,
respectivamente (tabela 1).
Em relação aos parasitas intracelulares, os valores do índice de
seletividade (IS) foram semelhantes aos do medicamento padrão (IS
= 32,0 e 39,3, respectivamente). Após 48 horas de incubação com
diferentes concentrações de andrographolida, os macrófagos
infectados com amastigotas foram analisados microscopicamente,
revelando que o composto eliminou os amastigotas sem
Tabela 1. Anti-T. cruziDados de atividade e citotoxicidade para Andrographolide e Benznidazol de controle positivo
CIa50(μM)
Composto TENTAR
Andrographolida 29,4±4.8
Benznidazol 17,7±2,0
aConcentração inibitória de 50%.bConcentração citotóxica de 50%.cÍndice de seletividade (CC50/IC50); TENTE: formas tripomastigotas; AMA: formas amastigotas.
pubs.acs.org/jcim Artigo
afetando as células quentes em concentrações de 10,0, 5,0 e 2,5 μM
(Figura 4).
Figura 4.Inibição da infectividade parasitária da andrographolida em
amastigotas intracelulares deT. cruzi. Os macrófagos foram infectados
com amastigotas e o tratamento, com diferentes concentrações do
composto, foi realizado por 48 horas com benzonidazol como
medicamento de referência. (A) macrófagos não tratados, (B) 10μM, (C) 5
μM e (D) 2,5 μM. Arrow: macrófago infectado; Seta na cabeça:
amastigotas; N, núcleo do macrófago; Barra de escala: 25μm. Um
experimento representativo foi mostrado.
É fundamental mencionar que DNDeu, uma organização sem fins
lucrativos dedicada à pesquisa e desenvolvimento de tratamentos para
doenças negligenciadas, implementou critérios preconizados para a
descoberta de novos compostos de sucesso para a DC.62,63DNDeudefine
um valor aceitável de atividade como um IC50< 10,0μM. Portanto, a
andrographolide pode ser considerada uma candidata de sucesso, já que
o IC50o valor contra amastigotas foi 2,9μM. Além disso, este composto
mostrou um CC50valor de 92,8μM, demonstrando citotoxicidade
reduzida.18,19Dessa forma, o valor do índice de seletividade da
andrographolide (SI = 32,0) foi bastante semelhante ao do benznidazol
(SI = 39,3) e superior aos critérios recomendados pelo DNDeu(linhagem
celular 10 vezes mais ativa versus linha celular de mamífero).
Em sílicoAnálise dos parâmetros ADMET, farmacocinéticos e
semelhantes a medicamentos da andrographolide.Considerando os
resultados obtidos anteriormente, alguns aspectos relativos aos parâmetros
ADMET, propriedades farmacocinéticas e perfis farmacológicos, cruciais para o
desenvolvimento de novos medicamentos, foram determinados a partir de
silícioferramentas (Figura 5) para andrographolida. O composto hitidentified
atende a todas as indicações de Lipinski's Regra de Cinco, uma regra comum
para avaliar a semelhança com drogas. Este composto também não apresenta
alertas de PAINS, o que significa que não há subestruturas que possam
interferir nos bioensaios por vários mecanismos.64No entanto, a presença de
um aceitante de Michael
CCb50(μM) SIc
AMA NCTC TENTAR AMA
2.9±0,3 92,8±2.3 3.2 32,0
5,0±1,5 190,6±13.4 10.8 39,3
H https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
Figura 5.Experimental eem sílicodados para andrographolida. A: Propriedades do mapa de radar ADMETlab2. B: Propriedades do mapa de radar SwissADME. Em ambos os casos, a
andrographolida está dentro dos limites estipulados para o candidato a medicamento.
grupo (α,β-sistema insaturado) na estrutura do andrographolide
desempenha um papel importante na metabolização deste composto,
uma vez que65este diterpenóide pode ser rapidamente biotransformado
em um derivado sulfonato (14-desoxi-12-sulfo-andrographolide). Além
disso, não há alertas de barreira hematoencefálica (BHE) para
andrographolide, o que significa permeabilidade reduzida na membrana
que protege o sistema nervoso central.66
As plataformas ADMETlab 2.0 e SwissADME fornecem uma visão
gráfica de propriedades relevantes para ocorrências eFiguras 5Um e
5B exibe os resultados para andrographolide. A partir desses
resultados foi possível observar que a andrographolida,
representada pelas linhas azuis e vermelhas, estava incluída entre
os limites superior e inferior. Chellampillai e Pawar67descrever um
valor LogP para andrographolide de 2,63±0,13, dentro do DNDeu
critérios (LogP < 3). Você e colegas65avaliaram a permeabilidade do
andrographolide que apresentou alta absorção nos modelos de
monocamada de células Caco-2 e células MDR1-MDCKII.
Sharifuddin, Parry e Parry68avaliaram a capacidade da
andrographolida em induzir alterações cromossômicas em células
humanas AHH-1 e MCL-5, e este composto não foi genotóxico nas
doses testadas (10 a 90μM). Srinivasan e
EU
pubs.acs.org/jcim Artigo
colaboradores69não relataram atividade mutagênica em ensaios de
Ames realizados em diferentes cepas deSalmonella typhimuriume
sem atividade clastogênicaem vitroem células CHO-K1 para
andrographolide. Li e colegas70avaliaram este composto quanto à
sua toxicidade cardíaca com a possível interação no hERG K+canal
em células CHO, mostrando um IC50> 100μM, bem dentro da faixa
segura (>10μM). Nossos resultados sugerem que a andrographolide
é um candidato promissor para o desenvolvimento
■
novos medicamentos para tratar a TA.
CONCLUSÕES
Este trabalho construiu com sucesso dois modelos de aprendizado
de máquina capazes de prever a atividade de compostos contra
formas intracelulares deT. cruzia partir de um conjunto de dados
construído com dados previamente relatados para produtos
naturais bioativos de plantas. Nossoem sílicoA estratégia permitiu
selecionar o diterpenóide andrographolida por meio de uma
campanha de triagem virtual. Esta substância foi isolada de
Cymbopogon schoenanthuse caracterizado quimicamente por RMN
e MS. Este composto mostrou eficácia contra a forma clinicamente
relevante, as amastigotas, apresentando potência semelhante à do
https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
J. Química. Inf. Modelo.XXXX, XXX, XXX-XXX
Jornal de informação química e modelagem
o medicamento padrão. É importante ressaltar que este composto
demonstrou reduzida citotoxicidade contra células de mamíferos e alto
índice de seletividade. Além disso, a andrographolide apresentou um
perfil adequado de acordo com a ADMET e propriedades semelhantes a
drogas obtidas a partir deem sílicoabordagens e quando comparados
com resultados experimentais da literatura. Portanto, considerando os
critérios de acerto para novos candidatos a fármacos e nossos protocolos
computacionais e experimentais, a andrographolide pode ser
considerada um excelente protótipo em estudos de otimização que
visam projetar novos derivados contra
■
. Cruzi.
T CONTEÚDO ASSOCIADO
Declaração de disponibilidade de dados
Os dados estão disponíveis noInformações de Apoio; informações
adicionais podem ser solicitadas aos autores correspondentes.
*siInformações de Apoio
As informações de apoio estão disponíveis gratuitamente em
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jcim.3c01410.
Dados relacionados a compostos, modelos de aprendizado
de máquina e HPLC/UV,1H,13Experimentos C e MS (PDF)
npacto (XLSX)
curado_npact (XLSX)
■
INFORMAÇÃO SOBRE O AUTOR
Autores Correspondentes
Kathia Maria Honório −Centro de Natural e Humano
Ciências, Universidade Federal do ABC, São Paulo 09210-180,
Brasil; Escola de Artes, Ciências e Humanidades, Universidade
de São Paulo, São Paulo 03828-000, Brasil; orcid.org/
0000-0002-6938-0676; E-mail:kmhonorio@usp.br João
Henrique Ghilardi Lago −Centro de Produtos Naturais e
Ciências Humanas, Universidade Federal do ABC, São Paulo
09210-180, Brasil; orcid.org/0000-0002-1193-8374;
E-mail:joao.lago@ufabc.edu.br
Autores
Henrique Barbosa −Centro de Ciências Naturais e Humanas,
Universidade Federal do ABC, São Paulo 09210-180, Brasil
Gabriel Zarzana Espinoza −Escola de Artes, Ciências e
Humanidades, Universidade de São Paulo, São Paulo 03828-000,
Brasil
Maiara Amaral −Laboratório de Fisiopatologia, Butantan
Instituto, São Paulo 05503-900, Brasil
Érica Valadares de Castro Levatti −Laboratório de
Fisiopatologia, Instituto Butantan, São Paulo 05503-900,
Brasil
Mariana Babberg Abiuzi −Laboratório de Fisiopatologia,
Instituto Butantan, São Paulo 05503-900, Brasil Gabriel
Correa Veríssimo −Departamento de Farmacêutica
Produtos, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais
31270-901, Brasil
Filipe de Oliveira Fernandes −Departamento de
Produtos Farmacêuticos, Universidade Federal de Minas
Gerais, Minas Gerais 31270-901, Brasil
Vinícius Gonçalves Maltarollo −Departamento de
Produtos Farmacêuticos, Universidade Federal de Minas
Gerais, Minas Gerais 31270-901, Brasil; orcid.org/0000-0001-
9675-5907
André Gustavo Tempone −Laboratório de Fisiopatologia,
Instituto Butantan, São Paulo 05503-900, Brasil;
orcid.org/0000-0003-2559-7344
J.
pubs.acs.org/jcim Artigo
Informações completas de contato estão disponíveis
em: https://pubs.acs.org/10.1021/acs.jcim.3c01410
Contribuições do autor
HB e GZE contribuíram igualmente. HB, GZE, GCV,
POF, VGM e KMH contribuíram para construir bancos de
dados e modelos de aprendizado de máquina. HB e JHGL
contribuíram com procedimentos cromatográficos e
caracterização química. HB, KMH, AGT e JHGL contribuíram
na preparação do manuscrito. MA, EVCL, MBA e AGT
contribuíram nos testes de bioatividade. Todos os autores
leram, revisaram e aprovaram o manuscrito. Todos os
autores aprovaram a versão final do manuscrito.
Financiamento
Este estudo foi financiado em parte peloCoordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil(
CAPES) - Código Financeiro 001. Os autores também
agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo - FAPESP (2017/50333−7, 2020/ 01221−4,
2021/02789−7, 2021/04464−8 e 2023/ 12447−1 ) e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico - CNPq (301354/2019−4, 405691/2021−1 e
307672/2021−2) pelo apoio financeiro.
Notas
■
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
AGRADECIMENTOS
Esta publicação faz parte das atividades da Rede de Pesquisa de
Produtos Naturais contra Doenças Negligenciadas
(ResNetNPND):http://www.resnetnpnd.org. JHGL, AGT e KMH
agradecem ao CNPq pelos prêmios científicos.
■
ABREVIATURAS
OPAS, Organização Pan-Americana da Saúde; NPACT, banco de
dados de alvo de atividade de composto anticâncer baseado em
plantas de ocorrência natural; PAINS, Compostos de interferência
Pan-ensaio; ADMET, absorção, distribuição, metabolismo, excreção e
toxicidade
■
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