Título: MODULAÇÃO NO SISTEMA LinFO-HEMATOPOIÉTICO.

Coordenador: RADOVAN BOROJEVIC

1. Diferenciação Linfo-Hematopoiética Normal e Patológica: Medula Óssea
1.1. Cultivo e manipulação in vitro de células progenitores hematopoiáticas. 1.2. Cultivo e
manipulação de precursores das linhagens mielóides. 1.3. "Purging" ex vivo e in vitro. 1.4. Análise
citogenética de células de pacientes hematológicos
1.5. Papel do receptor de vitamina D e TGF-B em leucemias mielóides agudas.
2. Diferenciação Linfo-Hematopoiática Normal e Patológica
Timo:
2.1. Definição do padrão de expressão e significado biológico de diferentes isoformas de laminina e
fibronectina no timo de camundongos e humanos. Esses dados poderão resultar em conceito novo
sobre a função diferencial de isofomas de proteínas de ECK na fisiologia do timo, abrindo novas
fronteiras sobre a análise de modificações de isoformas específicas, associadas a determinadas
patologias humanas ou de modelos experimentais. 2.2. Modular in vitro e in vivo a diferenciação
intratímica de linfócitos utilizando anticorpos e peptídeos específicos para diferentes ligantes e
receptores de ECM. Estes resultados permitirão saber se interações mediadas por matriz extracelular
são de fato relevantes na formação do repertório imunológico de células T. 2.3. Definir o padrão de
expressão de receptores de matriz extracelular no timo de animais e de culturas organotípicas de timo
fetal, infectados pelo Trypanosoma cruzi, assim como a contribuição desses receptores parai o escape
de células imaturas do órgão. Tais resultados contribuirão para o entendimento de como surgem células
autorreativas na doença de Chagas. podendo ainda servir como paradigma para estudos comparativos
em outras doenças autoimunes.
3. Migração de Linfócitos Maduros
3.1. Caracterização da expressão de ligantes e receptores de matriz extracelular em órgãos linfoides
periféricos e sítios de atividade imunológica efetora incluindo os modelos de transplante cardíaco e do
músculo esquelético do camundongo MDX. 3.2. Definição quanto aos efeitos de anticorpos e peptídeos
(agonistas e antagonistas) específicos para ligantes e receptores de matriz extracelular sobre o processo
de rejeição de transplantes cardíacos, seja induzida por células autorreativas derivadas de animais
chagásicos crônicos, ou ainda alorreativas presentes em animais normais. 3.3. Caracterização de
populações linfocitárias em sítios de rejeição de transplante cardíaco alogênico, ou decorrente de
células T autorreativas geradas em camundongos cronicamente infectados pelo Trypanosoma cruzi.
3.4. Mecanismo de ação da Cyclosporina-A na migração celular
3.5. Definição de populações linfocitárias nos sítios de lesão de musculatura estriada esquelética e
linfonodos de drenagem, no modelo murino de distrofia muscular de Duchenne, utilizando anticorpos e
peptídeos (agonistas e antagonistas) específicos para ligantes e receptores de matriz extracelular.
4. Comunicação Celular no Sistema Linfo-Hematopoiático:
Caracterização e papel de junções comunicantes. 4.1. Caracterização bioquímica e funcional de junções
comunicantes em diferentes compartimentos no sistema linfo-hematopoiático. 4.2. Definição de
modulação de comunicação celular mediada por junções gap em timócitos e entre esplenócitos, após
ativação com mitógenos para células T ou anticorpo – CD3. 4.3 Definição sobre a existência de
mudanças no padrão de junções comunicantes no sistema linfo-hematopoiético de animais infectados
pelo Trypanosoma cruzi.
5. Citotoxicidade e Permeabilização Celular: Mecanismos moleculares de citotoxicidade mediada por células.
5.1. Obtenção de perforina purificada, nativa e recombinante, peptídeos sintéticos agonistas da perforina,
anticorpos mono e policlonais anti-perforina, sondas de MRNA e primers para PCR. 6. Citotoxicidade e
Permeabilização Celular: Receptores P2Z e mecanismos de citotoxicidade induzida por ATP.

Comparação entre os três tipos de músculo

Característi
Estriado Esquelético Estriado Cardíaco Liso
ca
Multinucleado, núcleos
Núcleos Um ou dois núcleos centrais Um núcleo central
alongados na periferia
Sarcômeros Sim Sim Não. Corpos densos e placas densas
apoiam microfilamentos em rede no
 citoplasma. Não expressa troponina
Morfologia Células ramificadas com discos
Células longas e cilíndricas Células fusiformes, sem estriações
das Células intercalares
Citoesquelet Sarcômeros, Actina-f,
Sarcômeros, Actina-f, Actina-f, tropomiosina, Filamentos
o na Tropomiosina, Troponina,
Tropomiosina, Troponina, Miosina Intermediários (Vimentina, Desmina)
contração Miosina
Inervação Motora somática: Placa
SN Autônomo SN Autônomo
efetora Motora
Contração Voluntária, tudo ou nada Involuntária, rítmica e espontânea Involuntária; lenta e vigorosa
Retículo
Bem desenvolvido, com Pouco REL, mas não envolvido no
sacroplasmát Pouco definido
cisternas terminais armazenamento de Ca2+
ico
Túbulos T Sim. Formação da TRÍADE Sim. Formação da DÍADE Nenhum
Ligação de
Troponina C Troponina C Calmodulina
Cálcio
Controle do Calseqüestrina nas cisternas
Ca+2 extracelular Cavéolas
Cálcio terminais
Bainhas Epimísio, Perimísio,
Endomísio e bainhas Endomísio
envoltórias endomísio
Discos intercalares ou estrias
Junções
Nenhuma escalariformes (desmossomas e Nexus ou junções comunicantes
celulares
nexus ou junções comunicantes)
Musculatura associada ao
Parede de vasos sanguíneos,
Distribuição esqueleto, língua e parte Coração
vísceras, derme
anterior do esôfago,
Inervação
sensorial Fuso muscular, Órgãos
Aferentes SNA Aferentes SNA
(Ver O. dos Tendinosos de Golgi
Sentidos)
Colágeno, elastina, fatores de crescimento,
Secreção Peptídeo Natriurético Atrial proteoglicanas e
glicosaminoglicanas
Regeneração Sim: Células satélite Não Sim
Mitose Não Não Sim

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 Restrito ao coração. Origina-se do mesoderma esplâncnico.

7. Comunicação intercelular
A evolução dos organismos pluricelulares dependeu, em grande medida, da habilidade adquirida pelas células para
comunicarem umas com as outras. Esta comunicação é exigida pela regulação do funcionamento e organização em
tecidos, pelo controlo de crescimento e divisão, bem como pela coordenação das diversas actividades. A
importância e complexidade das comunicações intercelulares nos animais superiores sugere que uma parte
significativa do seu genoma é consagrada a estes processos.
Assim sendo, entre as células de um organismo pluricelular, estabelece-se uma densa teia de comunicações, em que
intervêm sinais de diferente natureza. Uns, de natureza eléctrica, são gerados por fluxos iónicos; outros, de
natureza química, consubstanciam-se em moléculas mensageiras. Porém, cada célula não é capaz de reconhecer
senão um número limitado de mensagens. Este reconhecimento faz-se, em geral, por intermédio de outras
moléculas, situadas estas, na maioria das vezes, na membrana celular e expostas à sua superfície. São designadas
por receptores membranares.
A existência de tão diversificados mecanismos de comunicação intercelular implica, na maior parte dos casos, por
sua vez, uma profunda especialização celular. Surgem assim, nos organismos superiores, grupos de células
responsáveis pela produção e pela transmissão de mensagens: são as células nervosas, as células neurosecretoras,
ou as células secretoras hormonais.
Todavia, importa salientar que a existência, num organismo, de mecanismos de comunicação que fazem apelo a
células especializadas, não exclui que todas as outras células possam comunicar entre si, directamente.
TOPO
7.1. – Sistemas de comunicação intercelular
As estratégias de comunicação desenvolvidas no seio de um organismo dependem de diversos factores, entre os
quais se destaca a distância que separa as células comunicantes. Nesta perspectiva, podem distinguir-se três
situações distintas:
a. comunicação entre células adjacentes;
b. comunicação local, a curta distância;
c. comunicação entre células muito distanciadas.
TOPO
7.2. – Comunicação entre células adjacentes
A existência ou não de uma barreira física, como a parede celular, condiciona obviamente a comunicação entre
células vizinhas, pelo que se tratarão separadamente as células animais das células vegetais.
 TOPO
7.2.1. – Comunicação entre células animais adjacentes
Nos animais, é habitual as células associadas em tecidos, apresentarem ao nível das respectivas membranas,
estruturas de aderência ou de impermeabilização, designadas por junções. Contudo, algumas junções, desempenham
uma função diferente. São designadas por junções de hiato ou "gap junctions" e permitem o trânsito de iões e de
pequenas moléculas entre células adjacentes. Na fig.1.7, esquematiza-se a arquitectura molecular dessas junções.
São formadas por estruturas proteicas, designadas por conexões, e formadas por seis sub-unidades de proteínas
intramembranares. Os conexões possuem um canal interior, que pode estar aberto ou fechado. São portanto
estruturas dinâmicas, que tiram partido da capacidade das proteínas assumirem conformações alternativas e cuja
funcionalidade dependente de factores diversos, como o teor em Ca+ ou o pH do meio. Entre células adjacentes, os
conexões estabelecem uma continuidade entre os respectivos citossois, mas também um hiato entre as membranas
de cerca de 3nm.
O trânsito iónico assegurado pelas junções hiato, é responsável, entre outras funções, pelas contracções síncronas
dos músculos cardíacos, pelos movimentos peristálticos do intestino e pela rapidez de comunicação entre certas
células nervosas (sinapses elécticas). Também desempenham um papel determinante nas células embrionárias, não
só na transmissão de informação inerente ao processo de diferenciação celular, mas também na distribuição de
metabolitos, antes da formação do sistema circulatório.
Fig. 1.7.: Arquitectura molecular das junções hiato
TOPO
7.2.2. – Comunicação entre células vegetais adjacentes
Durante a formação da parede celular, após a mitose, estabelecem-se canais entre as células filhas, que as mantêm
em comunicação, e que se designam por plasmodesmos. Apresentam diâmetros entre 20 e 40 nm. Os
plasmodesmos são atravessados por um prolongamento do retículo endoplasmático, designado por desmotúbulo.
Através dos plasmodesmos estabelece-se uma circulação molecular selectiva entre as células vegetais.
Fig. 2.7.: Plasmodesmos
TOPO
7.3. – Comunicação local
Muitas células segregam um ou mais sinais químicos que, libertos no líquido extracelular, actuam como mediadores
locais, unicamente sobre células localizadas na vizinhança imediata. São sempre substâncias hidrofílicas.
Distinguem-se das hormonas pelo facto de serem tão rapidamente captados pelas células alvo ou destruídos, que não
chegam a entrar na circulação sanguínea (fig. 3.7). Ao nível das células alvo, estes mediadores são reconhecidos por
receptores membranares, constituídos por proteínas intrínsecas (ver funcionamento das hormonas hidrofílicas).
Alguns destes mediadores são produzidos por células especializadas. Por exemplo, a histamina é segregada
sobretudo pelos mastócitos, células do tecido conjuntivo. Estas células armazenam histamina em vesículas e
libertam-na rapidamente por exocitose, em resposta a uma agressão, uma infecção local ou determinadas reacções
imunológicas. A histamina actua sobre as células das paredes dos capilares, dilatando-os e aumentando assim a
permeabilidade e, consequentemente, o acesso aos anticorpos e aos glóbulos brancos do sangue, às zonas críticas.
Existem três tipos diferentes de receptores membranares da histamina, susceptíveis de serem inibidos por
antihistamínicos específicos.
Outros mediadores, pelo contrário, têm uma origem mais ampla. As prostaglandinas, por exemplo, são lípidos
derivados dos fosfolípidos membranares, continuamente sintetizadas na membrana celular, e continuamente
degradados. Todavia, em certas circunstâncias desempenham funções biológicas importantes, como, por exemplo,
na estimulação da contracção dos músculos lisos uterinos, no momento do parto. Por isso, são empregues pela
indústria farmacêutica, no fabrico de agentes abortivos.
Fig. 3.7.: Acção dos mediadores locais
TOPO
7.4. – Comunicação a longa distância
Nos animais superiores, existem dois mecanismos fundamentais de transmissão de informação entre células
distanciadas: a transmissão nervosa, que é sobretudo adaptada à comunicação rápida e selectiva a grande distância, e
a transmissão hormonal, a qual, pela libertação no sangue de um mensageiro químico, se encontra melhor adaptado
à transmissão de directivas metabólicas. Nos vegetais, reconhece-se a existência apenas de mecanismos hormonais.
TOPO
7.4.1. – Comunicação nervosa
7.4.1.1. – Sistema nervoso
A infra-estrutura subjacente à transmissão nervosa é constituída pelo sistema nervoso. Nos animais é representado
por uma rede extremamente densa de condutores, que estabelece a relação entre o cérebro e todas as partes do
organismo.
A unidade funcional do sistema nervoso é a célula nervosa ou neurónio. O corpo celular dos neurónios, designado
por pericário, possui prolongamentos filiformes: dendrites e axónio. As dendrites, em número variável, podem ser
ramificadas e transmitem os sinais nervosos da periferia para o centro (condução centrípeta); pelo contrário, o
axónio, transmite os sinais do centro celular para a periferia (condução centrífuga).
Os neurónios comunicam uns com os outros através de estruturas de contacto, as sinapses, que se estabelecem entre
a extremidade axónica (botão axónico) de um neurónio e dendrites ou pericários de outros neurónios. Umas são
sinapses químicas e implicam a presença de um neurotransmissor, mediador químico entre as duas células; outras
são sinapses eléctricas, mais simples e mais rápidas, pois o seu funcionamento assenta na passagem de um fluxo
iónico através de um grande número de junções de hiato.
TOPO
7.4.1.2. – Transmissão do influxo nervoso
TOPO
7.4.1.3. – Sinapses químicas
As sinapses são junções entre a membrana botão terminal de um axónio e a membrana de um dendrite. Nesta junção,
o espaço que separa as duas células designa-se por fenda sináptica. O botão axónico contem vesículas de secreção
acumuladas junto à fenda sináptica., carregadas de neurotransmissor, o qual, quando liberto na fenda sináptica,
provoca a despolarização da membrana pós-sináptica.
O processo inicia-se com a chegada, ao terminal axónico, do sinal nervoso, sob a forma de uma onde de
despolarização, a qual provoca a abertura de canais específicos do cálcio. A entrada instantânea do cálcio no botão
axónico, induz a exocitose das vesícula de neurotransmissor. Um dos neurotransmissores comuns é a acetilcolina.
Na membrana pós-sináptica existem receptores específicos do neurotransmissor, acoplados a canais iónicos,
nomeadamente canais sódio. A fixação do neurotransmissor ao seu receptor, induz a abertura dos canais, a entrada
dos iões e, consequentemente a despolarização da membrana.
O processo decorre com grande rapidez, já que a ligação do neurotransmissor ao receptor, sendo lábil, é fugaz, por
um lado e, por outro, a presença, na fenda sináptica, de um enzima hidrolítico do neurotransmissor, (a
acetilcolinestesase, no caso em que o neurotransmissor é a acetilcolina) opera a inactivação daquele. A
aceticolinesterase hidrolisa uma molécula de acetilcolina em 40 micro-segundos ou mais de 1.500 000 moléculas
por minuto
Quando a sinapse conecta um neurónio motor e uma fibra muscular, designa-se por junção neuro-muscular (fig.. )
As substâncias que inibem a aceticolinesterase, provocam uma acumulação de acetilcolina na fenda sináptica e
comportam-se, por essa razão, como venenos extremamente poderosos. Encontram-se neste grupo, alguns gases de
combate e insecticidas organofosforados como o paratião. Outras substâncias inibidoras actuam a outros níveis: o
curare, substância de origem vegetal e empregue nas pontas das flechas, inibe os receptores pós-sinápticos da
acetilcolina; a toxina botulínica, por sua vez, inibe a exocitose da acetilcolina.
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7.4.2. – Comunicação hormonal
A comunicação química a longa distância efectua-se por intermédio de moléculas mensageiras designadas por
hormonas.
Nos animais, as hormonas são produzidas por células especializadas, agrupadas ou não em glândulas endócrinas.
São transportadas pela corrente sanguínea e detectadas pelas células alvo, por vezes dispersas no organismo, graças
a receptores específicos.
A grande maioria dos receptores encarregados de reconhecer as mensagens, encontra-se localizada à superfície da
membrana celular. Geralmente os receptores são proteínas, em cuja estrutura se distinguem três domínios: (i) uma
região externa, à qual se liga a molécula mensageira; (ii) uma região intermédia que mergulha na membrana celular
e (iii) uma região interna que se oferece ao contacto com o citoplasma.
A maior parte das hormonas apresentam a propriedade de serem pouco solúveis nos lípidos e muito solúveis na
água: são hidrofílicas. Por esta razão, não atravessam a membrana celular pois esta é formada, no essencial, por uma
dupla camada de fosfolípidos. Pelo contrário, as hormonas esteroides (hormonas supra-renais e sexuais) constituem
uma excepção; os receptores que as reconhecem situam-se, não na membrana celular, mas no núcleo da célula. As
hormonas esteroides devem, portanto, para serem reconhecidas pela célula, atravessar a membrana celular.
As hormonas hidrofílicas possuem a característica básica de serem mensagens externas. Para que a informação
consubstanciada nessas moléculas seja transmitida ao interior da célula, agindo sobre a actividade de uma ou mais
enzimas, é necessário que existam sistemas de transdução, que assegurem a transmissão da informação.
O receptor é uma (i) molécula (geralmente uma proteína), (ii) presente em número limitado em algumas "células
alvo", (iii) capaz de reconhecer especificamente uma só molécula "mensagem" natural (hormona, neurotransmissor,
factor de crescimento, etc.) e (iv) induzir, na sequência desta interacção, um efeito biológico particular.
(i) Somente as proteínas podem apresentar estruturas tridimensionais suficientemente complexas para
assegurarem uma grande especificidade de reconhecimento entre receptor e mensagem (modelo "chave-
fechadura");

(ii) Somente a actividade fisiológica destas células "alvo" deverá ser afectada pela "mensagem". Por
exemplo, os receptores da vasopressina, hormona antidiurética segregada pela hipófise posterior (ou
neurohipófise), encontram-se localizados unicamente em certas células do rim, que controlam o volume
urinário e em algumas células da parede dos vasos sanguíneos, que controlam as suas contracções;

(iii) Um receptor não reconhece senão uma só molécula "mensagem" natural, mas podem existir, pelo
contrário, num organismo, vários tipos de receptores para uma só molécula. Por exemplo, encontram-se
identificados quatro receptores da noradrenalina, diferentes: alfa1, alfa2, beta1 e beta2.

(iv) A maior parte das moléculas "mensagem" pertencem à categoria dos agonistas: significa que quando
ocupam os seus receptores iniciam uma cascata de reacções conducentes ao efeito fisiológico. Este efeito
biológico será função da concentração do agonista. Alguns produtos, bem conhecidos dos farmacólogos,
são capazes de se ligar especificamente a receptores sendo todavia incapazes de desencadear qualquer
efeito fisiológico, qualquer que seja a sua concentração. São designados por produtos antagonistas.
SISTEMA ADENIL-CICLÁSICO
Um dos mecanismos de transdução mais frequentemente utilizado pelas hormonas hidrófilas e pelos
neurotransmissores, é o sistema adenil-ciclásico, assim designado pelo facto de recorrer a uma enzima, a adenil-
ciclase. Em termos gerais, pode-se decompor este mecanismo em 5 etapas:
1- Uma molécula mensageira entra em contacto com um receptor e a ele se fixa especificamente;

2- Nestas circunstâncias, a proteína receptora altera a sua conformação e adquire a propriedade de poder
induzir a activação de várias (n1) moléculas de adenil-ciclase (proteína intrínseca da membrana);

3- A adenil-ciclase produz um mensageiro intracelular: a adenosina monofosfato cíclica (AMP cíclico ou

AMPc), a partir da adenosina trifosfato ou ATP. Cada molécula de adenil-ciclase produz n2 AMPc.

4- Cada AMPc activa, por sua vez, uma outra enzima, uma proteína quinase AMPc dependente, cuja
missão consiste em fosforilar certas proteínas da célula, isto é, transferir para elas um fosfato do ATP;

5- Se a proteína fosforilada for uma enzima, esta será activada e actuará de seguida sobre n3 outras
moléculas X, transformando-as em outras tantas moléculas Y.
No limite, uma só molécula mensageira induziu, sem penetrar na célula, a produção de n1xn2xn3 moléculas Y. Este
mecanismo implicou a transdução do sinal externo num sinal interno ( o AMPc) e a amplificação de sinal por uma
cascata de activação enzimática.
A cascata acima descrita compreende apenas duas enzimas. Em muitos casos concretos (ver glicogenólise), verifica-
se a existência de um maior número de enzimas intermédios, o que se traduz naturalmente, por uma maior
amplificação de sinal.
No homem, por cada descarga de adrenalina atinge uma concentração de 10-9 M e daí resulta um aumento da
concentração da glucose no sangue de 5.10-3. A amplificação de sinal hormonal pode ser estimada em 5.10-3/10-9,
isto é, em 5.106 vezes: 1 molécula de adrenalina desencadeia a libertação de 5 milhões de moléculas de glucose a
partir do glicogénio armazenado no fígado.
TOPO