26/02/2009

Tipos de PCR
Eduardo Paulino Castan

TiposdePCR

Tipos de PCR
PCR-RFLP RAPD AFLP PCR-colony Hot Start In situ Inverse Nested Competitive Multiplex Long Touchdown Degenerate RT-PCR * Real-Time PCR *

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PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrio)

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PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrio)

Normal

Mutante

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PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrio)

Variabilidade gentica Identificao de espcies
R.lalandiiR.porosus Gene mit RNAr 16S

Rhizoprionodonlalandii Digesto SspI

Rhizoprionodonporosus

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PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrio)

Mapeamento genmico genticas Anlise de doenas g
Fator V Leiden humano Relao com propenso a trombose profunda

Raias 2 e 3: pacientes que no apresentaram a mutao analisada; raias 4 e 6: pacientes com a mutao Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutao Fator V Leiden em homozigose.
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RAPD (DNA Polimrfico Amplificado Aleatoriamente)

DNAGenmico

Primersrandmicos

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RAPD (DNA Polimrfico Amplificado Aleatoriamente)

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RAPD (DNA Polimrfico Amplificado Aleatoriamente)

Identificao dos nveis de diversidade gentica populacional
Bryconcephalus (matrinchdaAmaznia)

Estao de piscicultura CEPTA RioAmazonas

estoquenatural(S)

diversidade gentica

estoquescultivados

diversidade gentica

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(a)PreparaodeAFLP

Enzimasde restrio(EcoR1 eMse1)eDNA ligase

DNAgenmico

Adaptadores

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(b)Restrioeligao

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(c)Amplificaoseletivacomumnucleotdeo

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(c)Amplificaoseletivacomtrsnucleotdeo

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

Alburnus alburnus

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PCR Colony
Verificar a presena do fragmento de interesse

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Hot Start PCR

DNA polimerases podem demonstrar uma pequena atividade temperatura ambiente, ambiente durante a montagem do experimento Essa in/eficiente atividade pode catalisar a extenso de qualquer extremidade 3 anelada Atividade exonuclease 5'-3' degrada qualquer extremidade 5' parcialmente anelada, destruindo o primer e o substrato molde Anelamento inespecfico de primers e templates

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Hot Start PCR

Tcnicas manuais Uso de Barreiras fsicas

Inativao reversvel da DNA polimerase

- Inibidores de ligao no covalente
1. Polipeptdio 2. Anticorpo 3. Aptamer

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In Situ PCR
PCR que ocorre dentro da clula em uma lmina. Pode ser realizada em clulas ou tecidos fixados

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PCR Inversa
Limitao da PCR convencional: as regies 5' e 3' que flanqueiam seu fragmento de DNA de interesse devem ser conhecidas Inverse PCR permite a PCR quando voc possui informao de apenas uma seqncia interna EcoR1
Digesto enzimtica

EcoR1

DNA ligase

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PCR Inversa
Sequenciamento de uma regio desconhecida
Vrios primers de espcies prximas

RegiocodificadoradogenedaMyoD
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Long PCR
PCR cuja extenso mais longa que as PCR convencionais (acima de 5 Kb); Para obteno de uma alta preciso mistura de polimerases especficas:
Ex: Proficient polymerases + Accurate polymerases (Pfu)

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PCR Multiplex
PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra

Umtubo Umtemplate Doisparesdeprimers Doisfragmentosamplificados

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Nested PCR
Variao da PCR convencional, na qual so utilizados dois pares de primers (ao invs de um), para amplificar um mesmo fragmento

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Competitive PCR
Usada para quantificao Densitometria de imagem Adiciona-se reao, uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA (competidor). Esse competidor deve conter sequncias para os mesmos primers utilizados para amplificar o alvo

Quantidade de DNA alvo pode ser determinada pela razo Alvo (T) /competidor (C)

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Touchdown PCR
Modificao da PCR convencional, que pode resultar na diminuio de amplificaes no-especficas Temperatura de anelamento: Inicialmente mais alta que a temperatura tima dos primers Diminuio de 1C a cada um ou dois ciclos, at atingir temperatura especfica Aps atingir temperatura especfica (touchdown), ela mantida nos ciclos restantes

95 30s 95 30 s, 60 30 s, 72 1min (3 ciclos) 95 30s,60 30s,72 1min(3ciclos) 95 30s,56 30s,72 1min(3ciclos) 95 30s,53 30s,72 1min(3ciclos) 95 30s,50 30s,72 1min(25ciclos) 72 5min 4 infinito
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Degenerate PCR
O que so primers degenerados? Primers que possuem um nmero de opes em vrias posies na sequncia Exemplos: 5-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-3 5-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3
A+C+G A+C+G+T A+T+G T+C+G A+T+C A+T C+G T+G A+C C+T A+G V N D B H W S K M Y R

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Degenerate PCR
Aplicaes:

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