Tcnicas e Diagnstico

Molecular

Prof. Dr. Luis Fernando Medina

Conhecimentos prvios
DNA

estrutura e funo
RNA e protenas
Reao em Cadeia pela Polimerase

Talvez at o final de semestre vocs conheam o

RT-PCR

Enzimas

de restrio
Mutaes
Gentica Mendeliana
Herana ligada ao sexo
Eletroforese
Qumica

Material gentico
Qumica dos cidos nucleicos
Estrutura do DNA e RNA
Sntese de DNA
Cromossomo eucariotos
Transcrio
Processamento do RNA
Traduo
Enzimas de restrio
Eletroforese
PCR
RT-PCR (Transcriptase reversa)
qPCR ou PCR em Tempo Real

O material gentico
Fluxo

de informao

Qumica dos cidos nucleicos

As

bases

Podem ser:
Pirimdicas

Pricas

Qumica dos cidos nucleicos

A

base est ligada:

Ribose RNA
Desoxirribose - DNA

Qumica dos cidos nucleicos

Base + acar = nucleosdeo

Base + acar + fosfato = nucleotdeo

Qumica dos cidos nucleicos

Estrutura

dos nucleotdeos

Na forma difosfato e trifosfato

Muito

importante - at aqui foi s mononucleotdeo

Estrutura do DNA
Entre 1940 e 1953 vrios
pesquisadores saber: Como o
DNA funciona como a base
gentica da vida?
Em 1953, Watson e Crick,
utilizando a foto produzida por
Rosalind Franklin, propuseram
o modelo da dupla hlice
Quem produziu a foto foi RF,
mas quem levou foi W e C.

Estrutura do DNA
O

modelo Watson-Crick
Utilizando a foto de RF propuseram o modelo
com as seguinte caractersticas:

A) Duas longas cadeias polinucleotticas, tendo um

eixo central, formando uma hlice dupla
B) Cadeias antiparalelas em sentido opostos
C) As bases so estruturas planas
D) As bases das cadeias opostas esto pareadas
Pontes de Hidrognio ocorrem entre AT e CG

Estrutura do DNA
O

modelo Watson-Crick
As bases das cadeias
opostas esto pareadas
Pontes

de Hidrognio
ocorrem entre AT e CG

Estrutura do DNA
O

modelo Watson-Crick

A estabilidade da dupla
hlice ocorre pelas pontes
de hidrognio entre as
hlices
As bases nitrogenadas
so hidrofbicas
Os acares e fosfatos
so hidroflicos

Estrutura do DNA
Modelo

de WeC
para a estrutura do
DNA

Estrutura do RNA
A

estrutura do RNA muito similar a do

DNA, mas:
O acar a ribose
Fita simples (h excesses)

Alguns

vrus de animais apresentam fita dupla

tRNA possui regies com dobras que formam
fitas duplas

A base nitrogenada timina substituida por

uracila

Estrutura do RNA
H

trs tipos principais de RNAs

rRNA RNA ribossmico

tRNA RNA transportador
mRNA RNA menssageiro

Mas

tambm temos

snRNA RNA nuclear pequeno, envolvido no

processamento do rRNA
RNA antisenso, microRNA, iRNA RNA de
interferncia. Todos envolvidos no processo
de regulao de expresso de genes

A sntese do DNA
Replicao

as cadeias
complementares so
sintetizadas.
Aps as fitas novas so
unidas entre si e as
moldes se reassociariam

Replicao

conservativa

dispersiva

Ocorre um mistura das

fitas novas e molde

A sntese do DNA
A

sntese biderecional

Uma fita contnua

A outra fita descontnua

Na

fita lider a progresso da

sntese da nova fita de DNA
ocorre de forma contnua
pela incorporao de
nucleotdeos pela DNA
polimerase
Na fita tardia a sntese
ocorre de forma des sintetiza
a nova fita

A sntese do DNA

A sntese do DNA

Cromossomos eucariotos

No ncleo

A cromatina esta organizada

na forma de nucleossoma
Que forma uma estrutura
mais espessa, que
chamada de solenoide
A importncia desta
organizao que permite
compactar DNA no ncleo
Se esticar o DNA ele
chegaria a 2 metros de
comprimento

Cromossomos eucariotos
Meninas

Meninos

Cromossomos eucariotos
Alelos

Cromossomos eucariotos

Aos conceitos

DNA-satlite apresenta sequncia curta e repetitivas (em

tandem)
DNA telomrico sequncias repetitivas presentes nas
extremidades dos cromossomos
Pode chegar at 1000 repeties 5-TTAGGGC-3
DNA centromrico possui sequncia curta que permite
ancoragem de vrias protenas

Cromossomos eucariotos
continuao

Sequncias Moderadamente Repetitivas

VNTRs nmero varivel de repeties em tanden

STRs repeties curtas em tandem (microsstiles)

Regies de 15 a 100 pb presente entre genes ou no interior

dos genes
Regies de 5 a 50 pb

Sequncias Repetitivas Transponveis

SINEs elementos intercalares curtos e tem menos

de 500 pb. Podem aparecer at 500.000 X
LINEs elementos intercalares longo, apresentam 6
kb e podem aparecer at 850.000 X

Transcrio
Componentes
RNA

da transcrio:

polimerase

DNA
Nucleotdeos

Transcrio
O

primeiro passo da transcrio a

ligao ao DNA molde

Nas bactrias a parte reconhece uma regio

do DNA (chamade de promotor)

sntese do RNA
complementar a uma
das fitas de DNA
A fita de DNA que
codifica chamada
de fita molde
A outra chamanda
de fita complementar

Transcrio
Na

regio promotora encontramos uma

sequncia consenso

Caixa TATA ou TATAbox

Transcrio
Observe

que a fita de RNA 5 3

Transcrio
Fita senso

Fita anti-senso

Processamento do RNA

O gene transcrito de um
eucarioto:

As regies internas que

sero traduzidas so
chamadas de xons
As regies que no sero
traduzidas so os introns

Eucarioto

Libera o pr-mRNA que

sofre modificaes

Processamento do RNA
Capeamento

5 (quepe)

adicionado uma guanina

modificada a 7metilguanosina

Este processo evita a

degradao do mRNA
Auxilia a orientar o transporte
do mRNA para o citoplasma
Auxilia no reconhecimento do
incio da traduo

Processamento do RNA

Poliadenilao

Ocorre a adio de uma cauda de adenina (at 250

nucleotdeo)
Ocorre cerca de 35 nucleotdeos aps a regio 3UTR

UTR regies no traduzidas (UnTraslated Regions)

A cauda poli auxilia na orientao para o citoplasma

Estabiliza a molcula contra degradao e reconhecimento
pelos ribossomos

Processamento do RNA
Splicing

Ao transcrever o mRNA a RNA pol II transcreve

gene inteiro
Os eucarioto possui regies do gene que no so
traduzidas (introns)
Estas regies so removidas do mRNA

Processamento do RNA
Protenas

contendo snRNPs
(pequenas
ribonucleoprotenas
nucleares) reconhecem estes
locais de clivagem

Processamento do RNA
No

local que
ocorre o splicing
h uma sequncia
que indica onde
as snRNP devem
se ligar
H diferentes
snRNPs

Processamento do RNA
Splicing

alternativo

Introns de um mesmo
gene so processados
de formas diferentes
(alternativa)
Produz diferentes
mRNAs semelhantes,
mas no idnticos
Aumenta a diversidade
de enzima (so as
isoformas)

Atualidades

Traduo
RNA mensageiro
Cdon de iniciao
AUG

Cdon de terminao
UAA UGA UAG

CAP

Poli (A)

Protena

UTRs sequncias no traduzidas

Traduo
Construindo
Iniciao

uma protena

Traduo
Construindo
Elongao

uma protena

Traduo
Construindo
Terminao

uma protena

Enzima de Restrio

A enzima reconhece o
stio (normalmente um
PALINDROMO)

AMOR = ROMA

Cliva o DNA no local

Forma extremidades

No exemplo, EcoRI forma

extremidades coesivas

Eletroforese
Mtodo

que permite
separar molculas pelo
tamanho

Funciona como peneira

molecular
Muito til para determinar o
tamanho do fragmento de
DNA

Est

baseada na carga do
DNA (negativa)

aplicada uma corrente

continua e fora a
passagem atravs do gel

Eletroforese

Mutaes um exemplo
Mutagnese

os cidos nucleicos absorvem a

luz ultravioleta que capaz de induzir
mutaes

PCR

VIDEO

rtPCR
Transcrio

Reversa PCR

Utiliza a enzima transcriptase reversa (de vrus)

Utiliza mRNA como molde

Permite quantificar a expresso de um gene

Sistema til para clonagem de genes eucariotos

Rt-PCR

Gene alvo
(DNA)

Extrao
de mRNA

Transcriptase
reversa
RNA - DNA

Dupla fita de
RNA/DNA

Rt-PCR

Remoo do RNA
com RNAase

Sntese da fita
complementar
de DNA

PCR - DNA

Rt-PCR

Utiliza o 1 primer com a transcriptase reversa

Utiliza o 2 primer com DNA polimerase

PCR

Insere no plasmdeo (faz uso de enzimas de

restrio e DNA ligase)

qPCR ou PCR em tempo Real

O PCR em tempo real

Baseado na PCR
Contm os mesmos elementos bsicos, mas neste caso
adicionado uma sonda fluorescente
Constante deteco e monitoramento dos produtos durante
toda a reao de amplificao (emisso de fluorescncia)

qPCR ou PCR em tempo Real

SYBR

green

qPCR ou PCR em tempo Real

FIM