OS GENES PARA O DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO SÃO EMBALADOS EM

BLOCOS DE CROMATINA MULTIVALENTE
NO ESPERMA DE PEIXES-ZEBRA

Geovana Andrade Aparecido

Orientador: Marcelo Beletti
Coorientadora : Amanda Nonato
 INTRODUÇÃO

 Uma questão central do desenvolvimento inicial é a forma como a

totipotência e a pluripotência são estabelecidas na linha germinal e nas
células do tronco embrionário (ES), respectivamente. Estudos em
células ES cultivadas in vitro forneceram muitos conceitos
interessantes para a pluripotência, como o uso de combinações
especiais de fatores de transcrição (POU5F1 [também conhecido como
OCT4], SOX2, outros) que operam como uma rede para promover a
pluripotência e auto-renovação, e a presença de cromatina
especializada em reguladores de desenvolvimento em células ES para
garantir o seu silêncio e até mais tarde em desenvolvimento.
 INTRODUÇÃO

 Opções (além da metilação do DNA) para o genoma do esperma para

fornecer contribuição epigenética à totipotência pareciam limitadas,
uma vez que a espermatogênese envolve a substituição da grande
maioria da cromatina baseada em histonas pela protamina ,que não é
conhecido por propagar informações através de modificações.
  Uma visão é que o genoma masculino não precisa transportar
nenhuma informação de embalagem de genes (além dos genes
impressos metilados), pois pode ser simplesmente "reprogramada" e
reembalada pelo ovo após a fertilização para atingir a
totipotência. Embora isso ocorra claramente, atualmente falta uma
compreensão de quais genes no genoma são suscetíveis ou
resistentes à desmetilação do DNA, além dos genes impressos
resistentes.
 INTRODUÇÃO

Estudos recentes levantaram várias questões:

  Primeiro, por que colocar reguladores de desenvolvimento embrionário em
cromatina bivalente em células espermáticas maduras? Uma possibilidade é
equilibrar esses genes para expressão no embrião. Outra possibilidade é protegê-
los da metilação do DNA através do uso da cromatina "ativadora", ao mesmo
tempo em que colocam cromatina repressiva sobre eles para evitar sua expressão
na linha germinal
 Outra questão chave é a complexidade da embalagem e marcação de genes de
desenvolvimento. Além disso, pode-se esperar que este sistema de embalagem /
marcação, se de fato instrutivo, exigir modificações adicionais ou variantes de
histonas para manter a robustez no embrião. 
 Finalmente, é de grande interesse compreender como esta embalagem é
estabelecida e mantida na linha germinal e se existe um sistema similar no ovo .
 OBJETIVO

 Compreender as relações de cromatina-transcrição e suas

contribuições para totipotência em células germinativas e embriões
precoce, explorando o modelo de peixe-zebra.
 PEIXE-ZEBRA
 Também é conhecido pelos nomes de bandeirinha, danio-
zebra, paulistinha e bandeira-paulista. É um importante organismo
modelo, frequentemente utilizado em pesquisas genéticas e análises
voltadas para a biologia do desenvolvimento.

FONTE: aquaA3
 MATERIAIS E MÉTODOS

 Células de esperma de machos de peixe-zebra e células ZF4 (células

de fibroblastos)
 MATERIAIS E MÉTODOS

WESTERN BLOT E ANTICORPOS

 Os fibroblastos e espermatozoides foram contados usando um hemicitômetro,
lavados com PBS e depois lisados ​em 2 × amostra de tampão. O Western Blot
foi feito de acordo com os procedimentos padrão. 
 Anticorpos : H3K4me3 (Abcam ab8580 e Active Motif 39159), H3K4me2
(Abcam ab7766), H3K14Ac (Upstate 07-353), H2AZ (Abcam ab4174),
H3K27me3 (Upstate 07-449), H3K9me3 (Motivo Ativo 39161), H3K36me3
(Abcam ab9050), H3K36me2 (Abcam ab9049), H4K16Ac (Abcam ab1762),
H4tetraAc (Upstate 06-866) e H3 (Abcam ab1791).
 MATERIAIS E MÉTODOS

 MeDIP:
4 μg de DNA genômico cortado (~ 400 pb) a partir de espermatozóides
maduras ou tecidos musculares dissecados foram incubados com
Dynabeads (Invitrogen) conjugado com anticorpo contra 5-metilcitidina
(Eurogentec BI-MECY-1000)
 MATERIAS E MÉTODOS

CHIP:
 10 7 de espermatozóides foram tratados com 0,05% de lisofosfatidilcolina
(Sigma L1381) em PBS em gelo durante 10 min. 
 Quinze unidades de MNase (USB 70196Y) foram então aplicadas para libertar
oligonucleossomas durante 5 min a 37 ° C.
  Dois microgramas de anticorpo específico conjugado com Dynabeads foram
incubados. 
 Os fragmentos puxados para baixo e a entrada de MeDIP e ChIP foram
amplificados por kit de amplificação de todo o genoma (Sigma WGA2), marcado
com cy3 ou cy5, E, em seguida, hibridizado para slides personalizadas Agilent
244k-feature. Duas réplicas biológicas foram utilizadas para cada ChIP e
rotuladas com permuta de corante.
 MATERIAIS E MÉTODOS

 Chip sequencial, 2 × 10 7 de espermatozóides foram reticulados e lisados ​no

tampão de lise de células de esperma (Tris 50 mM a pH 8,0, EDTA 10 mM,
EGTA 1 mM, NaCl 150 mM, SDS a 1%, DTT 3 mM). O lisado foi diluído com
tampão de diluição IP (Tris 16,7 mM a pH 8,0, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM,
Triton X-100 a 1,1%, SDS a 0,01%) e cortado por sonicação para obter
fragmentos de tamanho de mononucleosoma.
  O anticorpo foi aplicado ao primeiro IP como acima. Após a lavagem da
ligação não específica, as pérolas associadas à cromatina foram incubadas em
tampão de eluição (DTT 30 mM, SDS a 0,1%, NaCl 500 mM) durante 15
minutos a 37 ° C. O eluato foi diluído 30 vezes com tampão de diluição IP para
o segundo IP e depois tratado como em procedimentos IP padrão.
 MATERIAIS E MÉTODOS

Microarray promotor de peixe zebra personalizado:

Centenas de genes foram adicionais (aproximadamente 13.000 genes de
mRNA, miARN, tRNAs, rRNAs, e duas regiões de heterocromatina
centromérica)
 MATERIAS E MÉTODOS

Extração de RNA e microarray de expressão

As células foram rastreadas sob um microscópio. O RNA de 6 × 10 7 de
células de esperma maduras foi extraído com um kit de isolamento de
RNA . 
 RESULTADOS

COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DO GENOMA DO ESPERMA DE PEIXE-ZEBRA:

 A analise espectrométrica de massa revelou a presença de histonas canônicas
(H2A HAB, H E H4) bem como certas variantes de histonas canônicas e
variantes de H1. Afirmando que o esperma de peixe-zebra maduro é embalado
por histonas.
 RESULTADOS

 As proteínas da transtaminas (proteínas de transição e as variantes de

histona específicas do testículo) proteínas que constituem a grande
maioria das proteínas no esperma de mamíferos, não foram
identificadas no esperma de peixe zebra.
 O atual genoma do peixe-zebra não possui os genes estruturais que
codificam histonas específicas de testículos de mamíferos, proteínas
de transição ou protamina. 
 RESULTADOS

 Devido a falta de protamina, a morfologia da cabeça redonda do esperma de

peixe zebra maduro é semelhante ao estágio de espermatozoides no
desenvolvimento do esperma humano- o estágio que antecede a substituição
de histonas pelas prótons.

 Morfologia espermática e composição bioquímica da cromatina espermática do peixe zebra. ( A ) O esperma de peixe-zebra tem uma
morfologia de cabeça redonda (~ 10-μM de diâmetro)
 RESULTADOS

EMBALAGEM E CONDENSAÇÃO DE GENOMA DE ESPERMA:

Possibilidade de o esperma de peixe-zebra promover a condensação do
genoma utilizando histonas de ligação devido a falta de H4K16ac, que
são remodeladores de montagem para promover a compactação em
células somáticas.
 RESULTADOS

MODIFICAÇÕES DE HISTONAS ATIVAS E REPRESSIVAS NA CROMATINA DE

ESPERMA DE PEIXE-ZEBRA:
 Foram encontradas modificações correlacionadas com o silenciamento genes.
Com isso, cromatina de esperma se assemelha a cromatina somática.
 RESULTADOS

HIPOMETILAÇÃO DO DNA E LOCOS DE DESENVOLVIMENTO

 A análise revela três categorias de promotores hipometilados de DNA :
reguladores do desenvolvimento, fatores de transcrição e metabolismo.
 De fato, 250 principais genes hipometilados são dominados por fatores de
transcrição embrionários.
 Esses resultados revelam que o desenvolvimento no peixe-zebra é
acompanhado pela metilação do loco de desenvolvimento para transcrição.
 Por tanto, a cromatina multivalente pode ser mais importante para ajudar a
expressão de genes em embriões precoce do que durante a diferenciação
terminal.
 RESULTADOS

CARACTERÍSTICAS DA CROMATINA ESPERMÁTICA E TEMPO DE

EXPRESSÃO GÊNICA EM EMBRIÕES
 Os genes que impulsionam o ciclo celular e promovem o metabolismo em
embrião possuem altos níveis de histonas ativas no esperma.
 DISCUSSÃO:

 No momento, não está claro por que os peixes utilizam de estratégias em

empacotamento particulares .
 O peixe-zebra parece muito semelhantes aos mamíferos quanto a
embalagem utilizada para empacotar os genes no desenvolvimento
embrionário. Sugerindo que eles podem servir como um modelo importante
para embalagem e marcação de genes de desenvolvimento.
 REFERÊNCIAS

 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3065705/