Cintica Enzimtica

Enzimas so protenas que agem como catalisadores biolgicos: enzima Composto B (produto)
Reao catalisada pela enzima

Composto A (substrato)
Centro ativo ou stio cataltico de uma enzima a poro da molcula onde ocorre a atividade cataltica

Observe que no h consumo ou modificao permanente da enzima

Teoria da catlise
Considere as reaes:

A + B

v1 v-1

C v1 = v-1

No equilbrio da reao, as velocidades das reaes se igualam:

- concentraes de todos os reagentes no se alteram mais - pode se dizer que a reao terminou Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reao - o ponto do equilbrio atingido mais rpido - o ponto do equilbrio no se altera, ou seja [reagentes] e de [produtos] no final da reao so as mesmas da reao no catalisada - termodinmica da reao no se altera Catalisador no consumido na reao pode atuar em [ ] baixas

Teoria da catlise
O grfico mostra a variao de energia ao longo de uma reao.
Estado de transio

Energia de ativao ou barreira energtica: quantidade de energia que preciso fornecer aos reagentes para a reao ocorrer Estado de transio ou complexo ativado:

Energia

Energia de ativao

Reao no catalisada

Substrato (S)

Reao catalisada Produto (P)

Progresso da reao

forma molecular intermediria entre o reagente e o produto, existe somente no alto da barreira energtica. altamente instvel.

Um Catalisador diminui a barreira energtica criando percursos alternativos da reao para formao do estado de transio.

Algumas protenas, enzimas em especial, contm em sua molcula uma poro no proteica, que essencial para atividade biolgica.
metal Grupo prosttico cofator coenzima Distino entre cofator e coenzima depende da fora de ligao com a apoprotena. Ex: o NAD+ pode ser cofator de uma enzima (ligao fraca) e ser coenzima de outra (ligao forte). O mesmo ocorre com os metais.

Enzima
holozima

Apoenzima
parte proteica

ativa
Grupo Prosttico

Coenzima

Reao com CO2 Grupos acil H e grupos alquil xido-reduo xido-reduo Grupos aminos Grupos aldedos unidades C

Vitamina Biotina c. Pantotnico Vitamina B12 Riboflavina Niacina Piridoxina Tiamina cido flico

inativa

Biocitina Coenzima A Coenzima B12 FAD, FMN NAD, NADP Fosfato de piridoxal Pirofosfato Tiamina Tetrahidrofolato

Coenzimas participam do ciclo cataltico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos qumicos para a reao

Algumas enzimas formam intermedirios covalentes com seus substratos

Enzimas
Quimotripsina Elastase Esterases Trombina Tripsina Papana Gliceraldedo-3-PO4 desidrogenase Fosfatase alcalina Fosfoglicomutase Fosfoglicerato mutase Succinil-CoA sintase Aldolase Descarboxilases Enzimas dependentes de piridoxal fosfato

Grupo reativo no stio ativo

Intermedirio covalente

Enzimas com o mesmo tipo de mecanismo cataltico, ou seja, possuem o mesmo grupo de aminocidos no stio ativo, formam intermedirios covalentes similares

Enzimas so especficas para o reconhecimento de seus substratos.

Modelo Chave-Fechadura Emil Fisher (1950) Modelo chave-fechadura o reconhecimento (especificidade) do substrato pela enzima. o stio ativo da enzima pre-formado e tem a forma complementar molcula do Substrato, de modo que outras molculas no teriam acesso a ela. No entanto, o modelo chave-fechadura no explica a interao das enzimas com inibidores e anlogos dos substratos. Daniel Kosland (1970) Modelo de encaixe induzido o contacto com a molcula do substrato induz mudanas conformacioais na enzima, que otimizam as interaes com os resduos do stio ativo.

Formas rgidas

Modelo Chave-Fechadura
E e S se deformam, para otimizar o encaixe

Carboxipeptidase A uma enzima digestiva da classe das metaloproteinases.

Em A: o stio cataltico dessa enzima formado pelos resduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, direita) e de Glu270 (centro), e um tomo de Zn2+, que est acima do Glu270.

Em B: A ligao do substrato dipeptdico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudana conformacional nas vizinhanas do stio ativo da carboxipeptidase A.

Mecanismo de ao da quimotripsina, quimotripsina um exemplo tpico de uma serino protease

Enzima interage com substratos aromtcos Ligao a ser hidrolisada A H2O entra no stio ativo e forma uma ponte de H+ com a His-57

Trade cataltica Ser His - Asp

A Ser-195 transfere H+ para His-57 formando um estado de transio tetradrico com o substrato. O Asp-102 estabiliza o prton na His57 fazendo uma ligao inica

A H2O transfere H+ para a His-57 e OH para o substrato, formando um segundo estado de transio tetradrico

O H+ transferido da His57 para o substrato. A ligao susceptvel clivada, e parte do substrato fica ligado covalentemente enzima

CINTICA ENZIMTICA
Victor Henri (1903): E + S ES
Afirmou que um complexo enzima-substrato um passo essencial na catlise enzmtica

1913 Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra

K1

E+S
K-1 Etapa rpida

ES

Kp

E+P
Etapa lenta

A velocidade da reao apresenta trs regies de comportamento diferente, a medida que se aumenta a concentrao do substrato:
-parte a: v aumenta proporcionalmente com aumentos de S. -parte b: v aumenta no proporcionalmente com aumentos de S. -parte c: v no aumenta mais, tendendo a um valor mximo (Vmax), sendo independente da [S]

O grfico mostra um conjunto de reaes que esto acontecendo simultneamente, conforme as equaes abaixo:

Enzimas Componentes da Reao

K1 K3

E+S
e-x s-x

K2

ES
x

P+E

K1 = Cte de velocidade de formao do complexo K2 = Cte de velocidade de dissociao do complexo K3 = Cte de velocidade de cecomposio do complexo formando o produto v = Velocidade de formao do produto s = Molaridade inicial do substrato e = Molaridade inicial da enzima x = Molaridade do complexo no instante t

ENZIMAS CINTICA ENZIMTICA

Cintica Enzimtica Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores; Conhecer as condies timas da catlise; Ajuda a elucidar os mecanismos de reao; Determinar a funo de uma determinada enzima em uma rota metablica.

Enzimas Cintica enzimtica

E+S
K1 K2

ES

K3 K4

E +P

Estabilidade do complexo ES pode ser expressa pela relao entre as velocidades de dissociao e de formao do complexo Especfico para cada enzima

Km =

K2+ K3 K1

Cintica Enzimtica
Atividade Enzimtica
Estudante A

Com o aumento na concentrao do substrato, observa-se uma mudana na Atividade Enzimtica

Juang RH (2004) BCbasics

Nota

Estudante B Estudante C

1 2 3 4 Captulos Prova

Concentrao Substrato

S + E P
(em u m perodo fixo de tempo) 8 80 60 40 20 8

Produto

Aumento na Concentrao do Substrato

Substrato (mole)
4 6

Cintica Enzimtica
Teoria do Regime Estacionrio

E +P
Juang RH (2004) BCbasics

No estado estacionrio, a produo e o consumo do estado de transio d-se na mesma taxa. Desta forma, a [ ] no estado de transio mantm-se cte.

Concentrao do complexo ES em regime estacionrio S

Concentrao

ES E
Tempo de Reao

Cintica enzimtica
K1 E+S K2 ES K3 E +P

Michaelis e Menten expressaram matematicamente a velocidade da reao pela frmula:

V=

Vm . [S] Km +[S]

Onde Vm velocidade mxima da reao

Cintica enzimtica
V
V mx
Vmax 2

Km= [S]

[S]

Numericamente, Km pode ser expresso como o [substrato] necessria para que a velocidade da reao seja metade da velocidade mxima

A constante de Michaelis-Menten (KM) um parmetro cintico que traz informaes sobre a afinidade que a enzima tem pelo substrato. O KM numricamente igual [substrato] que produz metade da Vmax . Substituindo na equao v por Vmax/2, vemos:

KM = k-1+ k2 k1

Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S] 2 2 Km + [S] Vmax.Km + Vmax.[S] = 2Vmax.[S] Vmax.Km = Vmax.[S] Km = [S]

Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:

1.

E tem baixa afinidade por S Quando Vd mais alta do que Vf k-1+ k2 = grande k1 = pequeno Km alto

2.

E tem alta afinidade por S Quando Vf mais alta do que Vd k-1+ k2 = pequeno k1 = grande Km baixo

Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax atravs do grfico dos duplos recprocos (1/V x 1/S), e da equao de Lineweaver-Burk. Aplicando-se o
inverso a ambos os lados da equao de Michaelis-Mentem, obtem-se a equao de Lineweaver-Burk, que uma funo linear (uma reta):

Tang

=KM/Vmax

A interseo da reta com o eixo x igual a -1/KM substituindo y = 0 na equao, temos: 0 = Km . 1 + 1 Vmax [S] Vmax -1 = Km [S] -1 = Km -1 = Km . 1 Vmax Vmax [S] 1 [S]

y = a . x + b
Onde:

equao de reta

a = coef. angular = Km/Vmax (tangente ngulo alfa) b = coef. linear = 1/Vmax (interseo com o eixo y)

A velocidade da reao somente proporcional [E] quando a enzima est saturada, ou seja, reao de ordem zero (independe) em relao a [S]

Eficincia cataltica Kcat/Km

- k2 ou kcat (constante cataltica) mede o poder cataltico da enzima

v = k2 Etotal + [P] [ES]

k2 = Vmax (s-1) [Etotal]

Parmetro mais adequado para comparaes cinticas

Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax

Exemplo de Cintica Enzimtica (Invertase)

1) Usar uma qtidade pr-defininada de Enzima E 2) Adicionar o Substrato em vrias concentraes. S (x ) 3) Medir o produto em um Tempo fixo (P/t) vo (y ) 4) (x, y) Plote (curva hiperblica), estimar Vmax 5) Quando y = 1/2 Vmax obtm x ([S]) Km 1 vo
-1 Km 1 Vmax

Vmax vo 1/2

Dobro recproco

1/S

Km Plotagem

Exemplo real de cintica Enzimtica

Data
Substrato Produto no Velocidade Dobro recproco

1 2 3 4

[S] Absorbncia v (mole/min) 0.25 0.21 0.42 0.50 0.36 0.72 1.0 0.40 0.80 2.0 0.46 0.92

1/S 4 2 1 0.5

1/v 2.08 1.56 1.35 1.16

(1) O produto foi medido por espectroscopia a 600 nm (2) (2) Tempo de reao 10 min

Lineweaver-Burk

Plotagem Direta

1.0 v 0.5

Dobro recproco

2.0 1/v 1.0

1.0 -3.8
-2 0 2 4

[S]

-4

1/[S]

Cintica Enzimtica
Plotagem Direta

kcat / Km kcat
No Turn over

Vmax [S] vo= Km + [S]

Significncia

zero order 1st order Observe de vo sob Vrios [S], resultou na plotagem do rendimento Vmax and Km E3 E2 E1

k3 [Et]
Unid. de Atividade

Vmax
Mxima

&

Km
Competitivo

Velocidade Afinidade com Duplo recproco Substrato Inibio

1 mole min
Ativ. Especifica

No-competitivo

unit mg

Atividade

NMERO DE RENOVAO (TURNOVER NUMBER) n de mols de substrato convertido em produto por mol de enzima em unidade de tempo

Imcompetio

Concluses sobre Km
Km Pequena [substrato] necessria para a reao atingir metade da Vmxima Afinidade da enzima pelo substrato Grande [substrato] necessria para a reao atingir metade da Vmxima

Km

Afinidade da enzima pelo substrato

Concluses sobre Km
Km Km
v V

Afinidade da enzima pelo substrato Afinidade da enzima pelo substrato

Vmx V

V/2 V/2

ENZIMAS
1/V Km Km Km Km s [s] -1/Km -1/Km

1/s

Concluses sobre Km
Caracterstico de cada enzima Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato numericamente IGUAL a [substrato] na qual a velocidade da reao metade da Vmxima

Ordem de Reao

Influncia da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica

Mantidas fixas as condies de - temperatura tima - pH timo - [enzima]
Velocidade da reao

Cintica de ordem zero Cintica de 1a ordem

[S]

Influncia da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica

Baixa concentrao de substrato S

S +

E E

E E

E E

E E

E E

E E

P P

Formao do produto PROPORCIONAL concentrao de substrato

Influncia da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica

3/4 de saturao do centro ativo da enzima S S + S
E E E E

S S

E E

E E

E E

E E

P P P

P P P

100 % de saturao do centro ativo da enzima S S + S S

E E E E

S S

E E

E E

S S

E E

E E

P + P P P

P P P P

Formao do produto PROPORCIONAL concentrao de substrato

Influncia da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica

[Substrato] em excesso S

S S S S + S S S

E E

E E

S S S

E E

E E

S S

E E

E E

P + P P P S S

P P P P S S

S S

Velocidade da reao independe da [S]

Influncia da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica

Quando a formao de P for proporcional [S] a reao de 1a ORDEM
Velocidade da reao

Quando a velocidade da reao independe da [S] a reao de ORDEM ZERO

v = Vmax v = K[S]

[S]

Cintica Enzimtica
Devido ascenso gradual da curva hiperblica difcil determinar quando foi atingida a Vmx
Velocidade da reao

No se pode calcular com exatido os valores de Km e Vmx

[S]

Consideraes Finais
Apresentam alto grau de especificidade; So produtos naturais biolgicos; Reaes baratas e seguras; So altamente eficientes, acelerando a velocidade das reaes (108 a 1011 + rpida); So econmicas, reduzindo a energia de ativao; No so txicas; Apresenta um mercado em crescente expanso

Perguntas ?

Para mais informaes, visite as pginas abaixo:

http://www.brenda.uni-koeln.de/ http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/ http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid