Meios de Cultura

Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos
Mdulo IV
NDICE 1. Introduo ........................................................................................................................1 Procedimentos gerais ........................................................................................................... 1 2. Meios de cultura para transporte e conservao ...............................................................2 Cary Blair ........................................................................................................................... 2 Salina Tamponada ............................................................................................................... 2 Meio Stuart ........................................................................................................................ 3 gar nutriente .................................................................................................................... 4 3. Meios para crescimento e isolamento................................................................................6 gar Chocolate.................................................................................................................... 6 gar Thayer-Martin Chocolate ............................................................................................... 7 gar Salmonella-Shigella (ss)................................................................................................ 7 Caldo Selenito..................................................................................................................... 8 Caldo Tetrationato ............................................................................................................... 9 Caldo Tioglicolato com indicador .......................................................................................... 10 Caldo Tioglicolato sem indicador .......................................................................................... 11 gar Mac Conkey .............................................................................................................. 12 gar Sangue..................................................................................................................... 13 gar CLED cystine lactose electrolyte deficient .................................................................... 14 Caldo BHI brain heart infusion .......................................................................................... 15 Lwenstein Jensen............................................................................................................. 16 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook ............................................................................... 18 gar Mycosel .................................................................................................................... 19 gar Sabouraud ................................................................................................................ 20 4. Meios comerciais para provas de identificao ................................................................22 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base ........................................................ 22 gar Citrato Simmons ........................................................................................................ 23 gar Blis-Esculina ............................................................................................................. 24 gar Sangue - CAMP .......................................................................................................... 25 Caldo base de Moeller ........................................................................................................ 26 gar Dnase ...................................................................................................................... 28 gar Esculina.................................................................................................................... 30 gar Fenilalanina............................................................................................................... 31 CTA Cystine Tryticase Agar .............................................................................................. 32 Caldo Triptona e SIM ......................................................................................................... 33 Meio Caldo Triptona ........................................................................................................... 34 Caldo Malonato ................................................................................................................. 35 Caldo Nitrato .................................................................................................................... 36 Meio base para oxidao e fermentao - OF ......................................................................... 38 gar TSI triplo acar ferro .............................................................................................. 40 gar base uria (christensen).............................................................................................. 41 5. Frmulas e produtos para provas de identificao ..........................................................43 Para prova de catalase ....................................................................................................... 43 Para prova de coagulase..................................................................................................... 43 Para prova de gelatinase .................................................................................................... 45 Para prova de lecitinase ..................................................................................................... 46 Para prova de oxidase ........................................................................................................ 47 Para fermentao de carboidratos ........................................................................................ 48 Para a prova de hidrlise .................................................................................................... 49 Para crescimento a 42 e 44c.............................................................................................. 50 Para teste de motilidade ..................................................................................................... 51 Para prova de tolerncia ao NaCl 6,5% ................................................................................. 55 6. Discos para identificao.................................................................................................57 Bacitracina ....................................................................................................................... 57 Novobiocina...................................................................................................................... 57 Optoquina ........................................................................................................................ 58 7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos ...................................................60 HTM haemophilus test mdium ......................................................................................... 60 gar Mueller Hinton ........................................................................................................... 61 gar Mueller Hinton Sangue ................................................................................................ 62 8. Referncias bibliogrficas ...............................................................................................64
1. INTRODUO
PROCEDIMENTOS GERAIS
PREPARAO E DISTRIBUIO DE MEIOS DE CULTURA

Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de gua at que todo o meio fique mido e s depois deve-se acrescentar o restante da gua. Os meios preparados no comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga ou papel alumnio e adicionados em um nico frasco (normalmente em bquer), hidratar em pequena quantidade de gua at que todo o meio fique mido e s depois deve-se acrescentar o restante da gua. Sempre que for necessrio levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela de amianto ou similar e trip, no bico de Bunsen. Usar sempre luvas trmicas apropriadas para laboratrio para manipular vidrarias quentes; Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilizao de 15 minutos e a temperatura de 121C. Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtrao", usar o filtro com porosidade de micra, recomendado para partculas bacterianas. Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos no precisam estar esterilizados; Quando distribuir o meio aps a autoclavao, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis. Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos - tampas fechadas no permitem a entrada do vapor. 0,22
CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE E CRESCIMENTO

Para todos os meios confeccionados, colocar no mnimo 10% do lote preparado na estufa 35 1C por 24 horas para o controle de esterilizade. No deve haver mudana de cor nem crescimento de qualquer colnia. Para o controle de crescimento, sempre que possvel usar cepas ATCC, que so cepas de referncias de origem e padro definido de provas para a sua caracterizao. Se no for possvel o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.
RECOMENDAES GERAIS
Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle de crescimento de que realmente est funcionando. No usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados. Observar com ateno para as instrues de alguns inculos que so especficos para alguns meios de cultura. Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rpido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente so de 11 por 100 mm). As placas de Petri so de 50, 90 ou 150 mm de dimetro. Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricao, data de validade e tipo de armazenamento. Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plstico PVC transparente para evitar o ressecamento. Evitar o uso de sacos plsticos para embalar as placas, pois a gua de condensao formada facilita a proliferao de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plsticos, procurando tirar o excesso de ar.
Mod IV - 1
2. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAO

CARY BLAIR
PRINCPIO
meio de Cary Blair foi formulado partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patognicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio. A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente microrganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. a multiplicao de
O que difere este meio do meio de Stuart, a adio de uma soluo salina balanceada de tampo fosfato inorgnico e omitindo da frmula o azul de metileno.
UTILIDADE
Transporte de material fecal e conseqente conservao dos microrganismos.
FRMULA/ PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte Cary Blair.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 7 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para solidificar. pH: 7,4 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri ATCC 12022.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas.
INOCULAO
Introduzir um "swab" estril de madeira nas fezes recm coletadas; Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; Fechar o tubo; Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Branco opalescente. Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano.
RECOMENDAES
No deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta aps a semeadura. No semear fezes coletadas com mais de 6 horas. SALINA TAMPONADA
Mod IV - 2
PRINCPIO
Meio lquido tamponado que mantm a bactria vivel.
UTILIDADE
Meio de transporte de fezes.
FRMULA /PRODUTO
Frmula: NaCl Fosfato dipotssico anidro Glicerina bidestilada gua destilada
4,2 g 3,1 g 300 ml 700 ml
PROCEDIMENTOS
Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 mm; Esterilizar em autoclave.
Shigella flexneri ATCC 12022
INOCULAO
Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey.
Conservar de 4 a 8C por at 3 meses. MEIO STUART
PRINCPIO
A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente microorganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. a multiplicao de
UTILIDADE
Transporte de diversos materiais e conseqente conservao dos microorganismos. Conservao de microorganismos patognicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
FRMULA / PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte STUART
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 7 ml por tubo;
Mod IV - 3
Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para que solidifiquem. pH: 7,4 +/- 0,2
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Haemophilus influenzae ATCC 10211 Shigella flexneri ATCC 12022 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bordetella pertussis ATCC 9340
Conservar embalado de 4 a 8C por 1 a 2 semanas.
INOCULAO
O material biolgico deve ser coletado com auxlio de um "swab" estril com haste de madeira; Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; Fechar o tubo; Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Branco opalescente. Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano.
RECOMENDAES
No deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta aps a semeadura. GAR NUTRIENTE
PRINCPIO
O Nutriente gar um meio relativamente simples, de fcil preparao e barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de Microbiologia.
UTILIDADE
nutriente gar tem vrias aplicaes no laboratrio de Microbiologia, e pode ser utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas exames bacteriolgicos e isolamento de organismos para culturas puras. uso mais freqente para a conservao e manuteno de culturas em temperatura ambiente neste gar, como mtodo opcional para os laboratrios que no dispem do mtodo da crioconservao (congelamento das cepas em freezer - 70C). Usado para observar esporulao de espcies de bacilos Gram positivos.
FRMULA / PRODUTO
Produto: Nutriente gar Frmula: Extrato de carne Peptona gar gar gua destilada pH: 6,8 +/- 0,2
3g 5g 15 g 1000 ml
Mod IV - 4
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar os componentes; Fundir; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45).
Crescimento bom a excelente: Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie inclinada do meio; Incubar.
INTERPRETAO
Cor original do meio: branco opalescente Positivo: Crescimento na superfcie do gar; Negativo: Ausncia de crescimento.
RECOMENDAES
Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do gar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses. Conservar as cepas aps o crescimento no meio em temperatura ambiente. Por ser um meio nutritivo, a ausncia de crescimento no dever ocorrer.
Mod IV - 5
3. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO

GAR CHOCOLATE
PRINCPIO
Meio de gar Chocolate amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. base do meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Observao: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cistena aps resfriar a base achocolatada aproximadamente 50C.
UTILIDADE
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
FRMULA / PRODUTO
Meios comerciais: BHI gar *, Columbia gar Base, Blood gar Base, Mueller Hinton gar. Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado. Recomenda-se o uso da base de BHI gar, por apresentar melhor crescimento das cepas exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base temperatura de aproximadamente 80C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escuro (chocolate); Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro.
Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.
Conservar de 4 a 10C por 4 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; Incubar a 35C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias de tamanho pequeno a mdio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. Colnias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
RECOMENDAES
Lembrar que um meio rico e crescem vrios tipos de microrganismos.
Mod IV - 6
Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata-se ou no de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomrficos). No usar sangue de cavalo vencido. Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. GAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE
PRINCPIO
um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contm em sua frmula antibiticos que inibem o crescimento de Neisserias saprfitas e outras bactrias, quando em amostras colhidas de stios contaminados.
UTILIDADE
Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigao.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Thayer-Martin gar Base. Sangue desfibrinado de carneiro. Suplemento I: mistura de inibidores (antibiticos). Suplemento II: mistura de fatores de crescimento.
PROCEDIMENTOS
Dissolver os suplementos liofilizados conforme instrues do fabricante (normalmente em gua destilada estril que j acompanha o kit) e reservar; Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante (normalmente prepara-se 200 ml de base para cada frasco de suplementos I e II ); Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a 80C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escura (chocolate); Deixar resfriar a base a 50C; Adicionar assepticamente base resfriada os suplementos previamente dissolvidos; Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm ou 4 ml por tubos e inclinar para a superfcie ficar em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45). GAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
PRINCPIO
gar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos. A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. Tissulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de HS evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.
Mod IV - 7
UTILIDADE
Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar SS.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer o meio at fundir o gar; No autoclavar; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C.
Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella. Colnias incolores: suspeita de Shigella spp. Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores. As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
Conservar embalado de 4 a 8C por 3 meses.
RECOMENDAES
Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio. CALDO SELENITO
PRINCPIO
Tem propriedades que inibem coliformes e outras espcies da flora intestinal como estreptococos.
UTILIDADE
Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Selenito Novobiocina
PROCEDIMENTOS
Mod IV - 8
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer at levantar fervura, homogeneizando de vez em quando; No autoclavar; Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o vu de Proteus spp.); Distribuir 7 ml em tubos estreis de 15x150 mm com tampa de rosca.
Crescimento: Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspenso na placa de SS; Incubar a placa a 35 1C por 12 a 18 horas.
Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium. Negativo: no crescimento de Escherichia coli.
INOCULAO
Inocular 3 a 4 aladas da amostra de fezes no meio de cultura; Incubar a 351C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho tijolo. Aps incubao, semear com o auxlio de uma ala bacteriolgica em meios seletivos e enriquecidos (SS, Mac Conkey, XLD, Hectoen). CALDO TETRATIONATO
PRINCPIO
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adio da soluo de iodo inibe a flora intestinal normal de espcies fecais.
UTILIDADE
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Tetrationato. Soluo de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra de fezes. Iodo metlico 6,0 g Iodeto de potssio 5,0 g gua destilada 20,0 ml
PROCEDIMENTOS
Caldo tetrationato Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante; Aquecer at ferver; Distribuir 10 ml em tubos estreis com tampa de rosca; No autoclavar. Soluo de iodeto de potssio Macerar o iodeto de potssio e o iodo em um graal; Adicionar gua aos poucos at dissolver completamente; Colocar em frasco mbar.
Mod IV - 9
Crescimento: Preparar uma suspenso de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspenso em uma placa de SS; Se houver crescimento de Salmonella e inibio de Escherichia coli, liberar o lote para uso.
INOCULAO
Adicionar 0,2 ml da soluo de iodo no tubo; Inocular 1a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente; Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: lmpido com precipitado branco. O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao, semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey.
Tetrationato: Conservar de 4 a 8C por at 4 meses. Soluo de iodo: Conservar em frasco mbar a temperatura ambiente por at 12 meses.
Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAAO
Usar a tcnica de semeadura por esgotamento; Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumao de algodo embebido em gua); Incubao por 48 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata-se ou no de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificao com testes de oxidase e provas de fermentao.
RECOMENDAES
Antes de semear o material biolgico aquecer o meio de cultura em estufa 35C, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisserias; No usar meio, suplementos e sangue vencidos; Se no for incubado em CO2 e no houver crescimento, pode ser um resultado falso - negativo, pois as Neisserias necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento; Se no houver crescimento, incubar at 5 dias. CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR
Mod IV - 10
PRINCPIO
O meio de Tioglicolato d suporte para o crescimento de vrios microrganismos. O potencial de oxidao e reduo baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espcies preservadas com mercrio. A resazurina e o azul de metileno so indicadores da posio de oxidao de aerbios e a dextrose includa na frmula para os microrganismos que tem crescimento vigoroso na presena do carboidrato.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos aerbios, microaerfilos e anaerbios. Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo com indicador
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2
Crescimento bom a excelente: Bacillus subtilis ATCC 6633, Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Temperatura ambiente: 3 meses. Entre 4 a 8C: 6 meses.
INOCULAO
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at a metade do tubo; Retirar a ala sem agitar o tubo; Incubar 35 =/- 1C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio. Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. Crescimento de microrganismos anaerbios: crescimento na profundidade do meio. Crescimento de microrganismos aerbios: crescimento na superfcie do meio.
RECOMENDAES
No usar o meio quando estiver com cor rosa ou esverdeado na superfcie, pois indica a presena de oxignio no meio. Recomenda-se o uso do meio recm preparado, porm, se no houver a presena de oxignio, pode-se usar um perodo maior. No usar meios que estejam turvos. No utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio. CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR
Mod IV - 11
PRINCPIO
As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem uma anaerobiose suficiente para microrganismos anaerbios exigentes.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos anaerbios.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo sem indicador.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2
Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543.
Temperatura ambiente: 18 meses.
INOCULAO
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at o fundo do tubo; Retirar a ala sem agitar o tubo; Incubar 35 =/- 1C em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas.
INTERPRETAO
Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio. Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado.
RECOMENDAES
No usar meios que estejam turvos. Se necessrio, incubar um perodo superior 48 horas. GAR MAC CONKEY
PRINCPIO
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com outros meios, por isso no to seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o gar SS.
UTILIDADE
Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose.
Mod IV - 12
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: gar MacConkey.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao at fundir o gar completamente; Esterilizar em autoclave; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C.
Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (no fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram negativos. Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colnias incolores: no fermentadoras de lactose. No h crescimento de cocos Gram positivos.
Conservar as placas embaladas de 4 a 8C por at 3 meses. GAR SANGUE
PRINCPIO
O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservao dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
UTILIDADE
Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Blood gar Base, Columbia gar Base, BHI gar, Mueller Hinton gar; Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 ml para cada 100 ml de meio base. pH: 6,8 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante;
Mod IV - 13
Esterilizar em autoclave; Esfriar a base +/- 50C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro.
Hemlise beta hemoltica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemlise alfa hemoltica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Hemlise gama (sem hemlise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
INOCULAO
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; No final da semeadura, picar o meio com a ala para verificar hemlise em profundidade; Incubar 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho. Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas (lise total dos eritrcitos). Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros).
RECOMENDAES
No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise; No usar sangue humano, pois alguns microrganismos no apresentam hemlise; No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estude de hemlise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. GAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
PRINCPIO
Usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. A
UTILIDADE
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Cled.
Mod IV - 14
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar.
Positivo: Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colnias mdias ou grandes amareladas, aps 48 horas de incubao. Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colnias azuis translcidas. Negativo: ausncia de crescimento
INOCULAO
Verificar tcnica de semeadura quantitativa.
INTERPRETAO
Cor original do meio: azul claro. Colnias lactose positiva: cor amarela. Colnias lactose negativa: cor azul. Caractersticas de crescimento: Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo a branco azulado Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que E.coli Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de dimetro Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas Corynebacterium: colnias pequenas e cinza Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e periferia rugosa
RECOMENDAES
Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo lactose negativa ou positiva; Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos. CALDO BHI BRAIN HEART INFUSION
PRINCPIO
um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas. Mod IV - 15
A dextose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao.
UTILIDADE
Meio para cultivo de estreptococcos, fermentadores, leveduras e fungos. pneumococos, meningococos, enterobactrias, no
Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44C e para teste de motilidade em lmina.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231. Negativo: meio sem inocular.
INOCULAO
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia ou o material a ser testado realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas; Incubar a 35C 2 por 24 a 48 horas; Para isolamento de fungos incubar por at 5 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro, lmpido. Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao.
RECOMENDAES
Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar. Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X). LWENSTEIN JENSEN
PRINCPIO
A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis).
UTILIDADE
Isolamento primrio das micobactrias.
Mod IV - 16
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base Ovos de galinha frescos Meio base - frmula: Fosfato monopotssico Sulfato de magnsio Citrato de magnsio L-asparagina Fcula de batata Glicerol Ovos totais Soluo de Verde de malaquita a 2% 1,2 g 0,12 g 0,3 g 1,8 g 15,0 g 6,0 ml 500 ml 10 ml
Soluo de Verde de malaquita 2% - Frmula: Verde de malaquita 2g gua destilada 100 ml
PROCEDIMENTOS
Preparao dos ovos: Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias; Deixar os ovos submersos em gua e detergente comum, durante 30 minutos; Enxaguar com gua corrente cuidadosamente um a um; Deixar os ovos submersos em lcool etlico a 70% durante 30 minutos; Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estril; Reservar os ovos. Soluo de Verde de malaquita a 2%: Pesar o verde de malaquita e adicionar a gua; Homogeneizar bem at dissolver o corante; Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos; Reservar a soluo. Meio comercial: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente at ferver; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base 45 - 50C; Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de bquer estril e transferir, um a um, para uma proveta estril de 500 ml; Completar a proveta com ovos at completar 500 ml; Transferir os ovos para um copo de liqidificador estril - se no tiver liqidificador prprio para laboratrio, transferir os ovos para um balo de 1000 ml contendo prolas de vidro de tamanho mdio, ambos estreis; Homogeneizar os ovos; Passar os ovos para o balo que contm a base fria, filtrando em funil e gaze estril; Adicionar o verde de malaquita; Homogeneizar bem; Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfcie estourarem; Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estril; Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45) durante 50 minutos a 85C - se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50 minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. Meio no comercial: Diluir a L-asparagina em pouca gua e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen; Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita; Esterilizar em autoclave; Seguir os passos 4 ao 14 listados acima.
Mod IV - 17
Esterilizao: colocar todos os tubos em estufa; Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 Mycobacterium avium ATCC 25291
Conservar entre 4 a 8C por 3 meses.
INOCULAO
Para materiais biolgicos de stios contaminados, fazer descontaminao prvia pelas tcnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sdio, Corper & Stoner modificado); Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfcie do meio; Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta at secar bem o inculo; Depois de seco o inculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias 35C; Semanalmente, abrir as tampas prximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presena ou no de crescimento.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde claro Positivo: Crescimento de colnias amarelas Negativo: ausncia de crescimento.
RECOMENDAES
Como um meio rico em protenas, bactrias proteolticas contaminam o meio, liqefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubao para tirar as culturas que possam ter contaminado; No usar ovos velhos; No quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais; Manter sempre mais que um bquer estril para o caso de haver algum ovo estragado; No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. MEIO BIFSICO: LWENSTEIN E MIDDLEBROOK
PRINCPIO
O meio constitudo de duas fases, uma slida que o meio de Lwenstein Jensen e uma lquida, que o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessrios para o desenvolvimento das micobactrias isoladas de materiais nobres.
UTILIDADE
Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactrias do sangue e de materiais paucibacilares, como lquor, lquido pleural, bipsias, entre outros.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento). Ovos de galinha frescos
Mod IV - 18
PROCEDIMENTOS
Meio de Lwenstein Jensen: procedimento igual ao j descrito, distribuindo 12 ml do meio em frascos estreis com capacidade para 100 ml (usar tampo de algodo e depois do meio pronto parte slida e lquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumnio) e coagulando os frascos bem inclinados. Meio Middlebrook 7H-9 broth: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Adicionar o glicerol, conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base - 50C; Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instrues do fabricante; Homogeneizar bem; Distribuir 15 ml em cada frasco de Lwenstein Jensen inclinado; Fazer o controle de qualidade de esterilidade; Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em lcool etlico 70% durante 30 minutos) e lacre de alumnio. pH: 6,6 +/- 0,2
Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
Conservar os frascos embalados de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAO
Por serem materiais estreis, no necessrio a descontaminao; Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ; Se for outro material, inocular at 5 ml de material; Incubar durante 60 dias 35 /- 0,2; Banhar o meio slido semanalmente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: parte slida: verde clara, parte lquida: mbar claro. Positivo: turvao do meio lquido e crescimento de colnias amarelas no meio slido. Negativo: ausncia de turvao e crescimento nos meios lquido e slido.
RECOMENDAES
No usar frascos com meio lquido turvo; Volumes de inculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas; No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. GAR MYCOSEL
PRINCPIO
Mod IV - 19
A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatfitos o cloranfenicol inibe o crescimento de bactrias e alguns fungos filamentosos.
UTILIDADE
Isolamento de fungos patognicos, principalmente dermatfitos, a partir de material de investigao contaminado.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Mycosel gar, Mycobiotic gar ou gar seletivo para fungos patognicos.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 6,9 +/- 0,1
Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231. Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp.
INOCULAO
Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: estriar na superfcie inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37C; Observar diariamente a presena ou no de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAES
A ausncia de crescimento no indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido neste meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. GAR SABOURAUD
PRINCPIO
Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e filamentosos.
UTILIDADE
Mod IV - 20
Cultivo e crescimento de espcies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infeces superficiais. Caracterizao macroscpica do fungo filamentoso (colnia gigante).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Sabouraud Dextrose gar.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 5,6 +/- 0,1
Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.
INOCULAO
Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: semear na superfcie inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro 37C; Observar diariamente a presena ou no de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAES
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. No usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI gar.
Mod IV - 21
4. MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO

BASE DE NITROGNIO PARA LEVEDURAS YEAST NITROGEN BASE
PRINCPIO
Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de nitrognio livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observase o crescimento ao redor, aps um perodo de incubao.
UTILIDADE
Identificar as espcies de leveduras atravs da prova de assimilao de carboidratos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrognio para leveduras. Discos comerciais de carboidratos. Discos preparados no laboratrio, impregnados com solues de carboidratos a 1%: - Carboidrato 1g - gua destilada 100 ml
PROCEDIMENTOS
Para os discos de carboidratos: Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio; Usar discos estreis disponveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de dimetro em autoclave; Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar gua, homogeneizar bem at completa dissoluo - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol; Esterilizar por filtrao (cada um em frasco separado); Impregnar os discos previamente estreis (embeber totalmente os discos); Deixar os discos em estufa 37C at secarem totalmente . Para o meio base de nitrognio: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
CARBOIDRATOS Glicose Maltose Sacarose Lactose Galactose Melibiose Celobiose Inositol Xilose Rafinose Trealose Dulcitol POSITIVO Candida albicans Candida albicans Candida tropicalis Candida kefyr Candida albicans Candida guilliermondii Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Candida albicans Candida guilliermondii Candida albicans Candida guilliermondii Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei NEGATIVO
Mod IV - 22
Meio base: 4 a 10C por 6 meses. Discos: refrigerado e se possvel em dessecador durante 1 ano ou mais.
INOCULAO
Aquecer o tubo contendo 20 ml de meio base de nitrognio at fundir totalmente; Resfriar a base 47 - 48C; Fazer uma suspenso das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 ml de gua destilada estril, , usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas; Despejar a suspenso de leveduras no tubo contendo a base de nitrognio; Homogeneizar bem; Despejar o contedo homogeneizado (meio base + suspenso de leveduras) em placa de Petri de estril de 150 mm de dimetro; Esperar solidificar em temperatura ambiente; Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxlio de uma pina flambada; Incubar 30C durante 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilao do acar pela levedura. Negativo: Ausncia de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.
RECOMENDAES
No usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas; No usar inculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso - negativa; No adicionar a suspenso de leveduras base com temperatura superior a 48C, pois pode inativar as clulas e resultar em prova falso - negativa; Aps homogeneizar o meio base e suspenso de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente. GAR CITRATO SIMMONS
PRINCPIO
Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Citrato Simmons.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante; Ajustar o pH para 6,9 0,2; Aquecer sob agitao at fundir o gar; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Mod IV - 23
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Com o auxlio de um fio bacteriolgico, inocular na superfcie a colnia, no furar a base; Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde Positivo: cor azul ou crescimento no local do inculo. Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada. Se houver crescimento visual na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino (azul). Leitura inicial com 24 horas: Se resultado positivo: encerrar o teste. Se resultado negativo ou houver dvida: reincubar por mais 24/48 horas. Leitura com 48 horas: Se houver crescimento visvel na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste). Se resultado negativo ou houver dvida, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino(azul).
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas; Aps este perodo realizar controles negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxignio. No se devem transportar colnias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo. Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25C) por at 7 dias. No usar repiques de caldo. Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactria. Para fazer o inculo flambar o fio bacteriolgico. No fazer inculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo). GAR BLIS-ESCULINA
PRINCPIO
A prova de Bile-Esculina baseada na capacidade de algumas bactrias hidrolisarem esculina em presena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio. Aa esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares. As bactrias Bile-Esculina POSITIVAS, so capazes de crescer em presena de sais biliares. A hidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e esculetina. A esculetina reage com ons frricos (fornecidos pelo composto inorgnico do meio - o citrato frrico), formando um complexo negro. Mod IV - 24
UTILIDADE
Separao dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. Identificao dos Enterococcus spp., que so Bile-Esculina positiva. Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores e enterobactrias, usar o meio sem blis (vide prova de esculina).
FRMULA/ PRODUTO
Meio comercial: gar Blis-Esculina Frmula: Peptona Extrato de carne Blis Esculina Citrato frrico gar gua destilada pH = 7,0 5g 3g 40 g 1g 0,5 g 15 g 1000 ml
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir o meio; Distribuir 2,5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45).
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAO
Estriar a superfcie inclinada do meio; Incubar a 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: acinzentado Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio. Negativo: Ausncia de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio aps 72 horas de incubao.
RECOMENDAES
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas). Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presena de blis se incubados em atmosfera de CO2. GAR SANGUE - CAMP
Mod IV - 25
PRINCPIO
Consiste na interao da beta hemlise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma protena, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemlise no local da inoculao.
UTILIDADE
Separao do Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolticos e espcies de Listeria.
FRMULA/ PRODUTO
Para esta prova utiliza-se: Placa de meio gar Sangue. Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.
Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAO
Com auxlio do fio bacteriolgico, semear na superfcie de meio gar Sangue a cepa Staphylococcus aureus com uma nica linha reta; Novamente com o fio bacteriolgico (flambado), tocar nas colnias em estudo; Semear uma nica linha reta na superfcie do meio gar Sangue, perpendicularmente linha semeadura do S. aureus, sem tocar no inculo do S. aureus; Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio gar Sangue duas vezes, uma de cada lado semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inculo j feitos (a do S. aureus e cepa em estudo); Incubar 35C 24 horas. (a) Inculo do S. aureus (b) Inculo da cepa em estudo de de da da
INTERPRETAO
Positivo: Aumento da rea de hemlise em forma de flecha no local onde esto mais prximas as duas estrias de crescimento. Negativo: Ausncia de aumento da hemlise. Observa-se nitidamente a hemlise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.
RECOMENDAO
No utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem no produzir beta hemolisina. No tocar as estrias da semeadura das cepas, para no dar um resultado falso negativo. No utilizar placas de gar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, j que baseada na hemlise das cepas. CALDO BASE DE MOELLER
PRINCPIO
As descarboxilases so um grupo de enzimas com substrato especfico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminocidos para formarem aminas alcalinas. Essa reao, conhecida como descarboxilao, origina dixido de carbono como produto secundrio. Emprega-se normalmente trs aminocidos para identificao dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller a mais utilizada. Os produtos aminados especficos, so:
Mod IV - 26
Lisina: Cadaverina; Ornitina: Putrescina; Arginina: Citrulina.
A converso da arginina em citrulina uma atividade de diidrolase, e no descarboxilase, na qual o grupo NH2 retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina convertida em ornitina, que sofre descarboxilao para formar putrescina. A incubao deve ser em anaerobiose e para isso, adicionado 1 ml de leo mineral estril aps a inoculao. No incio da incubao, a glicose contida no meio fermentada e ocorre viragem de cor prpura para o amarelo. Quando o aminocido descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para prpura original.
UTILIDADE
Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificao. Utilizado principalmente para identificaes de enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos.
FRMULA / PRODUTO
Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase. Aminocidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina.
PROCEDIMENTOS
Preparar os meios com a Base de Moeller e aminocidos; Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminocidos, que ser usada como controle; Seguir as recomendaes do fabricante para pesar o meio Base de Moeller; Se usar aminocido L (levgiro), adicionar 1 grama do aminocido para cada 100 ml de meio base; Se usar aminocido DL (dextrgiro), adicionar 2 gramas do aminocido para cada 100 ml de meio base; Homogeneizar bem o meio; Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N ; Distribuir 2 ml por tubo (usar tubos de rosca); Esterilizar em autoclave.
Positivo: Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047. Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Enterobacter sakazakii. Negativo: Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.
INOCULAO
A partir de crescimento recente, inocular a colnia em estudo no tubo contendo o aminocido e no tubo controle; Colocar aproximadamente 1 ml de leo mineral estril em cada tubo; Incubar 35 +/- 1C em aerobiose.
INTERPRETAO
Mod IV - 27
Cor original do meio: prpura Positivo:
Tubo controle (sem aminocido) : amarelo e turvo - indica que o microrganismo vivel e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase. Tubo com aminocido: prpura e turvo- indica a formao de aminas a partir da reao de descarboxilao.
Negativo: Tubos controle e com aminocido: prpura.
RECOMENDAES
Verificar se o inculo foi satisfatrio para o crescimento, pois a cor original do meio - prpura, sem apresentar turvao no significa positividade e sim, ausncia de crescimento bacteriano. Como a reao ocorre em anaerobiose, imprescindvel a adio de leo mineral. Pode-se autoclavar o meio j com o leo mineral ou adicionar aps a inoculao do microrganismo. Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos no fermentadores, necessrio um perodo de incubao prolongado (24 a 72 horas). GAR DNASE
PRINCPIO
Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestvel. Estas enzimas hidrolisam cido desoxirribonuclico (DNA) contido no meio de cultura aps um perodo de incubao. Posteriormente este meio acidificado com HCl 1N para a revelao da prova.
UTILIDADE
Prova de identificao que separa os principais microrganismos de importncia clnica, entre eles: DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis. DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactrias, Gram negativos no fermentadores. demais bacilos
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: DNase gar.
PROCEDIMENTOS
Pode-se revelar a prova de duas maneiras: Com uma soluo de cido clordrico 1 N Adicionando base do meio de cultura azul de Toluidina O. Para a revelao com cido clordrico 1N:
Preparar e esterilizar o meio conforme instrues do fabricante; Esfriar o meio aproximadamente 50C; Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.
Preparar uma soluo de HCl 1N, seguindo a frmula abaixo: N= C1 V (nmero de equivalentes grama de soluto) (volume da soluo)
Mod IV - 28
C1 = M1 E E=M x
(peso molecular do soluto) (volume da soluo) x: para para para para bases: OH desprendido na reao cidos: H+ ionizveis oxidantes / redutores: variao do NOX sais normais: valncia do ction ou nion
Para a revelao com azul de Toluidina O:
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acrescentar para cada 1000 ml de base 0,1g de azul de Toluidina O; Esterilizar em autoclave; Esfriar o meio aproximadamente 50C; Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ou Escherichia coli ATCC 25922.
Meio: 4 a 10 C por 3 meses. cido Clordrico 1N: Guardar em frasco mbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade. Validade: 6 meses.
INOCULAO
Para as duas tcnicas de preparao, a inoculao a mesma: Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso na placa de DNase ; Incubar 35 +/- 1C 24 horas.
INTERPRETAO
Revelao com HCl 1 N: Cor original do meio: amarelo claro Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N at banhar totalmente a superfcie do meio; Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco. Positivo: Presena ntida de halo claro na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de halo claro em volta da colnia. revelao com azul de toluidina o: Cor original do meio: azul claro Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.
RECOMENDAES
Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova; Em uma mesma placa, pode-se fazer at 4 testes (placas de 50 mm de dimetro); armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N negativas; pode dar leituras falso
Para a deteco da atividade de DNase no necessrio que haja crescimento, por isso que a semeadura deve ser de forma circular densa e no de estria;
Mod IV - 29
Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um perodo maior de incubao (at 48 horas) para produzirem DNase; Usar cultura jovem (at 24 horas). GAR ESCULINA
PRINCPIO
Verifica se a bactria capaz de hidrolisar a esculina. A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores; Para identificao de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com blis, vide prova de BileEsculina.
FRMULA /PRODUTO
gar trptico de soja (TSA) ou base de gar sangue Citrato frrico Esculina gua destilada 4g 0,05 g 0,1 g 100 ml
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSA ou a base de gar sangue, o citrato frrico e a esculina e colocar tudo no mesmo Erlenmeyer; Colocar gua destilada; Ajustar o pH para 7,0; Aquecer lentamente at fundir o gar e dissolver o citrato frrico (lentamente porque o citrato frrico demora a dissolver); Distribuir 3 ml do meio em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
INOCULAO
Inocular colnias de crescimento recente (18 24 hs); Picar o meio e semear na superfcie do gar; Incubar a 35 C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: palha. Positivo: marrom escuro ou preto. Negativo: inalterado (palha).
Conservar de 4 a 8C, de 6 a 8 semanas. Aps este perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
Mod IV - 30
A enzima glicosidase responsvel pela hidrlise da esculina em todas as enterobactrias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli no possue a enzima glicosidase sendo necessrio usar a lactose, outro dissacardeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inculo leve com agulha bacteriolgica e interpretar aps 18-24 horas. A produo de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso no uma reao positiva. Resultado falso positivo pode ocorrer pela produo de HS em no fermentadores, semelhante ao bacilo da bactria Shewanella putrefaciens. GAR FENILALANINA
PRINCPIO
Verifica a capacidade da bactria de produzir cido fenilpirvico a partir da fenilalanina por ao enzimtica.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Fenilalanina Soluo de cloreto frrico: Cloreto frrico 10 g Adicionar 100 ml de gua destilada Colocar em frasco mbar. Validade: 6 meses A soluo de cloreto frrico 10% utilizada para revelar a atividade da enzima fenilalanina desaminase no meio de fenilalanina.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob constante agitao at fundir o meio; Ajustar o pH para 7,3 0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427 ou Proteus mirabilis ATCC 12453. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Fazer um inculo denso; Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 35C por 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado e distribuir o reagente sobre a superfcie do meio. Cor original do meio: amarelo palha.
Mod IV - 31
Positivo: formao de uma colorao esverdeada na superfcie do meio aps a adio do cloreto frrico. Negativo: o meio permanece inalterado.
Conservar de 4 a 8C, de seis a oito semanas.
RECOMENDAES
Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretao deve ser feita em at 5 minutos. CTA CYSTINE TRYTICASE AGAR
PRINCPIO
CTA um meio semi-slido, recomendado para o estudo de fermentao de carboidratos de microrganismos exigentes.
UTILIDADE
Usado para diferenciar espcies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Corynebacterium spp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial Cystine Tryticase agar Medium. Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose, mannose. Carboidrato gua destilada pH: 7,3 +/- 0,2 10 g 100 ml
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar; Pesar o CTA conforme instrues do fabricante, acrescentar 900 ml de gua e homogeneizar bem; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a aproximadamente 50C; Adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao; Distribuir em 3 ml por tubo; Deixar os tubos esfriar na posio vertical.
POSITIVO Glicose Maltose Lactose Sacarose Frutose Manose Neisseria sicca Neisseria sicca Neisseria lactamica Neisseria sicca Neisseria sicca Haemophilus parainfluenzae NEGATIVO Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Neisseria sicca Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Haemophilus influenzae
Temperatura ambiente por 3 meses.
Mod IV - 32
INOCULAO
Fazer um inculo bem denso, no centro do meio; Incubar 35C em jarra com vela acesa e gaze embebida em gua de torneira para manter a umidade da atmosfera.
INTERPRETAO
Cor original do meio: alaranjado Positivo: cor amarela, indicando acidificao (fermentao) do meio e turvao. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem turvao.
RECOMENDAES
Para provas negativas, incubar um perodo maior (72 horas); No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato; Fazer inculo denso, pois inculos fracos podem dar resultado falso negativo. CALDO TRIPTONA E SIM
PRINCPIO
Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano um aminocido que pode ser oxidado por certas bactrias resultando na produo de indol, aps a adio de reagentes de Erlich ou Kovacs.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, Haemophilus e anaerbios.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Triptona. Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade gar). Reativo Erlich Paradimetilaminobenzaldedo lcool etlico (95%) cido clordrico concentrado 1g 95 ml 20 ml
Guardar em frasco mbar em temperatura ambiente (22-25C). Cor original do reativo de Erlich: amarelo Ou Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso) ou ser preparado no laboratrio: lcool isoamlico Paradimetilaminobenzaldedo cido clordrico concentrado 150 ml 10,0 g 50 ml
Dissolver o aldedo em lcool e adicionar lentamente o cido clordrico; Guardar em frasco mbar e no refrigerador quando no estiver em uso. Obs: No conservar em temperatura ambiente por longo perodo a cor pode ser alterada de amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade. Xilol : pode ser adquirido comercialmente pronto para uso.
Mod IV - 33
PROCEDIMENTOS
Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio SIM Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
Controle qualidade para meio Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Controle qualidade para meio SIM:
Microrganismo Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli H2S + neg neg INDOL + neg + MOTILIDADE + neg +
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAO
Meio Caldo Triptona Fazer um inculo leve com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios); Fazer um inculo denso com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus); Incubar a 35C por 24 horas (enterobactrias) ou at 48 horas (bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente. Meio SIM Com o auxlio da agulha, inocular uma colnia no meio na posio vertical, lentamente at a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inculo; Incubar a 35C por 18-24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Aps incubao, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs. A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferncia dos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios, que podem produzir mnima quantidade de indol. Revelao com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e aguardar 1 minuto; Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura.
Mod IV - 34
Indol positivo: aparecer um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol. Indol negativo: permanecer um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM Realizar a leitura da motilidade e do HS. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.
Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido. HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra. HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada. Indol positivo aparecer um anel vermelho. Indol for negativo aparecer um anel amarelo.
Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8C. Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampo de algodo o meio pode ressecar antes deste prazo.
RECOMENDAES
Um timo pH para triptofanase levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH cido pode baixar a produo do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco. Cultura para ser testada produo de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tenso de oxignio baixa a produo de indol. Indol positivo se perde aps 96 horas de incubao. Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produo, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espcies de Clostridium spp. Pequenas modificaes podem ser necessrias para testar a produo de indol em no fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilizao de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. Na extrao de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluio do indol tornando-o fraco positivo ou negativo. Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inculo denso no caldo de triptona, incubao de 48 horas, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. CALDO MALONATO
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sdio como nica fonte de carbono, resultando em alcalinizao do meio.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
Mod IV - 35
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Malonato.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Ajustar o pH 6,7 0,2; Distribuir 1,5 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Inocular colnias puras de 18 a 24 horas; Inculo leve; Incubar a 35C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde. Positivo: azul. Negativo: inalterado (verde).
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. Aps este perodo realizar controle positivo e negativo semanalmente.
RECOMENDAES
Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentao da glicose aumenta a acidez. Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinizao, dificultando a interpretao. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inculo para comparao, junto com o teste em questo, se no aparecer nenhum trao azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo aps incubao de 48 horas. Cuidado ao interpretar resultados aps incubao prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reao fraca positivo podendo ser ignorado. CALDO NITRATO
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO) a nitrito (NO) ou gs nitrognio (N) (denitrificao).
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, anaerbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Nitrato. Reagentes para revelao da reao.
Mod IV - 36
Soluo A cido sulfanlico cido actico 5N
0,8 g 100 ml 0,6 g 100 ml 40 ml 100 ml
Soluo B N,N-dimetil-l-naftilamina cido actico 5N* * cido actico 5N cido actico glacial gua destilada
Zinco em p (pronto para uso)
PROCEDIMENTOS
Caldo nitrato Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH 7,0; Distribuir 3 ml do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido; Esterilizar em autoclave; Deixar o tubo esfriar na posio vertical Reagentes para revelao da reao.
Soluo A Dissolver o cido sulfanlico em uma parte do cido e depois completar com o restante do cido actico q.s.p. 100 ml.
Soluo B Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do cido e completar o restante do cido actico q.s.p. 100 ml.
Resultado Nitrato reduzido a nitrito Nitrato a gs Nitrato no reduzido Cepa Enterobactrias Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Resultado esperado Colorao vermelha Bolhas no tubo de Durhan Colorao vermelha somente aps adio de p de zinco
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC
INOCULAO
Fazer um inculo denso, com colnias recentes (18 24 horas) no meio com ala bacteriolgica; No agitar o tubo aps inoculao; Incubar 351C por 24 a 48 horas, sendo necessrio algumas vezes at 5 dias; Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a reao; Verificar a presena de bolhas dentro do tubo de Durhan.
INTERPRETAO
Cor original do meio: incolor a palha. Verificar se h bolhas de gs dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactria reduziu nitrato a gs = denitrificao. Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria reduziu nitrato a nitrito. Se aps a adio dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de p de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria no reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio.
Mod IV - 37
IMPORTANTE: algumas bactrias no conseguem reduzir nitrato a nitrito e s conseguem reduzir nitrito, como por exemplo alcaligenes faecalis e oligella uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para este fim.
RESULTADO reduziu nitrato a nitrito no reduziu nitrato a nitrito nitrato reduzido a gs
REAGENTES A e B +
P DE ZINCO no houve reao
GS NO TUBO DE DURHAN no houve reao
neg
pos
neg
neg
neg
Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8C por at 6 meses. Solues A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8C) por at 12 meses. cido actico 5N: Conservar de 4 a 8C por at 12 meses.
RECOMENDAES
Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo, devido alta sensibilidade do teste. Quando for adicionado o p de zinco, no colocar em excesso, pode resultar em falso negativo (incolor). MEIO BASE PARA OXIDAO E FERMENTAO - OF
PRINCPIO
Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio base de OF Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc). Vaselina lquida estril.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer o meio at dissolver todo o gar; Separar volumes iguais em diferentes Beckers, dependendo do nmero de carboidratos que sero preparados; Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 ml de meio base e homogeneizar; Distribuir 2 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a vlvula de presso da autoclave aberta e, quando estiver saindo bastante vapor, comear marcar o tempo. Vapor fluente s pode ser feito
Mod IV - 38
em autoclave com tampas regulveis para sada de vapor. Autoclaves horizontais no possuem controle de sada de vapor, so automticas); Pode-se tambm esterilizar a base e adicionar os acares esterilizados por filtrao em filtros Millipore 0,45 m (90 ml de base autoclavada e 10 ml de acar (esterilizado por filtrao); Deixar esfriar a temperatura ambiente na posio vertical.
Resultado OF-GLICOSE Cepa Resultado esperado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado
Oxidador Pseudomonas aeruginosa Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-FRUTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-LACTOSE Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-MALTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-MANITOL Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-SACAROSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-XILOSE Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina lquida Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 * Alcaligenes faecalis ATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238
INOCULAO
Inocular densamente at o fundo do tubo com a agulha bacteriolgica, colnias provenientes de uma placa de crescimento de 18 a 24 hs.; Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 ml de vaselina lquida estril, no outro tubo no colocar vaselina; Incubar temperatura de 35C por 48 horas ou mais; Se resultado negativo, pode ser necessrio at 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando diariamente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela tubo fechado - inalterado (verde) Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela Assacaroltico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde)
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses.
RECOMENDAES
Sempre antes de interpretar a reao verificar se h crescimento nos tubos, porque algumas bactrias no crescem no meio OF, sendo necessrio enriquecimento do meio, acrescentando 2 % de soro de coelho ou cavalo. Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.
Mod IV - 39
GAR TSI TRIPLO ACAR FERRO
PRINCPIO
Este meio contm trs acares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para deteco da fermentao de carboidratos e sulfato de ferro para deteco da produo de sulfato de hidrognio (indicado pela cor preta na base do tubo). A fermentao indicada pela mudana da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O gar fundido deixado solidificar, formando uma superfcie inclinada. Essa configurao origina duas cmaras de reao dentro do mesmo tubo. A poro inclinada ou bico, exposta em toda sua superfcie ao oxignio atmosfrico, aerbia. A poro inferior, denominada profundidade ou fundo, est protegida do ar e relativamente anaerbia. Quando se prepara o meio, importante que o bico e a profundidade tenham o comprimento igual ao redor de 3 cm cada um, de modo que o efeito das duas cmaras seja conservado.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentao de carboidratos, produo de sulfato de hidrognio e gs.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: TSI (trplice acar ferro).
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSI conforme instrues do fabricante; Ajustar o pH para 7,3 0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Microrganismo Escherichia coli Shigella flexneri Edwardsiella tarda Pseudomonas aeruginosa ATCC 25922 12022 15947 27853 Superfcie cido Alcalino Alcalino Alcalino Base cido, gs cido cido Alcalino HS neg neg + +
INOCULAO
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Semear por picada at o fundo e na superfcie do meio; Incubar 24 hs a 35C, com a tampa semi aberta.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente. Leitura: entre 18 e 24hs. Cor prpura = alcalino. Cor amarelo = cido. Reaes pice/base: Prpura/amarelo = fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos). Amarelo/amarelo = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 aucares). Mod IV - 40
Presena de gs (CO) = bolhas ou meio fragmentado. HS positivo = presena de precipitado negro.
PICE Vermelho Vermelho Amarelo
BASE Vermelho Vermelho Vermelho
HS neg neg neg
GS neg neg neg
INTERPRETAO MAIS PROVVEL Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) ou esquecimento de picar a base Enterobactrias ou Aeromonas Lac (neg) Samonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter
Amarelo Amarelo
Amarelo Amarelo
neg +
varia varia
Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
RECOMENDAES
Quando h produo de HS significa que a base sempre cida. No realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar em falsas reaes. No utilizar alas bacteriolgicas para no fragmentar o meio, ocasionando falsa reao de gs, utilizar fio bacteriolgico. Qualquer trao de escurecimento no meio deve ser indicado com HS positivo. GAR BASE URIA (CHRISTENSEN)
PRINCPIO
Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uria em duas molculas de amnia pela ao da enzima urease, resultando na alcalinizao do meio.
UTILIDADE
Bacilos Gram negativos fermentadores e no fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Uria. Soluo de uria a 40% (40 g uria + 100 ml de gua destilada).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio de uria conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar at 50C e adicionar assepticamente 5 ml da soluo de uria a 40% em 95 ml do meio base; Homogeneizar e distribuir 3 ml do meio assepticamente em tubos estreis com tampa de rosca; Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Obs: A soluo de uria a 40% uma soluo hipertnica e o risco de contaminao baixo, porm, pode-se esterilizar a soluo por filtrao (filtro Millipore de 0,45 m).
Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 1C por 24 horas. mudana de cor liberar para uso. Se no houver
Mod IV - 41
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315 Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAO
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Fazer um inculo denso; Semear na superfcie do meio, no picar a base, pois a base pode servir como controle; Incubar 35C de 6 a 24 horas, podendo ser necessrio at 6 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: alterao do meio para cor de rosa, pink. Negativo: sem alterao de cor do meio. Diferentes graus de hidrlise da uria podem ocorrer: Tubo inteiro cor pink. Superfcie do tubo cor pink, base no muda de cor. Fracamente positivo: pice cor pink, restante do tubo no muda de cor. Positivo rpido: 1 6 horas para Proteus spp. Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubao. Ex: algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses. Aps este perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
No aquecer a soluo base da uria, pois a uria pode se decompor se aquecida. No utilizar a uria de Stuart porque menos sensvel para detectar a presena de urease. No deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrlise.
Mod IV - 42
5. FRMULAS E PRODUTOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO

PARA PROVA DE CATALASE
PRINCPIO
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio.
UTILIDADE
Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis.
FRMULA/ PRODUTO
Perxido de Hidrognio (H2O2) 3%.
Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
perxido de hidrognio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3% sobre uma lmina; Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo na gota de perxido de hidrognio.
INTERPRETAO
Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo de efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio gasoso. Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia.
RECOMENDAES
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos podem produzir reao fraca de catalase. Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, no usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois so catalase negativos. PARA PROVA DE COAGULASE
PRINCPIO
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um cogulo, uma vez que a coagulase uma protena com atividade similar protombrina, capaz de converter o fibrinognio em fibrina, que resulta na formao de um cogulo visvel. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre. A coagulase conjugada (prova em lmina), tambm conhecida como fator de aglutinao, encontra-se unida parede celular bacteriana e no est presente em filtrados de cultivos.
Mod IV - 43
Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma (fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visveis. A coagulase livre (prova em tubo), uma substncia similar trombina e est presente em filtrados de cultivos. secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio, formando fibrina (cogulos). Quando uma suspenso em plasma do microrganismo produtor de coagulase preparada em tubo de ensaio, forma-se um cogulo visvel aps o perodo de incubao.
UTILIDADE
Separar as espcies de Staphylococcus de importncia clnica, S. aureus coagulase positiva, das demais espcies coagulase negativa.
FRMULA / PRODUTO
Plasma de coelho com EDTA liofilizado.
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
plasma antes e depois de reconstitudo, deve ser mantido refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Coagulase conjugada: Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro; Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis dentro de cada crculo; Com auxlio de um fio bacteriolgico agregar a colnia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada crculo; Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos; No outro crculo, adicionar outra gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis, como controle; Homogeneizar com palito de madeira; Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs; Observar presena de aglutinao. Coagulase livre: Com auxlio do fio bacteriolgico, estufa 37C at que turve; suspender colnias em estudo em caldo BHI e colocar em
Se necessrio, acertar a turbidez at 0,5 da escala de MacFarland; Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5 ml de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recm turvado; Incubar em estufa 35C 4 horas; Verificar se h presena de cogulo; Se no houver presena de cogulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubao.
Mod IV - 44
INTERPRETAO
Coagulase conjugada: Positiva: formao de precipitado branco e aglutinao dos microrganismos da suspenso, aps 15 segundos, no crculo que contm o plasma. Negativa: ausncia de aglutinao no crculo que contm o plasma. Controle sem plasma: dever ser leitoso e uniforme, sem presena de precipitado ou aglutinao. A presena de precipitado ou aglutinao, torna a prova inespecfica, devendo ser repetida a prova em tubo. Coagulase livre: Positiva: presena de qualquer grau de cogulo. Negativa: ausncia de cogulo.
RECOMENDAES
Para a coagulase em tubo, as provas negativas aps 4 horas a 37C, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubao prolongada a 37C podem produzir fibronolisinas, o que causa dissoluo do cogulo durante a incubao. Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e no agitar, pois a agitao pode desmanchar os cogulos parcialmente formados. Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA. No utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), daro resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos. Plasma humano no recomendado, pois contm quantidades variadas de Fator de Reao com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa. PARA PROVA DE GELATINASE
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina.
UTILIDADE
Identificar e classificar bactrias fermentadoras, no fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
FRMULA / PRODUTO
Filme no revelado de Raio X. Salina 0,9 % estril ou gua destilada estril.
PROCEDIMENTOS
Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm; Armazenar em frasco estril.
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estril ou gua destilada estril.; Com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazer um inculo denso da bactria a ser testada, adicionar uma fita de raio x. Fazer o inculo de colnias de crescimento de 18 a 24 horas; Mod IV - 45
Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estril ou gua destilada estril e a fita de Raio X, sem inculo.
INTERPRETAO
Positivo: emulso de gelatina (cor verde) na poro submersa do filme torna-se transparente (clara). Negativo: fita permanece verde, emulso esverdeada permanece na poro submersa do filme.
Fitas: seguir instrues do fabricante.
RECOMENDAES
Utilizar filme de Raio X no revelado. PARA PROVA DE LECITINASE
PRINCPIO
Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inculo.
UTILIDADE
Diferenciao de espcies de Bacillus e Clostridium.
FRMULA / PRODUTO
Frmula - meio base: Gema de ovo de galinha Proteose de peptona n 2 Fosfato dissdico Fosfato de potssio Cloreto de sdio Sulfato de magnsio Glicose Soluo de hemina (5 mg/ ml) gar gua destilada pH: 7,6 Soluo de gema de ovo 50%: Gema de ovo Soluo fisiolgica estril 1 ml 1 ml depende do volume de meio base ser utilizado 40 g 5g 1g 2g 0,1 g 2g 1 ml 20 g 1000 ml
PROCEDIMENTOS
Meio base: Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a soluo de gema de ovo; Aquecer em bico de Bunsen at fundir o gar; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. Meio para uso: Resfriar a 50C e adicionar 1 ml da soluo de gema de ovo a 50%; Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.
Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124. Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689. Mod IV - 46
Meio base (para estoque): 4 a 8C fechado, durante 6 meses. Meio para uso: 4 a 8C, embalado, durante 1 semana.
INOCULAO
Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso sobre a superfcie do meio. Incubar 37C 24 horas em aerobiose - para cepas de Bacillus spp.; Incubar 37C 48 horas em anaerobiose - para cepas de Clostridium spp.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo. Positivo: formao de halo branco ao redor das colnias. Negativo: ausncia de halo, meio fica inalterado.
RECOMENDAES
No usar ovos velhos. No usar meio vencido. PARA PROVA DE OXIDASE
PRINCPIO
O teste de oxidase baseado na produo intracelular da enzima oxidase pela bactria.
UTILIDADE
Ajuda caracterizar espcies de Neisseria, distingui no fermentadores (oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactrias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
FRMULA / PRODUTO
Reativo para teste de oxidade preparado no laboratrio: N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato gua destilada
1g 100 ml
Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso). Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro.
PROCEDIMENTOS
Reativo para teste de oxidase: Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Becker e adicionar 100 ml gua destilada, vagarosamente para no oxidar a soluo; Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Becker com o reativo; Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou; Colocar o papel na estufa a 35 1C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Becker para juntar o excesso de reativo; Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro. Obs: No utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas.
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor roxa). Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alterao da cor). Mod IV - 47
INOCULAO
Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a ser testada sobre a fita de oxidase. Observar se h formao de cor roxa de imediato.
INTERPRETAO
Cor original: branca ou levemente azulada Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria. Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao da bactria. No considerar alterao de cor tardia.
Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8C. Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas.
RECOMENDAES
No fazer o teste de colnias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentao inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo. No fazer teste de oxidase de colnias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB). No usar ala ou agulha porque pode conter traos de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em falso positivo. Utilizar colnias de meios no seletivos tais como: gar sangue e gar chocolate. Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade. No cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traos de ferro. PARA FERMENTAO DE CARBOIDRATOS
PRINCPIO
A fermentao de carboidratos amplamente utilizada para a diferenciao de gneros e identificao de espcies bacterianas. A prova consiste em verificar a capacidade do microrganismo fermentar ou no um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas caractersticas que auxiliaram na identificao.
UTILIDADE
Identificar e separar espcies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus coagulase negativa.
FRMULA/ PRODUTO
Produto: Caldo para fermentao de carboidratos. Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros. Frmula (base): BHI caldo 22,5 g Carboidrato 10 g Indicador * 1 ml gua destilada 200 ml gua destilada 900 ml * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol Etanol a 95% 1,6 g 100 ml
Mod IV - 48
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar; Pesar o BHI em bquer, acrescentar a gua e homogeneizar bem; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Esterilizar em autoclave; Aps esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao; Distribuir 3 ml por tubo.
CARBOIDRATOS Arabinose Rafinose Sorbitol Maltose Trealose POSITIVO Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus lugdunensis NEGATIVO Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum Staphylococcus schleiferi Staphylococcus epidermidis
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo; Incubar 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: prpura Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo; Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
RECOMENDAES
Para provas negativas, incubar um perodo maior (48 horas); No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato. PARA A PROVA DE HIDRLISE
PRINCPIO
A prova de hidrlise PYR um teste enzimtico que consiste na hidrlise do substrato Lpyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrlise do substrato libera -naphtylamide, que detectada com a adio do reagente, o N,Ndimetilaminocinamaldedo, que forma uma base de Schiff, de colorao vermelha.
UTILIDADE
Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp. Identificao de algumas espcies Staphylococcus coagulase negativa. Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Teste comercial : PYR test Frmula - Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt):
Mod IV - 49
BHI caldo Neopeptona Dextrose Cloreto de sdio Fosfato dissdico Carbonato de sdio gua destilada
500 g 20 g 2g 2g 0,4 g 2,5 g 1000 ml
Para cada 100 ml de caldo base, adicionar 0,01 ml de L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide. Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldedo a 0,01%
PROCEDIMENTOS
Pesar os componentes em bquer; Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo; Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente; Distribuir 0,2 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
Positivo: Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes ATCC 19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212 . Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae.
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. Comercial: ver instrues do fabricante
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo OU; No caso de usar kits comerciais, com auxlio de uma pina flambada, colocar um disco impregnado com o substrato de PYR sobre as colnias em estudo recm isoladas; Incubar 37C por 4 horas; Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU; Retirar o disco e colocar sobre uma lmina e adicionar 1 gota do reagente PYR.
INTERPRETAO
Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (aps adicionar o reagente de PYR). Negativo: Sem alterao de cor (permanece amarela ou alaranjada).
RECOMENDAES
Para identificaes presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente so cocos Gram positivos/ catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como blis esculina) tratar de enterococo ou no; No utilizar colnias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso - negativo; No exceder o tempo de leitura. PARA CRESCIMENTO A 42 E 44C
Mod IV - 50
PRINCPIO
Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas temperaturas.
UTILIDADE
Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao). Indicador prpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 ml de lcool etlico 95%).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Acrescentar o indicador prpura de bromotimol (1 ml de indicador em 1000 ml de meio); Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
Temperatura 42C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Temperatura 44C: Acinetobacter baumannii.
INOCULAO
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia a ser testada; Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas; Incubar em banho Maria na temperatura a ser testada, 42C ou 44C.
INTERPRETAO
Cor original do meio: prpura. Positivo: presena de turvao e viragem do indicador de cor prpura para amarelo = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao e permanncia da cor prpura = ausncia de crescimento bacteriano.
Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
RECOMENDAES
No fazer inculo muito denso, pode resultar em falsa turvao. Importante o controle da temperatura do banho, com termmetro de mxima e mnima. PARA TESTE DE MOTILIDADE
PRINCPIO
A bactria mvel atravs do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos so mveis. A bactria pode conter um ou muitos flagelos e sua localizao varia com a espcie da bactria e as condies de cultura.
UTILIDADE
Determinar se o microrganismo o no mvel; Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol, Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactrias; Mod IV - 51
Meio motilidade em caldo utilizado para no fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dvidas).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Motilidade Meio comercial: SIM Meio comercial: MILI Meio comercial: MIO Meio Comercial: BHI (brain heart infusion) Meio Comercial: Triptona Soluo de Vermelho de Tetrazlio.
PROCEDIMENTOS
Meio Motilidade: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio Motilidade com adio da soluo de Vermelho de Tetrazlio: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Adicionar 0,1 ml para cada 100 ml de base de soluo de vermelho de tetrazlio 0,1% e homogeneizar bem; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio SIM /Meio MILI/Meio MIO Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Caldo BHI (motilidade em caldo) Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente. Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente.
Meio Motilidade: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Meio SIM:
Mod IV - 52
Microrganismo Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli
HS + neg neg
Indol + neg +
Motilidade + neg +
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
Meio MIO:
Microrganismo Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Motilidade + neg neg Indol + neg + Ornitina + neg +
Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Meio MILI:
Microrganismo E. coli K. pneum. P. alcalifaciens S. enteritidis S. flexneri Crescimento denso denso denso denso denso Lisina + + neg + neg Motilidade + neg + + neg Indol neg neg neg neg neg
E.coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022
Meio BHI/Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Negativo: meio sem inocular.
INOCULAO
Meio Motilidade / Meio SIM / Meio MILI / Meio MIO Com o auxlio de um fio bacteriolgico inocular uma colnia pura de 18 24 horas, no meio na posio vertical, lentamente at a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubao; Incubar a 35C por 18-24 horas. Meio Caldo BHI / Meio Caldo Triptona Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 352C por 24 a 48 horas.
INTERPRETAO
Meio de Motilidade: Motilidade positiva: organismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio, causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inculo, em volta continua lmpido. Meio de Motilidade com Tetrazlio: Motilidade positiva: organismos mveis produzem uma nuvem cor pink e difundem-se completamente no meio. Motilidade negativa: h crescimento da bactria e produo de cor vermelho claro na linha do inculo e em volta do meio continua lmpido. Se resultado for negativo incubar a 21-25C por at 5 dias. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM: Realizar a leitura da motilidade e do H2S. Mod IV - 53
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar otubo suavemente e proceder a leitura do indol.
Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez; Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido; HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra; HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada; Indol positivo aparecer um anel vermelho; Indol negativo permanecer um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs);
Meio MILI Interpretar as reaes da motilidade e lisina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio (essa cor pode variar de intensa ou mais leve, de acordo com a reduo do indicador). Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo desenvolvimento de cor amarela.
Meio MIO Interpretar as reaes da motilidade e ornitina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio. Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo aparecimento da cor amarela.
Meio caldo BHI/ Meio Caldo Triptona Colocar uma gota do meio entre lmina e lamnula e observar ao microscpio com objetiva de 40 X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento browniano, verificando que o microrganismo se desloca em vrias direes.
Motilidade positiva: bactrias se movendo de um lado para outro. Motilidade negativa: bactria apresenta somente movimento browniano.
Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8 C por at 6 meses.
RECOMENDAES
A temperatura de incubao extremamente crtica, porque muitos microrganismos so mveis a 15-25C e no mveis a 37C. Se houver suspeita que o microrganismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35C e outro a temperatura ambiente 22-25C. Uso do sal de tetrazlio no meio de motilidade desejvel, mas pode inibir certos microrganismos fastidiosos.
Mod IV - 54
Flagelo o rgo locomotor e composto de protena, essa protena pode se desnaturar com excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de motilidade pode fornecer um resultado falso negativo. Flagelo pode ser destrudo tambm sob agitao violenta do tubo de cultura da bactria, podendo produzir um resultado de motilidade fraco positivo ou falso negativo. Microrganismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais por longos perodos tendem a perdem sua motilidade. Os testes de motilidade em anerbios so difceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos. PARA PROVA DE TOLERNCIA AO NaCl 6,5%
PRINCPIO
A tolerncia ao NaCl a 6,5% uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presena do sal. Meio base utilizado o BHI caldo, que um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactrias. Este meio normalmente contm 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentrao para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.
UTILIDADE
Separa Enterococcus spp., que so NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que so NaCl 6,5% negativos. Na identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
No h meio pronto para uso. Frmula: BHI caldo 25 g NaCl 60 g Indicador * 1 ml Glicose 1g gua destilada 1000 ml * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 ml Observao: o uso de indicador opcional.
PROCEDIMENTOS
Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um bquer; Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Mod IV - 55
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo; Incubar.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo. Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com ou sem viragem do indicador. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
RECOMENDAES
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas); Verificar a quantidade de NaCl contido na frmula do meio de BHI, pois a concentrao poder ser outra, dependendo do fabricante do meio, e a concentrao final do meio de NaCl a 6,5 % poder ser superior ou inferior concentrao desejada; No carregar no inculo, pois o excesso poder ser interpretado como crescimento e dar resultados falso - positivos (para os meios utilizados sem o indicador); Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentao das clulas bacterianas formadas; Os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificao destas espcies.
Mod IV - 56
6. DISCOS PARA IDENTIFICAO

BACITRACINA
PRINCPIO
Streptococcus beta hemoltico do grupo A so sensveis a concentraes baixas de bacitracina.
UTILIDADE
Identificao presuntiva de Streptococcus beta hemoltico do grupo A (S. pyogenes).
PRODUTO
Discos de bacitracina de 0,04 unidades/ disco.
Positivo (Sensvel): Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
Manter 4C. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
partir de caldo BHI ou TSB recm turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do "swab"; Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente; Incubar 35C 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Positivo (Sensvel): Presena de qualquer halo ao redor do disco. Negativo (Resistente): ausncia de halo ao redor do disco.
RECOMENDAES
Streptococcus alfa hemolticos so sensveis a baixas concentraes de bacitracina. No existem dados disponveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibio. O inculo bacteriano deve ser confluente, inculo muito diludo pode permitir que os Streptococcus no pertencentes ao grupo A paream sensveis bacitracina. NOVOBIOCINA
PRINCPIO
Separa espcies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensveis ou no a Novobiocina.
UTILIDADE
Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importncia clnica; Staphylococcus saprophyticcus a nica espcie isolada em humanos como causadora de infeces urinrias.
Mod IV - 57
FRMULA / PRODUTO
Discos de Novobiocina de 5 g.
Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Preparar uma suspenso do microrganismo em estudo com crescimento recente (at 24 horas) em caldo BHI, TSA ou soluo fisiolgica estril, acertando a turvao na escala 0,5 de MacFarland; Com auxlio de um "swab", semear na superfcie de uma placa de gar Mueller Hinton; Com uma pina previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na superfcie do meio e pressionar delicadamente; Incubar.
INTERPRETAO
Resistente: Ausncia de halo de inibio ou halos <= 15 mm. Sensvel: Presena de halo de inibio igual ou superior a 16 mm.
RECOMENDAES
No usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a suspenso; Se necessrio usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar 37C at turvar, acertar a turvao na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste; Cepas isoladas de outros materiais biolgicos que no urina, fazer identificao complementar com fermentao de acares para confirmar espcie. OPTOQUINA
PRINCPIO
Cloridrato de etil-hidroxicuprena (optoquina), um derivado da quinina, inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentraes muito baixas (5 g/ ml ou menores). As clulas do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido variao da tenso superficial, e produzida uma rea de inibio.
UTILIDADE
Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolticos.
FRMULA / PRODUTO
Discos de optoquina de 5 g
Positivo (Sensvel): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Mod IV - 58
Manter 4C. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
partir de caldo BHI ou TSB recm turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do "swab"; Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente; Incubar 35C 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7 de CO2.
INTERPRETAO
Positivo (Sensvel): Disco de 6 mm: halo de inibio de 14 mm ou mais. Disco de 10 mm: halo de inibio de 16 mm ou mais. Negativo (Resistente): Disco de 6 mm: halo de inibio inferior 14 mm ou ausncia de halo. Disco de 10 mm: halo de inibio inferior 16 mm ouausncia de halo.
RECOMENDAES
A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentraes muito elevadas.
Mod IV - 59
7. MEIOS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

HTM HAEMOPHILUS TEST MDIUM
PRINCPIO
um meio suplementado que permite o crescimento das espcies mais exigentes de Haemophilus, pois contm em sua frmula suplementos base de NAD e cistena.
UTILIDADE
Meio padronizado pelo NCCLS para realizao do teste de sensibilidade aos antimicrobianos de Haemophilus influenzae.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial HTM Suplemento VX: NAD (Coenzima I) e cistena.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante em um balo de fundo chato; Esterilizar em autoclave; Resfriar o meio a 50C e adicionar o suplemento previamente reidratado; Distribuir 50 a 60 ml em placas estreis de 150 mm (o meio deve ficar com uma espessura homognea de 3 a 4 mm); Deixar esfriar temperatura ambiente.
Crescimento: Preparar uma suspenso de Haemophilus influenzae ATCC 10211 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa; Incubar a placa 35 2C por 24 horas em estufa com 5% de CO. Se a bactria crescer em 24 horas, liberar o lote para uso. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros padronizados pelo NCCLS, que determina cada organismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
Mod IV - 60
GAR MUELLER HINTON
PRINCPIO
gar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condies de crescimento das principais bactrias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realizao do teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos de difuso em disco e E-test para enterobactrias, no fermentadores, Staphylococcus, Enterococcus sp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Muller Hinton.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH (7,2 7,4); Retirar da autoclave e medir novamente o pH; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;. Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira (4 a 8C). Obs: extremamente importante que o meio tenha espessura homognea de 3 a 4 mm.
Crescimento: Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa. Incubar a placa 35C por 24 horas. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina, de clcio e magnsio s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros padronizados pelo NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
RECOMENDAES
Principais variveis que podem interferir no resultado do antibiograma:
Mod IV - 61
Nveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentraes levam a diminuio na atividade de aminoglicosdeos diante de Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes diminudas levam a resultados contrrios. Concentrao de timidina ou timina: concentraes em excesso levam falsa resistncia para sulfonamidas e trimetropima. pH: em pH baixo vamos observar halos de inibio reduzidos para aminoglicosdeos, quinolonas, macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores. Espessura do meio: < de 3 mm leva falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva falsa resistncia. GAR MUELLER HINTON SANGUE
PRINCPIO
gar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condies de crescimento das principais bactrias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realizao do teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos de difuso em disco e E-test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos beta-hemolticos dos grupos A,B,C e G conforme instrues do NCCLS.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Muller Hinton. Sangue de carneiro desfibrinado.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH (7,2 7,4); Retirar da autoclave e resfriar a 50C; Adicionar 50 ml de sangue de carneiro desfibrinado por litro de meio de cultura de forma assptica; Homogeneizar bem sem formar espuma; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm; Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C. Obs: extremamente importante que o meio tenha espessura homognea de 3 a 4 mm.
Crescimento: Preparar uma suspenso de Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1 ml em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa; Incubar a placa 35C por 20 a 24 horas com 5% de CO. Se a bactria crescer em 24 horas, o lote est pronto para uso. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina, de clcio e magnsio s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa;
Mod IV - 62
Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros do NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
Conservar de 4 a 8C por at 3 meses.
RECOMENDAES
Principais variveis que podem interferir no resultado do antibiograma: Nveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentraes levam a diminuio na atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes diminudas levam a resultados contrrios. Concentrao de timidina ou timina: concentraes em excesso levam falsa resistncia para sulfonamidas e trimetropima. pH: em pH baixo vamos observar halos de inibio reduzidos para quinolonas, macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores. Espessura do meio: < de 3 mm leva falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva falsa resistncia.
Mod IV - 63
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Balows A., Hausler, W.J. Jr., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991. Becton Dickinson and Company. Manual of BBL products and laboratory procedures. 6th. Ed., United States of America, 1988. Becton Dickinson and Company. Product catalog for microbiology 1996/ 1997, Canada, 1997. Becton Dickinson and Company. DIFCO manual. 10th. Ed. Detroit, 1984. Konemen, E.W. Trad. Cury, A.E. Diagnstico microbiolgico: texto e atlas colorido. 5a. Ed., MEDSI, Rio de Janeiro, 2001. Larone, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identification. 3rd. Ed., Washington, American Society for Microbiology, 1994. Mc Faddin, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Ed. William & Wilkins Co., Baltimore, 1980. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, 1990. Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade, Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de bacteriologia da tuberculose. 2a. Ed., Rio de Janeiro, 1994.
10. Murray, P.R., Baron, J.E., Pfaller, A.M., Tenover, C.F. and Yolken, H.R. Manual of clinical microbiology. American Society for Microbiology, 7th ed., Washington. DC, 1999. 11. Oplustil, C.P., Zoccoli, C.M., Tobouti, N.R., e Sinto, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica, Sarvier, So Paulo, 2000. 12. Oxoid. Manual Oxoid. Espan, Unipath Espaa, 1995.
Mod IV - 64

Meios de Cultura

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Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos

PREPARAO E DISTRIBUIO DE MEIOS DE CULTURA

CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE E CRESCIMENTO

2. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAO

Frmula: NaCl Fosfato dipotssico anidro Glicerina bidestilada gua destilada

4,2 g 3,1 g 300 ml 700 ml

3. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO

Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium. Negativo: no crescimento de Escherichia coli.

A dextose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao.

Soluo de Verde de malaquita 2% - Frmula: Verde de malaquita 2g gua destilada 100 ml

4. MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO

Lisina: Cadaverina; Ornitina: Putrescina; Arginina: Citrulina.

Cor original do meio: prpura Positivo:

Negativo: Tubos controle e com aminocido: prpura.

Para a revelao com azul de Toluidina O:

Soluo A cido sulfanlico cido actico 5N

0,8 g 100 ml 0,6 g 100 ml 40 ml 100 ml

Zinco em p (pronto para uso)

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC

RESULTADO reduziu nitrato a nitrito no reduziu nitrato a nitrito nitrato reduzido a gs

P DE ZINCO no houve reao

GS NO TUBO DE DURHAN no houve reao

GAR TSI TRIPLO ACAR FERRO

Presena de gs (CO) = bolhas ou meio fragmentado. HS positivo = presena de precipitado negro.

PICE Vermelho Vermelho Amarelo

BASE Vermelho Vermelho Vermelho

HS neg neg neg

GS neg neg neg

5. FRMULAS E PRODUTOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAO

500 g 20 g 2g 2g 0,4 g 2,5 g 1000 ml

Microrganismo Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli

6. DISCOS PARA IDENTIFICAO

7. MEIOS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

GAR MUELLER HINTON

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