Apostila - Curso Doencas Eeneticas PDF

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Curso de atualizao

DOENAS GENTICAS:
o que h de novo?

Centro de Estudos do Genoma Humano
Depto. de Gentica e Biologia Evolutiva
Instituto de Biocincias
Universidade de So Paulo

17 a 21 de julho de 2006
2

ndice

Apresentao........................................................................................................................3
Cronograma............................................................................................ .............................5
Introduo s atividades em sala de aula.............................................................................6
Atividade 1, Resgatando conceitos , Oficina 1......................................................................7
Atividades 2 e 3.....................................................................................................................8
Atividades 4 e 5 ....................................................................................................................9
Oficina 2 ..............................................................................................................................10
Oficina 3...............................................................................................................................12
Oficina 4...............................................................................................................................16
Atividade 7...........................................................................................................................18
Prtica 1 . Isolamento de DNA.............................................................................................19
Prtica 2.- Eletroforese........................................................................................................20
Prtica 3 Interpretao se separao eletrofortica de DNA............................................21
Exerccios de Southern........................................................................................................23
Atividade 8 ..........................................................................................................................25
Estudo de heredogramas ....................................................................................................26
Exerccios Diagnstico de doenas genticas .................................................................30
O dogma central da Biologia ...............................................................................................33
A transcrio do DNA...........................................................................................................33
O cdigo gentico efeito de mutaes .............................................................................41
A sntese de protenas ........................................................................................................47
Digesto de cidos nuclicos ..............................................................................................52
Eletroforese .........................................................................................................................52
Southern blotting .................................................................................................................54
A reao em cadeia da polimerase ..56
Conceitos gerais de gentica bsica aplicveis gentica humana e mdica ..................58
Anlise de heredogramas ...................................................................................................65
O DNA mitocondrial humano ..............................................................................................73
As bases cromossmicas das doenas genticas .............................................................75
Diagnstico molecular de doenas genticas .....................................................................84
Aconselhamento gentico ...................................................................................................92
Diagnstico pr-natal ..........................................................................................................96
Leituras complementares ..................................................................................................101
Anexo 1 .............................................................................................................................102
Anexo 2 .............................................................................................................................103
Anexo 3 .............................................................................................................................105
Anexo 4..............................................................................................................................110

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Apresentao

DIAGNSTICO E J USTIFICATIVA
A sociedade moderna mantm um estreito relacionamento com a Gentica, rea do
conhecimento que apresentou nos ltimos anos revolucionrios avanos tecnolgicos, e que
faz parte do cotidiano da grande maioria dos cidados. Assim sendo, a compreenso de seus
princpios bsicos fundamental para que todos estejam preparados para opinar de modo
informado e conseqente frente s inovaes introduzidas por essa cincia na sociedade. Este
curso pretende levar os professores de Biologia a relacionar-se com o contedo escolar de
Gentica de maneira ldica, prazerosa e participativa, propiciando desta forma uma maior
apropriao e compreenso dos conceitos e procedimentos envolvidos.

OBJ ETIVOS
Atualizar os conceitos de Gentica Humana
Estudar os padres de herana trazendo para o concreto as relaes entre os
diferentes processos da hereditariedade
Compreender a relao entre gentipo e fentipo
Interpretar observaes e resultados moleculares de natureza experimental
Solucionar problemas sobre o emprego da moderna tecnologia da Gentica Molecular
Utilizar o tema "Doenas Genticas como eixo para a integrao de conceitos
clssicos da Gentica e seus aspectos moleculares, bem como ponto de referncia
para a anlise e discusses no campo da biotica e do aconselhamento gentico.
Considerar o papel do professor em sala de aula como "Agente disseminador de
temas que permeiam a discusso de valores ticos e sociais e que exigem um
posicionamento crtico acerca de situaes relacionadas rea de Cincias da
Natureza e suas tecnologias.

ESTRATGIAS E RECURSOS TECNOLGICOS
No curso sero utilizadas diversas estratgias tais como estudos dirigidos, discusses em
grupo, resoluo de exerccios, prticas de laboratrio, atividades ldicas presenciais,
animaes demonstrativas de fenmenos biolgicos, aulas dialogadas e expositivas.

FORMAS DE ACOMPANHAMENTO E DE AVALIAO DOS PARTICIPANTES
A avaliao ser constituda por duas ferramentas:
Avaliao formativa: elaborao de portiflio dirio. O aluno dever registrar as
atividades desenvolvidas durante o dia e o seu envolvimento nas mesmas
respondendo diariamente as seguintes questes: (1) O que aprendi hoje? O que as
atividades me acrescentaram? (2) O que no foi adequado? Considerar nas respostas:
o contedo da aula, as atividades e estratgias utilizadas, o relacionamento com o
grupo e a prpria participao.
Avaliao final: Cada participante dever fazer uma breve apresentao individual com
relao a : (a) Quais os contedos/atividades desenvolvidas durante o curso que
poderiam ser levadas para a escola? Por qu? (b) De que maneira isso poderia ser
feito?

RELAO NOMINAL DOS PROFESORES:
Eliana Maria Beluzzo Dessen
Regina Clia Mingroni Netto
Lyria Mori
Lygia Pereira da Veiga

MONITORES:
Douglas Silva Domingues
Sabrina Ribeiro de Paula

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ORGANIZAO DO CURSO
Carga horria total
o 40 horas

a) Sistemtica de desenvolvimento de atividades presenciais
As atividades desenvolvidas pretendem fornecer a contextualizao necessria
para retirar o aluno da condio de espectador passivo e facilitar o aprendizado
significativo dos princpios da Gentica clssica para melhor compreender a
Gentica Molecular
As atividades de laboratrio, ldicas presenciais e discusses sero
desenvolvidas em grupos com 4 alunos, distribudos em duas salas de aula. As
atividades sero orientadas por docentes e monitores do curso.
b) Distribuio da carga horria por tipo de atividade
As atividades desenvolvidas durante as 40 horas do curso esto detalhadas no
cronograma. Resumidamente o tempo ser distribudo como se segue:

o Aulas de laboratrio 18%
o Atividades ldicas presenciais 30%
Discusses 17%
Resoluo de exerccios - 5%
Avaliao final 5%

AVALIAO

Formativa
Elaborao de portiflio: o que aprendi hoje e o que as atividades acrescentaram
minha rede de conhecimento
Aspectos a serem considerados: contedo da aula, atividades e estratgias e
relacionamento.

Avaliao final:
Breve apresentao individual (tempo 3 minutos): o que levaria para a escola (qual
atividade e como faria).
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Cronograma

Dia

Horrio Programa

17/07/2006
manh

8:30 s 9:00

Recepo e recebimento de material
9:00 s 9:30 Apresentao do curso
9:30 s 10:45 Oficina: Recuperando conceitos: DNA, cromossomo, gene, alelo,
organizao da cromatina

10:45 s 11:10 Intervalo para caf
11:15 s 12:30 Revendo conceitos: DNA, cromossomo, gene, alelo, organizao da
cromatina

17/07/2006
tarde

13:30 s 15:15
Estudo dirigido: Revendo conceitos: a biologia molecular do gene
15:45 s 17:30 Estudo dirigido: Revendo conceitos: a biologia molecular do gene.
Apanhado geral.

18/07/2006
manh
8:30 s 10:15 Oficina: A famlia Silva e seus genes

10:45 s 12:30 Oficina: A famlia Silva e seus genes

18/07/2006
tarde
13:30 s 15:15

Oficina: A meiose e as leis de Mendel
15:45 s 17:30 Oficina: A meiose e as leis de Mendel

19/07/2006
manh
8:30 s 10:15 Prtica: Extrao de DNA, digesto com enzimas de restrio,
eletroforese

10:45 s 12:30

Southern blot, PCR

19/07/2006
tarde
13:30 s 15:15 Padres monognicos de herana: estudo dirigido, estudo de
heredogramas

15:45 s 17:30 Complicaes nos padres genealgicos bsicos: penetrncia
incompleta, expresso varivel, manifestao tardia.

20/07/2006
manh
8:30 s 10:15 Complicaes nos padres genealgicos bsicos: herana
mitocondrial, antecipao.

10:45 s 12:30 Diagnstico de doenas genticas

20/07/2006
tarde
13:30 s 15:15 Aconselhamento gentico

15:45 s 17:30 Projeto Genoma Humano

21/07/2006
manh
8:30 s 10:15

Projeto Genoma Humano
10:45 s 12:30 Problemas ticos atuais relacionados Gentica Humana

21/07/2006
tarde
13:30 s 14:45 A problemtica do ensino de Biologia nos Ensinos Fundamental e
Mdio
15:15 s 17:30 Avaliao

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ATIVIDADES

EM SALA DE AULA

As atividades em software 1 a 7 e as oficinas 1 e 2 (pginas 7 a 18) tm por objetivo
fazer uma reviso dos conceitos bsicos de organizao e funcionamento do material
gentico fundamentais para a compreenso dos mecanismos de origem e transmisso
das doenas genticas.

As prticas 1, 2, 3, os exerccios sobre Southern e a atividade 8 (pginas 19 a 25)
referem-se metodologia de manipulao do DNA. Tais tcnicas so utilizadas para
possibilitar o diagnstico das alteraes moleculares presentes no genoma de
portadores de alteraes genticas.

Exerccios de interpretao de heredogramas (pginas 26 a 29) e de diagnstico de
doenas genticas (pginas 30 e 31).

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Questo 1.
Anote as principais dvidas que voc teve ao assistir esse DVD.

1a. Responda as questes distribudas em classe (anexo 1).

1. Represente com massa de modelar, sobre uma folha de papel, um par de
cromossomos homlogos no perodo G1 da interfase (antes da duplicao do DNA).
2. Represente separadamente, o mesmo par de cromossomos no perodo G2 (aps a
duplicao do DNA).
3. Represente separadamente, o mesmo par de cromossomos em metfase mittica. A
seguir, represente um gene em heterozigose, nas trs fases anteriores.
4. Qual a constituio qumica dos cromossomos?
5. Como est organizado o DNA dos cromossomos em cada uma das fases
representadas? Desenhe, esquematicamente, ao lado dos modelos.
6. Desenhe, esquematicamente, ao lado dos modelos, a estrutura molecular de um gene.
7. Desenhe a diferena que pode haver entre os dois alelos do gene representado.
8. Redija um texto relacionando os conceitos envolvidos na atividade: cromossomos,
DNA, cromtide, gene e alelo (10 linhas no mximo).
9. Relacione as dvidas que ainda restaram aps a realizao da atividade.
10. Lembre-se que toda dvida vlida, no existem perguntas bobas.
11. Relacione os conceitos que no estavam claros para algum integrante do grupo e que
foram resolvidos durante a discusso.

Oficina 1 - Resgatando conceitos
Atividade em software 1: http://www.genome.gov/education/on line.htm
Resgatando conceitos: DNA, cromossomos, genes, alelos

8

Assista a animao referente a representao tridimensional do empacotamento do DNA
nuclear nos cromossomos.

Questes 2. Assista a animao e responda:
2.1. Qual o primeiro nvel de empacotamento do DNA? Qual o grau de empacotamento
nesse primeiro nvel?
2.2. O que cromatina?
2.3. Qual a relao entre cromossomo e cromatina?
2.4. Qual o grau de empacotamento do DNA na interfase?
2.5. Como est organizado o DNA no cromossomo?
2.6. Quantas molculas de DNA existem em cada cromossomo?

Assista a animao e responda:

Questes3.
3.1. O que uma unidade de transcrio?
3.2. Quais so os trs elementos essenciais numa unidade de transcrio?
3.3. O gene pode ser definido como uma unidade de transcrio?
3.4. O promotor faz parte do gene?
3.5. Como iniciada a transcrio em um gene procaritico?
3.6. O que sinaliza a parada da transcrio?

Atividade 1 em software: http://www.genome.gov/education/on line.htm
Atividade em software 2: Nveis de organizao da cromatina
http://www.whfreeman.com/biology
clicar em: Genetics - a conceptual approach. Pierce
clicar em Cap. 11 Levels of chromatin structure
Atividade em software 3. Transcrio gnica
clicar Captulo 13: Bacterial transcription
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4.1. Compare a organizao de um gene procaritico com a de um gene eucaritico.
4.2. Imediatamente aps a transcrio dos genes eucariticos os RNAs transcritos podem ser
traduzidos?
4.3. O que so ntrons?
4.4. O que so xons?
4.5. Qual a conseqncia de falha no processamento dos ntrons nos RNAs dos eucariotos?
4.6. Qual a conseqncia de falha no encapamento da extremidade 5 nos RNAs dos
eucariotos?
4.7. Qual a conseqncia de falha no encapamento da extremidade 3nos RNAs dos
eucariotos?


5.1. Quais so os principais componentes na traduo de um RNA mensageiro? Qual o papel
de cada um desses componentes?
5.2. Como a iniciao da traduo?
5.3. Descreva o processo de elongao da cadeia polipetdica.
5.4. Como ocorre a parada da sntese de protenas?
5.5. Verifique qual o efeito da seguinte mutao na regio de cdigo do gene:
a) deleo de trs nucleotdeos
b) deleo de um nucleotdeo
c) troca de um nucleotdeo (G)
d) troca de um nucleotdeo (U)
e) insero de um nucleotdeo (G)
f) insero de dois nucleotdeos (GG)

Atividade em software 4. O gene eucaritico. Processamento do RNA
mensageiro
http://www.whfreman.com/biology
clicar Captulo 14. Overview of mRNA processing
Atividade em software 5. Traduo. Efeitos das mutaes nas
protenas codificadas pelo gene
http://www.whfreman.com/biology
clicar em Cap. 11 The genetic code and translation. Bacterial translation.
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Questes da oficina 2:
12. Desenhe o gene que originou esse RNA mensageiro.
13. O que protena?
14. Qual o efeito da troca do nucleotdeo contendo a base G por um contendo a base C
no cdon de trmino?
15. Onde ocorrem as mutaes?
16. Comente a afirmao: um gene-um polipeptdeo.
17. Qual a relao entre a forma da protena e a funo que ela desempenha?
18. Qual a relao entre protena e fentipo?
Oficina 2: Trabalhando com um modelo para a sntese de protenas
(Amabis e Martho/Editora Moderna)
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Questes 6.

6.1. Assista a animao da interao entre alelos RR e responda:
a) Qual a caracterstica da protena codificada pelo alelo R?
b) Qual o fentipo do indivduo homozigtico para o alelo R?

6.2. Assista a animao da interao entre alelos rr e responda:
a) Qual a caracterstica da protena codificada pelo alelo r?
b) Qual o fentipo do indivduo homozigtico rr?
c) Correlacione o fentipo do homozigtico rr com as enzimas produzidas por esse
alelo.

6..3 Assista a animao da interao entre alelos Rr e responda:
a) Qual o fentipo do indivduo heterozigtico Rr?
b) Qual dos alelos, R ou r, dominante? Que resultado possibilita chegar a essa
concluso?
c) Do ponto de vista molecular como o organismo heterozigtico Rr?
d) O alelo R impede de alguma forma o alelo r de se manifestar?
Atividade em software 6. Do gene ao fentipo. Interao entre alelos.
Clicar em Cap. 14 Interaction between alleles at the molecular level
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PROCEDIMENTO

PARTE 1 Determinao dos fentipos dos pais

1.1. Observar a aparncia (fentipo) do casal que est sobre a mesa do professor(a).
1.2. Anotar na Tabela I o fentipo do homem e da mulher com relao s seguintes
caractersticas: pigmentao da pele, lbulo da orelha preso ou solto, dentio normal
ou hipodontia, nmero de dedos nas mos e calvcie precoce.

Tabela I Fentipos e gentipos possveis dos pais

1.3. Observar, na Tabela II, em anexo, a descrio das caractersticas, os gentipos
(constituio gentica) possveis para cada uma delas e a maneira como elas so
transmitidas para os filhos desse casal.
1.4. A partir das informaes contidas na Tabela II preencher a Tabela I com os possveis
gentipos do casal.
1.5. Considerar que os gentipos dos pais sejam os abaixo relacionados.

Caractersticas

Pai

Me
fentipo gentipos
possveis
fentipo gentipos
possveis
Pigmentao da
pele
(albinismo)

Lbulos das
orelhas

Ausncia de
incisivos
(hipodontia)

Nmero de dedos
nas mos

Calvcie precoce

Pai Me
Heterozigtico para albinismo
Heterozigtico para lbulo da orelha

Heterozigtico para hipodontia
Homozigtico dominante para polidactilia
Homozigtico C
2
Heterozigtica para albinismo
para calvcie precoce
Homozigtica recessiva para lbulo da orelha
Homozigtica recessiva para hipodontia
Homozigtica recessiva para polidactilia
Heterozigtica para calvcie precoce
Oficina 3: A famlia Silva e seus genes.
(Atividade completa no site http://www.ib.usp.br/microgene/

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1.6. O saco escrito PAI contm a composio allica do Sr. Silva. Cada ficha colorida
representa um alelo relacionado a uma caracterstica especfica. As fichas verdes, por
exemplo, representam os alelos para a caracterstica albinismo (A e a) e as fichas
vermelhas representam o par de cromossomos sexuais (X e Y) que determinaro a
caracterstica sexo.
1.7. O saco escrito ME contm a composio allica da Sra. Silva. Cada ficha colorida
representa um alelo relacionado a uma caracterstica especfica. As fichas amarelas,
por exemplo, representam os alelos para a caracterstica nmero de dedos nas mos
(P e p).
Tabela II Caractersticas fenotpicas e alelos correspondentes

CARACTERSTICA FENOTPICA
E
PADRO DE HERANA

CONSTITUIO
GENTICA
(gentipo)

APARNCIA
FSICA
(fentipo)

ALBINISMO (PELE SEM
PIGMENTAO)
Essa caracterstica decorre do
bloqueio da sntese de melanina. Os
indivduos afetados apresentam a
pele, cabelos e ris sem pigmentao.
Herana autossmica recessiva.

AA (homozigtico)
Aa (heterozigtico)
aa (homozigtico)

normal
normal
albino

LBULOS DAS ORELHAS
Nos indivduos heterozigticos os
lbulos das orelhas so soltos e nos
homozigticos recessivos,
presos.Herana autossmica
recessiva.

LL (homozigtico)
Ll (heterozigtico)
ll (homozigtico)

lbulos soltos
lbulos soltos
lbulos presos

AUSNCIA DE INCISIVOS
(HIPODONTIA)
Indivduos afetados para hipodontia
no possuem os dentes incisivos.
Herana autossmica dominante.

Hh (heterozigtico)
hh (homozi gtico)

incisivos
ausentes
incisivos
presentes

NMERO DE DEDOS A MAIS
(POLIDACTILIA)
Caracteriza-se pela presena de um
maior nmero de dedos. Herana
autossmica dominante.

PP (homozigtico)
Pp (heterozigtico)
pp (homozigtico)

polidctilo
polidctilo
normal

CALVICIE PRECOCE
Manifesta-se como dominante nos
homens e recessiva nas mulheres.
Herana autossmica

C
1
C
1
C
(homozigtico)
1
C
2
C
(heterozigtico)
2
C
2

(homozi gtico)

e calvos
calvo normal
e normais

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PARTE 2 - Formao dos gametas (espermatozide e vulo) dos pais

2.1. A partir dos alelos presentes em um indivduo, a composio allica de um
gameta determinada ao acaso. Na formao dos gametas, os alelos
relacionados com cada uma das caractersticas (Tabela II) comportam-se de
maneira independente. Por essa razo, para cada uma das caractersticas o
alelo que far parte de um determinado gameta pode ser sorteado de modo
independente.

2.2. Considerando a composio gentica do pai, e utilizando as fichas do saco PAI
construir um gameta paterno (espermatozide) como indicado a seguir:

2.2.a. Determinar, inicialmente, se o gameta ser portador do cromossomo Y ou
de um cromossomo X. Retirar do saquinho sexo uma ficha e coloc-la, no
crculo vermelho da estrutura que representa o espermatozide.
2.2.b. Repetir esse procedimento para cada uma das caractersticas, usando as
fichas dos saquinhos correspondentes.

2.3. Considerando a composio gentica da me e utilizando as fichas do saco
ME construir um gameta materno (vulo). Retirar do saquinho sexo uma
ficha e coloc-la, no circulo vermelho da estrutura que representa o vulo. Para
as demais caractersticas repetir o procedimento do item 2.2b.

PARTE 3 - Formao do zi goto e do fentipo do(a) filho(a)

3.1. A unio entre o vulo e o espermatozide corresponde fecundao e origina o
zigoto. Simulando a fecundao: colocar o espermatozide dentro da estrutura
que representa o vulo para que, assim, forme-se o zigoto.

3.2. Considerando a constituio gentica do zigoto e utilizando as peas da cartela
das caractersticas, construir, usando um boneco, o fentipo do filho(a) do casal

PARTE 4 - Anlise dos resultados

4.1. Comparar o descendente produzido pelo seu grupo com os descendentes
construdos pelos demais grupos da classe.
a) Anotar a proporo de descendentes masculinos e femininos obtidos.
b) Anotar, para cada uma das demais caractersticas, a proporo de
aparecimento dos respectivos fentipos.
c) Verificar se houve diferenas entre as propores dos fentipos nas
diferentes caractersticas. Em caso afirmativo, formular hipteses que
expliquem essas diferenas.
.
4.2. Verificar que outros tipos de gametas podem ser formados a partir da constituio
gentica do casal.

4.3. A partir da constituio gentica do casal, calcular a probabilidade de
aparecimento na descendncia de:
a) uma criana albina.
b) um menino calvo.
c) uma menina com os lbulos da orelha presos.
d) um menino albino com os lbulos da orelha presos.

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PARTE 5 - Correlacionando conceitos

1. A parte 2 dessa atividade refere-se formao dos gametas, vulos e espermatozides.
As fichas representam os alelos, ou seja, as formas alternativas de um gene (A ou a, P ou
p, etc). Na clula:
a) onde esto localizados os alelos?
b) qual a composio qumica dos alelos?
c) que tipo de informao est contida num alelo?
d) que tipo de diferena voc imagina que haja entre um alelo e outro?

2. O que ocorre com o nmero de cromossomos no processo de formao dos gametas?

3. A parte 3 dessa atividade refere-se formao do zigoto. O que ocorre com o nmero de
cromossomos no processo de fecundao?

4. Na clula, qual o processo responsvel pela reduo do nmero de cromossomos na
formao dos gametas?

5. Quantas formas allicas de um gene existem em cada uma das clulas somticas de um
ser humano? E em seus gametas?

6. A informao gentica est contida no DNA. Na clula, onde est localizado o DNA?

7. A informao gentica est contida no DNA. Em que linguagem qumica essa informao
est escrita?

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PROCEDIMENTO

PARTE I - Clula com um par de cromossomos, heterozigtica para um gene (Aa)
1. Desenhar um crculo em um papel, representando os limites da clula que ir
sofrer meiose. Lembre-se de que a membrana do ncleo se desfaz quando a clula
entra em diviso.
2. Fazer dois rolinhos de massa de modelar, de cores diferentes, com cerca de 10 cm
de comprimento e 0,5 cm de dimetro representando o cromossomo de origem
materna e o cromossomo de origem paterna.
3. Aplicar nos bastes de massa os pinos de plstico marcados com as letras A e a,
representando os alelos do gene em questo.
4. Duplicar cada cromossomo, materno e paterno, fazendo, com a massa de modelar,
dois novos rolinhos em massa da cor correspondente.
5. Unir os rolinhos da mesma cor pelos centrmeros.
6. Colocar o alelo correspondente nas novas cromtides formadas.
7. Com os bastes de massa representando os cromossomos duplicados, simular:
a) o emparelhamento dos cromossomos homlogos,
b) a primeira diviso da meiose,
c) a segunda diviso da meiose.

PARTE II - Cl ula com dois pares de cromossomos, heterozigtica para dois genes
localizados em cromossomos diferentes (AaBb)

1. Utilizar quatro bastes de massa de modelar para representar dois pares de
cromossomos homlogos. Usar cores diferentes para os cromossomos de origem
paterna e materna e para os diferentes pares de cromossomos homlogos. A
clula a ser considerada tem nmero diplide de cromossomos igual a quatro (2n =
4 cromossomos).
2. Moldar um par de cromossomos metacntricos (centrmero no meio) e um par de
cromossomos acrocntricos (centrmero na extremidade).
3. Aplicar nos bastes de massa que representam os cromossomos metacntricos, os
pinos de plstico marcados com as letras A e a. Nos bastes de massa que
representam os cromossomos acrocntricos aplique os pinos com as letras B e b.
4. Duplicar cada cromossomo, materno e paterno, fazendo, com a massa de modelar,
quatro novos rolinhos da cor correspondente.
5. Unir os rolinhos da mesma cor pelos centrmeros.
6. Colocar o alelo correspondente nas novas cromtides formadas.
7. Com os bastes de massa representando os cromossomos duplicados simular:
a) o emparelhamento dos cromossomos homlogos, sem permutao entre os
cromossomos homlogos
b) a primeira diviso da meiose,
c) a segunda diviso da meiose

ENTENDENDO A ATIVIDADE

1. Na seo I.2, o que representa cada um dos rolinhos de massa de modelar?
Quantas molculas de DNA formam o cromossomo nessa fase? Explique.
2. Na sua simulao identifique:
a) os cromossomos homlogos,
b) as cromtides irms.

Oficina 4. Meiose e as leis de Mendel
(atividade completa no site http://www.ib.usp.br/microgene/

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3. Quando o alelo presente em uma cromtide A na cromtide-irm tambm est o
alelo A. Por que?
4. Quantas possibilidades de posicionamento so possveis quando dois pares de
cromossomos homlogos emparelhados esto na metfase da primeira diviso da
meiose?
5. Compare o comportamento dos cromossomos na meiose com a segregao dos
alelos:
a) na primeira diviso meitica.
b) na segunda diviso meitica.
6. Quantos e quais tipos de gametas foram formados na meiose de uma clula duplo-
heterozigtica (AaBb)?
7. Segundo a lei da segregao independente (2 lei de Mendel), quantos e quais
tipos de gametas so produzidos por um indivduo duplo-heterozigtico AaBb?
8. Simule uma permutao entre o par de alelos A e a e o centrmero. Quantos e
quais tipos de gametas foram formados?
9. possvel afirmar que a 1 lei de Mendel resultado direto da separao do par de
cromossomos homlogos para clulas opostas na 1 diviso meitica? J ustifique
10. possvel afirmar que a 2 lei de Mendel resulta do comportamento independente
de um par de cromossomos homlogos em relao a outro par de homlogos na 1
diviso da meiose? J ustifique.

PROBLEMAS

1) O que herdamos, biologicamente, de nossos pais?
2) Explique como o nmero de cromossomos mantido constante nas espcies com
reproduo sexuada.
3) possvel ocorrer meiose em uma clula haplide? E a mitose possvel? J ustifique a sua
resposta.
4) A sndrome de Down o tipo mais comum e vivel das anomalias cromossmicas
humanas e ocorre em 0,15% das crianas nascidas vivas, crianas cujos pais so
cromossomicamente normais e sem qualquer histrico da sndrome na famlia. A causa
mais freqente da sndrome de Down a trissomia (trs cromossomos) do cromossomo
21. Proponha uma hiptese para explicar a possvel origem desta trissomia.
5) A autofecundao um tipo de reproduo sexuada? J ustifique a sua resposta.
6) Por que a descendncia originada de reproduo sexuada to variada? Quais so os
fatores responsveis por esta variabilidade?
7) Uma espcie de verme tem um nmero diplide de cromossomos igual a 10. Quantas
combinaes cromossmicas diferentes so possveis durante o processo de meiose para
a formao dos gametas?
8) possvel afirmar que as 1 e 2 leis de Mendel resultam do comportamento dos
cromossomos durante a meiose? J ustifique a sua resposta.

18

Questes 7.
Assista a animao Meiose e responda:
6.1. Em que momento ocorre a duplicao dos cromossomos nas clulas que vo se dividir por
meiose?
6.2. Qual o produto da primeira diviso da meiose?
6.3. O que caracteriza a segunda diviso da meiose?
6.4. Qual a diferena chave entre mitose e meiose?
6.5. Qual a conseqncia de falha na separao dos cromossomos homlogos?
6.6. Qual a conseqncia de falha no emparelhamento dos cromossomos homlogos?
6.7. O que ocorre se o emparelhamento dos cromossomos homlogos for incorreto?
6.8. Quantas possibilidades de posicionamento dos cromossomos so possveis quando dois
pares de cromossomos homlogos esto emparelhados esto na metfase da primeira diviso
da meiose? E no caso de trs pares de cromossomos?
6.9. Quantos e quais tipos de gametas so formados na meiose de uma clula duplo-
hetorozigtica (AaBb)?
6.10. Quantos e quais tipos de gametas so formados por um indivduo duplo-heterozigtico
(AaBb)?

Atividade em software 7. Meiose. Efeitos causados por erros na diviso
celular
http://www.whfreeman.com.br
clicar em Cap. 2 - Meiose
19

Procedimento
1. Pique um tomate grande em pequenos pedaos
2. Num recipiente misture 150 ml de gua, uma colher de sopa de detergente e uma
colher de ch de sal de cozinha. Mexa bem.
3. J unte a soluo descrita no item anterior com o tomate picado
4. Coloque em banho-maria a 65
o
5. Resfrie rapidamente a mistura colocando o recipiente em uma bacia de gelo. Mexa
bem
C por 30 minutos (caso no haja um banho-maria
disponvel incube temperatura ambiente por 30 minutos)
6. Coe a mistura em uma peneira e em seguida coe a soluo aquosa em um filtro para
caf. Coloque o liquido resultante em um copo ou outro recipiente transparente.
7. Despeje delicadamente sobre a soluo dois volumes de lcool comum. O DNA
comea a precipitar na interfase.

Questes da prtica 1
Os protocolos para extrao de DNA, apesar de apresentarem pequenas diferenas
dependendo do material biolgico do qual ele ser extrado, consistem basicamente de duas
etapas. Na primeira etapa, provoca-se o rompimento das membranas celulares, o que permite
a liberao do DNA. Na segunda, realizam-se um ou mais tratamentos enzimticos ou
qumicos para purificar a preparao de contaminantes.
1. O rompimento das membranas das clulas do tomate ocorre em que passo do
protocolo? Explique.
2. Na segunda etapa de um protocolo de extrao de DNA podem ser realizados
tratamentos para purificar a preparao de contaminantes. Que tipo de contaminantes
uma preparao de DNA apresenta?
3. Qual a funo do lcool nesse protocolo de extrao?
4. Considerando os procedimentos de extrao do DNA genmico voc espera obt-lo
sem quebras mecnicas e/ou qumicas?

Respostas comentadas
1. No passo 3. Os agentes mais empregados para a lise ou solubilizao das membranas
so os detergentes. Diferentes detergentes extraem diferentes tipos e quantidades de
lipdeos da membrana, juntamente com protenas. Os detergentes solubilizam ou
dispersam material insolvel em gua por meio da formao de agregados
microscpicos (micelas).
2. Os contaminantes so RNA, protenas e outras macromolculas. O RNA pode ser
eliminado por digesto com RNase. As protenas, principalmente as mais estreitamente
ligadas ao DNA (histonas), podem ser digeridas por enzimas, como a proteinase K, por
exemplo. O agente desproteinizante mais largamente utilizado o fenol, um eficiente
desnaturador de protenas. O clorofrmio tambm um agente desproteinizante muito
empregado. Aps tratamento com esses agentes, a mistura deve ser centrifugada para
separao das fases fenlica e aquosa. Na interface entre essas duas fases deposita-
se uma camada de protenas desnaturadas. Observao: No protocolo caseiro o passo
de purificao foi omitido.
3. O DNA contido na fase aquosa est dissolvido em gua. Na presena de
concentraes relativamente altas de ctions monovalentes (Na
+
4. Como o DNA genmico formado por molculas muito longas (lembre-se que cada
cromossomo formado por uma nica molcula de DNA) inmeras quebras mecnicas
so originadas nos procedimentos de extrao. As maiores molculas apresentam
tamanho de cerca de 30 kb. Por outro lado, como as drogas utilizadas na extrao no
eram puras (detergente com corantes, por exemplo) elas ocasionam quebras
adicionais nas molculas de DNA.
), o etanol induz uma
mudana estrutural transitria na molcula dos cidos nuclicos ocasionando sua
agregao e precipitao. Em outras palavras, o DNA sai de soluo e precipita.

Prtica 1 - Receita caseira para isolar DNA de tomate
20

PROCEDIMENTO

Eletroforese de corantes de alimentos
Misture 0,1 g de agarose, 10 ml de gua, 0,1 l de sal de cozinha
Aquea em forno microondas at a fervura
Despeje a soluo em uma bandeja de plstico contendo um mini pente
Aguarde a solidificao e retire, cuidadosamente, o pente.
Coloque o gel na cmara de corrida e complete com uma soluo de gua e sal at
que o gel fique submerso
Aplique, com a ajuda de uma seringa de 1ml, os corantes A, B e C em poos
separados do gel
Conecte a cmara de corrida uma fonte de corrente continua.

Questes da prtica 2:
2.1. Qual a carga dos corantes analisados? Como voc chegou a essa concluso?
2.2. Explique o aparecimento de mais de uma cor aps a corrida eletrofortica.

Prtica 2 Eletroforese de corantes de alimentos
21

Analise o gel da figura abaixo:

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 14. Raia 1 DNA do fago lambda digerido com a enzima de restrio Hind III. Esses fragmentos so utilizados
como marcadores de peso molecular; Raia 2 DNA genmico de Drosophila melanogaster, sem digerir; Raia 3
preparao de DNA genmico de Drosophila digerida com Dnase; Raia 4 preparao de DNA genmico de
Drosophila digerida com Rnase; Raia 5 DNA genmico de Drosophila digerido com a enzima Eco RI; Raia 6 DNA
do plasmdeo pBr322 digerido com Eco RI; Raia 7 DNA do plasmdeo pBr322 digerido com Hind III; DNA do fago
lambda digerido com Hind III

Questes:
1. O que caracteriza uma banda nesse gel de agarose?
2. Estime os tamanhos dos fragmentos de cada amostra.
3. Sabendo-se que o genoma de Drosophila tem 4x10
8
4. A anlise do gel permite concluir a respeito da nuvem de molculas de baixo peso
molecular que se coram com brometo de etdeo?
pb, distribudos em quatro longas
molculas de DNA (os 4 cromossomos), como explicar o padro observado aps o
fracionamento por meio de eletroforese? Para responder essa questo leve em
considerao a integridade das molculas de DNA aps o procedimento de extrao.
5. Comparando os padres apresentados pelas amostras de DNA das raias 2 e 5 voc
pode apresentar uma hiptese para o arrasto visualizado abaixo da banda de alto
peso molecular do DNA na raia 2.

Respostas comentadas:
1. Em um gel de eletroforese uma banda contm molculas (lineares) de mesmo
tamanho.
2. Valores aproximados para:
Raia 1 22.000; 9.400; 6.500; 4.300; 2.300; 2.000 pares de bases
Raia 2 30.000 pb +um gradiente de molculas com peso molecular inferior a
30.000 pb
Raia 3 o DNA foi digerido pela DNAse, restando apenas o RNA.
Raia 4 - 30.000 pb +um gradiente de molculas com peso molecular inferior
Raia 5 no h bandas definidas na preparao. Uma coleo de fragmentos
com peso molecular entre 25.000 e 500 pares de bases foram originados pela
digesto.
Raias 6 e 7 4.300 pb
Prtica 3 Interpretao de separao eletrofortica de DNA
22

3. As longas molculas que compem os cromossomos de Drosophila sofrem quebras
mecnicas e qumicas durante a extrao. A maioria desses fragmentos possui cerca
de 30.000 pb. Um gradiente de molculas com tamanho entre 30.000 e 1000 pb
evidencia que as quebras produzem tambm fragmentos de menor tamanho.
4. As nuvens so formadas por molculas de RNA. Essa concluso possvel
observando-se o resultado da digesto da preparao de DNA genmico com RNase:
a nuvem desapareceu.
5. Considerando-se que a distribuio dos stios de corte para uma as enzimas de
restrio so ao acaso, fragmentos dos mais variados tamanhos so originados. Assim
sendo, um gradiente de tamanho pode ser observado como produto da digesto.
6. A digesto com Eco RI cortou as molculas com cerca de 30.000 pb majoritariamente
presentes numa preparao de DNA genmico, originado fragmentos de tamanhos
variados e que so visualizados como um arrasto.

23

1. O segmento de DNA apresentado no esquema abaixo codifica para uma protena e foi
mapeado com enzimas de restrio. Uma sonda homloga regio indicada na figura ser
utilizada para estudar o gene em experimentos de Southern blotting. Nesses experimentos, o
DNA genmico de um indivduo normal para o gene foi digerido separadamente com as
enzimas Eco RI e Hind III. Aps a digesto, o DNA foi fracionado em gel de agarose,
transferido para uma membrana de nilon e hibridado com a sonda abaixo indicada, marcada
com radioatividade. Aps a hibridao, a membrana foi coberta com filme de raio-X, exposta
durante um perodo adequado de tempo e o filme foi revelado. Considerando o mapa de
restrio abaixo, esquematize no filme de raio-X.
a) o padro de bandas obtido no caso do DNA genmico ter sido digerido por Eco
RI.
b) O padro de bandas obtido no caso do DNA genmico ser digerido por Hind III.
c) O padro de bandas obtido no caso do DNA genmico ser proveniente de um
indivduo em que o stio Hind III marcado com asterisco foi destrudo atravs
de uma mutao de ponto (suponha digestes simples do DNA com Eco RI e
Hind III).
d) O padro de bandas obtido no caso do DNA ser proveniente de um indivduo
com a deleo representada no esquema II (suponha digestes simples com
Eco RI e Hind III).

Obs.: A barra preta indica a regio genmica utilizada como sonda.

Exerccios sobre Southern blot
24
2. A anemia falciforme est associada a existncia de uma mutao de ponto A - T, no gene da
-globina que ocasiona, na protena, a troca do aminocido Glu por Val. Esta mutao elimina
um stio reconhecido pela enzima de restrio Mst II. O desenho abaixo representa um
esquema dos genes selvagem e mutante.

O DNA de uma pessoa normal foi extrado, digerido com a enzima Mst II, fracionado por
eletroforese e submetido a Southern blot. A sonda utilizada na hibridao foi o segmento de
1,3 kb indicado na figura abaixo.
a) Planeje um teste utilizando a tcnica de "Southern blot" para o diagnstico pr-natal desta
doena. Faa o esquema do resultado esperado considerando um feto normal e de um
portador da doena cujos pais so heterozigticos.
1 2 3 4
Raia 1 marcadores de peso molecular
Raia 2 DNA de pessoa normal

b) Complete na figura o padro de bandas esperado para o DNA de:
a) pessoa homozigtica para a mutao de ponto que causa a anemia falciforme.
b) Pessoa heterozigtica para a mutao

25

Questes 8:
8.1. Comente a afirmao: a reao em cadeia da polimerase uma reao de replicao in
vitro.
8.2. Qual a funo dos primers na tcnica da PCR?
8.3. necessrio conhecer a seqncia de bases do DNA do segmento que se deseja
amplificar? E a seqncia dos segmentos adjacentes ao fragmento que se deseja amplificar?
8.4. Cite pelo menos trs aplicaes da tcnica da PCR
Atividade em software 8: Reao em cadeia da polimerase (PCR)
http://bcs.whfreeman.com/
clicar Cap 15
clicar PCR
26

1. Verifique os principais smbolos usados na confeco dos heredogramas na figura abaixo:

2. Analise, em grupo, os heredogramas A a F segundo o roteiro de perguntas que acompanha
cada um deles.

HEREDOGRAMA A

Questes A:
Discuta com seu grupo as seguintes questes:
A1. H afetados em todas as geraes?
A2. H homens e mulheres afetados?
A3. Os homens afetados tiveram descendentes afetados? De eu sexo?
A4. As mulheres afetadas tiveram descendentes afetados?
A5. Qual o mais provvel mecanismo de herana dessa condio?
A6. Coloque os gentipos mais provveis nos indivduos dessa genealogia.
Discusso em grupo: Estudo de heredogramas
27
HEREDOGRAMA B

Questes B:
Discuta com seu grupo as seguintes questes:
B1. H afetados em todas as geraes?
A2. H homens e mulheres afetados?
A3. Os afetados tm genitores afetados?
A4. Qual o mecanismo de herana mais provvel dessa condio na famlia?
A5. Coloque os gentipos mais provveis nos indivduos dessa famlia.
A6. O casamento consangneo aumenta a chance de um casal ter crianas afetadas por
doenas genticas?

28
HEREDOGRAMA C

Questes C:
C1.H afetados em todas as geraes?
C2. H hmens e mulheres afetados geraes?
C3. Os afetados tm genitores afetados?
C4. Qual o mecanismo de herana mais provvel nessa famlia?
C5. Coloque os gentipos mais provveis nos indivduos dessa famlia.
C6. Por que o mecanismo de herana autossmico recessivo pouco provvel nessa famlia?

HEREDOGRAMA D

Questes D:
D1. H afetados em todas as geraes?
D2. H homens e mulheres afetados?
D3. Os afetados tm genitores afetados?
D4. O gene mutado foi transmitido por homens?
D5. O gene mutado foi transmitido por mulheres?
D6. Qual o mecanismo de herana mais provvel nessa famlia?
D7. Coloque os gentipos mais provveis nos indivduos dessa famlia.
29
HEREDOGRAMA E

Questes E:
E1. H afetados em todas as geraes?
E2. H homens e mulheres afetados?
E3. Os afetados tm genitores afetados?
E4. O gene mutado foi transmitido por homens? Para filhos e filhas?
E5. O gene mutado foi transmitido por mulheres? Para filhos e filhas?
E6. Qual o mecanismo de herana mais provvel nessa famlia?
E7. Coloque os gentipos mais provveis nos indivduos dessa famlia.

HEREDOGRAMA F

Questes F:
F1. H afetados em todas as geraes?
F2. H homens e mulheres afetados?
F3. Os afetados tm genitores afetados?
F4. O gene mutado foi transmitido por homens afetados?
F5. O gene mutado foi transmitido por mulheres afetadas?
F6. Qual o mecanismo de herana mais provvel dessa condio nessa famlia?

30

1. A anemia falciforme uma doena autossmica recessiva causada por substituio de cido
glutmico (codificado por GAG) por valina (codificado por GTG) na posio 6 da cadeia beta da
hemoglobina. A substituio elimina o stio da enzima de restrio Mst II. Essa enzima corta o
DNA de pessoas normais originando um fragmento de 1,1 kb; nas pessoas com a mutao a
enzima gera um fragmento de 1,3 kb.
a) Faa um esquema desta regio do gene indicando stios de restrio nas pessoas
normais e nas com a mutao.
b) Faa um esquema do resultado de uma hibridao com uma sonda especfica do gene
na seguinte famlia: 1) pai heterozigoto; 2) me heterozigota; 3) filho afetado; 4) filha
afetada; 5) filha heterozigota; 6) filho heterozigoto; 7) filho homozigoto normal.

2. Esquematize um teste baseado na PCR que permita identificar o nmero de cpias de uma
seqncia de trinucleotdeos em indivduos portadores de uma doena causada por uma
expanso de trinucleotdeos.

3. Um zoolgico adquiriu uma fmea de tigre para seu programa de reproduo em cativeiro.
Apesar da identidade da me dessa fmea ser conhecida, havia dvida sobre sua paternidade
e alguns dos machos potenciais para serem usados no cruzamento poderiam ser muito
aparentados a ela. Foi realizado, ento, o exame do DNA dessa fmea de tigre, de sua me e
de trs machos, com o objetivo de se evitar excessiva consanginidade no cruzamento.
Os resultados da anlise usando uma sonda de
minisatlite esto mostrados na figura abaixo,
onde M = me; T = tigresa; M1-3 = machos
potenciais de serem usados no cruzamento. Qual
dos trs machos seria o mais adequado para ser
cruzado com a tigresa? J ustifique sua resposta.

4. Quatro pares de gmeos, nascidos no espao de
uma hora, foram trocados em uma maternidade.
Voc foi chamado para resolver o problema. Como
um primeiro passo, voc deseja identificar os pares
de gmeos. Para isso analisou o sangue de cada
criana usando uma sonda que identifica
polimorfismos de VNTR. Com base nos resultados
mostrados na figura, responda quais crianas so
irms e como voc ir identificar os pais corretos.

Exerccios: Diagnstico de doenas genticas
31

5. A doena de Huntington uma doena neurodegenerativa com padro de herana
autossmica dominante. O incio dos sintomas ocorre geralmente aps a quarta dcada de
vida. O gene da doena foi identificado em 1992. Mas, antes disso, para as famlias que
desejassem, era feito o aconselhamento gentico com RFLPs mapeados prximos ao gene da
doena. Uma das sondas utilizadas chamada G8 e revela um polimorfismo de stios de
restrio Hind III representado no esquema a seguir. A genealogia representada na prxima
pgina de uma famlia estudada na Venezuela e nela esto indicados os resultados do
estudo com a sonda G8. Com base nessas informaes responda as questes de a-d:
a) Esquematize o provvel resultado das hibridaes aps Southern blotting para cada
um dos indivduos identificados pelas letras correspondentes ao tipo de quando este
digerido com Hind III. So todos diferentes?
b) Que associao com o RFLP voc pode observar na genealogia?
c) Existe algum indivduo excepcional quanto ao padro de segregao da doena?
d) Imagine que o indivduo VI-11 da genealogia no seja afetado pela doena. O que voc
diria a ele sobre a possibilidade de manifestar a doena, considerando que ele tem
somente 20 anos de idade?

32

Textos de apoio s atividades
realizadas

33
O DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA

Regina Clila Mingroni Netto, Eliana Maria Beluzzo Dessen, Jos Mariano Amabis

No final de 1953, os pesquisadores adotaram como hiptese de trabalho a idia de que
o DNA atuaria como molde para a sntese do RNA, cujas molculas migrariam para o
citoplasma onde iriam determinar o arranjo dos aminocidos nas protenas. Este esquema para
o fluxo de informao gentica, abaixo esquematizado, foi denominado dogma central da
Biologia, por Francis Crick em 1956.

Assim, o dogma central define o paradigma da Biologia Molecular, ou seja, que os
genes so perpetuados como seqncias de cido nuclico e se expressam por meio da
sntese de protenas.

A TRANSCRIO DO DNA

A transcrio do DNA em molculas de RNA um processo altamente seletivo, pois
apenas uma pequena poro das seqncias de DNA copiada em RNA. Na maioria das
clulas de mamferos, por exemplo, apenas 1% das seqncias de nucleotdeos copiada em
seqncias funcionais de RNA. Essa seletividade de importncia fundamental, uma vez que a
transcrio o primeiro estgio da expresso gnica e o passo principal em que ela
controlada. O passo inicial na regulao de um gene, e s vezes o nico, a deciso se ele
ser transcrito ou no.
A sntese de RNA ocorre dentro da chamada bolha de transcrio, uma estrutura na
qual cerca de 18 pares de bases do DNA so temporariamente separados e uma das fitas da
dupla hlice serve como molde para o RNA que est se formando. medida que a polimerase
do RNA se move, a bolha de transcrio move-se com ela, e a cadeia de RNA aumenta em
tamanho. Aps a passagem da polimerase, a cadeia de RNA se solta de seu molde e as duas
cadeias do DNA voltam a se emparelhar, restabelecendo as pontes de hidrognio rompidas
durante a transcrio.
O processo de transcrio tem incio quando a polimerase do RNA liga-se a uma
seqncia especial de DNA, denominada promotor, localizada no incio de um gene. Nessa
seqncia de bases existe uma regio especial, denominada stio de iniciao, que
corresponde a primeira base do DNA a ser transcrita em RNA. A partir desse ponto, a
polimerase do RNA move-se ao longo do molde, sintetizando RNA, at alcanar a seqncia
de terminalizao.
A seqncia de DNA transcrita em uma nica molcula de RNA, que teve incio no
promotor e trmino na regio terminalizadora, constitui uma unidade de transcrio. Nos
eucariontes uma unidade de transcrio , em geral, composta por um nico gene. J nos
procariontes, uma unidade de transcrio contm, em geral, instruo para a sntese de

A informao perpetuada atravs da replicao do DNA.
A informao expressa em um processo de dois estgios:
1. a transcrio origina um RNA de fita simples, idntico
em seqncia de bases a uma das fitas do DNA;
2. a traduo converte a seqncia de bases do RNA
na seqncia de aminocidos da protena.

34
diversas cadeias polipeptdicas, ou seja, contm vrios cistrons. O RNA codificado por tal
unidade de transcrio denominado policistrnico.

Etapas da transcrio

Reconhecimento do molde de DNA

As molculas livres de polimerases do RNA colidem ao acaso com o DNA podendo
ligar-se a ele, porm muito fracamente. A polimerase do RNA liga-se fortemente ao DNA
apenas quando ela contata uma regio promotora. Nesse caso, a enzima liga-se fortemente ao
promotor causando o desemparelhamento da dupla hlice (Figura 1).

Toda regio promotora contm uma seqncia de bases especfica que marca o local
de incio de sntese do RNA. No genoma das bactrias, a seqncia mnima com capacidade
de sinalizar o local de incio de transcrio tem 12 pares de bases.
O seqenciamento de bases de diferentes promotores mostrou que h uma seqncia
bsica que est presente em todos eles. Por essa razo, ela chamada de seqncia
consenso. Essas seqncias, no entanto, no possuem todas as bases iguais, havendo
alguma variao entre elas. Assim, pode-se perguntar como as seqncias devem ser
analisadas para se determinar se elas so suficientemente semelhantes pra constituir um sinal
reconhecvel?
As seqncias de DNA sinalizadoras podem ser definidas em termos de uma
seqncia ideal que representa cada uma das bases que esto presentes com maior
freqncia em cada uma das posies. Todas as seqncias conhecidas so ento alinhadas
para maximizar a homologia entre elas. Para que uma seqncia seja aceita como consenso,
cada base particular deve ser predominante em sua posio e a maioria dos exemplos
conhecidos devem relacionar-se com o consenso possuindo apenas poucas substituies, no
mais do que uma ou duas
Em um promotor bacteriano h quatro caractersticas conservadas: (1) o stio de incio
de transcrio, que em geral uma purina; (2) o TATA box, que uma regio de seis pares
de bases ao redor do stio -10, e seqncia consenso TATAAT ; (3) uma seqncia consenso
TTGACA, localizada ao redor do stio -35; (4) a distncia entre os stios -10 e -35,
correspondente a 16 - 18 pares de bases e que crtica para a ligao da polimerase do RNA.
A conservao de curtas seqncias consenso em stios reguladores do gene uma
caracterstica tanto de procariontes quanto de eucariontes.

Figura 1. direita,
representao esquemtica do
processo de transcrio do
DNA. medida que a
polimerase se desloca sobre o
DNA, uma das cadeias serve de
molde para a molcula de RNA.
Acima, representao
esquemtica da organizao do
DNA na bolha de transcrio.
35
Incio da transcrio

A transcrio tem incio quando um primeiro nucleotdeo trifosfatado posicionado
sobre a cadeia molde de DNA, por ao da polimerase do RNA.
A polimerase do RNA permanece ligada regio promotora enquanto so adicionados
os primeiros nove nucleotdeos da cadeia de RNA sendo sintetizada. Essa fase pode ser
prolongada pela ocorrncia de eventos abortivos, nos quais a enzima sintetiza transcritos de
tamanho inferior a nove nucleotdeos. Essa fase inicial, chamada fase de iniciao, termina
quando a polimerase consegue estender a sntese alm desse tamanho.

Fase de elongao

Aps a sntese de cerca de nove nucleotdeos da molcula de RNA, a subunidade
sigma da polimerase do RNA dissocia-se e diversos fatores de elongao se associam
polimerase, que passa a se deslocar ao longo do DNA, alongando a molcula de RNA em
processo de sntese. Essa a fase de elongao.
medida que a polimerase do RNA se move ao longo do DNA, ela desenrola a hlice,
expondo um novo segmento da cadeia molde. Os nucleotdeos vo sendo covalentemente
unidos extremidade 3' da cadeia em crescimento, formando um hbrido DNA/RNA na regio
desenrolada do DNA. Imediatamente atrs do local onde est ocorrendo a sntese, a regio do
DNA j copiada volta a se emparelhar, refazendo a dupla hlice. O RNA, que vai se soltando
do DNA, emerge como uma fita simples e livre.
A etapa final da transcrio, chamada fase de trmino, envolve o reconhecimento de
uma seqncia sinalizadora, a partir da qual nenhuma base deve ser incorporada ao RNA.
Quando a ltima base adicionada ao RNA, a bolha de transcrio colapsa e o hbrido
DNA/RNA desfeito, as duas cadeias do DNA emparelham-se completamente e o RNA e a
enzima se soltam.
A seqncia de DNA que sinaliza o trmino da transcrio chamada regio
terminalizadora.

O trmino da transcrio

Na bactria E. coli h dois mecanismos bsicos de trmino de transcrio. No primeiro
deles, a terminao direta e a seqncia de DNA que sinaliza o trmino da transcrio
contm cerca de 40 bases, sendo que na extremidade 3' existe um segmento rico em C e G,
seguido por 6 ou mais timinas. No RNA transcrito, a seqncia rica em C e G fica arranjada de
modo a que a molcula de RNA possa formar, nessa regio, uma ala em forma de grampo de
cabelo (hairpin). Na molcula de RNA, essa ala seguida por uma srie de Us que
correspondem aos resduos de adenina da cadeia molde de DNA. A estrutura em forma de
grampo, juntamente com a seqncia de Us, provoca a parada e o desprendimento da
polimerase do RNA com conseqente trmino da transcrio.
O segundo mecanismo de trmino depende da participao de uma protena que se
acredita liga-se molcula de RNA nascente em algum ponto antes da seqncia que sinaliza
o trmino da transcrio.

O RNA MENSAGEIRO

Os transcritos de RNA que contm a informao para a sntese de protenas so
denominados RNA mensageiros (RNAm). H importantes diferenas nos detalhes da sntese
e da estrutura dos RNA mensageiros de pro e eucariontes. Nas bactrias, o RNAm transcrito
e traduzido no nico compartimento celular e os dois processos ocorrem acopladamente. Na
clula eucarionte, a sntese e a maturao dos RNAm ocorrem exclusivamente no ncleo.
Apenas quando o RNAm est maduro que ele exportado para o citoplasma e traduzido.
Diferenas significativas na traduo dos RNAm de bactrias e de eucariontes so
devidas a suas caractersticas estruturais e estabilidade. A diferena estrutural que o RNAm
de bactrias freqentemente codifica para vrias protenas, sendo chamado de policistrnico,
enquanto o RNAm de eucariontes na maioria dos casos codifica para apenas uma cadeia
polipeptdica, sendo chamado de monocistrnico (Fig. 10). A diferena funcional que o
RNAm de bactrias geralmente instvel, e por isso traduzido em protenas durante um
36
perodo de tempo muito curto, tipicamente poucos minutos. O RNAm dos eucariontes mais
estvel e pode continuar a ser traduzido por vrias horas ou mesmo dias.
Vrios passos so necessrios para produzir o RNA mensageiro maduro dos
eucariontes. As molculas mensageiras recm-sintetizadas pela polimerase II so
denominadas transcritos primrios. A populao de tais transcritos no ncleo foi
originalmente denominada RNA heterogneo nuclear (RNAhn), por causa da grande variao
em tamanho que apresentava, contrastando com os RNAs mais uniformes e de menor
tamanho realmente necessrios para codificar uma protena. Muita dessa variao em tamanho
no RNA recm-sintetizado devida presena de longas seqncias de nucleotdeos que
sero retiradas do transcrito primrio em um processo denominado splicing.

ntrons so removidos do pr-RNAm

Para a produo de um RNA mensageiro em clulas eucariticas, o segmento inteiro
do gene, incluindo ntrons e xons, primeiramente transcrito em uma longa molcula de RNA,
o transcrito primrio. Antes que o RNA deixe o ncleo, todas as seqncias de ntrons so
retiradas e os xons so unidos entre si. O resultado uma molcula mais curta de RNA, que
agora contm uma seqncia codificadora ininterrupta. Quando esse passo, denominado
splicing do RNA, completado, o RNA uma molcula de RNAm funcional que pode deixar o
ncleo e ser traduzida em protenas.
Como a clula determina quais as partes do transcrito primrio devem ser removidas?
Diferentemente da seqncia de cdigo de um xon, a seqncia exata de nucleotdeos da
maioria dos ntrons parece no ser importante para a clula. Embora haja pouca semelhana
entre as seqncias de nucleotdeos de ntrons diferentes, cada ntron contm uma curta
seqncia de nucleotdeos que atua como uma marca para sua remoo (Fig. 2).
Os ntrons so removidos do RNA por enzimas que, ao contrrio de muitas outras
enzimas, so compostas por um complexo de RNA e protena. Essas partculas encarregadas
do splicing do RNA so denominadas snRNPs ou snurps (do ingls - small nuclear
ribonucleoprotein particles). Em cada ntron, um grupo de snRNPs se associa ao RNA, excisa
(ou corta) o ntron, e o rene cadeia de RNA liberando o ntron excisado como um lao (Fig.
2 e 3). Um dos papis do RNA presente nos snRNPs (snurps) reconhecer e por
complementaridade de bases emparelhar com a seqncia de nucleotdeos que marcam o
incio e o ponto de ramificao de cada ntron (veja Fig. 3). Desse modo, os snurps aproximam
as duas extremidades do ntron permitindo a ocorrncia do splicing. Embora os snurps tenham
um papel central na reao de splicing, outras protenas so tambm necessrias.

Figura 2. Seqncia de nucleotdeos que
sinaliza o incio e o final de um ntron. As
trs seqncias de nucleotdeos mostradas
so necessrias para remover um ntron.
As outras posies de um ntron podem
ser ocupadas por qualquer nucleotdeo. As
seqncias especiais so reconhecidas
por snRNPs, que clivam o RNA nos limites
ntron-xon e ligam covalentemente os
xons. A adenina (A) apontada pela seta
forma o ponto de ramificao do lao
produzido na reao de splicing (Figura 12)
e est tipicamente localizado cerca de 30
nucleotdeos da extremidade 3do ntron.

37
Figura 3. Mecanismo de sntese
de cadeias polipeptdicas nos
organismos eucariontes, mostrando
como so removidas as regies no
codificadoras (ntrons) do RNAm.

O splicing do RNA em eucariotos permite uma vantagem adicional. O transcritos
primrios de vrios genes eucariticos podem sofrer splicing de diferentes maneiras para
produzir diferentes RNAm, dependendo do tipo de clula no qual o gene est sendo expresso,
ou do estgio de desenvolvimento do organismo. Isso garante que diferentes protenas sejam
produzidas a partir do mesmo gene (Fig.4).
Em concluso, ao invs de ser um processo que acarreta desperdcio, o splicing do
RNA dos eucariotos permite o aumento do j enorme potencial de cdigo de seus genomas.

Os RNAm sofrem outras modificaes

Os RNAs sintetizados pela polimerase II tambm so modificados em ambas as
extremidades, ficando bastante diferentes dos transcritos produzidos por outras polimerases.
Essas modificaes sero utilizadas posteriormente, no citoplasma, como sinais de que esses
RNAs devem ser traduzidos em protenas.
A extremidade 5' da molcula de RNA "encapada" (do ingls capped) pela adio de
um nucleotdeo contendo G metilado. O encapamento ocorre no incio da transcrio, quando o
transcrito ainda pequeno com apenas 30 nucleotdeos de comprimento. Essa reao se d
pela ligao de uma molcula de 7-metilguanosina extremidade 5' do transcrito. A
extremidade 5' cap tem um importante papel nos passos iniciais da traduo do RNAm, alm
de proteger o RNA nascente de degradao.

Figura 4. Splicing alternativo do gene da
-tropomiosina de rato. -tropomiosina
uma protena que regula a contrao das
clulas musculares. Seu papel em outras
clulas no bem conhecido. Uma vez
que o transcrito primrio feito, ele pode
sofrer splicing de diferentes modos, e
produzir RNAms distintos que originam
protenas variantes. Alguns dos padres
de splicing so especficos para certos
tipos de clulas. Por exemplo, a -
tropomiosina feita em musculatura
estriada diferente da feita na
musculatura lisa. A cabeas de seta na
parte superior da figura representam
stios onde podem ocorrer clivagem e
adio da cauda de poli (A).

38
A extremidade 3' do transcrito tambm modificada. O transcrito clivado em um stio
especfico da molcula e uma cadeia de nucleotdeos com base adenina (cauda de poli-A)
adicionada, na extremidade clivada, por ao de uma polimerase especfica.

O RNA TRANSPORTADOR

A primeira hiptese para explicar a atuao do RNA como intermedirio na sntese de
protenas partia do princpio que as molculas de RNAm se dobrariam de modo a formar
concavidades nas quais os diferentes aminocidos pudessem se encaixar. Esse dobramento
do RNA seria especfico para cada um dos 20 aminocidos existentes na clula e, desse modo,
o RNA forneceria a instruo para a ordenao dos aminocidos durante a sntese de protena.
Essa hiptese foi descartada por Francis Crick em 1956; seu argumento foi que no
havia uma fundamentao qumica para a interao entre o RNA dobrado e um aminocido.
Mesmo que o dobramento proposto ocorresse, no haveria condies para a discriminao
precisa entre os aminocidos, sabidamente muito semelhantes entre si, como por exemplo,
glicina e alanina ou valina e isoleucina, que diferem apenas pela presena de um grupo metil
(CH
3
Os RNAt foram intensamente estudados e hoje se sabe que eles esto envolvidos em
uma multiplicidade de reaes. Para desempenhar certas reaes necessrio que todos os
tipos de RNAt possuam algumas caractersticas em comum mas, por outro lado, eles possuem
pequenas diferenas que permitem a distino entre os diferentes tipos de molculas.
). Crick props, ento, que antes de serem incorporados em protenas, os aminocidos
deveriam ligar-se a molculas adaptadoras especficas, e essas poderiam ligar-se
especificamente s bases de um RNA que teria sido sintetizado tendo o DNA como molde.
Hoje se sabe que o papel de molcula adaptadora desempenhado pelos RNAs
transportadores (RNAt).
Todos os RNAt devem ser capazes de interagir com stios especficos dos ribossomos
durante o processo de sntese de protena. Alm disso, em uma de suas extremidades, eles
devem se associar ao RNAm, atravs da interao entre bases complementares, na outra
extremidade eles devem transportar um aminocido. Para cumprir essas funes, todos os
tipos de RNAt devem obedecer a uma regra geral e uniforme quanto sua forma e tamanho.
Os RNAt consistem de um conjunto de pequenas molculas de RNA, cada uma delas
com cerca de 80 nucleotdeos. Diferentemente dos demais cidos nuclicos, eles apresentam
diversas bases no-usuais, ou seja, diferentes de A, G, C ou U. Essas bases originam-se por
modificaes de bases usuais aps sua incorporao na molcula de RNAt (Fig. 5).

Figura 5. Alguns exemplos de bases no usuais presentes em RNAt

As bases das molculas precursoras dos RNAt sofrem uma vasta gama de
modificaes, desde simples metilaes at restruturao do anel purnico. Tais modificaes
aumentam a versatilidade dos RNAt, o que muito importante para as vrias funes que
desempenham. O efeito mais evidente da modificao de bases dos RNAt a alterao em
sua capacidade de emparelhamento com o RNAm. Nesse caso a modificao ocorre em bases
da trinca (anticdon), por meio das quais o RNAt se emparelha com o RNA mensageiro
durante a sntese de protena, ou nas vizinhanas delas.
O seqenciamento de bases de centenas de RNAt de bactrias e eucariontes mostrou
que todos tm a mesma estrutura secundria, uma forma de folha de trevo mantida por
emparelhamento de bases entre pequenas regies de complementaridade (Fig. 6).

39

Os quatro braos principais presentes na estrutura em forma de trevo receberam
denominaes relacionadas sua estrutura ou funo que desempenham. O brao aceptor
termina com uma seqncia de bases no emparelhadas, cujos grupos hidroxila livres 2' ou 3'
tm a capacidade de se ligar a aminocidos; o brao ou ala T assim denominado porque
contm timina; o brao ou ala anticdon contm a trinca do anticdon; o brao ou ala D
contm a base dihidrouridina. Como mostrado na figura 17, a estrutura secundria do RNAt se
dobra, originando uma estrutura terciria mais compacta, em forma de L, com o anticdon em
uma das extremidades e o brao aceptor na outra. A estrutura terciria mantida por meio de
pontes de hidrognio entre bases que se encontram desemparelhadas na estrutura secundria.

O RNA RIBOSSMICO

Os ribossomos so estruturas ribonucleoproticas, presentes no citoplasma de clulas
pro e eucariontes, que atuam na sntese de protenas. Os ribossomos so compostos por duas
subunidades de tamanhos diferentes, que se encaixam uma na outra formando um complexo
com massa de vrios milhes de daltons. Mais da metade dessa massa corresponde a uma
classe especial de RNA, o chamado RNA ribossmico (RNAr). Existem evidncias de que
esse RNA tem atividade cataltica na sntese de protenas.
As subunidades dos ribossomos, assim como as molculas de RNAr, so designadas
pelo seu coeficiente de sedimentao, expresso em unidades Svdeberg (S).
Atualmente, h evidncias de que o RNAr interage com o RNAm ou RNAt em cada um
dos estgios da traduo, e que, de fato, diversas protenas so necessrias.

Figura 6. Ao lado,
estrutura em forma de
folha de trevo da
molcula de RNAt no
plano. Abaixo, duas
vises da conformao
tridimensional do RNAt
determinada por difrao
de raios X.
40

Figura 7. Representao esquemtica de
ribossomos. esquerda, modelos
tridimensionais das subunidades de um
ribossomo bacteriano observadas de dois
ngulos diferentes: (a) subunidade menor,
(b) subunidade maior, e (c) subunidades
reunidas. direita, modelo ampliado
mostrando a posio do RNAm e da cadeia
polipeptdica sendo sintetizada.

41
O CDIGO GENTICO

Regina Clila Mingroni Netto, Eliana Maria Beluzzo Dessen, Jos Mariano Amabis

Sistema de codificao gentica

Cdigo gentico o conjunto de regras que governa a relao entre a seqncia de
nucleotdeos no DNA e a ordem dos aminocidos nas protenas. nessa relao que reside a
essncia da expresso gnica e a decifrao do cdigo gentico foi realmente um importante
marco na histria da Biologia.
Cdigo definido como "um sistema de smbolos (letras, nmeros ou palavras) usado
para representar um certo significado pr-estabelecido, s vezes secreto". Por exemplo, o
cdigo Morse internacional constitudo por pontos, barras e espaos. Para quem no
conhece o cdigo, os pontos e barras no tm o menor significado, mas conhecendo-se as
regras do cdigo, os pontos e barras podem ser facilmente convertidos em frases.
O cdigo gentico permite clula converter seqncias de bases do DNA em cadeias
polipeptdicas.

A unidade do cdigo gentico

Existem 20 diferentes aminocidos que devem ser especificados durante o processo de
sntese de protenas por algum tipo de combinao das quatro diferentes bases existentes no
DNA. Quantas bases devem ser utilizadas para construir um cdigo que permita que os 20
aminocidos diferentes sejam especificados?
Se as palavras desse cdigo tivessem uma base, apenas quatro aminocidos seriam
especificados. Um cdigo baseado em conjuntos de duas bases permitiria 16 combinaes
diferentes. J um cdigo baseado em trincas de bases permitiria 64 combinaes distintas de
bases, o que seria suficiente para determinar os 20 aminocidos. Como os sistemas celulares
so geralmente econmicos, um cdigo baseado em quatro letras seria muito improvvel, pois
permitiria 256 combinaes diferentes. Assim, um cdigo baseado em trincas seria a situao
mais razovel. Contudo, ainda fica a seguinte pergunta: Como so lidas essas trincas? Uma
aps a outra ou uma mesma base pode fazer parte de trs trincas adjacentes? Nesta segunda
opo diramos que o cdigo sobreposto. (Fig.8)
Em um cdigo sobreposto, cada base do DNA participaria da codificao de dois ou
trs aminocidos. Este tipo de cdigo imporia severas restries sobre as seqncias de
aminocidos das protenas. Assim, por exemplo, um aminocido cujo cdigo fosse CAG no
poderia ser seguido por um outro cujo cdigo tivesse como primeira base um T ou um C

Figura 8. Comparao entre cdigos de trs letras
sobreposto e no-sobreposto. No cdigo no-sobreposto, a
protena traduzida por cdons que no compartilham
nenhum nucleotdeo. J no cdigo sobreposto, cada cdon
compartilha um ou mais nucleotdeos, dependendo do grau
de sobreposio, com os cdons vizinhos.
42
porque, por definio, a primeira base do prximo aminocido teria que ser A ou G,
dependendo da extenso da sobreposio.
Brenner, na dcada de 60, foi o primeiro a propor que o cdigo no era sobreposto, isto
, que cada base participaria na codificao de um nico aminocido.
Tambm devemos considerar que se o cdigo fosse sobreposto, toda vez que uma
base fosse alterada na molcula do DNA, um, dois ou trs aminocidos seriam alterados na
protena mutante. A evidncia gentica, contudo, no falava a favor dessa hiptese. Em
estudos sobre mutaes no vrus do mosaico do tabaco (TMV), a substituio de um nico
nucleotdeo no genoma viral resultava geralmente na alterao de um nico aminocido na
cpsula protica do vrus, e no na alterao simultaneamente de trs aminocidos, como seria
esperado se o nucleotdeo alterado fizesse parte de trs cdons ao mesmo tempo.

A Natureza trplice do cdigo

Quando Benzer estava trabalhando no sistema rII do fago T4, ele verificou que os
indivduos com mutao de ponto revertiam muito freqentemente para o tipo selvagem. Ele
poderia ter pensado que este fato seria devido reverso da mutao original que resultaria
novamente na seqncia de bases do tipo selvagem. Isso verdadeiro para a maioria das
reverses, no entanto, mutaes reversas no constituem a nica maneira pela qual indivduos
com mutaes de ponto no loco rII podem reverter ao tipo selvagem. Foi verificado que, em
alguns casos, os revertidos carregavam uma segunda mutao ocorrida nas proximidades da
mutao original. As duas mutaes juntas eram responsveis pela produo de um fentipo
selvagem, isto , a segunda mutao suprimia o efeito da primeira e foi, por este fato,
denominada mutao supressora.
Crick e Brenner, em 1961, aproveitaram essas mutaes supressoras para provar que
o cdigo gentico era realmente composto por trincas, oito anos aps a idia ter sido proposta.
Eles foram capazes tambm de demonstrar que a seqncia de bases do DNA era lida a partir
de um determinado ponto, trinca por trinca, de maneira no sobreposta. Isto significava que
cada mensagem gentica tinha uma estrutura de leitura fixa que poderia ser alterada pela
adio ou remoo de uma nica base. O polipeptdio especificado pela mensagem conteria
aminocidos incorretos a partir do ponto em que a base foi adicionada ou removida. Um
aspecto que deve ser ressaltado o fato destas mutaes terem sido induzidas por corantes
do tipo acridina, que causam insero ou deficincia de bases na seqncia de nucleotdios do
DNA.
Crick e Brenner assumiram que se uma mutao fosse uma insero de apenas uma
base no DNA da regio rII (representada por um sinal +), a sua supressora deveria ser uma
deleo (representada por sinal -). Assim, se a seqncia de bases do DNA estivesse sendo
lida trinca por trinca (da esquerda para a direita), comeando de um ponto determinado, a
insero de uma base determina que todas as trincas direita da mutao fossem lidas de
maneira diferente do original; esta seria, portanto, uma mutao do tipo mudana do quadro
de leitura. Geralmente, isto resultaria num polipeptdio no funcional. Para compreender
melhor os efeitos de uma mutao que afeta o quadro de leitura, observe esta frase em ingls
constituda por palavras de apenas trs letras:

THE FAT CAT ATE THE BIG RAT

Deletando C C

THE FAT ATA TET HEB IGR AT

Inserindo A: A

THE FAT ATA ATE THE BIG RAT

A insero suprime o efeito da deleo pois restaura a fase de leitura. Mas sozinha,
uma insero tambm perturbaria completamente o sentido da frase:

43
Inserindo A: A

THE FAT CAT AAT ETH EBI GRAT
Assim, a leitura correta das trincas seria interrompida aps uma mutao (+), sendo,
entretanto, restabelecida aps uma mutao (-). Se a regio alterada entre as duas mutaes
no for crtica, o polipeptdeo pode ser funcional.
Mutaes supressoras esto sempre prximas das mutaes que elas suprimem, uma
vez que pouco provvel que um polipeptdeo contendo grande nmero de aminocidos
alterados permanea funcional. Caso tivssemos uma segunda mutao de sinal (+) ela no
teria suprimido a mutao (-) e no haveria reverso para o tipo selvagem.
Considere a seguinte seqncia de bases:

CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT C...

a. Note como a insero de uma base altera a seqncia:

Insero de um G:

G
CAT CAG TCA TCA TCA TCA TCA TC...

b. Note como a insero de uma segunda base qualquer mantm a seqncia alterada:

Insero de um A:

A
CAT CAG TCA TAC ATC ATC ATC ATC...

A natureza trplice do cdigo somente foi demonstrada quando foram obtidos mutantes
contendo trs mutaes do tipo inseres ou trs deficincias, pois esses mutantes triplos
tinham o fentipo selvagem. Este resultado s seria possvel se o cdigo fosse lido em trincas,
pois somente neste caso a ordem correta da leitura seria restabelecida aps trs alteraes de
mesmo sinal.

c. Note como a insero de uma terceira base qualquer restabelece a seqncia original:

Insero de um T:
T
CAT CAG TCA TAC TAT CAT CAT CAT C...

Os experimentos revelaram tambm a impossibilidade de apenas 20 dos 64 cdons
possveis serem usados para especificar aminocidos. Neste caso, 44 cdons no teriam
sentido, isto , no corresponderiam a aminocidos. Se isso fosse verdadeiro, um destes
cdons sem sentido deveria muito provavelmente aparecer entre uma insero e sua
deficincia supressora, determinando a terminao da cadeia polipeptdica antes que a leitura
correta fosse restabelecida. Em outras palavras, estes estudos j sugeriam que, como veremos
em breve, o cdigo gentico era degenerado.
Dizer que o cdigo gentico degenerado significa que mais de um tipo de trinca de
bases pode determinar o mesmo aminocido na cadeia polipeptdica.

44

O CDIGO " IN VIVO"

Os detalhes do cdigo que foram demonstrados pelos experimentos in vitro so
verdadeiros in vivo? Eles se aplicam aos organismos superiores, j que todos os trabalhos
foram realizados com bactrias e fagos?
Hoje est largamente demonstrado que o cdigo gentico universal. Na verdade, a
universalidade do cdigo pode ser considerada em diversos nveis. Assim, estudos sobre a
seqncia de bases do fago R17 mostraram que AUG realmente o cdon inicial desse vrus e
que isso tambm verdadeiro para leveduras e mamferos. As observaes sobre substituio
de aminocidos em mutantes de organismos to diferentes como vrus do mosaico do tabaco,
levedura e homem so compatveis com o cdigo estabelecido para E. coli.
Em extratos de E. coli contendo todo o material necessrio para a transcrio e
traduo, pde ser sintetizada in vitro a protena do vrus da pliomielite. RNA mensageiro para
hemoglobina de coelho, pde ser traduzido em clulas de sapo, originando hemoglobina de
coelho.
A universalidade do cdigo gentico sugere que ele deve ter sido estabelecido muito
cedo na evoluo.
As excees universalidade do cdigo so raras e geralmente envolvem cdons de
parada. Por exemplo, em micoplasma, UGA codifica para triptofano e em certas espcies de
ciliados UAA e UAG codificam para glutamina. As principais alteraes do cdigo ocorreram
nos DNAs mitocondriais. Isto deve ter sido possvel porque a mitocndria um sistema
relativamente fechado, responsvel pela sntese de poucas protenas. A maioria das alteraes
envolve os cdons de parada, mas trocas no significado de alguns aminocidos so tambm
observadas, como podemos observar na tabela a seguir.

OS EFEITOS DAS MUTAES

Muitas mutaes acarretam mudanas na seqncia de nucleotdeos que no afetam o
funcionamento do material gentico dos organismos. Isso ocorre porque so mutaes
silenciosas que ocorrem no DNA intergnico e nos componentes no codificantes dos genes
como, por exemplo, nos ntrons. Em outras palavras, a maior parte dos genomas pode sofrer

Tabel a 1. Cdigo gentico: correspondncia de trios 5 - 3 de RNAm (cdons) e resduos de
aminocidos na cadeia polipeptdica. O asterisco indica cdons de parada de leitura ou
terminadores.
45
mutaes sem qualquer efeito significativo no seu funcionamento. J as mutaes em regies
codificantes dos genes tm maior importncia. As conseqncias das mutaes de ponto que
afetam a seqncia de um cdon podem ser:

a) A mutao pode ser sinnima, isto , o novo cdon especifica o mesmo aminocido do
cdon no mutado. A mutao sinnima uma mutao silenciosa porque o gene mutado
codifica para a mesma protena codificada pelo gene no mutado, por causa da degenerao
do cdigo gentico.

b) A mutao pode ser no sinnima, isto , ela gera um novo cdon que especifica um
aminocido diferente. A protena codificada pelo gene mutado ter, portanto, um aminocido
diferente. Freqentemente, isto no afeta a atividade biolgica da protena porque estas so
capazes de tolerar certas mudanas em sua estrutura sem perda de sua funo. Contudo,
alteraes de aminocidos no stio ativo de uma enzima tm um impacto maior e podem levar
perda de funo da protena. Uma alterao no sinnima tambm chamada de mutao de
sentido errado (missense).

c) A mutao pode converter o cdon que especifica um aminocido em um cdon de parada
(nonsense). Essa mutao sem sentido produz uma protena menor porque a traduo
interrompe-se no codon mutado. (do RNA mensageiro). O efeito desta mutao sobre a
protena depender do que foi perdido. Em geral, mutaes desse tipo resultam em uma
protena no funcional.

d) A mutao pode converter um cdon de trmino de traduo em um cdon que especifica
um aminocido. Isto resultar em uma protena com aminocidos adicionais. As protenas
poderiam tolerar estas mudanas sem o comprometimento de sua atividade biolgica. No
entanto, dependendo do nmero de aminocidos adicionais, isto pode afetar a estrutura
tridimensional da protena, afetando sua funo.

Como j estudamos, inseres e delees tambm podem afetar os genes. Se o
nmero de nucleotdeos perdidos ou inseridos for trs (ou mltiplo de trs) um (ou mais
cdons) perdido ou adicionado produzindo efeitos variados sobre a estrutura da protena
codificada pelo gene. Se o nmero de nucleotdeos perdidos ou inseridos no for trs ou
mltiplo de trs, haver mudana no quadro de leitura. Isto significa que todos os cdons a
jusante (a 3') da mutao tero um quadro de leitura diferente daquele do gene no mutado.
Isto resulta em alterao significativa na estrutura da protena, j que parte do polipeptdeo
codificado pelo gene mutado ter uma seqncia de aminocidos diferente do polipeptdeo
codificado pelo gene normal.
Os efeitos de mutaes que ocorrem em regies no codificantes do genoma so mais
difceis de serem previstos. Stios no DNA de ligao a protenas so susceptveis a mutaes
de ponto, inseres e delees que podem alterar a seqncia de nucleotdeos envolvidos em
interaes DNA-protena. Estas mutaes poderiam inativar promotores ou seqncias
reguladoras da expresso gnica. Origens de replicao tambm poderiam perder a funo se
as mutaes afetassem stios relevantes para a ligao a outras protenas envolvidas em
complexos proticos que participam da replicao do DNA.
Mutaes tambm podem ocorrer em introns ou nos limites entre introns e exons.
Nestas regies, mutaes sero importantes se afetarem nucleotdeos envolvidos em
interaes RNA-RNA ou RNA-protena que ocorrem no processo de splicing. Um resultado
possvel destas mutaes o de que o intron no seja removido do pr-RNA mensageiro.
Conseqentemente, isto equivaleria insero de novos cdons, modificando o polipeptdeo
traduzido.

Efeitos das mutaes em microorganismos

Os efeitos das mutaes em microorganismos podem ser descritos com base nas
propriedades de crescimento dos mutantes em diferentes meios de cultura. Assim, eles podem
ser enquadrados nas seguintes categorias:

46
a) Mutantes auxotrficos crescem apenas quando suplementados com um nutriente que no
necessrio para a clula no mutada (prototrfica). Por exemplo, E. coli sintetiza
normalmente seu prprio triptofano, graas s enzimas codificadas por cinco genes
pertencentes ao operon triptofano. Bactrias que apresentem mutaes nestes genes que
levem falta do aminocido sero mutantes auxotrficos. Neste caso, o mutante no sobrevive
em um meio de cultura no suplementado com triptofano.

b) Mutantes letais-condicionais so mutantes que no resistem a determinadas condies de
crescimento. Quando crescidos em condies normais (permissivas), eles parecem normais.
Entretanto, se transferidos a condies restritivas, seu fentipo anormal se manifesta. Mutantes
sensveis temperatura so exemplos tpicos de mutantes letais-condicionais. Eles crescem
como clulas selvagens sob temperatura normal mas crescem mal, ou no crescem, quando a
temperatura sobe acima de um limiar que pode variar para cada mutante.

c) Mutantes resistentes a inibidores podem resistir aos efeitos txicos de um antibitico ou
de outro inibidor. Em alguns casos, a mutao modifica a estrutura da protena que interage
com o inibidor. Neste caso, o inibidor perde sua funo porque j no pode interagir com a
protena alvo. Em outros casos, a mutao altera a protena responsvel pelo transporte do
inibidor ao interior da clula.

d) Mutantes de regulao possuem promotores ou outras seqncias reguladoras alteradas.
Nesta categoria esto os mutantes constitutivos, aqueles que expressam continuamente genes
que, normalmente, esto ativos apenas em certas condies. Esses mutantes sero estudados
posteriormente.

Os efeitos das mutaes nos organismos pluricelulares

O primeiro ponto a ser considerado neste caso refere-se importncia de uma
mutao para uma clula somtica e para um gameta. Como a clula somtica no transmitir
a cpia de seu material gentico para a prxima gerao, uma mutao em uma clula
somtica importante para o organismo apenas no momento em que ela ocorre, isto , ela no
tem impacto nas demais geraes. Na verdade, a maioria das mutaes somticas no
significativa mesmo que elas produzam a morte celular porque haver um nmero enorme de
clulas idnticas no mesmo tecido. Uma exceo seria quando uma mutao afeta uma clula
que, por sua vez, traz dano ao organismo ao induzir, por exemplo, a formao de um tumor.
Mutaes nas clulas que originam os gametas so mais importantes, pois elas sero
transmitidas aos organismos da gerao seguinte e, portanto, estaro presentes em todas as
clulas dos organismos que herdaram a mutao. A maioria das mutaes nos gametas sejam
as silenciosas ou as que ocorrem em regies codificantes, no alterar significativamente o
fentipo dos organismos portadores das mesmas. Aquelas que o fazem podem ser divididas
em duas categorias:

a) Mutaes de perda de funo que reduzem ou anulam a atividade protica: A maioria
dessas mutaes que levam perda de funo so recessivas, j que o heterozigoto portar
uma verso no mutada do gene que codifica para uma protena funcional. Desta forma, a
verso normal do gene compensa o efeito da mutao. Existem, no entanto, excees nas
quais a mutao de perda de funo pode agir como dominante se o produto do gene for
realmente necessrio em dose dupla.

b) Mutaes de ganho de funo so menos comuns: Elas podem residir em regies
reguladoras do gene e no necessariamente em regies codificantes. Neste caso, a mutao
poderia levar expresso de um ou mais genes em tecidos onde eles normalmente no se
expressam. Alternativamente, a mutao poderia levar expresso exagerada de um gene, ou
ainda expresso de um produto gnico com funes distintas do produto original.

47
A SNTESE DE PROTENAS

Regina Clia Mingroni Netto, Eliana Maria Beluzzo Dessen, Jos Mariano Amabis
(apostila disciplina Bio-211 Biologia Molecular)

O RNA e a sntese de protenas

As protenas constituem mais da metade da massa seca total de uma clula e sua
sntese tem uma importncia fundamental para a manuteno e o crescimento celulares. A
sntese de protenas ocorre nos ribossomos e envolve vrios tipos de molculas de RNA que
atuam nas diversas etapas do processo. Inicialmente, uma molcula de RNA mensageiro deve
ser sintetizada a partir de uma das cadeias do DNA que codifica para a protena. No
citoplasma, molculas de cada um dos 20 aminocidos que entram na composio das
protenas devem se unir a seus respectivos RNA transportadores. As subunidades
ribossmicas que promovero a sntese devem se associar com protenas auxiliadoras no
processo.
A sntese de protenas tem incio quando todos os componentes mencionados acima,
ou seja, um RNA mensageiro, um dos RNA transportadores e as subunidades de um
ribossomo se renem para formar um ribossomo funcional. Cada ribossomo percorre, ento, a
molcula de RNAm traduzindo a seqncia de cdons em uma seqncia de aminocidos.
Vejamos agora, em detalhe, cada uma dessas etapas.

O papel do RNAt

As molculas de RNAt atuam como adaptadores no processo de sntese de protenas,
uma vez que elas definem a posio dos aminocidos de acordo com a seqncia de bases do
RNA mensageiro. Essa caracterstica dos RNAt se deve ao fato deles terem duas regies de
ligao em sua molcula, uma onde se liga covalentemente um aminocido especfico e outra,
o anticdon, por meio da qual se ligam ao cdon do RNAm, por meio de pontes de hidrognio.
A ligao de um RNAt com seu aminocido especfico catalisada por uma enzima
chamada sintetase do aminoacil-RNAt. A atuao dessa enzima se d em duas etapas.
Primeiramente, os aminocidos reagem com ATP para formar um aminoacil-adenilato. A
energia para essa reao fornecida pela clivagem da ligao altamente energtica do ATP,
com liberao de pirofosfato. Essa etapa conhecida como ativao do aminocido. Em uma
segunda etapa, o aminocido ativado reage com o RNAt, liberando uma molcula de AMP. A
ligao do aminocido com o RNAt se d entre o grupo carboxila do aminocido e um carbono
2' ou 3' da ribose do ltimo ribonucleotdeo da extremidade 3' do RNAt, o qual contm sempre
a base adenina (Fig. 9).
Existem pelo menos vinte tipos diferentes de aminoacil-sintetases, uma para cada tipo
de aminocido. Cada uma reconhece um nico aminocido e catalisa sua unio a um dos
RNAts correspondente a esse aminocido. Lembre-se que pode existir mais de um tipo de
RNAt para um mesmo aminocido.
Um RNAt denominado de acordo com o aminocido ao qual ele se liga. Por exemplo,
o RNAt que se liga ao aminocido alanina chamado RNAt
Ala
. Um aminoacil-RNAt carregando
um aminocido especfico designado pela abreviatura do aminocido colocada antes de sua
sigla; por exemplo, o RNAt
Ala

ligado a seu aminocido chamado Ala-RNAt.

48

Figura 9. Representao esquemtica das
reaes de ativao de um aminocido e de sua
ligao ao RNA t, as quais so catalisadas por
enzimas denominadas sintetase do aminoacil-
RNAt.

O papel do RNAm e dos ribossomos

O processo da sntese de protenas comparvel a uma linha de montagem, na qual o
ribossomo vai deslizando sobre o RNA mensageiro e os aminocidos, trazidos pelos RNAt, vo
sendo encaixados em seus respectivos lugares, de acordo com a seqncia de bases do
RNAm.
O ribossomo um pacote complexo de molculas de protena e de RNA, as quais
formam stios catalticos com funes especializadas. Vrios fatores acessrios participam,
juntamente com o ribossomo, da sntese de protenas e a energia para a movimentao do
ribossomo fornecida pela hidrlise de GTP.
Um ribossomo possui um stio para a ligao do RNA mensageiro e trs stios para a
ligao de RNA transportadores. Os stios onde se ligam os RNA transportadores so
denominados: stio P, stio A e stio E (Fig. 10).

Figura 10. Representao esquemtica dos stios de ligao dos RNAs no ribossomo. As setas indicam que os RNAts
e o RNAm se movem atravs do ribossomo em um mesmo sentido.

49
O stio P, ou stio de ligao do peptidil-RNAt, onde se associa a molcula de RNAt
ligada extremidade do polipeptdeo em crescimento. O stio A, ou stio de entrada do
aminoacil-RNAt, onde se associa o RNAt recm-chegado ao ribossomo e que trs o
aminocido a ser incorporado na cadeia polipeptdica em crescimento. O stio E (do ingls exit),
ou stio de sada, ocupado transitoriamente pelo RNAt livre de aminocido que acabou de
sair do stio P e que est, portanto, saindo do ribossomo. Enquanto o stio E est ocupado, a
afinidade do stio A fica muito reduzida, impedindo assim que um novo aminoacil-RNAt entre no
ribossomo antes que ele esteja pronto para receb-lo. Assim, o caminho do RNAt no ribossomo
se d na seguinte seqncia: ele entra no stio A, passa para o stio P e finalmente deixa o
ribossomo pelo stio E.
Cada ribossomo apresenta um segmento da cadeia polipeptdica em processo de
sntese, com comprimento correspondente ao segmento de RNAm j traduzido por ele. Essa
cadeia polipeptdica em formao costuma ser chamada de protena nascente.
Em geral, sobre uma molcula de RNA mensageiro, so encontrados vrios
ribossomos, cada um deles com um fragmento de protena nascente. Se olhssemos da
extremidade 5' para a 3' do RNA mensageiro, veramos os ribossomos a ele associados
apresentando protenas nascentes progressivamente maiores, pois os ribossomos mais
prximos da extremidade 3' estariam mais prximos do fim da sntese do polipeptdeo. A esta
estrutura formada por uma molcula de RNA mensageiro associada a vrios ribossomos d-se
o nome de polissomo.
O tamanho de um polissomo depende tanto do comprimento do RNAm quanto da
eficincia com o que o ribossomo capaz de se ligar ao mensageiro para iniciar a traduo.
Em bactrias, os polissomos contm, em geral, dezenas de ribossomos e podem ser
encontrados associados ao DNA. Isso ocorre porque em bactrias, a traduo e a transcrio
so acopladas, ou seja, os RNAm comeam a ser traduzidos antes do trmino de sua sntese.
Nos eucariontes, os polissomos apresentam em mdia 8 ribossomos e so
encontrados no citoplasma, livres no citossol ou presos s paredes do retculo endoplasmtico.
Podemos ter uma idia da atividade de sntese de protena em uma clula examinando
o nmero de alguns elementos envolvidos nesse processo em uma bactria, por exemplo. A
clula de Escherichia coli possui cerca de 20 mil ribossomos, que constituem um quarto da
massa total da clula, cerca de 3 mil cpias de cada tipo de RNAt e por volta de 1500
molculas de RNAm.
O processo de sntese de protenas costuma ser dividido em trs etapas: iniciao,
elongao e terminao.
A iniciao consiste nas reaes que precedem o incio da formao do peptdeo,
portanto, a etapa que ocorre antes da unio dos primeiros aminocidos. Ela consiste na
ligao do ribossomo ao RNAm formando um complexo de iniciao que contm o primeiro
aminoacil-RNAt (o da N-formilmetionina em bactrias). A iniciao uma etapa demorada e
pode ser decisiva na determinao da freqncia com que um mensageiro ser traduzido.
A elongao compreende todas as reaes que ocorrem desde a formao da
primeira ligao peptdica at a incorporao do ltimo aminocido do peptdeo, sendo a etapa
mais rpida da sntese de protenas. Em bactrias, so adicionados cerca de 15 aminocidos
por segundo cadeia polipeptdica em crescimento, de modo que a sntese de um polipeptdeo
com 300 aminocidos leva cerca de 20 segundos. Em eucariontes, a velocidade menor, so
adicionados cerca de 2 aminocidos por segundo.
A termi nao compreende os processos necessrios liberao do polipeptdeo
pronto. Nesta etapa, o ribossomo se dissocia do RNAm.

ETAPAS DA SNTESE DE PROTENAS

Apesar de muito semelhante nos aspectos gerais, a sntese de protenas difere entre
clulas procariticas e clulas eucariticas. As principais diferenas so observadas na etapa
de iniciao do processo.

50
A iniciao da traduo em procariontes

Em E. coli, o processo de iniciao da traduo requer a presena de uma subunidade
menor do ribossomo (30S), um RNAt especial iniciador da traduo, uma molcula de RNAm e
trs fatores proticos de iniciao.
Inicialmente uma subunidade ribossomal 30S livre associa-se a um RNA mensageiro. A
formao desse complexo depende da interao de bases entre uma seqncia do RNAr 16S
e uma regio especial do RNAm, conhecida como seqncia de Shine-Dalgarno. Essa
seqncia corresponde a um consenso de 6 bases localizado sete nucleotdeos acima do
cdon de iniciao AUG. A regio do RNAm que compreende a seqncia de Shine-Dalgarno
e que interage com o ribossomo no processo de iniciao denominada stio de ligao do
ribossomo e compreende cerca de 40 nucleotdeos.
Em seguida, um RNAt especial, o RNAt-
fMet
A adio da subunidade maior do ribossomo posiciona o RNAt-
(da N-formilmetionina, associado a um fator
de traduo, combina-se ao complexo formado pela subunidade do ribossomo 30S e pelo
RNAm. O passo final da iniciao a associao da subunidade maior do ribossomo para
construir um ribossomo completo.
fMet

no stio P do
ribossomo completo. Este o nico RNAt bacteriano capaz de entrar no stio P diretamente,
sem ter que passar pelo stio A, como acontece com os demais RNA transportadores. Com o
RNAt inciador no stio P, o stio A fica posicionado no segundo cdon do mensageiro e ir
determinar qual aminoacil-RNAt ser incorporado nessa posio.

A iniciao da traduo em eucariontes

A iniciao da traduo em eucariontes mais complexa que nos procariontes e
envolve diversos fatores de iniciao e no ser tratada aqui.

A elongao da cadeia polipeptdica

O processo da elongao da cadeia polipeptdica basicamente o mesmo em
procariontes e eucariontes. A adio de um aminocido novo cadeia em crescimento ocorre
em trs etapas: (1) ligao de um aminoacil-RNAt ao stio A do ribossomo; (2) transferncia da
cadeia polipeptdica em crescimento do stio P para o stio A atravs da ligao peptdica com o
aminocido recm-chegado e (3) translocao do ribossomo ao longo do RNAm, transferindo o
novo peptidil-RNAt do stio A para o stio P, com posicionamento do prximo cdon a ser
traduzido no stio A. Durante a terceira etapa, o RNAt descarregado translocado para o stio
E. Esses trs passos so repetidos de maneira cclica e vrios fatores so importantes nesses
processos.
Na primeira etapa, o aminoacil RNAt se liga ao stio A e sua especificidade
determinada pelo cdon do RNAm ali posicionado. Os trs nucleotdeos do anticdon devem
emparelhar com os trs nucleotdeos do cdon.
A formao de uma ligao peptdica no ribossomo consome pelo menos 3 ligaes
fosfato de alta energia: uma para carrregar o RNAt com seu aminocido especfico (aminoacil-
sintetase), outra para ligar o aminoacil-RNAt ao stio A do ribossomo na primeira etapa e a
terceira gasta no movimentos de translocao do ribossomo.
O processo de elongao de um peptdeo muito rpido. Na E. coli, as trs etapas que
culminam com a adio de um nico aminocido leva cerca de 0,05 segundos. Logo, a sntese
de um peptdeo contendo 300 aminocidos leva apenas 15 segundos. Considerando a sua
complexidade e especificidade, a rapidez do processo de traduo surpreendente.

O trmino da traduo

Como j vimos, existem trs cdons do cdigo gentico que no codificam
aminocidos (UAG, UAA e UGA), sendo usados como sinais de trmino da sntese da cadeia
polipeptdica. Em bactrias, o cdon UAA o cdon de terminao mais utilizado, e UGA
mais usado que UAG.
Nenhum dos cdons de terminao tem um RNAt correspondente, eles so
reconhecidos diretamente por fatores proticos. Em E. coli, os fatores que catalisam a
terminao so denominados RFs (do ingls release factors). RF-1 reconhece o cdon UAA e
51
UAG, e RF-2 reconhece os cdons UGA e UAA. Esses fatores entram no stio A do ribossomo,
quando este stio se posiciona sobre um cdon de terminao. Eles tambm requerem a
presena de um peptdil-RNAt no stio P para agir. Nos eucariontes, existe apenas um fator de
terminao, o chamado eRF. Para o eRF se ligar ao ribossomo necessrio GTP, que
provavelmente clivado aps a concluso da etapa de terminao. A reao de terminao
consiste na liberao do polipeptdeo pronto do RNAt, expulso do ltimo RNAt do ribossomo e
dissociao do ribossomo do RNAm.

QUADROS DE LEITURA DO RNA MENSAGEIRO

Dada uma seqncia de bases do DNA ela pode ser lida teoricamente em trs quadros
de leitura, um comeando na primeira base, outro na segunda base e outro na terceira base;
uma leitura a partir da quarta base repete o primeiro quadro e assim por diante.
Um quadro de leitura formado exclusivamente por trincas que significam aminocidos
chamado de quadro de leitura aberto ou ORF (do ingls open reading frame). Um quadro de
leitura que no pode ser traduzido, porque interrompido por um cdon de terminao, dito
bloqueado. Se uma certa seqncia de DNA est bloqueada nos seus trs quadros de leitura
possveis, ela no pode ter funo de codificar protena.
Uma seqncia que traduzida em protena tem um quadro de leitura que comea
sempre com um cdon de iniciao e se extende por uma srie de cdons sucessivos que
significam aminocidos, at atingir um cdon de terminao.
A identificao de um quadro de leitura aberto em uma seqncia de DNA no significa
obrigatoriamente que tal seqncia seja traduzida em protena at que tal fato seja
efetivamente demonstrado pela identificao do seu produto protico (Fig. 11).

Figura 11. Resumo da organizao da informao gentica na molcula de DNA. Uma molcula de DNA uma dupla
hlice formada por duas cadeias polinucleotdicas. A informao encontra-se na seqncia de bases ao longo de uma
das cadeias (cadeia com sentido). A expresso de um gene se d pela transcrio de uma seqncia de bases do
DNA em uma molcula de RNAm.

A transcrio da informao gentica em RNA e a traduo em protenas so
reguladas por seqncias especiais de bases presentes no DNA e no RNA. Uma dessas
seqncias no DNA forma o stio de ligao da polimerase do RNA. Esse stio de ligao
localiza-se antes do stio de incio de traduo presente no RNAm. No DNA localiza-se tambm
o stio de trmino da transcrio, o qual fica alm do stio de trmino da traduo localizado no
RNAm.

52
TCNICAS QUE PERMITEM A MANIPULAO DO DNA
Bio-211 Biologia Molecular Apostila Prtica

DIGESTO DE CIDOS NUCLICOS

Existem vrias enzimas que atuam sobre os cidos nuclicos, algumas sem
especificidade em relao s bases, como a DNase que degrada molculas de DNA e a RNase
que degrada molculas de RNA. H tambm enzimas, como as enzimas de restrio, que
atuam de modo especfico, isto , cortam as molculas de DNA em locais com seqncias de
bases especficas. Essas enzimas diferem entre si quanto seqncia de bases do DNA que
reconhecem e cortam. As seqncias de reconhecimento so em geral palindromicas, isto ,
possuem a mesma seqncia de 4 ou mais nucleotdeos, quando lida na direo 5- 3, em
ambas as fitas. As enzimas de restrio cortam ambas as fitas o DNA sempre entre o mesmo
par de nucleotdeos (Figura 12).

Figura 12. Exemplos de seqncias de nucleotdeos que so reconhecidas e cortadas por enzmas de restrio. As
seqncias so palindmicas, isto , a seqncia de nucleotdeos a mesma se a hlice for girada 180 graus ao redor
do centro do segmento. As enzimas cortam as duas fitas do DNA dentro do stio de reconhecimento. Para algumas
enzimas como HpaI, o corte produz extremidade em fundo cego, para outras, como EcoRI, HindIII e PstI, o corte produz
extremidade assimtricas e que so coesivas, ou seja, podem ser reunidas novamente e recompor a dupla-hlice por
ao da enzima ligase.

Os fragmentos gerados pela digesto de uma amostra de DNA com uma determinada
enzima de restrio podem ser separados e identificados por eletroforese.

ELETROFORESE

Eletroforese um termo geral que se refere tcnica de separao ou caracterizao
de molculas carregadas eletricamente com base em suas taxas especficas de migrao em
um campo eltrico. O processo geralmente realizado em uma matriz porosa de modo que as
macromolculas possam migrar diferencialmente de acordo com sua propriedades fsicas.
53
A matriz comumente usada na separao de molculas de DNA com tamanhos
variando entre 100 e 30.000 pares de bases o gel de agarose, uma forma de agar altamente
purificada. A matriz porosa do gel de agarose serve como uma peneira molecular atravs da
qual as molculas movem-se com velocidades diferentes, inversamente proporcionais ao seu
tamanho. Assim, quanto menor for a molcula, maior ser a distncia que ela percorre em um
determinado perodo de tempo.
Os fragmentos de DNA migram em direo ao plo positivo, uma vez que tm carga
eltrica negativa, conferida pela ionizao dos seus grupos fosfatos. Aps a migrao
eletrofortica, todas as molculas de DNA de mesmo tamanho ficam agrupadas em uma
determinada regio do gel e so visualizadas como uma banda.
Podemos dividir o procedimento de eletroforese em quatro etapas: preparao do gel
de agarose, aplicao das amostras, eletroforese e anlise dos fragmentos separados.
A concentrao da agarose no preparo do gel escolhida em funo do tamanho dos
fragmentos que se deseja separar. Uma certa quantidade de agarose colocada em um
volume adequado de soluo tampo, de modo a se obter a concentrao desejada. A mistura
aquecida para derreter a agarose e em seguida despejada em uma bandeja. Sobre a
soluo ainda quente na bandeja coloca-se um pente plstico que forma cavidades ou poos
no gel quando a agarose se solidifica. Ao esfriar, a agarose constituir um gel solidificado,
formado por uma densa rede de molculas interligadas.
As amostras de DNA so ento aplicadas e a cuba contendo o gel submerso em
soluo tampo conectada a uma fonte de corrente contnua. A corrente eltrica gerada pela
fonte se transmite atravs da soluo tampo e faz com que as molculas migrem em direo
ao plo positivo, saindo do poo e penetrando no gel.
Aps algum tempo, quando os corantes atingem uma distncia adequada dos poos, a
corrente desligada e o gel transferido para uma soluo contendo o corante brometo de
etdeo, especfico para cido nuclico. Os corantes aplicados juntamente com a amostra de
DNA auxiliam no monitoramento do tempo de corrida.
O gel ento imerso em uma cuba contendo o tampo de corrida da eletroforese e o
pente cuidadosamente removido do gel, deixando uma srie de poos para a aplicao das
amostras. Antes da aplicao, as amostras de DNA so misturadas a uma soluo densa,
contendo sacarose ou glicerol, a qual contem tambm um ou dois corantes que auxiliam a
monitorar o deslocamento das molculas no gel.
O primeiro sinal de que a corrente eltrica realmente est passando pela cuba a
visualizao dos produtos da eletrlise da gua, ou seja, bolhas de hidrognio se formam no
eletrodo negativo e o gs oxignio surge a partir do eletrodo positivo. Minutos depois possvel
verificar que os corantes aplicados juntamente com o DNA j esto migrando atravs do gel,
em direo ao plo positivo. A banda que se move mais rapidamente a do corante azul de
bromofenol, de cor mais azulada. Ela migra do mesmo modo que um fragmento de DNA com
cerca de 500 pares de bases.
A visualizao dos gis de agarose depende da transiluminao com luz ultravioleta,
que faz o brometo de etdeo fluorescer com a cor laranja. Uma luz ultravioleta de comprimento
de onda entre 260-360nm emite luz na amplitude tima para iluminar os gis corados com
brometo de etdeo.
As fotografias obtidas a partir dos gis de agarose so muito importantes como registro
dos experimentos realizados e indispensveis para a interpretao posterior dos mesmos. Uma
cmara Polaroid utilizada para fotografar os gis colocados sobre um transiluminador de
ultravioleta.
Molculas lineares de DNA migram em matrizes porosas (gis) submetidas a
eletroforese, em taxas que so inversamente proporcionais ao log
10
de seus pesos
moleculares. O tamanho de um fragmento de interesse pode ento ser determinado
comparando sua mobilidade com molculas padres de tamanho conhecido. Assim sendo,
entre as amostras aplicadas em um gel, pelo menos uma das raias deve conter uma srie de
fragmentos de tamanho conhecido de modo a permitir a construo de uma curva padro que
permitir a estimativa de tamanhos de fragmentos desconhecidos. O marcador mais
amplamente utilizado o DNA do fago lambda () digerido com a enzima Hind III, pois fornece
uma gama de fragmentos que variam entre 23.130 e 564 pares de bases (Veja raias 1 e 8 da
figura apresentada na Prtica 3).
54
SOUTHERN BLOT

A hibridao de DNA pela tcnica de Southern permite a visualizao de fragmentos
especficos de DNA entre todos os fragmentos que compem um genoma complexo. Nessa
tcnica, o DNA genmico digerido por uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos
resultantes so separados por eletroforese. O DNA presente nas amostras desnaturado por
imerso do gel em uma soluo com pH superior a 10,5 e, em seguida, os fragmentos de DNA
so ento transferidos do gel para uma membrana. Em seguida a membrana exposta a uma
soluo contendo uma sonda, ou seja, uma molcula de cido nuclico de fita simples, que
tenha seqncia complementar ao fragmento que se tem interesse em detectar. Uma sonda
pode ser um oligonucleotdeo sinttico, um plasmdeo onde foi clonada uma seqncia de
interesse ou ainda um RNA (Figura 13).

Figura 13. Representao do mtodo de Southern blotting.

A dupla hlice da molcula de DNA mantida atravs de pontes de hidrognio
formadas entre os pares de bases complementares adenina-timina e guanina-citosina. A
temperaturas acima de 90
o
Como mencionado anteriormente, pode-se empregar uma sonda de DNA fita simples
para reconhecer e hibridar com sua seqncia complementar em uma amostra de DNA
genmico (ou outros alvos). Para que isso seja possvel, a sonda deve ser marcada por
radioatividade, cor ou quimiluminescncia com o objetivo de permitir a sua visualizao. Sob
condies restritivas de reao, molculas de DNA de fita dupla estveis sero formadas
apenas quando houver um perfeito emparelhamento de bases ao longo de todo o segmento
que hbrida, ou seja, entre a sonda e o DNA alvo.
C ou a pHs superiores a 10,5 essas pontes de hidrognio so
rompidas, separando as fitas complementares, o que corresponde desnaturao da molcula
de DNA. Em condies adequadas de sal, temperatura e pH, as fitas complementares podem
restaurar-se, recompondo assim a molcula de DNA original. Esse processo onde fitas simples
alinham-se e formam molculas em dupla fita conhecido como hibridao.
Aps o processo de hibridao do DNA preso ao gel com a sonda marcada so
realizados procedimentos para a visualizao do local de hibridao. Quando a sonda foi
marcada com istopos radioativos a membrana coberta com um filme de raio X que, aps
algum tempo de exposio, revelado. A hibridao aparece como gros de prata depositados
no filme. No caso de sonda marcadas com digoxigenina, por exemplo, aps a hibridao a
membrana incubada com um anticorpo anti-digoxigenina. Esse anticorpo liga-se
digoxigenina incorporada na sonda durante o processo de marcao. O imunocomplexo
resultante pode ser detectado por uma reao colorida iniciada pela enzima fosfatase alcalina,
que est ligada ao anticorpo. Um precipitado de cor marrom-prpura indicar as reas da
membrana onde houve ligao da sonda com os fragmentos de restrio contendo as
seqncias de DNA complementares (Figura 14)

55

Figura 14. Esquema de utilizao de uma sonda de DNA marcada com digoxigenina para a deteco de fragmentos
complementares. A digoxigenina incorporada na sonda reconhecida por um anticorpo anti-digoxigenina acoplado a
fosfatase alcalina.

Figura 15. Deteco da mutao no gene da anemia falciforme mediante o uso de enzimas de restrio e da tcnica
de Southern blotting.
56
A REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Paulo A Otto, Regina Clia Mingroni, ngela Maria Vianna Morgante 2006 Princpios de Gentica
Humana e Mdica. Em: Tratado de Clnica Mdica

, Amato Carlos Lopes Editor. Editora Roca Ltda.

Uma tcnica cuja introduo acarretou uma avalanche de inovaes na rea da
gentica molecular foi a chamada reao em cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain
Reaction), desenvolvida na dcada de 1980. A PCR consiste em uma sucesso de reaes de
replicao de uma molcula de DNA, realizada em tubo de ensaio. Parte-se de uma amostra
de DNA-alvo, por exemplo, uma certa amostra de DNAS genmico de um indivduo. So
fornecidos os reagentes necessrios replicao do DNA, que incluem os quatro tipos de
nucleotdeos na forma trifosfatada, ons e um par de iniciadores de reao (primers), que so
oligonucleotdeos cujas seqncias de bases so complementares s seqncias de bases
que flanqueiam o segmento de DNA que se deseja amplificar por meio da PCR. A necessidade
de um par de iniciadores da reao decorre de uma peculiaridade do prprio mecanismo de
replicao do DNA in vivo: as polimerases que replicam o DNA so incapazes de iniciar a
sntese de uma nova cadeia a partir da cadeia molde; s so capazes de alongar uma cadeia
de cido nuclico pr-existente, que lhe fornece uma extremidade 3 livre na qual sero
adicionados os novos nucleotdeos trifosfatados. Na clula viva, os iniciadores (primers) so
adicionados, nucleotdeo a nucleotdeo, por uma RNA polimerase e constitudos por
ribonucleotdeos. Na reao da PCR, os primers so sintetizados artificialmente e se
constituem de curtos segmentos de 15 a 23 desoxirribonucleotdeos. As seqncias de bases
dos primers so definidas em funo de sua complementaridade com a seqncia de bases
que flanqueia o segmento de DNA que se deseja amplificar. Aps sucessivos ciclos de
desnaturao do DNA (por aquecimento da amostra), hibridao dos primers (com o
resfriamento da amostra) e extenso dos fragmentos pela DNA polimerase (a temperatura de
cerca de 72
o
Nem todo o DNA genmico amplificado, mas apenas o segmento de DNA
compreendido entre o local de hibridao de ambos os primers amplificado. De maneira
anloga ao que ocorre na tcnica de Southern blotting, a PCR permite evidenciar, dentre uma
coleo de fragmentos de DNA do genoma de um indivduo, apenas um pequeno trecho. As
vantagens dessa tcnica so numeras: pequenas quantidades de DNA podem ser analisadas e
o resultado costuma ser obtido muito mais rapidamente do que na tcnica de Southern. No
entanto, o planejamento dos primers da PCR requer prvio da seqncia de bases do DNA-
alvo que se deseja amplificar. A PCR, sem dvida, revolucionou os diagnsticos laboratoriais
com base no estudo do DNA e permitiu avanar muito tambm no que diz respeito ao
diagnstico pr-natal e identificao individual, com nfase em questes forenses.
C, a alquota de DNA inicial amplificada milhares de vezes, como mostrado na
Figura 16).
Se um indivduo for portador de uma substituio de bases em um certo gene que
altera o local de corte de uma enzima de restrio, o produto obtido pela PCR de um segmento
desse gene pode ser clivado com a enzima. A anlise dos fragmentos obtidos pode mostrar a
presena dessa substituio. De maneira anloga ao blotting, o tamanho do fragmento
amplificado pode indicar uma deleo ou uma insero de bases. A ausncia completa de
amplificao de um fragmento revela a deleo completa da regio do gene que est contida
entre os dois primers.

57

Figura 16. Esquema mostrando como funciona a tcnica da PCR.
58

CONCEITOS GERAIS DE GENTICA BSICA APLICVEIS GENTICA HUMANA E
MDICA


Como cada pessoa se origina de um zigoto que recebe um complemento simples ou
haplide de cromossomos de cada genitor, os cromossomos de cada clula esto
representados por pares de cromossomos ditos homlogos, um lote de origem materna e outro
de origem paterna. Dos 23 pares de cromossomos encontrados no ncleo de uma clula
humana diplide qualquer, 22 pares so comuns a indivduos de ambos os sexos e recebem o
nome de autossomos. O vigsimo-terceiro par formado por dois cromossomos X (nesse caso,
tambm homlogos) nas mulheres e por um par exibindo heteromorfismo em indivduos de
sexo masculino (um cromossomo X e um cromossomo Y). Diz-se, portanto, que a mulher tem
23 pares de cromossomos homlogos (incluindo os dois cromossomos X) e os homens 22
pares de cromossomos homlogos e um par de cromossomos heterlogos (um X e um Y).
Atravs de um processo de diviso especial denominado meiose, as clulas da linhagem
germinativa originam os gametas masculinos e femininos, cada um deles (espermatozides e
vulos) contendo um lote haplide de 23 cromossomos. Enquanto todos os vulos possuem 22
autossomos e um cromossomo X, existem dois tipos de espermatozides, uns contendo o
cromossomo X e outros contendo o cromossomo Y. No momento da fecundao, dependendo
do cromossomo sexual contido no espermatozide, originar-se- um zigoto destinado ao sexo
masculino ou ao sexo feminino, se o cromossomo sexual for o Y ou o X, respectivamente.
Como metade dos espermatozides carregam o cromossomo X e a outra metade o Y, espera-
se que recm nascidos de sexo feminino e masculino ocorram em propores
aproximadamente iguais (diz-se ento que a razo sexual ao nascimento cerca de 1).
Nos cromossomos, os genes esto situados em posies especficas que recebem o
nome de locos, que so ditos homlogos em relao a todos os autossomos e ao par de
cromossomos X em mulheres. Em indivduos de sexo masculino, os cromossomos sexuais X e
Y apresentam apenas alguns poucos locos em comum. A maior parte dos genes do Y esto
ligados determinao gentica do sexo do embrio e da fertilidade masculina; fora isso, o
cromossomo Y relativamente pobre em genes que codificam protenas; portanto, a maioria
dos genes do cromossomo X ocorrem em dose nica em machos.
Os genes situados em um mesmo loco so ditos alelos e todos os alelos de um
mesmo gene presentes nos indivduos da populao originam-se por mutao de alelos pr-
existentes. Assim, os alelos resultam de diferenas nas seqncias de bases nucleotdicas do
DNA em um gene. Estudos recentes de biologia molecular tm mostrado que o nmero de
alelos albergados em qualquer loco geralmente muito grande, o que confere s populaes
um alto grau de variabilidade gentica, mostrando, portanto que a plasticidade evolutiva dos
seres humanos e de todos os organismos de uma maneira geral enorme.
Normalmente designamos os alelos de um loco usando uma mesma letra ou
abreviatura para indicar que pertencem a um mesmo loco e ndices para diferenci-los entre si
(por exemplo, a
1
, a
2
, a
3
etc). Os indivduos que possurem num mesmo loco autossmico duas
cpias iguais de um mesmo alelo (por exemplo, a
1
a
1
) so ditos homozigotos (no caso, quanto
ao gene a
1
); quando o loco estiver ocupado por dois alelos diferentes (por exemplo, a
1
a
2
ou
a
2
a
3
) o seu portador dito heterozigoto. As constituies genticas exemplificadas acima
(a
1
a
1
, a
1
a
2
, a
2
a
3
) so denominadas gentipos. Em relao a locos do X em indduos de sexo
masculino, os gentipos correspondero simplesmente aos alelos (por exemplo, b
1
, b
2
, b
3
etc)
possveis e costuma-se referir a esses indivduos como hemizigotos (respectivamente quanto
aos alelos b
1
, b
2
, b
3
etc).
O gentipo do indivduo pode determinar uma caracterstica fsica ou fisiolgica
qualquer, comumente referida como fentipo. Os alelos que compem o gentipo interagem de
vrias maneiras, originando os vrios fentipos.
Quando o fentipo correspondente a um dos homozigotos semelhante ao dos
heterozigotos, diz-se que a caracterstica que se expressou no heterozigoto a dominante. A
que no se expressa no heterozigoto dita recessiva. Por exemplo, em relao aos grupos
sangneos do sistema ABO, os alelos A e B so ambos dominantes em relao ao alelo O,
que recessivo. Assim, indivduos de grupo sangineo "A", que possuem apenas antgenos A
59
recobrindo suas hemcias, podem ter gentipo AA ou AO; de maneira semelhante, indivduos
"B" podem ter gentipo BB ou BO, mas a indivduos "O" corresponde apenas o gentipo OO,
que indica a ausncia dos dois antgenos.
No entanto, existem situaes em que a cada gentipo corresponde um fentipo
distinto: fala-se ento de semidominncia ou dominncia incompleta quando o fentipo do
heterozigoto intermedirio em relao aos fentipos dos dois tipos de homozigotos, e de
codominncia quando cada um dos dois produtos tpicos dos homozigotos est presente no
heterozigoto. Um exemplo clssico de codominncia dado pelo sistema de grupos
sangneos MN, no qual os indivduos homozigotos MM ou NN apresentam na superfcie de
suas hemcias apenas antgenos M ou N, enquanto heterozigotos MN apresentam os dois
tipos de antgenos. Esse tambm o caso dos alelos A e B, no sistema ABO, em que o
indivduo com o gentipo AB possui os dois tipos de antgenos nas hemcias.
A designao herana intermediria mais apropriada para caractersticas
quantitativas, que discutiremos mais adiante, como tamanho ou pigmentao, em que
indivduos Aa, por exemplo, apresentam um fentipo que aproximadamente a mdia dos
fentipos apresentados por AA e aa.
As regras de transmisso das caractersticas biolgicas determinadas geneticamente
so extremamente simples se considerarmos um loco autossmico com dois alelos, com ou
sem dominncia, como mostra a Tabela 2 abaixo, que rene os resultados dos cruzamentos
que podem ocorrer numa populao qualquer:

Tabela 2 - Resultados possveis em casamentos envolvendo locos autossmicos biallicos,
com e sem dominncia (D =fentipo dominante, correspondente ao gentipo A- =AA ou Aa; r
=fentipo recessivo, equivalendo ao gentipo aa)

Tabel a 2 Resultados possveis em casamentos envolvendo locos autossmicos biallicos, com e sem dominncia.

importante ter-se em conta que as percentagens esperadas na prole de cada tipo de
cruzamento parental correspondem a probabilidades que somente iro corresponder a valores
observados em um nmero de amostragens enorme. Como os resultados genotpicos na prole
independem de resultados que j ocorreram, a chance de nascer uma criana aa de um casal
de heterozigotos Aa x Aa, por exemplo, sempre 1/4, quaisquer que sejam os gentipos dos
filhos que j nasceram. No campo das anedotas de gentica mdica, muito conhecida aquela
do casal de heterozigotos Aa quanto a cor de olho que perguntou ao seu mdico o que seria
preciso fazer para nascer uma criana de olhos claros (aa). A resposta que recebeu foi que era
muito simples, pois bastava que o casal tivesse quatro filhos: trs iriam nascer com olhos
castanhos e um com olhos azuis!
Em se tratando de locos biallicos ligados ao cromossomo X, no caso de codominncia
existiro trs fentipos possveis femininos, cada um equivalente a um gentipo diferente (por
exemplo X
B
X
B
, X
B
X
b
e X
b
X
b
), e dois masculinos (com ou sem dominncia, os fentipos
masculinos correspondero sempre aos gentipos X
B
e X
b
). No caso de dominncia entre os
alelos X
B
e X
b
, existiro dois fentipos (dominante e recessivo) tanto em fmeas como em
machos, porm correspondendo respectivamente aos gentipos X
B
X
-
= X
B
X
B
ou X
B
X
b
e
X
b
X
b
, ou X
B
e X
b
.
60
A Tabela 3 mostra os casamentos possveis com as freqncias esperadas dos diversos tipos
nas respectivas proles em relao a essas duas situaes.

Tabel a 3 Resultados possveis em casamentos envolvendo locos ligados ao X biallicos, com e sem dominncia.

No caso de genes do cromossomo X importante lembrar-se que, dos dois
cromossomos X de uma clula diplide de uma mulher qualquer, apenas um est
geneticamente ativo, com todos os seus genes funcionando normalmente; o outro encontra-se
inativado, com apenas uns poucos locos ativos. Essa inativao do cromossomo X em clulas
femininas tem incio nas primeiras fases de segmentao do embrio, completando-se entre a
segunda e a terceira semanas da vida embrionria em humanos (fase em que o blastocisto
est se aninhando na mucosa uterina, ocasio em que conta com cerca de 1000 a 2000
clulas). Um dos dois cromossomos X da mulher (o de origem materna ou o de origem
paterna), ao acaso, sofre um processo de condensao numa clula que at ento
apresentava os dois cromossomos X com todos os seus locos ativos; todas as clulas
descendentes dessa clula, no entanto, tero sempre o mesmo X inativado. Esse processo
("teoria de Lyon") recebe o nome de lyonizao em homenagem sua descobridora, a cientista
inglesa Mary Lyon. O resultado disso um fenmeno conhecido como compensao de dose:
inativando aleatoriamente um dos cromossomos X nas clulas femininas, em mdia a
quantidade de produto do gene de cada loco do X ser a mesmo tanto em machos como em
fmeas. Outra conseqncia disso que, devido a pequenos desvios naturais da taxa
esperada de inativao ao acaso (segundo a qual se espera que cerca de metade dos X
inativados sejam os de origem materna), as mulheres apresentam uma maior variabilidade que
os homens na expresso fenotpica dos genes ligados ao X.
Na herana dita quantitativa, o fentipo do indivduo vai depender da interao de
diversos pares de genes situados em locos que segregam independentemente nos diversos
cromossomos. Existem vrios modelos de herana quantitativa; no mais comumente citado, a
caracterstica depende da interao de um nmero relativamente grande de genes distribudos
nos vrios cromossomos e cada um deles tendo efeito aditivo relativamente pequeno; num
outro modelo, o fentipo resultaria de interaes complexas entre genes de efeito marcante
localizados num nmero restrito de locos. Existem provavelmente ainda sistemas que se
comportam como hbridos desses dois, albergando ao mesmo tempo genes de pequeno efeito
aditivo, situados em vrios locos, ao lado de outros (em quantidade restrita) com efeito mais
marcante ("genes principais"). Todos os trs modelos admitem, ainda, a interveno de fatores
ambientais na expresso fenotpica das caractersticas quantitativas, tanto assim que esses
modelos comumente so referidos como multifatoriais, resultando da ao conjunto de
sistemas polignicos e de fatores ambientais (entendendo-se como tal todos os fatores que
no so genticos). A interveno destes ltimos em caractersticas como o peso e a altura
bvia. Vrios autores ainda se preocuparam em elaborar ndices que medem a participao
relativa de fatores ambientais e genticos na determinao dessas caractersticas. Um desses
ndices a taxa de herdabilidade, que tenta determinar a proporo de variabilidade fenotpica
61
de uma caracterstica atribuvel a fatores genticos.
Na verdade, a influncia no se limita s caractersticas multifatoriais discutidas acima.
Nosso fentipo, de uma maneira geral, resulta da interao entre o gentipo e o ambiente. Isso
claramente exemplificado no caso da fenilcetonria: para apresentar a doena, um indivduo
precisa, alm do gentipo recessivo, ingerir fenilalanina em sua dieta.
A maioria dos conceitos acima so diretamente aplicveis a caractersticas fenotpicas
normais, freqentes na populao.
Quando essas caractersticas so condies patolgicas (defeitos isolados, doenas,
sndromes, seqncias, associaes ou complexos malformativos), o primeiro problema que
tem lugar que elas so extremamente raras na populao, tipicamente cada uma delas
ocorrendo com freqncias da ordem de 1/10.000 ou menos; as excees so dadas
geralmente por uma ou outra condio excepcionalmente mais freqente em alguns grupos
tnicos, como o caso da fibrose cstica em populaes de extrao nrdica, da doena de
Tay-Sachs em judeus de extrao asquenazi e da anemia falciforme entre indivduos de origem
africana. Essa raridade explicada pelo fato de que qualquer caracterstica gentica s pode
ser difundido na populao atravs de mutaes, que ocorrem espontanemente com
freqncias insolitamente baixas, ou atravs de portadores do gene mutante, que o transmitem
a seus descendentes; como a caracterstica patolgica, redunda direta ou indiretamente na
diminuio da probabilidade de reproduo de seus portadores, de modo que se no fosse
pelas mutaes (que so capazes de manterem os genes mutantes patolgicos apenas em
freqncias muito baixas) os genes patolgicos desapareceriam totalmente das populaes,
uma vez que os portadores de alelos normais desses genes possuem uma eficincia
reprodutiva maior que os afetados, ento submetidos aos efeitos da seleo natural. Apenas os
genes autossmicos alterados que so totalmente recessivos podem se acumular na
populao em heterozigotos assintomticos, que vo se tornando cada vez mais freqentes;
com isso, acaba ficando provvel a formao de um casal de heterozigotos. Um filho
homozigoto recessivo desses casais (que nasce com probabilidade de 25%) vai ser afetado e
portanto objeto de seleo natural, o que vai impedir que o gene continue a aumentar de
freqncia na populao.

62

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mecanismo autossmico
dominante

Em relao a doenas condicionadas por genes autossmicos dominantes, os afetados
so heterozigotos; apenas em duas (das cerca de trs mil com esse mecanismo confirmado ou
provvel) dessas doenas conhece-se o fentipo dos homozigotos quanto ao alelo que causa a
doena, os quais ocorreram devido a circunstncias excepcionais: na acondroplasia, onde o
fentipo (nanismo) favoreceu a formao de casais de afetados heterozigotos, e na
hipercolesterolemia familial, onde afetados heterozigotos (tipicamente com histria de
acidentes vasculares na terceira ou quarta dcadas de vida) ocorrem com freqncia
relativamente alta na populao (da ordem de 1/500); do casamento ao acaso entre alguns
desses heterozigotos (com chance de 1/500 x 1/500 =1/250.000) nasceram alguns afetados
homozigotos (com 1/4 da chance anterior, ou seja 1/1.000.000), portadores de quadros
gravssimos de ateroesclerose generalizada e acidentes vasculares ocorrendo em mdia j
antes da puberdade. De certa forma, como se a forma grave fosse determinada por
mecanismo autossmico recessivo, se se considerar que os afetados heterozigotos esto
praticamente isentos de seleo natural, uma vez que a doena neles se manifesta
tardiamente.
Fora essas excees, no entanto, no se conhece o fentipo correspondente aos
homozigotos e a dominncia foi definida condicionalmente ("dominncia condicional"), baseada
no fato de que os heterozigotos Aa manifestam uma doena e no fato de que de casamentos
entre pessoas afetadas e normais em mdia nascem crianas normais e afetadas em
propores aproximadamente iguais, o que coincide com o esperado terico de cruzamentos
Aa x aa = 1/2 Aa: 1/2 aa. No entanto provvel, como foi verificado nos casos da
acondroplasia e da hipercolesterolemia familial, que o fentipo correspondente aos
homozigotos seja sempre diferente e muito mais grave (provavelmente letal) que o dos
heterozigotos.
Quatro fenmenos importantes observados na herana autossmica dominante de
caracteres patolgicos so a ocorrncia natural de casos devidos a mutao nova, a
penetrncia incompleta, a expressividade varivel e a antecipao clnica.
Devido ao fato de ocorrerem na populao com freqncia insolitamente baixa
(geralmente da ordem de 1/10.000 ou menos) freqentemente os casos de doena
autossmica dominante so isolados, resultando de mutaes novas (quando se tiver certeza
de que isso realmente ocorreu, o termo mais adequado para tais casos o de espordicos).
Por isso no causa estranheza o fato de uma parte considervel dos casos dessas doenas
serem espordicos e o fato de, mesmo entre casos familiais, geralmente se poder localizar o
primeiro afetado resultante de mutao nova.
Outra caracterstica freqente nas caracterstica patolgicas autossmicas dominantes
a penetrncia incompleta: tipicamente uma frao dos heterozigotos quanto a esses genes
no apresenta manifestaes fenotpicas detectveis. Quando isso acontece, diz-se que a
caracterstica no penetrou. Entendendo-se por taxa de penetrncia a probabilidade de um
gentipo manifestar-se fenotipicamente. Em muitas doenas autossmicas dominantes a taxa
de penetrncia alta, porm incompleta. Isso significa na prtica que apenas uma
percentagem dos heterozigotos (representada pela taxa de penetrncia K) manifesta sinais e
sintomas caractersticos da doena ou defeito. Por exemplo, no retinoblastoma bilateral, onde o
gentipo dos afetados Rr, a probabilidade de um indivduo que herdou o gene mutante
apresentar o tumor da retina entre o nascimento e no mximo seis anos de idade (cerca de 80
a 90%) depende de haver acontecido um segundo evento mutacional inativando o alelo normal
r, um gene supressor de tumor, em pelo menos um dos cerca de um milho de retinoblastos do
embrio. Nesse caso, a falta de penetrncia tem lugar quando no ocorre esse segundo evento
mutacional em estgio embrionrio, o que acontece com probabilidade de 10 a 20%.
Outro conceito importante em gentica mdica a expressividade, que pode ser
definida no caso das doenas autossmicas dominantes como o grau de manifestao
fenotpica determinado pelo gentipo heterozigoto. A expressividade tipicamente muito
varivel na maioria das doenas determinadas por mecanismo autossmico dominante. Isso
explica porque o diagnstico clnico de patologias desse grupo geralmente difcil, pois alguns
afetados apresentam com certa freqncia sinais e sintomas insuficientes (s vezes ausentes,
63
como no caso de falta de penetrncia de genes com penetrncia incompleta) para se fechar
um diagnstico de certeza. Em casos familiais da doena, no entanto, a ocorrncia de afetados
tpicos parentes prximos de um afetado atpico permite fechar o diagnstico de certeza neste
ltimo.
O fenmeno da antecipao refere-se observao, num conjunto de casos familiais
da doena, de casos conspicuamente mais graves e completos nos indivduos mais jovens,
pertencentes s geraes mais recentes. Antigamente explicava-se o fenmeno
exclusivamente na base de uma tendenciosidade de averiguao: entre os afetados
pertencentes s geraes mais antigas de um heredograma com casos familiais esto
presentes indivduos que conseguiram se reproduzir, conseqentemente menos afetados,
enquanto as geraes mais recentes contm uma amostra aleatria de indivduos com quadros
diversos, geralmente bem mais graves que os apresentados em mdia pelos indivduos das
geraes anteriores. Mais recentemente, no entanto, descobriu-se um certo nmero de
doenas decorrentes de um novo mecanismo de mutao, uma expanso patolgica de
seqncias altamente repetitivas de trinucleotdeos que flanqueiam ou esto inseridas nos
genes correspondentes. Cada vez que o gene transmitido, pode ocorrer aumento no nmero
de cpias dessas seqncias, nmero esse que, a partir de um determinado limiar, impede o
funcionamento do gene ou altera o seu produto de modo a desencadear a patologia. Assim,
nessas doenas, o fenmeno da antecipao tem bases moleculares, pois os indivduos das
geraes mais jovens tm geralmente expanses maiores do que os das geraes mais
antigas. Esto nesse caso a sndrome do X frgil, que a sndrome de retardo mental herdado
mais freqente, a distrofia miotnica de Steinert e vrias doenas neurolgicas, como diversos
tipos de ataxias cerebelares e a doena de Huntington.

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mecanismo autossmico
recessivo

Numa populao onde os cruzamentos ocorrem ao acaso em relao ao fentipo e ao
grau de parentesco entre os indivduos, como se os indivduos da gerao filial resultassem
da combinao ao acaso entre os gametas (espermatozides e vulos) produzidos por todos
os indivduos da populao. Em relao a um loco autossmico qualquer (por exemplo, o que
pode abrigar os alelos A e a), espermatozides contendo os alelos A e a ocorrero nas
freqncias gnicas p e q respectivamente, o mesmo acontecendo com os vulos.
Combinando-se esses gametas ao acaso, verifica-se que a probabilidade de formao de
homozigotos AA na gerao filial o produto p x p =p
2
, da mesma maneira que homozigotos
aa ocorrero com probabilidade q x q =q
2
. Como heterozigotos vo resultar de fecundaes
tanto de vulos A por espermatozides a como de vulos a por espermatozides A, eles iro
ocorrer com probabilidade p x q +q x p =2pq. Em relao a doenas determinadas por padro
autossmico recessivo, a freqncia de heterozigotos no afetados na populao 2pq =2%
aproximadamente para doenas com incidncia ao nascimento da ordem de q
2
=1/10.000,
correspondentes a genes deletrios com freqncia q = 1% = 1/100. Como a chance de
formao casual de um casal de heterozigotos 2pq x 2pq =2% x 2% =1/50 x 1/50 =1/2.500
e como a chance de nascimento de um afetado na prole de casal de heterozigotos 1/4,
chega-se probabilidade de na populao ocorrer um homozigoto filho de dois heterozigotos,
que o produto 1/2.500 x 1/4 =1/10.000, que a prpria freqncia da doena ao nascimento.
O importante a guardar disso tudo que basta nascer uma criana afetada por uma
doena recessiva qualquer para se ficar sabendo que o gene causador do defeito est
presente em heterozigose nos genitores. A no ser nos casos em que ocorram casamentos
consangneos ou nos casos em que o alelo recessivo responsvel esteja em freqncia
elevada em certos grupos populacionais, a doena em geral ficar restrita tipicamente a
apenas uma irmandade, ao contrrio do que pode ser observado nos outros mecanismos de
herana.
Um fenmeno freqentemente associado a doenas causadas por esse tipo de
mecanismo a consanginidade parental, que se encontra aumentada praticamente em todas
as doenas autossmicas recessivas conhecidas. Quanto mais raro for o gene, maior ser a
taxa de consanginidade parental: por exemplo, no caso da fenilcetonria (freqncia
populacional da ordem de 1/10.000) cerca de 10-20% dos casais parentais so primos em
primeiro grau; na aquiropoidia (uma amputao congnita extremamente rara de membros
registrada apenas no Nordeste do Brasil) todos os afetados resultaram de unies
consangneas. No captulo sobre clculo de riscos, que poder ser consultado pelos
64
interessados em detalhes de deduo, mostramos que, enquanto na prole de casais no-
consangineos a probabilidade de uma criana qualquer nascer afetada q
2
, essa mesma
probabilidade toma o valor literal q
2
+pq/16 na prole de primos em primeiro grau. Se dividirmos
essa ltima probabilidade por q
2
obtemos quantas vezes mais provvel ocorrer um caso da
doena na prole de primos do que na de casais no aparentados: RR =[q
2
+q(1-q)/16]/q
2
=1
+(1-q)/16q. Para um valor de q =1% essa expresso toma o valor 1 +99/16 =7,1, o que
significa, por exemplo, que a chance de ocorrer uma criana afetada por fenilcetonria na prole
de primos em primeiro grau sete vezes maior que a chance correspondente prole de casais
no consangneos.

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mecanismo recessivo ligado
ao cromossomo X

Em relao a doenas determinadas por mecanismo recessivo ligado ao cromossomo
X, os afetados so homens hemizigotos que recebem o gene de mes heterozigotas ou que
resultam de mutaes novas. So descritos rarssimos casos de mulheres afetadas. Algumas
so homozigotas (nesse caso, todas resultantes de casamentos entre afetados e mulheres
deles aparentadas); outras excepcionalmente so heterozigotas com desvio muito acentuado
da inativao ao acaso de um dos cromossomos X, de tal modo que a grande maioria dos
cromossomos X inativados os que albergam o alelo normal, o que favorece a manifestao
do fentipo.

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mecanismo dominante ligado
ao cromossomo X

Em relao a doenas determinadas por mecanismo dominante ligado ao X, as
afetadas so geralmente mulheres heterozigotas, que via de regra, possuem quadros clnicos
bem mais brandos que os apresentados por homens hemizigotos quanto ao gene. Isso ocorre
por efeito da lyonizao, devido ao fato de que as mulheres so um mosaico quanto a esses
genes, possuindo em mdia apenas esses genes funcionando em metade de suas clulas - na
outra metade vai estar funcionando o alelo normal. comum a ocorrncia de fentipos letais
em machos, muitos desses fentipos sendo desconhecidos por determinarem a eliminao do
concepto em fases precoces do desenvolvimento. Devido a isso, observa-se comumente a
transmisso da caracterstica dentro das famlias apenas atravs de mulheres afetadas.

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mutaes no DNA
mitocondrial

As mitocndrias so as nicas organelas nas clulas animais que contm DNA prprio,
chamado de DNA mitocondrial (DNAmt). Pode haver centenas ou milhares de mitocndrias por
clulas e cada uma pode conter vrias molculas de DNA. O DNAmt humano uma molcula
de DNA circular, com mais de 16.000 pares de bases de comprimento distribudos em 37
genes mitocondriais que contm a informao necessria para codificar 13 polipepeptdeos, 22
tipos de RNA transportador e dois tipos de RNA ribossmico. No entanto, uma mitocndria
humana incapaz de funcionar adequadamente de maneira independente do genoma nuclear,
pois os demais polipeptdeos e molculas de RNA que atuam nas mitocndrias so codificados
por genes localizados nos cromossomos situados no ncleo.
Estudos de grandes genealogias documentaram a clara herana materna das doenas
causadas por mutaes do DNA mitocondrial. Nesse mecanismo de herana, todas as
mulheres afetadas pela doena podem ter descendentes afetados. No entanto, homens
afetados nunca tm filhos ou filhas afetados. Isso ocorre porque as mitocndrias de um
indivduo so herdadas de sua me, ou seja, as mitocndrias de um indivduo resultam da
multiplicao das mitocndrias originadas de sua me, presentes no ovcito por ocasio da
fecundao. Em geral, os humanos no herdam o DNA mitocondrial presente nos
espermatozides, pois as mitocndrias de origem paterna so destrudas aps a fecundao.
Quando ocorrem mutaes no DNA mitondrial das clulas da linhagem germinativa de
um indivduo, pode se instalar uma doena de herana mitocondrial na sua descendncia.
De maneira geral, os sintomas presentes nas doenas de herana mitocondrial
compreendem alteraes de diversos tecidos, as principais sendo as seguintes: miopatia,
65
alteraes neurolgicas, atrofia ptica, diabetes e surdez. Acredita-se que esses sinais e
sintomas ocorram nas doenas de herana mitocondrial porque a maioria das mutaes j
descrita afeta a eficcia do mecanismo de fosforilao oxidativa e, portanto, a produo de
ATP. Tecidos com elevadas demandas de ATP ou que so submetidos a alteraes muito
rpidas da demanda de ATP seriam os primordialmente afetados pelas mutaes que alteram
o DNA mitocondrial.
O fenmeno da expressividade varivel dos quadros clnicos notvel nas genealogias
onde segregam as mutaes mitocondriais. Geralmente, o grau de variabilidade dessa
expressividade muito maior do que o observado em distrbios semelhantes de herana
autossmica dominante. Por exemplo, a surdez hereditria de herana mitocondrial tem um
grau de expressividade clnica varivel muito maior do que a surdez de herana autossmica
dominante.
Parte da expressividade varivel observada nas doenas de herana mitocondrial tem
sido explicada pela observao de, no mesmo indivduo, e s vezes at mesmo dentro de um
mesmo tecido, poderem ocorrer molculas de DNA mitocondrial com alelos normais apenas,
coexistindo com molculas de DNA mitocondrial mutadas. Esse fenmeno, chamado de
heteroplasmia, freqente na herana mitocondrial e explica em parte porque rgos, tecidos,
ou mesmo indivduos da mesma famlia podem exibir graus da afeco to distintos.
No entanto, mesmo nas famlias onde segregam doenas mitocondriais para as quais
a heteroplasmia rara ou excepcional, ocorre tambm expressividade varivel dos sinais e
sintomas. Fatores ambientais, como por exemplo, a histria de estresse oxidativo, o uso de
medicamentos e o estilo de vida do indivduo podem influenciar a gravidade das
manifestaes. Outro fator tambm capaz de influenciar o quadro clnico seria a variabilidade
gentica presente em diversos outros locos do genoma nuclear, cuja funo tambm codificar
produtos gnicos que atuam nas mitocndrias.

Principais caractersticas das doenas condicionadas por mecanismo multifatorial

No mecanismo conhecido como multifatorial, o fentipo dos indivduos resulta da ao
integrada de genes situados em vrios locos espalhados pelos diversos cromossomos
(mecanismo polignico) e de sua interao com fatores no-genticos comumente referidos
como ambientais.
A maioria dos defeitos e malformaes presentes ao nascimento determinada por
esse tipo de mecanismo. So exemplos tpicos o lbio leporino (com ou sem palato fendido), os
defeitos de fechamento de tubo neural (as espinhas bfidas, as meningomieloceles e a
anencefalias), os diversos tipos de p torto congnito, a estenose hipertrfica do piloro e a
luxao congnita do quadril. Apenas esses defeitos contribuem com um total de afetados ao
nascimento de quase 1%. Tambm so condicionadas por esse tipo de mecanismo doenas
comuns na populao, geralmente nos grupos etrios um pouco mais avanados, como a
lcera pptica gastro-duodenal, a epilepsia, a hipertenso arterial, muitos casos de diabetes
mellitus do adulto e os transtornos do humor. Contrariamente aos defeitos deteminados por
mecanismo monognico, que tipicamente so raros na populao e possuem risco de repetio
elevado quando de ocorrncia familial, os defeitos multifatoriais so relativamente freqentes
na populao (taxas da ordem de 1/1000 ou mais) e possuem risco de repetio pequeno ou
desprezvel (tipicamente da ordem de 5% ou menos).
Outra diferena sutil o limiar de manifestao, aqui representado por uma carga de
alelos deletrios no sistema polignico, como mostrado no esquema da Figura 9, que mostra a
distribuio hipottica, numa populao, de todos os gentipos possveis quanto ao sistema
polignico associado a um determinado defeito multifatorial. A freqncia populacional da
doena est indicada pela rea escurecida: se essa rea corresponder, por exemplo, a 1/1000
da rea total da funo distribuio dos gentipos, isso significa que a freqncia do defeito
1/1000.

ANLISE DE HEREDOGRAMAS

Os heredogramas representados nas Figuras 17, 18, 19, 21 e 22 so tpicos dos quatro
possveis mecanismos de herana monognica: autossmico dominante (com penetrncia
completa ou incompleta), autossmico recessivo, ligado ao X recessivo ou dominante. Na
66
figura 16, apresentamos o mecanismo de herana mitocondrial. Em todos esses
heredogramas, os smbolos escurecidos representam indivduos afetados por uma doena
hereditria; a exceo dada pelos smbolos escurecidos de tamanho menor, que indicam
insucessos reprodutivos (abortos ou bitos fetais). Os quadrados representam indivduos de
sexo masculino e os crculos indivduos de sexo feminino; indivduos com sexo desconhecido
ou no pertinente ao problema so representados por losangos. As geraes so denotadas
por algarismos romanos (I, II, III, IV etc., da mais antiga mais recente) e os indivduos de cada
gerao por algarismos arbicos. Com finalidade apenas de facilitar a leitura do texto,
inserimos nos smbolos que representam os diferentes indivduos os gentipos a eles
correspondentes.
preciso ter sempre presente o fato de que as doenas hereditrias, com raras
excees, ocorrem na populao com freqncias insolitamente baixas, geralmente da ordem
de grandeza de 1/10.000 ou menos. Disso resulta que os afetados por doenas autossmicas
dominantes so via de regra heterozigotos.
No caso de doenas ligadas ao cromossomo X, tanto recessivas quanto dominantes,
as mulheres que transmitem o gene so sempre heterozigotas; os poucos casos de mulheres
homozigotas quanto a genes recessivos deletrios ligados ao cromossomo X surgiram de
casamentos consangneos entre heterozigotas e primos afetados hemizigotos, tendo ambos
recebido o gene responsvel pelo defeito de sua av comum heterozigota.
No caso de doenas autossmicas recessivas os afetados so homozigotos com
genitores heterozigotos; apesar de a freqncia de heterozigotos para esses genes ser
relativamente alta na populao (freqncia de 2% no caso de doenas que ocorrem na
populao na freqncia de 1/10.000), para nascer um afetado preciso que os dois genitores
sejam heterozigotos (probabilidade 2% x 2% =4/10.000) e que ambos transmitam o gene
deletrio para a prole (probabilidade 1/2 x 1/2 =1/4), o que resulta na freqncia populacional
de afetados 4/10.000 x 1/4 =1/10.000); v-se assim que numa famlia qualquer com afetados
deve ocorrer somente um casamento entre dois heterozigotos (os genitores do afetado) e que
dificilmente ocorrero heterozigotos fora do ramo da famlia que contm os afetados (que
tambm, pelo raciocnio desenvolvido mais acima, ocorrero em apenas uma irmandade);
violaes a essas regras somente so encontradas em casos de famlias com casamentos
consangneos (que tipicamente so encontrados com maior freqncia entre os progenitores
de afetados, por favorecerem o encontro de duas pessoas heterozigotas quanto a um mesmo
gene patolgico herdado de um ascendente comum delas) ou no caso de algumas doenas
sabidamente freqentes em alguns grupos populacionais, como o caso da anemia falciforme
na frica equatorial e da fibrose cstica entre nrdicos.

Heredograma 1: herana autossmica dominante

No heredograma da Figura 17, I-1 afetado e casado com I-2. Os filhos do casal so
cinco (II-1 a II-5), sendo que II-2, II-4 e II-5 so afetados. II-5 (afetado) casou-se com II-6
(pertencente a uma irmandade de 6 indivduos, dois dos quais constituem um par de gmeos
dizigticos (II-10 e II-11); nessa irmandade uma gestao terminou em aborto de sexo no
determinado (provavelmente porque foi muito precoce, de cerca de dois meses de idade
gestacional). Do casal II-5/II-6 nasceram cinco crianas, duas das quais (III-3 e III-5) so
afetadas. A menina III-3 a propsita (ou caso ndice); o propsito o primeiro indivduo
estudado da famlia, geralmente afetado, que motiva o levantamento do heredograma; sempre
assinalado por uma seta.
Figura 17 - Heredograma tpico de
uma doena, rara na populao,
determinada por mecanismo
autossmico dominante com
penetrncia completa.
67
O padro de transmisso da doena nessa famlia representada na figura claramente
autossmico dominante, pois existem afetados em todas as geraes e os afetados pertencem
aos dois sexos. Fica claro tambm, como detalharemos mais abaixo, que os afetados so
heterozigotos, pois aqueles que se reproduziram tiveram crianas normais e afetadas.
O mecanismo de herana ligado ao X excludo com certeza absoluta devido ao fato
de ocorrerem duas transmisses da doena de pai afetado para filho de sexo masculino.
A herana autossmica recessiva afastada, pois as mulheres I-2 e II-6, nessa
hiptese, precisariam ser ambas heterozigotas; no sendo aparentadas biologicamente de
seus maridos (homozigotos recessivos na hiptese de herana autossmica recessiva), a
chance disso ocorrer muito baixa, uma vez que todas as doenas aqui apresentadas so
raras na populao.
Todos os indivduos representados por smbolos escurecidos so heterozigotos Aa (em
que A o gene que determina a doena e a o seu alelo normal), pois homozigotos AA ocorrem
em situaes muito excepcionais: por exemplo, na acondroplasia, resultantes de casamentos
entre dois heterozigotos afetados; conhecem-se menos de 10 casos de prole afetada AA
desses casamentos e os defeitos sseos so gravssimos, com a maioria dos afetados
falecendo durante os dois ou trs primeiros anos de vida; em outras doenas a chance do
casamento dependeria do encontro casual de dois afetados, cada um deles ocorrendo numa
freqncia da ordem de 1/10.000 ou menos. Se se trata de doena determinada por gene
autossmico dominante de penetrncia completa (indicando que todos os seus portadores
apresentam o fentipo completo ou incompleto que caracteriza a doena), todos os indivduos
da genealogia representados por smbolos claros so aa.
Em heredogramas como esse, tpicos de doena autossmica dominante, comum a
doena aparecer pela primeira vez num indivduo que filho de genitores normais, por efeito
de mutao nova. No heredograma que estamos analisando, por exemplo, o indivduo I-1 tinha
genitores normais e com probabilidade alta (com certeza caso a penetrncia seja completa) o
primeiro indivduo portador do gene mutante A na famlia.
O risco de repetio da doena numa criana que tanto o casal I-1/I-2 como o casal II-
5/II-6 venham a ter estimado em 50% ou 1/2, pois para a doena se manifestar num indivduo
qualquer, basta que ele receba de seu progenitor afetado heterozigoto o gene A. Este tambm
ser o risco de recorrncia da doena na prole dos afetados II-2, II-4, II-5, III-3 e III-5, caso eles
venham a se casar (como acontece geralmente) com pessoas normais no aparentadas. O
risco para a prole de todos os indivduos normais da genealogia (incluindo o casal j
constitudo I-3/I-4) desprezvel, da ordem de grandeza de zero.

Heredograma 2: herana autossmica dominante com penetrncia
O heredograma da figura 18 abaixo mostra a segregao de uma doena autossmica
dominante de penetrncia incompleta, pois um dos membros do casal I-1/I-2 e o indivduo II-5,
todos fenotipicamente normais, so na verdade heterozigotos Aa, uma vez que tiveram filhos
normais e afetados.

O casal I-3/I-4 e todos os seus filhos so aa, da mesma maneira que um dos membros
do casal I-1/I-2; todos os filhos normais dos casais I-1/I-2 e II-5/II-6, no entanto, podem ser aa
ou Aa no penetrantes.
Figura 18 - Heredograma tpico de
determinada por mecanismo
autossmico dominante com
penetrncia incompleta.
68
A configurao genealgica observada poderia tambm ser explicada, primeira vista,
por uma doena de herana autossmica recessiva, mas diante da raridade das doenas
genticas em geral na populao, muito pouco provvel que a mulher II-6 fosse tambm
heterozigota quanto ao gene que est segregando na famlia biolgica de seu marido II-5.

Heredograma 3: herana autossmica recessiva

.

O heredograma da figura 19, alm de ilustrar o mecanismo da herana autossmica
recessiva, introduz mais alguns smbolos usados nos heredogramas. Assim, a unio entre os
indivduos III-5 e III-6 indica consanginidade e est representada por uma linha dupla, que
substitui a simples usada para assinalar os casamentos entre indivduos no aparentados entre
si. O concepto III-10 um aborto ou bito fetal de sexo feminino. Os indivduos III-11 e III-12
so gmeos monozigticos. A linha inclinada sobre os smbolos I-1, I-2 e IV-2 indicam que eles
j faleceram. O ponto de interrogao no interior de IV-2 indica que no se sabe se ele era
afetado ou no (por exemplo, morreu jovem antes da idade mdia de manifestao dos
primeiros sinais e sintomas da doena). O nmero 3 dentro do smbolo mais direita da ltima
gerao representa trs indivduos normais de sexo masculino (IV-5, IV-6 e IV-7).
O mecanismo ligado ao X pode ser afastado devido ocorrncia de afetada de sexo
feminino (IV-1) filha de genitores normais. A hiptese de herana autossmica dominante com
penetrncia incompleta uma possibilidade, mas no presente caso ela fica enfraquecida pela
ocorrncia do casamento consangneo entre III-5 e III-6.
Tipicamente, no mecanismo de herana autossmico recessivo, os afetados costumam
concentrar-se numa nica irmandade. Fortemente indicativo desse mecanismo a ocorrncia
de consanginidade parental, como aconteceu no heredograma aqui representado (III-5 e III-6
so filhos de dois irmos, portanto primos em primeiro grau). O gentipo dos afetados IV-1 e
IV-4 bb, em que b um gene recessivo que em homozigose determina a doena. Devido a
isso, os genitores primos em primeiro grau so ambos heterozigotos Bb e mais provvel,
nesse caso, que os genes presentes em homozigose nos dois afetados tenham origem comum
num nico alelo patolgico b presente em dose nica em I-1 ou em I-2, os ascendentes
comuns do casal de primos. Seguindo esse raciocnio, II-2 e II-3 tambm so heterozigotos,
casados cada um deles com um homozigoto normal BB (II-1 e II-4). Cada um dos irmos de III-
5 (III-1 a III-4) tem portanto chances iguais (50%) de ser homozigoto BB ou heterozigoto Bb, o
mesmo acontecendo com os irmos de III-6 (III-7 a III-12). Finalmente, cada um dos irmos
normais dos afetados (IV-3, IV-5, IV-6 e IV-7) possui chance de ser heterozigoto igual a
(1/2)/(1/4+1/2) = 2/3, uma vez que sendo normal e filho de heterozigotos s pode ser
heterozigoto Bb ou homozigoto BB com probabilidades que esto entre si assim como 1/2 : 1/4
ou 2 : 1 ou 2/3 : 1/3. Isso tudo fica claro se considerarmos o esquema mostrado na Figura 13
abaixo, que mostra a distribuio esperada dos gentipos possveis na prole de um casal de
heterozigotos, excluindo-se a possibilidade de a criana ser bb, uma vez que apresenta o
fentipo dominante: v-se imediatamente que em duas das trs eventualidades que
correspondem ao fentipo B- a criana Bb.

Figura 19 - Heredograma
tpico de uma doena, rara na
populao, determinada por
mecanismo autossmico
recessivo
69

O risco de recorrncia do defeito ou doena na prole do casal III-5/III-6 obviamente
1/4 ou 25%, uma vez que tanto III-5 como III-6 so heterozigotos Bb e para que uma prxima
criana que venham a ter nasa afetada preciso apenas que cada um deles transmita-lhe o
gene b, o que vai ocorrer com probabilidade R = 1/2 x 1/2 = 1/4 ou 25%. O risco de ocorrncia
de prole afetada nos casais j constitudos I-1/I-2, II-1/II-2 e II-3/II-4, todos do tipo BB x Bb,
desprezvel, da ordem de grandeza de zero. Quanto aos indivduos III-1 a III-4 , III-7 a III-9 e III-
11 e III-12, cada um dos quais tem chance de heterozigose Bb igual a 1/2 ou 50%, o risco de
afeco em sua prole depender de o futuro cnjuge (por hiptese no aparentado) ser
tambm heterozigoto e de ambos lhe transmitirem o alelo b patolgico. Para genes recessivos
patolgicos que ocorrem na populao com freqncias da ordem de 1% aproximadamente,
como o caso dos genes do albinismo e da fenilcetonria, a freqncia de afetados ao
nascimento da ordem de 1/10.000 mas a freqncia de heterozigotos fixa-se em cerca de
1/50 ou 2%. Isso significa que o risco de prole afetada para cada um desses indivduos (III-1 a
III-4 , III-7 a III-9 e III-11 e III-12) ser R = 1/2 x 1/50 x 1/4 = 1/400 ou 0,25% , risco esse de
ordem de grandeza desprezvel. Se um desses indivduos casar-se com um parente, no
entanto, o risco ser muito maior. Suponhamos por exemplo que o indivduo III-1 venha a se
unir com III-9, sua prima em primeiro grau. Cada um possui uma chance a favor de ser
heterozigoto da ordem de 1/2, de modo que o risco para a sua prole estimado em R = 1/2 x
1/2 x 1/4 = 1/16 = 6,25%. Apesar de esse risco ainda ser relativamente baixo, ele est
aumentado 6,25/0,25 =25 vezes em relao ao risco existente na hiptese de qualquer um dos
cnjuges se casar com uma pessoa no aparentada. Resta-nos agora calcular os riscos de
prole afetada para os filhos do casal III-5/III-6. O risco para a prole de IV-1 ou IV-4 (afetados)
R = 1 x 1/50 x 1/2 = 1%; para a prole de IV-3, IV-5, IV-6 e IV-7 o risco correspondente
calculado segundo R = 2/3 x 1/50 x 1/4 = 1/300 ou cerca de 0,3%. Conclumos, portanto que o
risco de prole afetada s est aumentado significativamente (R = 25%) para o casal III-5/III-6.

Heredograma 4: herana recessiva ligada ao cromossomo X

Figura 20 - Gentipos possveis na
prole normal de um casal de
heterozigotos, ficando claro que a
probabilidade de uma criana normal
ser heterozigota 2/3.
Figura 21 - Heredograma tpico
de uma doena, rara na
populao, determinada por
mecanismo recessivo ligado ao
cromossomo X
70

O heredograma ilustra um caso tpico de herana recessiva ligada ao cromossomo X,
como o caso da distrofia muscular progressiva tipo Duchenne.
O mecanismo autossmico recessivo pode ser afastado usando-se a mesma
argumentao do caso da primeira genealogia. A herana dominante com penetrncia
incompleta no pode ser afastada, mas muito pouco provvel, pois para explicar-se a
configurao da genealogia baseando-se nesse mecanismo seria preciso que os dois
heterozigotos no penetrantes fossem mulheres (I-4 e II-6) e que os quatro afetados fossem
homens; a chance combinada disso vale (1-K)
2
.(1/2)
6
< 1/1.000 para um valor da taxa de
penetrncia K = 0,8. Como na hiptese de mecanismo recessivo ligado ao cromossomo X a
probabilidade da configurao 1 (ou seja, tem que acontecer exatamente o que aconteceu,
ou seja, os quatro afetados tm que ser homens e todos eles aparentados entre si atravs das
duas mulheres heterozigotas), chega-se a concluso que o mecanismo recessivo ligado ao X
pelo menos 1.000 vezes mais provvel que o autossmico dominante com penetrncia
incompleta.
Como se nota da anlise do heredograma, apenas indivduos de sexo masculino so
afetados. Excepcionalmente, mulheres heterozigotas podem apresentar manifestaes da
doena, geralmente sob forma bem mais branda que a apresentada em mdia pelos homens
hemizigotos afetados, como j se observou inmeras vezes na hemofilia por deficincia do
fator VIII ou mais raramente na prpria distrofia muscular de Duchenne. Evidentemente isso
possvel desde que exista um desvio significativo no processo de lyonizao e a mulher tenha
inativado na maioria de suas clulas o cromossomo X contendo o alelo normal. A anlise do
heredograma mostra ainda que todos os afetados so aparentados entre si atravs das
mulheres I-4 e II-6, que so heterozigotas obrigatrias quanto ao gene que produz a doena.
Outro detalhe interessante notado na genealogia e que no deixa dvidas quanto ao
mecanismo de transmisso do trao patolgico o fato de que a mulher II-6 casou-se em duas
ocasies com indivduos no aparentados, e de ambos os casamentos originaram-se afetados.
Outra caracterstica importante, que no se aplica ao caso da distrofia muscular de Duchenne e
a outras condies letais ligadas ao cromossomo X, em que os afetados no conseguem
reproduzir-se, que a prole dos afetados normal. Um ponto importante a se considerar que
se ocorrer transmisso de homem afetado para filho de sexo masculino afetado, fica excluda a
possibilidade do mecanismo ligado ao X, tanto dominante como recessivo.
Chamando-se X
c
o gene que em hemizigose determina a doena recessiva ligada ao
X, vem que o gentipo dos afetados II-7, III-2, III-4 e III-6 X
c
. O casal I-1/I-2 e todos os seus
filhos (II-1 a II-5) so hemizigotos X
C
(se homens) ou homozigotas X
C
X
C
(se mulheres). As
mulheres heterozigotas certas (gentipo X
C
X
c
) so, conforme j mencionado, I-4 e II-6. A
afirmao quanto a esta ltima no deixa dvidas e no caso de I-4, apesar de ela ter tido
apenas um filho afetado, teve, atravs de II-6, trs netos igualmente acometidos. As demais
mulheres que ocorrem na genealogia (II-8, III-1 e III-3) so heterozigotas provveis, uma vez
que so todas filhas de heterozigotas certas, cada uma com probabilidade de 50% favorecendo
a hiptese de heterozigose. Todos os homens assinalados por smbolos claros, sejam parentes
em primeiro grau de afetados ou no, so hemizigotos quanto ao gene normal (gentipo X
C
).
Da mesma maneira que na situao anterior, calcularemos em seguida o risco de
repetio da doena na prole de todos os indivduos da genealogia representada na Figura 14.
Os riscos de criana afetada na prole dos casais I-3/I-4, II-5/II-6 e II-6/II-10 so de 25% ou 1/4,
uma vez que nessas situaes as genitoras so heterozigotas e para nascer uma criana
afetada preciso que herde o cromossomo Y do pai (probabilidade 1/2) e o cromossomo X
com o alelo responsvel pela doena da genitora heterozigota (tambm com probabilidade
1/2). O risco final obtido multiplicando-se essas duas probabilidades: R = 1/2 x 1/2 = 1/4 ou
25%. O risco de criana afetada na prole de todos os afetados, desde que eles no venham a
se casar com mulheres aparentadas ou pertencentes a famlias com casos da mesma doena,
da ordem de grandeza de zero (ou seja, para nascer um menino afetado seria necessrio
que ocorresse mutao nova no cromossomo X recebido da me). importante lembrar que,
embore o afetado no transmita o gene deletrio a nenhum dos filhos homens que tiver, todas
as suas filhas sero heterozigotas certas, com risco de afeco para a sua futura prole
estimado em 1/4 ou 25%. O risco de descendncia afetada nulo para o casal I-1/I-2, para os
seus filhos II-1 a II-4 e para todos os demais indivduos de sexo masculino assinalados por
smbolos claros ainda no mencionados (II-9 e III-5). Quanto ao risco de prole afetada para as
mulheres heterozigotas provveis II-8, III-1 e III-3, estimado em R = 1/2 x 1/4 = 1/8 ou 12,5%,
71
uma vez que cada uma delas tem probabilidade de ser heterozigota igual a 1/2 ou 50%.

Heredograma 5: herana dominante ligada ao cromossomo X

A figura 22 ilustra um caso tpico de transmisso de uma doena dominante ligada ao
X, mecanismo relativamente raro no conjunto das doenas genticas monognicas. Como no
modo de transmisso autossmico correspondente, ocorrem afetados em todas as geraes.
Nota-se que mulheres heterozigotas X
D
X
d
afetadas tm filhos X
D
e filhas X
D
X
d
afetados com
probabilidades iguais (25%), enquanto os homens hemizigotos afetados X
D
no transmitem o
defeito para nenhum de seus filhos, enquanto todas as suas filhas so necessariamente
heterozigotas X
D
X
d
afetadas. Nota-se tambm que a configurao do heredograma poderia
acontecer sob hiptese de doena autossmica dominante. Sob essa hiptese, a probabilidade
de ocorrncia de 5 afetados de sexo feminino e de 5 meninos normais na prole de II-6, na
ordem mostrada, toma valor (1/2)
10
= 1/1024; sob hiptese de mecanismo ligado ao X
dominante, no entanto, essa ocorrncia seria a nica possvel (com probabilidade 1). A
probabilidade favorecendo esta ltima hiptese , portanto, no caso, cerca de 1.000 vezes
maior que a outra. Inversamente, caso tivesse sido observado apenas um caso de transmisso
do defeito de pai para filho ou se pelo menos uma das filhas do afetado fosse normal, a
hiptese de mecanismo dominante ligado ao X seria afastada.
Determinemos agora os gentipos de todas as pessoas representadas no
heredograma, sob a hiptese de herana dominante ligada ao X, agora bem fundamentada.
Todos os indivduos representados por smbolos claros so hemizigotos X
d
ou homozigotas
X
d
X
d
normais, enquanto os hemizigotos afetados (smbolos escurecidos) possuem gentipo
X
D
e as heterozigotas afetadas (representadas por crculos negros) so X
D
X
d
.
Os riscos para a prole dos indivduos II-1 a II-4 do casal I-1/I-2 e de todos os indivduos
normais das proles de I-3/I-4, II-5/II-6 e II-6/II-10 so desprezveis, da ordem de grandeza de
zero. O risco de doena na prole de I-3/I-4 (homem X
d
x mulher X
D
X
d
) de 1/2 ou 50%, pois
esse casal pode ter quatro tipos diferentes de filhos, cada um deles com probabilidade de 25%:
X
D
, X
d
, X
d
X
d
, X
D
X
d
. O risco para as proles de II-5/II-6 e II-6/II-10 tambm de 1/2 ou 50%,
com a diferena que agora todas as meninas (que vo ocorrer com probabilidade de 50%)
sero heterozigotas afetadas X
D
X
d
enquanto todos os meninos (que tambm ocorrero com
probabilidade de 50%) sero hemizigotos X
d
normais, uma vez que o cruzamento parental do
tipo homem X
D
x mulher X
d
X
d
.

Figura22 - Heredograma tpico de uma
doena, rara na populao, determinada
por mecanismo dominante ligado ao
cromossomo X.
72

Heredograma 6: herana mitocondrial

Nesse mecanismo, exemplificado atravs do heredograma mostrado na Figura 23, o
defeito condicionado por gene mutante localizado no DNA das mitocndrias, organelas que
provm do vulo, sendo portanto transmitidas s crianas de ambos os sexos pela me. A
inspeo do heredograma mostra claramente que as crianas (meninos e meninas) de
mulheres afetadas so igualmente afetadas, contrariamente ao que acontece com a prole de
homens afetados, que sempre normal. A situao complicada geralmente pela penetrncia
incompleta e expressividade muito varivel do gene que determina a doena ou defeito na
prole de mulheres portadoras do DNA mitocondrial mutante, geralmente afetadas. Desse modo,
nem todas as crianas dessas mulheres so necessariamente afetadas, como o caso do
indivduo III-10 da genealogia acima; a distino importante em relao herana autossmica
dominante que no ocorrem crianas afetadas na prole de homens afetados. A heteroplasmia
(presena de cpias de DNA mutante mitocondrial ao lado de cpias normais, em propores
variadas nos diferentes indivduos) contribui para a expressividade do quadro clnico, que
costuma ser muito mais varivel do que na herana autossmica dominante. Esse tipo de
transmisso vem ganhando importncia crescente em gentica mdica desde que se descobriu
que uma frao considervel dos casos de surdez no sindrmica so devidas a mutaes de
DNA mitocondrial. Outras doenas e sndromes com manifestaes metablicas, neurolgicas,
musculares e visuais tambm podem ser causadas por mutaes no DNA mitocondrial.

Figur23 - Heredograma tpico de
determinada por gene mutante
localizado no DNA das
mitocndrias.
73
O DNA MITOCONDRIAL HUMANO
Regina Clia Mingroni

Embora a maior parte do DNA na maioria dos organismos eucariontes esteja presente
no ncleo, uma parte do DNA celular est presente nas mitocndrias dos animais, das plantas
e dos fungos e tambm nos cloroplastos das plantas. Essas organelas so importantes para
as clulas do ponto de vista energtico, pois nas mitocndrias ocorre a sntese de ATP e nos
cloroplastos ocorre a fotossntese.

O DNA mitocondrial humano
O DNA mitocondrial humano uma molcula de DNA circular de dupla-fita cuja
seqncia completa de nucleotdeos foi estabelecida em 1991. Tem 16569 pb de comprimento.
As duas fitas do DNA tm composio de bases diferente e por isso receberam diferentes
nomes: a cadeia H (de heavy ou pesada) rica em guaninas e a cadeia L (de light ou leve)
mais rica em citosinas. Embora o DNA mitocondrial humano seja predominantemente de dupla-
fita, em um pequeno segmento ocorre DNA com tripla-fita, estrutura que resulta da sntese
adicional de um pequeno segmento do DNA mitocondrial, na regio que chamamos de
hipervarivel. Clulas humanas contm geralmente milhares de cpias do DNA mitocondrial. O
DNA mitocondrial humano corresponde a cerca de 0,5% do DNA total de uma clula somtica.
Na figura 17 est representado o DNA mitocondrial humano que contm 37 genes: 28
so presentes na cadeia pesada e nove na cadeia leve. Um total de 13 dos 37 genes que
codificam polipeptdeos e so traduzidos nos ribossomos mitocondriais. Eles codificam alguns
elementos dos complexos respiratrios, enzimas relacionadas fosforilao oxidativa. Todas
as demais protenas mitocondriais so codificadas pelos genoma nuclear e so traduzidas
pelos ribossomos do citoplasma celular antes de serem importadas pela mitocndria. Os
demais 24 genes mitocondriais codificam 22 tipos de RNAs transportadores e dois tipos de
molculas de RNA ribossmico, que constituem parte do aparato de sntese protica
mitocondrial. Outros componentes so codificados exclusivamente pelo genoma nuclear. Esses
genes ocupam a maior parte da extenso do DNA mitocondrial. No entanto, existe uma regio
no codificadora de aproximadamente 1200 nucleotdeos que conhecida por nomes
diferentes: ala D (D loop), regio de controle ou regio hipervarivel. O termo regio de
controle se refere ao fato de que essa regio contm os sinais que controlam a replicao do
DNA e a transcrio do RNA. O termo D-loop se refere ao incio da replicao do DNA, quando
a cadeia de DNA recm-sintetizada desloca uma das cadeias parentais, formando uma espcie
de bolha no local. A seqncia do DNA nessa regio chamada de hipervarivel porque,
sendo uma regio que no codifica um produto, ela pode acumular mutaes de ponto em uma
taxa de 10 a 25 vezes superior s taxas de mutao encontradas no DNA nuclear. Por isso,
essa regio a mais estudada em pesquisas evolutivas e de gentica de populaes.

Mutaes no DNA mitocondrial causam vrias doenas genticas nos humanos

A gravidade de uma doena causada por uma mutao no DNA mitocondrial depende
do tipo de mutao e da proporo entre as molculas de DNAmt mutado e no mutado em um
certo tipo celular. Muitas vezes quando so detectadas mutaes no DNA mitocondrial, as
clulas podem conter uma mistura de molculas de DNAmt selvagem ou mutado,
caracterizando a condio chamada de heteroplasmia. Cada vez que uma clula de mamfero
se divide, molculas de DNAmt selvagens ou mutadas vo segregar ao acaso para as clulas
filhas. Assim, o gentipo em relao ao DNAmt pode se modificar entre uma diviso celular e
outra, e entre uma gerao e outra. O acaso pode fazer com que se estabeleam linhagens
predominantemente portadoras de DNA mutado ou predominantemente selvagens. Uma vez
que todas as enzimas necessrias para a replicao do DNA mitocondrial so codificadas pelo
DNA nuclear, mutaes no DNA mitocondrial em teoria no afetam sua capacidade de
replicao. Ao contrrio, foram descritos casos em que grandes delees do DNA mitocondrial
acarretaram vantagem replicativa.
Todas as clulas contm mitocndrias, mas, curiosamente, as mutaes mitocondriais
afetam preferencialmente certos tecidos. Aqueles que so os mais comprometidos geralmente
so aqueles com elevada demanda de ATP produzido pela cadeia de fosforilao oxidativa, ou
aqueles com demandas rpidas e muito variveis de ATP. A neuropatia ptica hereditria de
Leber (degenerao no nervo ptico acompanhada de cegueira progressiva), por exemplo,
causada por uma mutao de sentido errado no gene mitocondrial que codifica a subunidade 4
74
da NADH-CoQ redutase. Qualquer uma das grandes delees de DNA mitocondrial que j
foram estudadas causam diversas outras doenas como oftalmoplegia externa crnica
progressiva e sndrome de Kearns-Sayre, caracterizadas por defeitos de viso e degeneraes
do sistema nervoso central. Um outro tipo de condio, que se caracteriza pela presena de
fibras musculares vermelhas esgaradas e movimentos atxicos pode ser devida a mutaes
no gene do RNAt mitocondrial da lisina. Como resultado dessa mutao, a traduo de
diversas protenas mitocondriais parece estar comprometida. O interessante a respeito das
doenas resultantes de mutaes mitocondriais na espcie humana que, salvo uma nica
exceo descrita, elas sempre tm herana materna. Em outras palavras, as mulheres
transmitem a doena a seus filhos e filhas, mas homens afetados jamais transmitem a doena
a seus descendentes.

Figura 24. Representao do DNA mitocondrial humano. A fita do DNA representada pelas
linhas internas denominada cadeia leve (L, light). A fita do DNA representada pelas linhas
externas chamada de cadeia pesada ( H, heavy). O
L
a origem de replicao da cadeia leve;
O
H
a origem de replicao da cadeia pesada; P
L
o promotor da cadeia leve; P
H

o
promotor da cadeia pesada.

\
75
AS BASES CROMOSSMICAS DAS DOENAS GENTICAS

Paulo A Otto, Regina Clia Mingroni, ngela Maria Vianna Morgante 2006 Princpios de
Gentica Humana e Mdica. Em: Tratado de Clnica Mdica

, Amato Carlos Lopes Editor.
Editora Roca Ltda.
A Citogentica estuda a estrutura, a funo e a evoluo dos cromossomos. A
Citogentica Clnica focaliza especialmente as alteraes cromossmicas, os mecanismos que
as originam e seus efeitos fenotpicos. Seis a sete em cada mil recm-nascidos tm uma
alterao cromossmica. Essas alteraes constituem a causa gentica principal de
malformaes congnitas e retardo mental e podem estar relacionadas tambm com
esterilidade e infertilidade. Entre os abortamentos espontneos de primeiro trimestre, 50% tm
anormalidades cromossmicas como causa. A comparao entre as freqncias das
anormalidades cromossmicas nos abortos e ao nascimento mostra o efeito deletrio que elas
tm sobre o desenvolvimento, chegando a termo apenas uma pequena frao dos conceptos
afetados.

Como estudar os cromossomos humanos

As clulas somticas humanas tm 46 cromossomos, 23 herdados de cada genitor.
Vinte e dois pares cromossmicos so semelhantes no homem e na mulher e se denominam
autossomos. O par de cromossomos sexuais formado por dois cromossomos X na mulher e
por um cromossomo X e um Y no homem.
Quando uma clula se divide, seus cromossomos progressivamente aumentam a
condensao e encurtam, o que permite visualiz-los e analisar sua morfologia ao microscpio
ptico. J na clula que no est em diviso, os cromossomos esto muito distendidos e,
apesar de cada um manter sua integridade, no permitem a anlise morfolgica. Assim, para
analisar cromossomos so necessrias clulas em diviso, obtidas a partir de tecidos vivos.
Os cromossomos so analisados nas fases de metfase ou prometfase da diviso
mittica que dar origem a duas clulas com nmero de cromossomos igual ao da clula-me.
O cromossomo, nessas fases, j est duplicado, consistindo de duas cromtides, unidas pelo
centrmero (Figura 25). Cada cromtide formada por uma molcula de DNA associada a
protenas e esse material chamado de cromatina.

Os exames cromossmicos ps-natais, para diagnstico de alteraes cromossmicas
constitutivas, so rotineiramente realizados nos linfcitos do sangue perifrico, diante da
facilidade de obteno do material e da relativa simplicidade da tcnica de cultivo. Outros tipos
de clulas podem tambm ser usados, quando a pesquisa de uma determinada alterao exige
a extenso da anlise, como por exemplo os fibroblastos obtidos de bipsias de pele. No
diagnstico pr-natal, a anlise cromossmica realizada em amnicitos ou em clulas das
vilosidades corinicas.
Para o estudo dos cromossomo dos linfcitos, o sangue colhido com um
anticoagulante, a heparina, e aps a sedimentao das hemcias, uma alquota de plasma
com os leuccitos em suspenso inoculada no meio de cultivo, que contm a fito-
hemaglutinina, o agente mitognico que estimula os linfcitos a dividirem-se. Aps cerca de 70

Figura 25 Os cromossomos metafsicos
esto duplicados, formados por duas
cromtides unidas no centrmero. De acordo
com a posio do centrmero, os
cromossomos so classificados em
metacntricos, submetacntricos e
acrocntricos. Nos braos curtos dos
cromossomos acrocntricos humanos
observam-se constries secundrias (onde
esto situados os genes que codificam RNA
ribossmico) e, em sua extremidade, massas
de cromatina mais condensada, os satlites
76
horas de incubao a 37 C, grande o nmero de clulas em diviso. Para se obterem as
metfase ou prometfases necessrias anlise, o processo de diviso deve ser interrompido
nessas fases. Esse bloqueio feito utilizando-se substncias, como a colchicina, que impedem
a formao do fuso mittico, necessrio para a separao das cromtides dos cromossomos e
sua migrao para as clulas-filhas. Aps esse passo, as clulas so separadas do meio de
cultura por centrifugao e tratadas com uma soluo hipotnica, para que os cromossomos se
espalhem e, assim, possam ser claramente vistos, sem estarem emaranhados uns com os
outros. O material , ento, fixado com uma soluo de metanol e cido actico. Pingam-se
algumas gotas da suspenso de clulas em fixador sobre lminas de microscopia e, aps
secagem, as preparaes esto prontas para serem submetidas aos diversos mtodos de
colorao dos cromossomos que permitem sua anlise ao microscpio.
O mtodo de colorao cromossmica rotineiramente utilizado nos exames
diagnsticos o que produz faixas claras e escuras (bandas) ao longo dos cromossomos,
permitindo identificar todos os pares: as preparaes cromossmicas so tratadas com uma
soluo de tripsina e coradas com o corante de Giemsa bandamento G. Para a classificao
dos cromossomos levam-se em conta seus tamanhos, posio do centrmero e o padro das
bandas. O conjunto de cromossomos arranjados aos pares o caritipo da clula. O termo
caritipo utilizado tambm para designar a constituio cromosmica de um indivduo. Por
exemplo, o caritipo de um homem normal 46, XY e o de uma mulher, 46, XX. Existem
normas que so seguidas internacionalmente para se descreverem os caritipos normais e
alterados (ISCN, An International System for Human Cytogenetics Nomenclature, 1995).
Na anlise dos cromossomos deve-se cuidar para que o nvel de distenso dos
cromossomos seja o adequado para se obterem pelo menos 550 bandas no lote haplide.
Cromossomos mais compactados impedem o diagnstico de muitas alteraes estruturais
identificveis pela anlise do padro de bandas G. O poder de resoluo da tcnica, entretanto,
no permite a deteco de alteraes que comprometam menos de 5 milhes de pares de
bases do DNA e alteraes maiores podem passar despercebidas, caso no produzam
mudanas no padro das bandas.
Hoje possvel a deteco de alteraes menores, utilizando a tcnica de hibridao in
situ fluorescente (FISH, Fluorescent In Situ Hybridization) na anlise cromossmica. Por
exemplo, na pesquisa de uma determinada deleo cromossmica, usa-se um segmento de
DNA, a sonda, que contm a seqncia de bases do segmento que se supe deletado. Cpias
da sonda so colocadas em contato com as preparaes cromossmicas, em condies
apropriadas, de modo a que ocorra sua ligao (hibridao) com o segmento exatamente
correspondente (homlogo). As sondas so previamente marcadas com um fluorocromo. Pode-
se, assim, verificar se o segmento est ou no presente no cromossomo, na anlise ao
microscpio de fluorescncia (Figura 26).
Existem sondas disponveis comercialmente que permitem detectar microdelees
cromossmicas j descritas em associao a quadros clnicos especficos (Figura 27). Outras
so homlogas s pores terminais dos cromossomos, sendo utilizadas para detectar
diminutas translocaes e delees situadas nas extremidades dos cromossomos. As regies
dos centrmeros de cada cromossomo tambm so identificveis e, assim, possvel contar o
nmero de cromossomos de um tipo num ncleo interfsico, portanto na clula que no est
em diviso (Figura 28). Conjuntos de sondas correspondentes a toda a extenso de um
cromossomo bibliotecas cromossmicas - podem ser hibridadas simultaneamente, o que
permite, por exemplo, identificar segmentos cromossmicos adicionais num caritipo, cujo
padro de bandas no seja caracterstico.
As tcnicas de hibridao in situ tornam-se progressivamente mais sofisticadas. O uso
de fluorocromos de cores diferentes para marcar as sondas permite analisar vrios
cromossomos ao mesmo tempo e at mesmo todos os cromossomos podem agora ser
analisados simultaneamente, associando-se as combinaes de fluorocromos diversos a
sistemas de filtros especiais e recursos computacionais (cariotipagem espectral e M-FISH).
Uma outra tcnica, CGH (Comparatice Genomic Hybridization) evidencia perdas e ganhos de
segmentos cromossmicos hibridando, com metfases normais, o DNA obtido da amostra que
se quer testar (marcado para fluorescer em vermelho) juntamente com o DNA de uma amostra
de tecido normal (marcado para fluorescer em verde). A anlise da fluorescncia dos
cromossomos feita por computador: um segmento com

77

Figura 27 Identificao por FISH de uma
microdeleo de um cromossomo do par 17
num paciente com suspeita diagnstica de
neurofibromatose tipo 1: a sonda,
correspondente ao segmento deletado, marcou
um nico cromossomo 17 (fluorescncia verde).
Nos dois cromossomos 17 tambm observa-se
os sinais de uma outra sonda hibridada ao
mesmo tempo, que serviu de controle para a
sensibilidade do teste (fluorescncia vermelha).

Figura 28 Trissomia do cromossomo 18
evidenciada num ncleo interfsico pela
hibridao de uma sonda do centrmero desse
cromossomo

excesso de verde est deletado na amostra teste e aquele com excesso de vermelho est
duplicado nela. O estudo de tumores, que costumam apresentar alteraes cromosmicas
extremamente complexas, especialmente beneficiado por essas tcnicas.

Figura 26 Na hibridao in situ fluorescente (FISH), a
sonda marcada com um fluorocromo liga-se ao segmento
homlogo no cromossomo metafsico, que assim
evidenciado. No processo, o DNA da sonda e dos
cromossomos desnaturado (separao das cadeias da
hlice dupla) e posto em contato, oferecendo-se as
condies para que volte condio de cadeia dupla
(renaturao). Quando a cadeia dupla refeita entre o
DNA da sonda e o do cromossomo (hibridao), o
segmento do cromossomo pode ser visualizado
fluorescente ao microscpio de luz UV.
78
As alteraes cromossmicas

Os cromossomos podem ter o nmero ou a estrutura alterados. As alteraes do
nmero dos cromossomos decorrem de erros na separao dos cromossomos na diviso
celular (no-disjuno cromossmica). Esses erros podem acontecer na formao dos gametas
(numa meiose) ou aps a unio dos gametas que formam o zigoto (numa mitose). As
alteraes estruturais resultam de quebras nos cromossomos, seguidas de fuso de
extremidades que no estavam contguas. Assim, os segmentos podem ser trocados de
posio, perdidos ou duplicados. Essas alteraes tambm podem se originar durante a
formao dos gametas ou depois da formao do zigoto.
Em geral as anormalidades cromossmicas no so herdadas e surgem em cada
gerao como mutaes novas. Isso acontece porque na maioria dos casos h perda ou ganho
de cromossomos ou de segmentos cromossmicos que levam seus portadores morte pr - ou
ps-natal e aqueles que sobrevivem geralmente no as transmitem para a prole, porque so
estreis ou apresentam quadro clnico muito grave. Nas pessoas portadoras de alteraes
estruturais, entretanto, essa alterao est freqentemente equilibrada, ou seja, houve
mudana de posio de segmentos cromossmicos, sem que ocorressem perdas ou ganhos
que produzissem efeitos clnicos. Esses indivduos podem passar essas alteraes para a
gerao seguinte, na forma equilibrada ou no, mas entre eles h uma parcela que estril,
por efeito do rearranjo cromossmico na gametognese.
A Tabela 4 mostra as freqncias dos diversos tipos de alteraes cromossmicas
entre recm-nascidos.

Tabela 4 Freqncias dos diferentes tipos de alteraes cromossmicas por mil
nascimentos*

Tipos de alterao Freqncia/1000
Numricas 3,4
Autossmicas 1,4
Cromossomos sexuais 2
Estruturais 2,6
No equilibradas 0,6
Equilibradas 2
Total 6

*Freqncias estimadas a partir dos estudos de sries de recm-nascidos consecutivos em
diferentes pases.

As alteraes cromossmicas numricas

Os erros de diviso celular podem resultar em indivduos com trs ou quatro vezes o
nmero haplide (n = 23) de cromossomos: os triplides (3n = 69 cromossomos) e os
tetraplides (4n =92 cromossomos), respectivamente. Ambas as condies so muito raras e
letais, provocando quase sempre abortamento ou morte logo aps o nascimento. A triploidia ,
na maioria das vezes, resultado de dispermia, ou seja, da participao de dois
espermatozides na fertilizao de um vulo. Pode acontecer tambm a produo de um
gameta diplide, por uma falha na diviso meitica ou ainda pela fuso de um vulo com um
corpsculo polar. A tetraploidia parece resultar principalmente de um erro mittico, depois da
formao do zigoto, levando duplicao do nmero total de cromossomos.
Com maior freqncia os erros de separao dos cromossomos resultam em
alteraes em um par, que perde ou ganha um cromossomo, produzindo-se, respectivamente,
monossomias ou trissomias (as aneuploidias). Erros mais complexos, que atingem mais de um
par ou com ganhos de mais de um cromossomo podem ocorrer, mas so bem mais raros.
Essas alteraes, mesmo quando afetam um nico par cromossmico, so encontradas
principalmente em abortos. Entre recm-nascidos, as monossomias autossmicas no
aparecem e a nica trissomia de autossomos com freqncia significativa a do cromossomo
21, que causa a sndrome de Down, com uma incidncia de 1/800 a 1/1.000. As outras duas
trissomias compatveis com a sobrevivncia at o nascimento so as dos cromossomos 13 e
18, observadas em 1/10.000 e 1/6.000 nascidos vivos, respectivamente. A maioria dos
afetados, entretanto, morrem nas primeiras semanas de vida. Algumas outras trissomias
79
autossmicas, como a do cromossomo 8, podem ser encontradas em nascidos vivos, se bem
que muito raramente e, nesses casos, foram detectadas clulas normais ao lado das clulas
trissmicas, caracterizando um mosaicismo cromossmico.
As aneuploidias dos cromossomos sexuais so mais freqentes. Estima-se que 1/400
meninos e 1/650 meninas nasam com essas alteraes. Mesmo a monossomia X (45,X)
encontrada entre recm-nascidas (1/5.000), apesar de constituir a alterao cromossmica
individualmente mais freqente nos abortos. A explicao para a menor letalidade das
alteraes do nmero de cromossomos sexuais est no fato de que um dos cromossomos X
nas clulas somticas da mulheres est inativo, num mecanismo de compensao de dose, ou
seja, para compensar a presena de dois cromossomos X nas mulheres e um nico no homem.
O nmero de genes no cromossomo X muito maior do que no cromossomo Y, onde se
encontram principalmente genes que atuam no desenvolvimento e no funcionamento dos
testculos, havendo raros segmentos homlogos ao cromossomo X. O silenciamento de um dos
cromossomos X nas mulheres no atinge, entretanto todos os genes, havendo aqueles que
funcionam em dose dupla. Os defeitos produzidos pela alterao do nmero de cromossomos
X parecem, assim, decorrer do funcionamento alterado desses genes.
Apesar de as aneuploidias poderem decorrer de erros na separao de cromossomos,
tanto meiticos (Figura 29) como mitticos (Figura 30), elas resultam principalmente da no-
disjuno cromossmica na primeira diviso meitica materna. Estudos da origem do
cromossomo extra presente em crianas com sndrome de Down, utilizando polimorfismos do
DNA, mostram que em 90% dos casos a no-disjuno foi materna, 75% tendo ocorrido na
primeira diviso meitica. Quando o cromosomo extra contribuido pelo pai, a no-disjuno
tem chances semelhantes de ter acontecido em qualquer das duas divises meiticas. Em
cerca de 3% dos casos, a no disjuno ps-zigtica, ocorrendo, portanto, numa mitose.
Antes mesmo de se saber que a trissomia 21 era a causa da sndrome de Down, j se
detectara a influncia da idade materna em sua incidncia. Para mulheres com menos de 35
anos de idade, o risco de nascer uma criana afetada pela sndrome de aproximadamente
1/1.000; esse risco vai progressivamente aumentando, especialmente aps os 35 anos,
quando de 1/400, atingindo 1/100 aos 40 anos e 1/25, aps a idade de 45 anos. Esse risco
se aplica tambm a outras trissomias. A idade materna a partir dos 35 anos constitui-se, assim,
na indicao mais freqente para o diagnstico pr-natal de doenas genticas.
O mecanismo pelo qual a idade materna influencia a ocorrncia de no-disjuno no
est esclarecido. Diferentemente do que ocorre na gametognese masculina, em que a meiose
um processo contnuo a partir da maturidade sexual, na mulher a meiose se inicia por volta
do terceiro ms de vida intra-uterina. Por ocasio do nascimento, os ovcitos encontram-se no
final da prfase da primeira diviso meitica, numa fase estacionria o dictiteno, s
retomando a diviso, um a cada ciclo menstrual, a partir da puberdade. Esse envelhecimento
do vulo no dictiteno seria o responsvel pelo aumento na incidncia de no-disjuno
cromossmica.

As alteraes da estrutura cromossmica

Os cromossomos podem quebrar-se e o mecanismo de reparo celular ao atuar para cicatriz-
los pode faz-lo incorretamente, resultando em mudanas de posio, perdas e duplicaes de
segmentos cromossmicos. Um outro mecanismo que pode originar rearranjos cromossmicos
a recombinao ilcita entre segmentos do genoma que tm seqncias muito semelhantes,
mas no esto situadas exatamente na mesma posio em cromossomos homlogos. Difere,
assim, da recombinao que leva troca de segmentos exatamente correspondentes que
ocorre normalmente na meiose e que produz diferentes combinaes de genes paternos e
maternos em um par de cromossomos.
Um rearranjo cromossmico pode no alterar a informao gentica, estando
equilibrado sem produzir efeitos clnicos. Quando h perda ou ganho de segmentos, o
rearranjo est no-equilibrado e o portador apresenta um quadro clnico caracterizado
geralmente por malformaes congnitas e retardo mental de graus variveis. interessante
que rearranjos cromossmicos que se apresentam equilibrados na anlise do padro de
bandas G podem estar associados a sinais clnicos. O fato de esses rearranjos serem mais
freqentes entre pessoas afetadas do que na populao geral indica que no se trata sempre
de simples coincidncia. Na verdade, j se demonstrou, em anlises mais refinadas por

80

Figura 29 Comportamento dos
cromossomos na meiose: a formao de
clulas haplides os gametas - a partir de
uma clula germinativa diplide (A).
Formao de gametas aneuplides, devido a
no disjuno dos cromossomos X e Y na
primeira (B) e na segunda diviso da meiose
masculina (C).

Figura 30 No-disjuno cromossmica ps-
zigtica, numa diviso mittica no incio do
desenvolvimento, originando um indivduo com
trs linhagens celulares: 45,X/47,XXX/46,XX
(mosaicismo cromossmico).

81
Um rearranjo cromossmico pode no alterar a informao gentica, estando
equilibrado sem produzir efeitos clnicos. Quando h perda ou ganho de segmentos, o
rearranjo est no-equilibrado e o portador apresenta um quadro clnico caracterizado
geralmente por malformaes congnitas e retardo mental de graus variveis. interessante
que rearranjos cromossmicos que se apresentam equilibrados na anlise do padro de
bandas G podem estar associados a sinais clnicos. O fato de esses rearranjos serem mais
freqentes entre pessoas afetadas do que na populao geral indica que no se trata sempre
de simples coincidncia. Na verdade, j se demonstrou, em anlises mais refinadas por
hibridao in situ e do DNA, que as quebras em rearranjos aparentemente equilibrados podem
danificar genes, levando a um fentipo alterado. Esse tipo de alterao est abaixo do poder
de resoluo da anlise cromossmica por bandamento.
A Figura 31 mostra alguns tipos de alteraes estruturais dos cromossomos humanos.

Fi gura 31 Alteraes cromossmicas estruturais

As translocaes so rearranjos que consistem em trocas de segmentos entre
cromossomos. Entre as crianas com sndrome de Down, por exemplo, uma frao de
aproximadamente 4% tem uma trissomia 21 por translocao: possuem dois cromossomos 21
livres e um terceiro translocado para um outro cromossomo (Figura 32). Essas translocaes
geralmente ocorrem na formao de um dos gametas que originou a criana e no tendem a
repetir na irmandade do afetado. Entretanto, um dos genitores pode ser portador da
translocao em estado equilibrado e, se este for o caso, h risco aumentado de repetio da
sndrome de Down na famlia. A Figura 32 mostra o que pode ocorrer na meiose de um
portador de translocao equilibrada entre os cromossomos 14 e 21: na meiose ocorre
normalmente o emparelhamento dos cromossomos homlogos, o que assegura que cada
gameta formado receba um representante de cada par. No portador da translocao
equilibrada os cromossomos 21 e 14 se emparelham com os homlogos que formam o
cromossomo translocado. Quando esses cromossomos vo para os gametas, podem faz-lo
em seis diferentes combinaes. Dois tipos de gametas podem originar crianas normais, com
cromossomos normais ou com a translocao equilibrada. Os demais gametas vo formar
zigotos com alteraes cromossmicas, monossomias e trissomias do cromossomo 14 ou do
21. Dessas alteraes, a nica compatvel com o desenvolvimento at o nascimento a
trissomia do 21. Assim, teoricamente, o risco de criana com sndrome de Down na prole do
portador de 1/3. O risco emprico, entretanto, bem diferente: quando a me a portadora
da translocao, o risco de cerca de 15% e de menos de 5%, quando o pai portador.
Esse risco menor do que o esperado em parte explicado pelo abortamento espontneo de
fetos com trissomia 21. A diferena entre os riscos para homens e mulheres portadores pode
decorrer de seleo contra os espermatozides com alteraes cromossmicas ou de
peculiariedades meiticas que possam estar favorecendo o tipo de segregao dos
cromossomos que origina gametas normais.

82

Figura 32 Os dois cromossomos 21
livres e um terceiro translocado para um
cromossomo 14, em uma criana com
sndrome de Down. O esquema mostra
como o cromossomo translocado se
formou. Houve no processo a perda de
pequenos segmentos dos dois
cromossomos, compreendendo
basicamente genes que produzem RNA
ribossmico. Como esses genes esto
repetidos muitas vezes nos outros
cromossomos acrocntricos, essa perda
no traz efeitos clnicos.

O fato de a sndrome de Down poder ser causada por uma translocao herdada torna
a realizao do exame cromossmico dos afetados ou de seus pais necessria, mesmo
quando o diagnstico pode ser firmado com base nos sinais clnicos.
O que apresentamos sobre as translocaes na sndrome de Down, aplica-se aos
rearranjos estruturais em geral. Quando uma alterao estrutural detectada numa criana, os
genitores devem ter seus cromossomos analisados. Se um dos genitores portador da
alterao cromossmica equilibrada, outras pessoas de sua famlia tambm podem ser
portadoras, com risco aumentado de ter criana com alterao cromossmica. Esses possveis
portadores devem ser identificados e alertados sobre essa possibilidade, estando indicado que
se submetam ao exame cromossmico. Uma das indicaes indiscutveis de diagnstico pr-
natal justamente quando um dos membros do casal tem uma alterao cromossmica
equilibrada (Figura 33).

Figura 33 Um
portador de
translocao
equilibrada entre os
cromossomos 14 e 21
(A) tem fentipo
normal, possuindo
toda a informao
gentica desses
cromossomos
necessrias para o
desenvolvimento
normal. Pode formar,
entretanto, gametas
com alteraes
cromossmicas: na
meiose, o
emparelhamento do
cromossomo
translocado com os
cromossomos 14 e 21
normais (B) leva
formao de seis
diferentes tipos de
gametas (C).

83
Quando Solicitar Exame Cromossmico

Foi citado anteriormente a necessidade de certos exames de laboratrio para
esclarecer ou confirmar o diagnstico. Muitos deles so exames normalmente executados por
laboratrios clnicos, mas alguns, por motivos histricos ou por ainda serem muito usados em
pesquisa, so freqentemente realizados nos laboratrios de gentica humana ou nos servios
de Aconselhamento.
Os mais importantes so: o estudo direto dos cromossomos humanos ao microscpio
para determinao do caritipo e o estudo do DNA. Como se trata de exames caros e
trabalhosos, o clnico deve solicit-los apenas quando ele for plenamente indicado. No h
sentido, por exemplo, em solicitar estudo de caritipo em doenas sabidamente mendelianas,
como as mucopolissacaridoses, ou as formas bem caracterizadas de nanismo; ou em defeitos
de causa multifatorial, como o p torto ou o lbio leporino; ou em entidades que podem
pertencer a uma ou outra dessas categorias, como a hidrocefalia ou a microcefalia.
Suspeita-se de anomalia cromossmica e pede-se, com plena indicao o estudo
citognico de laboratrio em casos de:
1. Malformaes congnitas mltiplas, que correspondem a sndromes j
reconhecidamente devido a anomalias cromossmicas (mongolismo, sndrome do miado do
gato, etc.).
2. Malformaes congnitas mltiplas, que no constituem sndrome conhecida de
aberrao cromossmica, desde que tambm no se encaixem em sndrome gnica,
multifatorial ou ambiental conhecida.
3. Duas ou mais malformaes associadas ao atraso de desenvolvimento e retardo
mental.
4. Sinais menos tpicos do que os anteriores, que sejam, entretanto, reforados por um
ou mais dos seguintes sinais ou circunstncias: antecedentes pr ou perinatais me de idade
elevada, poli-hidrmnios, artria umbilical nica, placenta pequena, apresentao plvica ou
podlica, estatura e peso baixos ao nascer em relao idade gestacional; sinais clnicos
anomalias fsicas menores, fisionomia do paciente totalmente diferente da de seus parentes.
5. Alguns dos sinais abaixo indicativos de aberraes dos cromossomos sexuais (em
vrios desses casos o exame de cromatina sexual suficiente para, em associao com sinais
clnicos, firmar o diagnstico): testculos pequenos; amenorria primria; hipogonadismo;
fertilidade diminuda ou nula; genitlia externa ambgua.
6. Pessoa normal que teve criana portadora de aberrao cromossmica estrutural
(translocao) para investigar a presena da translocao equilibrada.

84
DIAGNSTICO MOLECULAR DE DOENAS GENTICAS
Regina Clia Mingroni Netto

So vrias as estratgias para se estudar aspectos moleculares das doenas
hereditrias, pois algumas ainda no tiveram os genes responsveis identificados. Em outras,
apesar de o gene causador ter sido identificado, ocorrem tantos tipos de mutaes diversas
que se torna difcil desenvolver um nico teste para diagnstico. Contudo, para a maioria dos
casos, possvel fazer aconselhamento gentico seguro e tambm diagnstico pr-natal,
desde que se conhea pelo menos a localizao aproximada do gene no cromossomo.
Os testes diagnsticos baseados em anlise de DNA so realizados em crianas e adultos com
relativa facilidade, a partir de procedimentos de extrao de DNA de sangue perifrico. Um
volume de 5ml de sangue fornece DNA mais do que suficiente para vrios testes, sendo a
sobra do DNA estocada para estudos futuros. Se necessrio, o DNA pode ser extrado a partir
de amostras muito menores de sangue, como, por exemplo, 500l, caso o objetivo seja estudar
o DNA atravs da PCR.
A objetivo bsico das tcnicas de diagnstico pr-natal obter amostras de tecido
fetal para anlises bioqumicas, de DNA ou de cromossomos. A coleta de amostras de
vilosidade cornica, de lquido amnitico ou mesmo de sangue fetal atravs da cordocentese
permite obter DNA em quantidade suficiente para as anlises que descreveremos a seguir. A
vilosidade corinica a parte da futura placenta de origem fetal que, localizada fora do
embrio, tem constituio gentica igual do feto. Na amniocentese, so coletadas no lquido
amnitico as clulas chamadas amnicitos que podem ser submetidas a estudos. A coleta
feita transabdominalmente, geralmente a partir da 16
a
semana de gestao, atravs de uma
seringa especial guiada por ultrassom. Porm, pode ser necessrio fazer uma cultura de
clulas para se obter material suficiente para anlise, o que torna este estudo mais demorado.
A cordocentese consiste na coleta de sangue fetal atravs de uma agulha introduzida nos
vasos do cordo umbilical. Entre essas tcnicas de coleta, a amostra de vilosidade corinica
a menos invasiva e a mais precoce (realizada entre a 8
a
e a 12
a
A seguir, vamos detalhar alguns exemplos de doenas hereditrias e as ferramentas
moleculares que podem ser utilizadas no seu diagnstico.
semana de gestao).
Portanto, ela tem sido a preferida na obteno de material para estudos de DNA.

MUTAES QUE AFETAM STIOS DE RESTRIO: DETECO DIRETA POR
SOUTHERN BLOTTING

Uma maneira das maneiras mais simples de se estudar uma doena hereditria
atravs da deteco de uma mutao que modifica um stio de restrio. Quando o DNA dos
afetados digerido com enzimas de restrio, separado em gel de agarose, submetido a
Southern-blotting e hibridao com uma sonda especfica para o gene, fragmentos de DNA de
tamanho alterado surgem como resultado da hibridao, diferentes daqueles esperados para
as pessoas normais. Um exemplo desse tipo de anlise o representado pela mutao que
causa a anemia falciforme na espcie humana (Fig. 34).
A anemia falciforme resulta de uma mutao de ponto que substitui um cido glutmico
(GAG) por uma valina (GTG) na posio 6 da cadeia beta da hemoglobina. Felizmente, para
efeito de diagnstico, a mutao que troca A por T elimina stios de restrio de vrias enzimas
conhecidas. Assim, essa mutao pode ser facilmente detectada aps digesto com enzima de
restrio seguida de Southern-blotting e hibridao com sondas do gene. Por exemplo, a
enzima de restrio Mst II gera um fragmento de 1,1 kb no DNA de pessoas normais. Este stio
de Mst II destrudo na presena da mutao e nas pessoas portadoras surge ento um
fragmento de 1,3 kb. A figura 1 mostra os resultados desse tipo de anlise numa famlia em
que ocorre a anemia falciforme. Este tipo de exame s possvel porque sempre o mesmo
tipo de mutao que leva anemia falciforme, em todas as famlias estudadas. Porm,
doenas em que todos os casos so devidos a um nico tipo de mutao so, infelizmente,
uma exceo. Como veremos, outras doenas requerem outras estratgias de anlise mais
elaboradas.
A anlise por meio do Southern-blotting seguido de hibridao pode ser tambm usada
no diagnstico de muitas outras doenas hereditrias, desde que a mutao altere o tamanho
de um fragmento de restrio de maneira detectvel ou cause a deleo de um certo fragmento
de restrio. Por exemplo, cerca de 60% dos casos de Distrofia Muscular do tipo Duchenne so
devidos a delees diversas no gene da distrofina, localizado no cromossomo X. Antes do
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advento das tcnicas de PCR, era comum hibridar o DNA dos afetados com sondas de cDNA
do gene da distrofina, procurando-se detectar delees. Uma sonda de cDNA hibrida com
vrios exons do gene simultaneamente, e a ausncia de um sinal de hibridao pode significar
uma deleo (Fig. 35).
Um tipo muito especial de mutao responsvel por doenas foi identificado a partir de
1991. Algumas doenas como a sndrome do cromossomo X frgil, a distrofia miotnica de
Steinert e a doena de Huntington so causadas por um mecanismo mutacional peculiar: a
expanso anormal de trinucleotdeos repetidos polimrficos. Em outras palavras, uma
seqncia de trinucleotdeos (por exemplo, CGG na sndrome do X frgil) pode variar
normalmente na populao at um certo nmero de cpias. Acima de um certo nmero de
cpias, podem surgir os sinais clnicos da doena. O mais curioso sobre essas sndromes
que o nmero de cpias dos trinucleotdeos pode ir aumentando a cada gerao, o que
acarreta maior gravidade do quadro clnico ou maior risco de prole afetada para os portadores
das expanses maiores. No caso da distrofia miotnica e da sndrome do X frgil, em que as
expanses acarretam um aumento aprecivel no tamanho de um dado fragmento de restrio
que abrange as repeties, o diagnstico das expanses feito por Southern-blotting seguido
de hibridao com sondas radioativas, como apresentado na figura 36.

USO DE MARCADORES MOLECULARES EM ESTUDOS DE LIGAO: GENE DA
DOENA AINDA NO IDENTIFICADO

Em muitas das doenas hereditrias atualmente em investigao, ainda no foi
possvel identificar o gene responsvel. Em outras, o gene j foi identificado, mas existe uma
enorme variedade de tipos de mutaes diferentes que afetam o mesmo gene, tornando a
anlise da mutao invivel atravs de um nico mtodo de diagnstico. Nesses casos,
somente mtodos sofisticados de deteco de mutao ou o seqenciamento dos xons do
gene da doena nos afetados poderiam ser usados para identificar cada tipo de mutao.
Nesses casos e nos casos das doenas com genes ainda no identificados, possvel usar os
RFLPs (restriction fragment length polymorphisms) como ferramenta indireta de
aconselhamento gentico.
Como j dissemos, os RFLPs representam diferenas em stios de restrio que
ocorrem como polimorfismos na populao em geral. Essas pequenas variaes na seqncia
de bases do DNA responsveis pelos RFLPs no acarretam efeitos fenotpicos e no so
responsveis pela doena em si. Contudo, se localizados muito prximos ao gene da doena
em estudo, servem como indicadores indiretos da segregao da mutao que causa a
doena. Portanto, para usar um RFLP em aconselhamento gentico, necessrio saber
previamente que o marcador escolhido localiza-se prximo ao gene da doena, existindo uma
baixa probabilidade de ocorrer permutao entre eles. Essa informao obtida atravs de
estudos de ligao prvios entre o marcador e o gene da doena, realizados a partir de vrias
famlias. Na figura 4, podemos observar como um RFLP permite concluir quais so os
provveis indivduos portadores de um gene mutado na genealogia, em que segrega uma
doena de herana ligada ao cromossomo X.
Convm lembrar, porm, que este mtodo no representa um mtodo de deteco
direta da mutao e que tem suas limitaes. Primeiramente, devem ser estudados vrios
indivduos da mesma famlia para que se obtenham resultados conclusivos. Ainda, os
indivduos portadores certos da mutao devem ser informativos, ou seja, heterozigotos em
relao aos marcadores selecionados. Se isto no ocorrer, deve se procurar um outro
marcador molecular para o qual a famlia seja informativa. Leva-se em conta tambm no
aconselhamento gentico a probabilidade, ainda que pequena, de que ocorra um evento de
recombinao entre os marcadores e o gene da doena, levando a uma interpretao errada
dos resultados. Mesmo com estas limitaes, esta metodologia muito usada e resultados com
confiabilidade de 95% ou mais podem ser oferecidos s famlias que buscam aconselhamento
gentico.
86

Figura 34. Deteco direta da mutao da cadeia da
hemoglobina atravs de digesto com enzima de restrio e
Southern blotting. (a) A troca de bases (A por T) destri o stio
de reconhecimento de vrias enzimas de restrio, incluindo
Mst II. (b) Esta enzima corta o gene da globina normal,
originando um fragmento de 1,1kb e outro de 0,2 kb,
detectveis atravs da hibridao com uma sonda da regio 5
do gene da -globina. c) Diagnstico pr-natal da anemia
falciforme utilizando o polimorfismo de Mst II. A me (M) e o pai
(F) so portadores do alelo que causa a siclemia pois tm dois
fragmentos, 1,1kb e 1,3kb. O filho normal (C) homozigoto em
relao ao alelo normal de 1,1kb. O feto herdou um alelo
mutado de cada um dos pais e ser afetado pela siclemia.

Figura 35. Identificao de delees na distrofia muscular
Duchenne utilizando sondas de cDNA. O DNA de meninos com
DMD (pistas de 1 a 4A) e seus irmos normais (pistas de 1 a
4B) foi digerido com a enzima Taq I e hibridado com uma sonda
de cDNA que detecta sete exons no DNA dos indivduos
normais (i a vii). Os meninos afetados tm diversas delees e
o paciente 4A apresenta um fragmento de tamanho anormal,
alm de outros exons deletados. A primeira pista indica o
marcador de peso molecular.

87

Da mesma forma que os RFLPs, existem outros tipos de seqncias polimrficas
dispersas no genoma humano, igualmente teis no mapeamento de genes que causam
doenas e no aconselhamento gentico. So os chamados VNTRs (variable number of tandem
repeats) ou minissatlites. Esses polimorfismos consistem em repeties presentes em nmero

Figura 36. Deteco da mutao do loco FMR-1 causadora da
sndrome do cromossomo X frgil. (N) um homem normal,
sem nenhuma expanso de trinucleotdeos no loco FMR-1; (TN)
um homem portador de uma pequena expanso naquele loco,
a qual no tem efeitos fenotpicos; nesse caso, diz-se que o
indivduo portador da pr-mutao. (A) um homem afetado
pela sndrome, apresentando retardo mental; ele portador de
uma enorme expanso no loco FMR-1, ou seja, da mutao
completa.

Figura 37. Herana codominante de um
RFLP mapeado no cromossomo X humano.
Os alelos 1 e 2 diferem pela presena de
um stio de restrio para a enzima Eco RI
(E). Note que, nesta famlia, o alelo 2
segrega com a mutao que causa doena,
enquanto que o alelo 1 aparece no
indivduo do sexo masculino que no
herdou a doena da me. Note tambm que
a presena do alelo 2 nas irms dos
afetados permitiu a concluso de que estas
mulheres so heterozigotas quanto ao gene
da doena.

88
varivel de cpias nos indivduos da populao. Os mdulos constituintes das repeties so
seqncias repetitivas de 9 at cerca de 60 pares de bases. So tantos os tipos de segmentos
repetidos (o que os pesquisadores da rea chamam de "alelos") na populao que
praticamente todas as pessoas so heterozigotas quanto ao nmero de cpias (no caso dos
RFLPs, geralmente existem somente dois ou poucos "alelos" diferentes na populao). A
diferena entre os "alelos" pode ser detectada se o DNA dos indivduos for digerido por uma
enzima de restrio cujo stio de corte flanqueie a VNTR, seguido de eletroforese em gel de
agarose e da hibridao com sonda especfica. A grande vantagem das VNTRs sobre os
RFLPs reside no maior grau de polimorfismo presente na populao, o que significa maior
chance de que uma dada famlia seja informativa para um marcador.
Quando uma sonda de DNA complementar apresenta a diversos minissatlites, a
hibridao resulta em um padro complexo de bandas que denominado de fingerprinting de
DNA, ou impresso digital gentica. Dado o alto grau de polimorfismo das bandas na
populao, praticamente impossvel que dois indivduos no aparentados tenham os mesmos
comprimentos de fragmentos nas vrias VNTRs estudadas simultaneamente, da o nome de
impresso digital gentica (Fig. 38).

A figura 39 mostra o resultado de um fingerprinting com bandas idnticas obtido de
gmeos monozigticos e dizigticos. Tanto a impresso digital gentica (sondas multilocais)
como VNTRs analisadas individualmente (sondas unilocais) so muito usadas para resolver
questes de paternidade duvidosa e identificao de indivduos para finalidades forenses.

Figura 38. VNTRs (variable number of tandem
repeats): (a) o loco da VNTR um intron do
gene da mioglobina composto por quatro
repeties de uma seqncia de 33pb. (b) A
variabilidade em vrios loci de VNTR pode
gerar diversidade de fragmentos suficiente para
identificar indivduos. No exemplo, entre duas e
oito cpias da VNTR esto presentes nos trs
loci diferentes (I a III), que so detectados
simultaneamente pela mesma sonda. Embora
indivduos diferentes possam ter alguns alelos
em comum, a chance de que dois indivduos
tenham todos os fragmentos em comum
mnima. Os stios de corte das enzimas de res-
trio esto indicados por setas.

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Existe tambm um terceiro tipo de polimorfismo de DNA muito usado em estudos de
ligao e identificao de indivduos: so os chamados microssatlites. Eles so constitudos
por seqncias repetidas de dinucleotdeos, trinucleotdeos ou tetranucleotdeos, geralmente.
Por exemplo, repeties do dinucleotdeo AC de nmero varivel so constituintes comuns
desse tipo de polimorfismo. Como os "alelos" diferem entre si por dois, trs ou quatro
nucleotdeos apenas, a anlise no possvel em gis de agarose comuns. Fragmentos
pequenos de DNA contendo as repeties polimrficas so amplificados pela PCR na presena
de primers altamente especficos. Os produtos da amplificao so separados em gis de
acrilamida semelhantes aos usados para seqenciamento do DNA. Por empregar a PCR, este
mtodo tem a vantagem de utilizar quantidades muito menores de DNA que um blotting
comum seguido de hibridao, e os resultados so visualizados muito mais rapidamente. Por
isso, os microssatlites so tambm utilizados na identificao de indivduos ou em questes
de paternidade. Mais modernamente, eles tambm so estudados nos analisadores genticos
automticos, ou seja, nos mesmos equipamentos que analisam o seqenciamento
automatizado do DNA.

A TCNICA DA PCR NO ESTUDO DAS DOENAS HEREDITRIAS

A reao da PCR (reao em cadeia da polimerase) tem facilitado muito os estudos de
DNA para efeito de diagnstico. Para que a PCR seja utilizada em algum teste diagnstico,
fundamental o conhecimento da seqncia de bases do DNA da regio em estudo, pelo menos
parcialmente. Desse modo, primers especficos regio em estudo podem ser construdos.
A tcnica tem algumas propriedades que a tornam extremamente vantajosa em termos
de prtica laboratorial: em primeiro lugar, a quantidade de material necessria para a reao
de alguns nanogramas de DNA, em comparao com os 5 a 10 g necessrios quando o DNA
obtido de um paciente que vai ser estudado por meio de uma tcnica de Southern-blotting.
Um pouco de sangue (200 l) e amostras de vilosidade corinica podem ser facilmente
utilizados em procedimentos diagnsticos. At mesmo a soluo obtida aps um bochecho
com soluo salina pode conter clulas suficientes para anlise pela PCR. Esta vantagem torna
mais vivel a realizao de programas de triagem em larga escala populacional de doenas
genticas, como por exemplo, da anemia falciforme.

Figura 39.Fingerprinting de DNA
em pares de gmeos, aps
hibridao com uma sonda que
detecta VNTRs em vrios loci. Cada
par de pistas contm o DNA de
pares de gmeos. Os gmeos do
primeiro par e do terceiro par tm
padres idnticos de bandas,
indicando que so gmeos
monozigticos. O par de gmeos do
meio tem padres distintos,
indicando que so gmeos
dizigticos. A figura tambm ilustra
o grau de variao detectada entre
indiv-duos que no so gmeos
idnticos.

90
A segunda vantagem que a deteco dos produ-tos da amplificao muito mais
simples do que os procedimentos baseados no Southern-blotting, pois a anlise dos resultados
dispensa, na maioria dos casos, o uso de sondas. Quando consideramos que muitos dos
diagnsticos de doenas so feitos com base em sondas marcadas radioativamente, dispensar
a radiao do processo altamente desejvel em termos prticos. Os produtos da amplificao
podem ser analisados diretamente aps eletroforese em gel de agarose, ou, dependendo do
tamanho dos produtos amplificados, aps eletroforese em gel de acrilamida.
A terceira vantagem reside no tempo gasto pelos exames baseados na PCR: algumas
horas de amplificao so seguidas por mais algumas horas de eletroforese e os produtos j
so analisados. possvel fornecer um resultado em menos de 48 horas, o que altamente
desejvel, principalmente em casos de diagnstico pr-natal. Em contrapartida, um mtodo
baseado em Southern-blotting requer no mnimo uma semana at o resultado final.
Em ltimo lugar, a especificidade da reao permite que vrias seqncias possam ser
amplificadas simultaneamente desde que os produtos tenham tamanho diferente e possam ser
diferenciados aps eletroforese em gel. Um exemplo importante desta anlise, chamada de

multiplex, a aplicao na anlise simultnea de delees em vrios exons do gene que
causam a distrofia muscular de Duchenne. Na reao representada na figura 40, nove regies
do gene so analisadas no mesmo teste. A ausncia de amplificao significa deleo da
regio que seria amplificada.
Um outro exemplo interessante da aplicao rotineira da PCR no estudo de doenas
o caso da fibrose cstica, a doena autossmica recessiva mais freqente nas populaes de
origem europia. Descobriu-se, aps a clonagem do gene, que o tipo de mutao mais
freqente em caucasides uma deleo de trs nucleotdeos (TTC) no xon 10 do gene,
localizado no cromossomo 7. Esta mutao, conhecida como deleo F508, pode ser
estudada atravs da PCR pois os afetados apresentam um certo produto de amplificao que
fica trs pares de bases menor do que o das pessoas normais. A diferena pode ser observada

Figura 40. Diagnstico de distrofia muscular Duchenne pela
anlise de exons deletados por PCR mltiplo. A barra
representa os 2000 kb do gene da distrofina. Foram construdos
pares de primers para amplificar as nove regies do gene da
distrofina mais freqentemente deletadas nos
afetados.representadas (barras negras). Amostras de DNA de
cada paciente so amplificadas na presena dos nove pares de
primers simultaneamente e os produtos da PCR so analisados
diretamente em gel de agarose corado com brometo de etdeo.
O paciente 1 no tem deleo de nenhum fragmento enquanto
que o paciente 4 tem uma grande deleo. Os outros pacientes
tm delees diversas. A pista branco um controle da
amplificao realizada sem nenhum DNA, e serve para verificar
se os reagentes da PCR no esto contaminados.

91
por eletroforese em gel de poliacrilamida. O resultado obtido em uma famlia com fibrose cstica
est mostrado na figura 8.
Assim, do ponto de vista cronolgico, muito comum que uma doena seja
primeiramente estudada indiretamente com o uso de RFLPs, micro ou minissatlites, enquanto
o gene responsvel ainda no foi identificado. Depois da identificao do gene, pode ser
comum o emprego de sondas marcadas. Quando o gene j est muito bem caracterizado, as
pores crticas j esto seqenciadas a as principais mutaes causadoras da doena so
conhecidas, comum a substituio dos mtodos de diagnstico baseados em Southern-
blotting por mtodos baseados na PCR, que visam a identificao das mutaes especficas.

Figura 41. Resultados da reao da PCR, revelando a mutao
tipo deleo F508 que causa a fibrose cstica. O afetado (em
preto) homozigoto para a mutao e apresenta duas bandas
de 47pb; os indivduos heterozigotos para a mutao, indicados
por um ponto preto, apresentam duas bandas de tamanho
distinto, 47 e 50pb.

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O ACONSELHAMENTO GENTICO

Priscila Guimares Otto, Paulo A Otto, Oswaldo Frota-Pessoa 1998 Gentica Humana e Clnica. Editora Roca Ltds.
So Paulo, pg 307-312.

Os casos de Aconselhamento Gentico, sejam enviados por clnicos, sejam vindos por
iniciativa das prprias famlias, podem ser organizados, do ponto de vista prtico, nas
categorias que comentaremos a seguir:
A - Casal normal, com histria reprodutiva insatisfatria por qualquer das razes abaixo:
1. Esterilidade (aberrao dos cromossomos sexuais?).
2. Abortos numerosos, com ou sem alguns filhos normais ou afetados (translocao
equilibrada em um dos cnjuges, talvez detectvel apenas pelas tcnicas de
bandeamento dos cromossomos?).
3. Uma ou mais crianas com anormalidades (distrbios ambientais durante a
gestao, o parto ou a primeira infncia? Translocao equilibrada em um dos
cnjuges? Gene recessivo patognico em heterozigose nos dois?).
B - Casal normal, sem filhos ou com filhos normais, que temem que sua prole venha a ser
afetada por uma das seguintes razes:
4. Os cnjuges so consangneos (risco global de 13% para primos em 1 grau, ou
mais que isso se houver precedentes na famlia com afeces autossmicas
recessivas).
5. Os cnjuges so relativamente idosos (riso de cerca de 2% aps os 40 anos
quanto ao nascimento de criana mongolide, ligeiro aumento no risco de outras
anomalias cromossmicas devido elevao na taxa de no-disjuno na mulher;
ligeiro aumento do risco de doenas dominantes, por mutao nova, devido ao
acmulo de mutaes na estirpe germinativa do homem).
6. A mulher Rh-negativa e o homem Rh-positivo (se a mulher no recebeu
transfuso de sangue Rh-positivo, o risco s existe para crianas Rh-positivas
nascidas aps o primeiro produto Rh-positivo; e, mesmo assim, uma assistncia
mdica adequada poder evitar a eritroblastose fetal).
7. Um dos cnjuges recebeu radiao ionizante ou drogas mutagnicas, por exemplo,
para tratamento de cncer, ou fez uso de drogas possivelmente teratognicas, ou
ainda, sofreu certas infeces (sfilis, rubola, tuberculose), que considera
transmissveis ao feto (exceto em casos de altas doses de radiao ionizante ou
drogas mutagnicas, o risco fica pouco aumentado se o agente em questo cessar
de atuar antes que se inicie a gravidez).
8. H precedente, na famlia de um dos cnjuges ou de ambos, de anomalias que
parecem hereditrias.
C - Casal normal, com um ou mais filhos afetados (decidir com base em anamnese e dados
clnicos e laboratoriais se a afeco gentica, ambiental ou multifatorial para estimar o risco
de recorrncia). So especialmente importantes as seguintes categorias:
9. Retardo mental (drogas ou infeces durante a gravidez? Trauma de parto?
Infeco na primeira infncia? Mutao dominante nova? Genes recessivos.
Anomalia cromossmica?.
10. Defeito fsico congnito, simples ou mltiplo, com ou sem retardo mental (mesmas
possibilidades do item 9).
11. Sndrome de herana mendeliana clara (com base em diagnstico firme, estimar o
risco de recorrncia que , em geral, alto; conforme o caso, estender o
aconselhamento a outros membros da famlia, tentando a deteco de
heterozigotos, quando indicado).
12. Sndrome multifatorial (recorrer a riscos empricos; os riscos, em geral, so baixos).
A) Pessoa afetada, solteira ou j casada, cuja anomalia possa passar prole. H a
distinguir vrias categorias, conforme risco para a prole:
13. Risco nulo ou quase: caso das sndromes sexuais esterilizantes (Turner, Klinefelter,
feminizao testicular, etc.) ou que exigem confinamento com impedimento
reprodutivo (retardo mental e psicoses graves).
14. Risco moderado: caso de defeitos multifatoriais, como lbio leporino; de doenas
ligadas ao sexo, como hemofilia, j que os afetados so homens cujas crianas so
normais, embora as filhas sejam transmissoras; de doenas recessivas de
gravidade mdia ou grande, desde que o afetado no se case com parente
consangneo.
93
15. Risco alto: sndromes mendelianas autossmicas dominantes de gravidade e
penetrncia mdias e altas.
B) Grupo heterogneo de casos quanto motivao para o Aconselhamento
Gentico:
16. Casos mdico-legais ou privados referentes a paternidade duvidosa, troca de
crianas, etc.
17. Crianas a serem adotadas, para as quais se pretende determinar a probabilidade
de virem a apresentar afeces hereditrias ou caractersticas raciais especficas.
18. Pares de gmeos que se apresentam para determinao de zigosidade (se so
monozigticos ou dizigticos).
19. Casos de diagnsticos pr-natal de afeces genticas nos pases em que o aborto
provocado legal quando o exame pr-natal revela que a criana teria alta
probabilidade de ir a ser afetada.

CIRCUNSTNCIAS DO ACONSELHAMENTO

O clnico aplica-se principalmente ao tratamento de seus pacientes; cada vez mais,
entretanto, ele est assumindo a responsabilidade de orient-los sobre planejamento familial
em casos de doenas hereditrias. A negligncia em faz-lo indesculpvel sempre que a
doena grave e de alto risco de recorrncia. Por exemplo, ante um caso de catarata
dominante, fenilcetonria ou distrofia muscular progressiva tipo Duchenne, o dever mais crucial
do clnico fazer o Aconselhamento Gentico ou encaminhar os interessados para servio
especializado que o faa.

Em Que Casos o Aconselhamento Gentico Indicado?

importante, portanto, que mesmo os mdicos no especializados em gentica
desenvolvam e apliquem critrios prticos para decidir em quais de seus casos indicado o
Aconselhamento Gentico. Eis alguns desses critrios:
1. Doenas ou defeitos, congnitos ou tardios, que no tenham obviamente causa
infecciosa, traumtica ou geritrica, mesmo quando no diagnosticados em termos de
sndrome conhecida e embora o afetado constitua caso isolado na famlia.
2. Casos de afeco repetida na famlia, que no seja claramente causado por fator
no-gentico.
3. Casais consangneos em qualquer grau, que tenham tido prole com afeco no
claramente ambiental ou tenham parentes com afeces autossmicas recessivas; e
namorados, noivos ou casados, mesmo com filhos normais, que sejam primos em 1 ou 2 grau
ou tenham maior grau de consanginidade, embora sem precedente de doenas autossmicas
recessivas na famlia.
4. Casos, mesmo isolados, de doenas ou defeitos que sabidamente tm componente
hereditrio significante, quer mendeliano, quer multifatorial.

Quem Deve Fazer o Aconselhamento?

Em princpio, o mdico da famlia a pessoa mais indicada para encarregar-se do
Aconselhamento Gentico pelo menos em sua fase inicial (descobrir que h indicao para o
Aconselhamento) e final (apoiar emocionalmente a famlia e orient-la psicologicamente quanto
deciso a tomar perante o relatrio tcnico).
Em casos tpicos e relativamente simples de doenas genticas, como albinismo
universal, Sndrome de Down (com caritipo analisado), acondroplasia (com diagnstico
diferencial seguro), o clnico bem informado deve encarregar-se inteiramente do
aconselhamento; e com a difuso que a gentica vem adquirindo no meio mdico, seu mbito
de ao tende a aumentar.
Resta, porm, um problema: o clnico deve saber gentica suficiente para reconhecer
em que casos sua gentica insuficiente para que ele resolva sozinho o caso. Isto o mais
difcil: porm, na prtica, evita-se qualquer perigo adotando o princpio que qualquer clnico
geral consciente j se acostumou a aplicar em relao aos diferentes setores da medicina: em
caso de dvida, encaminha-se o interessado ao especialista.

94

O Especialista

A quem enviar o consulente nos casos mais complicados? Existem no Brasil vrios
servios de Gentica Mdica e Aconselhamento Gentico, em geral associados s
universidades. Cada clnico geral deve relacionar-se com um deles, do mesmo modo que se
relaciona com clnicos especializados em Neurologia, Hematologia e tantos outros setores.
Os especialistas em Aconselhamento so mdicos que se especializaram em gentica
ou bilogos que se dedicaram gentica humana e adquiriram tirocnio em Aconselhamento.
Alguns dentre os ltimos dedicaram-se investigao sobre certas doenas a ponto de
se tornarem proficientes no diagnstico diferencial: mas, como regra, o geneticista que trabalha
em aconselhamento solicita do clnico diagnstico seguro para basear nele suas estimativas de
risco.
Em casos em que reste dvida, ele recorre a assessores clnicos especializados, tal
como faz o clnico geral.
No h dvida que o ideal o servio de aconselhamento situado em um centro
universitrio, de modo a usufruir da colaborao tanto de geneticistas como das diversas
clnicas especiais e tambm de psiclogos.
Em muitos casos, o prprio clnico prefere que o servio de Aconselhamento se
encarregue de orientar ou firmar o diagnstico preciso, avalie riscos e oriente diretamente a
famlia. Mais raramente o clnico recorre ao servio de Aconselhamento, ou a um geneticista,
apenas para a estimativa dos riscos, encarregando-se de transmitir o resultado famlia e
apoi-la psicologicamente quanto s suas decises.
Finalmente, h situaes em que o clnico solicita este ou aquele exame especializado
do mbito gentico, como poderia solicitar um eletroencefalograma ou uma dosagem de
hemoglobina.

ETAPAS DO ACONSELHAMENTO

Uma descrio das principais fases por que passa, em geral, um caso de
Aconselhamento Gentico servir para salientar certas caractersticas desse servio e mostrar
como nele se combinam componentes muito variados.

A - Determinao do tipo de herana
1. Diagnstico seguro da afeco do propsito (primeiro afetado na famlia a ser
examinado), se necessrio com confirmao por testes de laboratrio e consulta a
especialistas clnicos; ou sua mais completa caracterizao, caso no se chegue
ao diagnstico formal. Em muitos casos importante insistir no diagnstico
diferencial, pois muitas doenas parecidas tm herana bem diversa (por exemplo,
as mucopolissacaridoses e as distrofias musculares progressivas).
2. Levantamento do heredograma para investigar a possvel existncia de outros
afetados e seu grau de parentesco com o propsito e para determinar possveis
casamentos consangneos.
3. Estudo clnico dos outros afetados que existam para determinar se apresentam a
mesma doena do propsito e que variaes a expressividade da afeco
apresenta-se na famlia.
4. Balano entre as possveis causas genticas e ambientais da afeco, do propsito
e de outros afetados mediante anamnese, principalmente sobre antecedentes pr-
natais e perinatais.
5. Delineamento do tipo de transmisso do componente causal gentico, quando
possvel, com base nos dados dos itens 2 a 4.
6. Pesquisa bibliogrfica orientada pelo nome da nosologia quando se conseguiu
diagnstico formal; ou pelos sinais mais caractersticos, em caso contrrio. Hoje em
dia j existem programas de computador que executam essa tarefa; h tambm
diversos servios de rede de computadores que fornecem detalhes atualizados
sobre qualquer doena gentica.
7. Comparao dos dados da literatura com as concluses ou hipteses do item 5
para firmar-se o tipo de herana ou de causa ambiental no caso em estudo.
95
8. Exame dos membros da famlia aparentemente normais, quando for o caso, para
detectar transmissores do gene ou de aberraes cromossmicas equilibradas.
Isso pode consistir em aplicao de exames de DNA, testes de deteco de
heterozigotos em casos de genes recessivos, como na fenilcetonria e hemofilia,
ou de genes co-dominantes como na siclemia; ou na investigao de sinais frustros
ou subclnicos para reconhecimento de heterozigotos quanto a gene dominante de
penetrncia incompleta; ou ainda, em caso de aberraes cromossmicas
estruturais, no estudo citognico para deteco de portadores equilibrados de
aberraes estruturais.

B - Clculo dos riscos
9. Estimativa dos riscos de recorrncia da afeco em crianas que venham a nascer
dos pais do propsito e de outros casais da famlia. No caso de causa polignica
ou multifatorial, recorrer aos riscos empricos mais bem colhidos da literatura.
10. Redao do relatrio, que deve incluir referncia aos dados clnicos e genticos
pertinentes, a anlise do problema e a enunciao dos riscos.

C - Entrevista de Aconselhamento
11. Avaliao, ao longo das entrevistas de exame e coleta de dados, das tenses
emocionais presentes nos pais, irmos e outros parentes dos afetados.
12. Explicao verbal dos termos do relatrio famlia, de maneira adaptada s suas
condies culturais e sob forma que no precipite crises emocionais de
importncia. Em certos casos, omite-se esta etapa e remete-se o relatrio, sob
carter confidencial, ao clnico.
13. Ajuda aos consulentes para que conscientizem os riscos e adotem atitude racional
a respeito.
14. Assessoramento dos consulentes sobre mtodos de garantir o xito do
planejamento familial que venham a adotar em face dos riscos.
15. Esclarecimento tranqilizador aos membros da famlia que temam, sem razo,
riscos altos de recorrncia da afeco, quando for o caso.
16. Aconselhamento de outros membros da famlia, mesmo que no fossem de incio
consulentes, quando o estudo tenha demonstrado que sua prole corre alto risco.
17. Nos casos indicados, explicao aos solteiros da famlia sobre a importncia de
evitarem casamentos consangneos.

D - Acompanhamento
18. Quando indicado, seguimento dos casos atravs de contatos a intervalos longos
para aferir a eficcia do aconselhamento ou refor-lo.
96
DIAGNSTICO PR-NATAL


O diagnstico pr-natal consiste na aplicao de um conjunto de tcnicas capazes de
verificar a sade e o desenvolvimento do concepto (embrio ou feto) e de nele detectar,
quando presentes, defeitos e doenas. Alguns mtodos permitem a visualizao direta
(amnioscopia, fetoscopia) ou indireta (ultrassonografia, raios-X) do concepto e a conseqente
deteco de anomalias anatmicas. Outros dependem da obteno de fragmentos de tecido
(bipsia de vilosidades corinicas), de lquido amnitico (amniocentese) ou de alquotas de
sangue (cordocentese), material esse que colhido para a aplicao direta ou indireta (aps
cultivo) de testes bioqumicos (para deteco de erros inatos de metabolismo), moleculares
(testes de DNA para a deteco de genes mutantes) e citogenticos (estudo dos cromossomos
e determinao do caritipo para verificar-se suspeita de aberrao cromossmica).
A verificao da evoluo do ganho ponderal e do aumento da circunferncia
abdominal e a ausculta fetal j faziam parte de longa data da rotina do acompanhamento pr-
natal das gestantes; alteraes a detectadas j constituam evidncia de defeito ou doena no
concepto. Atualmente, mesmo em pases subdesenvolvidos, j faz parte da rotina obsttrica o
acompanhamento das condies de gestao pela ultra-sonografia, que j inclui um exame
morfofuncional geral do feto. As demais tcnicas referidas no pargrafo anterior aplicam-se a
situaes especficas, onde h risco aumentado de certos tipos de defeitos ou doenas para o
concepto.

Principais indicaes do exame de diagnstico pr-natal

Idade materna avanada: mes idosas tm chance aumentada de gerar crianas portadoras
de defeitos cromossmicos, em especial as trissomias autossmicas. O efeito est bem
demonstrado na sndrome de Down, na qual a probabilidade de um afetado chegar a nascer
muito maior que nas demais trissomias (como as dos cromossomos 13 e 18, responsveis
respectivamente pelas sndromes de Patau e Edwards), onde o efeito praticamente anulado
pela alta taxa de abortamento espontneo precoce. De fato, a principal aplicao do
diagnstico pr-natal ainda continua sendo a idade materna avanada com a finalidade
especfica de verificar-se se o concepto portador ou no do defeito cromossmico
responsvel pela sndrome de Down (geralmente uma trissomia simples do cromossomo 21).
Geralmente o exame indicado para gestantes com 38 anos ou mais, pois este grupo de
mulheres contribui com praticamente metade de todos os casos da sndrome de Down. Se
todas essas mulheres se submetessem a esse exame e optassem pela interrupo da gravidez
quando for constatada a trissomia, a incidncia da sndrome de Down ao nascimento baixaria
de cerca de 1/800 para 1/1600, ou seja, a freqncia de afetados na populao seria reduzida
metade da taxa normal de ocorrncia. Para se reduzir mais ainda essa freqncia seria
necessrio submeter ao exame, em condies de rotina, um nmero muito grande de
mulheres, o que ainda invivel economicamente. No entanto, mesmo no grupo de mulheres
com maior risco, com idade entre 40 e 50 anos, o risco por si s baixo, de 4% no mximo;
apesar disso, encontra-se cerca de 40 vezes aumentado em relao ao risco de mes jovens,
que da ordem de 1/1000.

Defeitos de fechamento do tubo neural: determinados por mecanismo multifatorial, eles
apresentam um espectro de expressividade clnica que varia da espinha bfida oculta ou aberta
e dos diversos tipos de meningomielocele at defeitos extremamente graves como as
encefaloceles e a anencefalia, estas ltimas resultantes de anomalias do desenvolvimento
embrionrio que comprometem a extremidade cranial do tubo neural. O risco de repetio
desses defeitos na prole de casais que j tiveram uma criana afetada baixo, da ordem de
4%. Como, no entanto, o defeito pode ser detectado com segurana atravs de tcnicas
simples e no-invasivas, como a ultrassonografia, comumente indica-se o exame para casais
que j tiveram criana afetada. Como na vigncia do defeito os nveis de alfa-feto-protena
encontram-se elevados no soro materno e no lquido amnitico, a dosagem dessa substncia
(associada aplicao da tcnica da ultrassonografia) est indicada. No caso da anencefalia,
defeito incompatvel com a sobrevivncia do concepto, freqentemente os casais tm solicitado
autoridade legal permisso para interrupo da gravidez, que geralmente fornecida atravs
de um alvar. Desta maneira, alm das situaes j previstas em lei que permitem a
97
interrupo da gravidez no Brasil, vai se abrindo pouco a pouco espao para a inclurem as
condies de defeitos e malformaes muito graves, que diminuem grandemente a qualidade
de vida ou impedem totalmente a sobrevivncia do concepto.

Casais com prole afetada por doena recessiva: no caso de doenas autossmicas
recessivas os genitores de afetados so heterozigotos, o que determina o risco alto de
repetio (25%) do defeito ou doena numa criana qualquer que venham a ter. No caso de
doenas ligadas ao X recessivas esse risco varia de 17 a 25% nos casos isolados, fixando-se
em 25% na situao de casos com recorrncia na irmandade ou na famlia. So conhecidas
atualmente entre 3000 e 4000 doenas e defeitos diferentes condicionados por esses tipos de
mecanismo, mas na prtica existem testes moleculares que podem ser aplicados em
diagnstico pr-natal em menos de 10% dessas condies. A situao ainda complicada
atualmente pelo fato de a maioria dos laboratrios de biologia molecular capazes de
processarem esses exames serem especializados em apenas um certo nmero deles. O
nmero de doenas pesquisadas aumenta quando se considera a possibilidade da aplicao
de estudos indiretos de ligao com marcadores mapeados nas vizinhanas do loco da
doena. De qualquer maneira, existindo o exame, claramente est ele indicado nessa situao,
talvez a mais importante pela grandeza do risco a ela associada.

Portadores de alterao cromossmica equilibrada: numa frao pequena de casais com
crianas afetadas por defeitos cromossmicos um dos genitores portador da alterao
cromossmica em estado dito equilibrado, ou seja, sem que redunde em manifestaes
fenotpicas para o seu portador. Outros parentes do afetado tambm podem ser portadores
equilibrados. O tipo de defeito mais freqentemente encontrado nesses casos so as
translocaes equilibradas, como as que podem ocorrer entre os braos longos dos
cromossomos 21 e 14 na sndrome de Down. A verificao emprica das taxas de recorrncia
nesses casos mostrou que o risco da ordem de 15 a 20%, quando a me portadora da
translocao equilibrada e menor que 5%, quando o portador o pai. A ordem de grandeza
dessas cifras seguramente indica a aplicao de tcnicas de diagnstico pr-natal.

Outras indicaes: a aplicao de tcnicas de diagnstico pr-natal tambm est indicada em
casos de suspeita de infeco durante a gravidez capaz de produzir defeitos fetais (como o
caso da rubola, sfilis, citomegalovirose etc), no caso de ingesto de drogas com capacidade
teratognica, como a talidomida, em doenas maternas de natureza sistmica como o diabetes
e ainda em casos de imunizao materna. A maioria dos servios de diagnstico pr-natal
ainda indica a aplicao do exame em casos de casais que tiveram crianas portadoras de
defeitos cromossmicos; como esses defeitos geralmente so de natureza espordica e o seu
risco de repetio pequeno ou desprezvel, geralmente da ordem de 1% ou menos, o exame
aqui se justifica para a tranqilizao psicolgica que possa trazer aos casais nessa situao.
Algumas outras situaes, no entanto, no justificam a aplicao do exame, como o caso da
consanginidade parental. Apesar de o risco de doena autossmica recessiva na prole de
primos em primeiro grau estar aumentado cerca de dez vezes em relao ao risco
correspondente para no-consangneos, o nmero enorme de doenas possveis e a
ausncia de manifestaes detectveis em condies de rotina de muitas delas tornam invivel
a aplicao do mtodo, do mesmo modo que para a populao geral.

Principais tcnicas utilizadas no diagnstico pr-natal
Muitos servios de diagnstico por imagem j se tornaram proficientes no diagnstico
de defeitos congnitos em exames de rotina durante o acompanhamento de gestantes, mas
so os servios de patologia fetal que congregam especialistas na deteco desses defeitos.
Alm da parte relativa ao dianstico por imagem, os servios de patologia fetal esto
aparelhados para a aplicao das tcnicas de que trataremos nesta seo. Nesses servios os
profissionais prestam esclarecimentos adequados aos consulentes sobre todos os aspectos,
tcnicos, mdicos e ticos dos exames, mas importante que, ao encaminhar suas
consulentes para diagnstico pr-natal, seu mdico j lhes esclarea de maneira geral em que
consiste o mtodo e quais so suas limitaes e riscos associados.

Ultrassonografia
Trata-se de um mtodo no-invasivo e incuo que consiste na emisso de ondas
ultrassnicas de alta freqncia, cujo reflexo (eco) captado por um transdutor e transformado
98
em imagem num monitor. Apesar de depender da percia e preparo do ultrassonografista, a
aparelhagem conta com o auxlio de computador capaz de realizar clculos e medidas em
tempo real. Equipamento Doppler a cores acoplado ultrassonografia permite determinaes
de fluxo nos vasos do feto. A ultrassonografia em duas dimenses foi a primeira utilizada e
permite a obteno de cortes tomogrficos do concepto com boa resoluo. Atualmente est
sendo substituda pela ultrassonografia tridimensional, que permite a visualizao da imagem
em profundidade, inclusive em tempo real, com aparelhagem mais sofisticada. Teoricamente o
exame pode ser aplicado com sucesso a partir da dcima-primeira semana da gestao, uma
vez que nessa ocasio a morfologia fetal j est praticamente definida e a maioria (cerca de
80%) das malformaes eventualmente presentes j podem ser detectadas. A poca ideal para
a sua aplicao depende, no entanto, do aparelho ou sistema a ser investigado. Assim,
defeitos de fechamento do tubo neural (espinhas bfidas, meningomieloceles e anencefalias)
podem ser diagnosticados com segurana apenas a partir da dcima-quinta semana e as
displasias esquelticas, de uma maneira geral, mais tardiamente, a partir da dcima-oitava
semana. Num exame de rotina realizado num servio de patologia fetal so verificados
sistematicamente sinais morfolgicos indicadores de defeitos cromossmicos, como o aumento
da translucncia nucal, geralmente devido a acmulo de linfa (higroma cstico incipiente) nessa
regio e muito comum na monossomia X (sndrome de Turner) e nas trissomias autossmicas
(sndromes de Down, Patau e Edwards). A presena desse sinal indica a coleta de material do
concepto e a realizao de estudo cromossmico. Alm de ser empregada no diagnstico
direto de uma srie de defeitos, a ultrassonografia usada sistematicamente para monitorar os
outros exames invasivos de diagnstico pr-natal, como se pode verificar no esquema da
Figura 34 abaixo, em que o transdutor de ultrassonografia est sempre presente no
acompanhamento das tcnicas de bipsia de vilosidade corinica transcervical ou
transabdominal, amniocentese e cordocentese. Embora idealmente toda gravidez devesse ser
acompanhada atravs da tcnica, constituem indicaes de certa maneira formais da
ultrassonografia pr-natal, entre outras, as seguintes:
a) gestaes complicadas por variaes patolgicas da quantidade de lquido amnitico, muitas
vezes associadas a malformaes do concepto. Assim, o polidrmnio pode indicar a presena
de defeitos obstrutivos de tubo digestivo como a atresia do esfago, enquanto o oligodrmnio
muitas vezes manifestao de defeitos renais (sndrome de Potter ou seqncia do
oligodrmnio devido a agenesia renal bilateral);
b) casais com histria de filhos afetados por doena autossmica recessiva cujos sinais so
passveis de deteco pelo exame, como o caso de vrias displasias sseas (sndrome de
Ellis-van Creveld, aplasia de eixo radial que ocorre na sndrome de Fanconi, forma recessiva
grave de osteognese imperfeita) ou os defeitos de vrios rgos e sistemas que ocorrem na
sndrome de Meckel-Gruber (microcefalia e defeitos de fechamento cranial do tubo neural como
a encefalocele occipital, polidadctilia, rim policstico, onfalocefe); prole de indivduos adultos
afetados por doenas autossmicas dominantes como a acondroplasia e outras formas de
displasia ssea hereditria;
c) antecedentes na famlia (parentes em primeiro grau) com malformaes de natureza
multifatorial como os defeitos de fechamento de tubo neural j mencionados, fendas de lbio
ou palato;
d) casais com histria de filhos ou parentes prximos afetados por microcefalia e outros
defeitos de desenvolvimento craniano;
e) antecedentes familiares de hidrocefalia, principalmente se os afetados forem de sexo
masculino e suspeitar-se da forma clssica recessiva ligada ao X por estenose congnita do
aqueduto de Sylvius. O defeito pesquisado, verificando-se se existe ou no dilatao do
sistema ventricular cerebral, uma vez que muitos afetados apresentam circunferncia craniana
normal ao nascimento.
Resumimos a seguir as principais tcnicas invasivas de diagnstico pr-natal,
representadas esquematicamente na Figura 34. Todos esses procedimentos so monitorados
pela ultrassonografia.

99

Figura 42 - Principais tcnicas de diagnstico pr-natal, todas monitoradas pela ultrassonografia (tr indica o aparelho
transdutor): a) bipsia de vislosidades corinicas por via vaginal transcervical; b) bipsia de vilosidades corinicas por
via transabdominal; c) amniocentese; d) cordocentese ou puno do cordo umbilical.

Bipsia das vilosidades corinicas
O exame desse material permite a aplicao de tcnicas que visam o estudo do
caritipo, a verificao do sexo do embrio, a aplicao de testes bioqumicos e enzimticos e
a extrao e anlise do DNA. Entre a stima e a dcima-primeira semana da gravidez
possvel atingir a margem do crio frondoso que ir formar a futura placenta por meio de uma
cnula introduzida atravs da vagina e do colo do tero. Atravs dela aspira-se o material e,
com o auxlio de uma lupa esteroscpica, seleciona-se o material de origem embrionria
(vilosidades corinicas). Nessa poca as clulas das vilosidades dividem-se ativa e
espontaneamente e possvel obter-se metfases para estudo cromossmico diretamente ou
aps curto perodo de incubao. Em algumas situaes a obteno de material via vaginal
transcervical dificultada ou impossibilitada pela ocorrncia de vaginite, anomalias de tero e
de canal cervical ou de gravidez mltipla; opta-se ento por atingir a placa corinica atravs de
uma puno transbdominal, que constitui a tcnica de eleio entre a 11a. e a 17a. semana,
ocasio em que a bolsa amnitica j preencheu totalmente a cavidade uterina, eliminando o
espao virtual livre que permitia o acesso ao crio frondoso sem lesar as membranas do
embrio. Recentemente esta via est sendo usada com freqncia cada vez maior, tendendo a
substituir totalmente a via vaginal transcervical.

Amniocentese
a puno transabdominal suprapbica, por meio de uma longa agulha conectada a
uma seringa, da cavidade amnitica, com a finalidade de obteno do lquido, que s vezes o
prprio material a ser analisado (no caso de dosagem de pigmentos, alfa-feto-protena e outras
100
substncias). Geralmente o que se pretende colher so as clulas que se encontram
suspensas no lquido por descamao dos epitlios de revestimento externo (fibroblastos de
pele) ou interno (clulas originrias dos tratos urinrio, digestivo e respiratrio). Como nas
outras tcnicas que visam a obteno de material de origem fetal, a amniocentese
monitorada pela ultrassonografia, que permite assim a seleo de regies onde a coleta do
lquido mais fcil, alm de afastar com segurana as possibilidades de leso placentria ou
fetal. O material obtido concentrado por centrifugao e submetido a cultura de clulas
previamente s anlises citolgicas, bioqumicas e cromossmicas que se pretende nele
aplicar. Como j referido anteriomente, o exame realizado a partir da 17a. semana contada a
partir da ltima menstruao. Como as demais tcnicas de diagnstico pr-natal, o
procedimento seguro, praticamente desprovido de riscos e complicaes para a gestante e o
concepto, alm de poder ser realizado em consultrio, em regime de atendimento ambulatorial.
Embora no haja a necessidade de indicao formal de anestesia local, esta aplicada com
certa freqncia para eliminar a dor e o desconforto produzidos pela puno abdominal. A
dosagem da alfa-feto-protena, antigamente realizada com freqncia para o diagnstico dos
defeitos de fechamento do tubo neural, vem sendo substituda progressivamente pela
ultrassonografia, pois a capacidade discriminante das aparelhagens mais modernas
excelente e permite, nas mos de um profissional experiente, detectar com segurana esses
defeitos.
A taxa de conceptos com aberraes cromossmicas (monossomia e outras
aneuploidias do cromossomo X, trissomias autossmicas e casos de mosaicismo) detectadas
em material colhido atravs da tcnica da bipsia das vilosidades corinicas
significativamente maior do que a observada usando-se a tcnica da amniocentese. Parte da
discrepncia pode ser explicada pela probabilidade de abortamento devido a defeitos
cromossmicos ser maior nas fases iniciais da gravidez, em que o primeiro mtodo aplicado.

Cordocentese
A cordocentese consiste na puno por agulha da veia umbilical do feto, proximamente
insero do cordo na placenta. Pode ser realizada em qualquer ocasio a partir da dcima-
oitava semana da gravidez. No material colhido (de 1 a 10 ml de sangue, dependendo da
poca da puno e do tipo de exame) podem ser realizados os mais diversos exames, que
incluem o estudo do caritipo, a determinao de anticorpos em casos de suspeita de
aloimunizao ou de infeces, testes bioqumicos e moleculares.

Fetoscopia
O procedimento, que consiste na insero de um cateter munido de fibra ptica na
cavidade amnitica por via transabdominal, permite, atravs da inspeo visual direta do feto, o
diagnstico de uma srie de defeitos externos e de vrias afeces congnitas da pele e
anexos. O prprio fetoscpio permite o uso de acessrios como agulhas com a finalidade de se
obterem amostras de tecidos fetais. So comumente diagnosticados pela inspeo direta
proporcionada pelo procedimento defeitos crnio-faciais, de extremidades e at do tegumento;
a anlise indireta de material colhido ou biopsiado permite o diagnstico de defeitos
cromossmicos, hemoglobinopatias, defeitos da coagulao, erros inatos de metabolismo e um
sem nmero de outras afeces.
O diagnstico pr-natal oferece a opo de ter filhos para casais que evitariam a
procriao na ausncia do exame por temerem o aparecimento ou repetio de doena
gentica em sua prole. Inversamente, no caso de gravidezes no-planejadas de casais em
risco, o diagnstico pr-natal de normalidade do concepto vai permitir, na maioria das vezes,
que a gestao seja levada a termo, pois no cmputo geral o resultado do exame afasta a
possibilidade do defeito temido.

101
LEITURAS COMPLEMENTARES

A Oficina 2 completa: Temas de Biologia. Trabalhando Temas Fundamentais: Cdigo Gentico
e Sntese de Protenas. J . M. Amabis e G. R. Matho. Editora Moderna, encontra-se disponvel
no site da Editora Moderna http://www.moderna.com.br

As atividades completas realizadas nas Oficinas 3 e 4 A Famlia Silva e seus genese Meiose
e as leis de Mendel esto disponveis no site http://www.ib.usp.br/microgene. Esses kits
educacionais podem ser emprestados para utilizao em escolas de Ensino Mdio.

Para saber mais sobre a Sndrome do X-frgil visite os endereos:
http://www.xfragil.org.br
http://www.ib.usp.br/textos/

Para saber mais sobre Mutao e Cncer leia o texto do anexo 3.

102
ANEXO 1

Levantamento de conceitos sobre DNA, cromossomos e genes

1. Para voc, a expresso uma molcula de DNA significa
a) uma nica cadeia de desoxirribonucleotdeos
b) duas cadeias de desoxirribonucleotdeos complementares e emparelhados
c) no tenho certeza sobre o significado dessa expresso.

2. Em sua concepo, cromossomos so estruturas que
a. s existem durante as divises celulares.
b. s existem durtante as interfases.
c. existem sempre durante o ciclo de vida da clula.
d. no tenho certeza sobre o significado do termo.

3. Em sua concepo, o termo cromatina refere-se a estruturas que
a. s existem durante as divises celulares
b. s existem durante as interfases
c. existem sempre durante o ciclo de vida da clula
d. no tenho certeza sobre o significado do termo

4. Um cromossomo, antes de sua duplicao, possui
a. uma nica molcula de DNA
b. duas molculas de DNA
c. muitas molculas de DNA
d. no tenho certeza da resposta

5. Cada uma das cromtides que constituem um cromossomo metafsico contm
a. uma nica cadeia de desoxirribonucleotdeos
b. duas cadeias complementares de desoxirribonucleotdeos
c. um nmero varivel de cadeias de desoxirribonucleotdeos
d. no sei responder questo

6. Dentre as frases a seguir, a que melhor define um gene
a. uma unidade de transcrio na molcula de DNA
b. uma molcula de DNA em um cromossomo
c. uma cadeia simples de DNA que codifica um polipeptdeo
d. um segmento da molcula de DNA que codifica um polipeptdeo
e. no tenho certeza da resposta

7. Os diferentes alelos de um mesmo gene diferem entre si por
a. se localizarem em cromossomos no homlogos
b. se localizarem em posies diversas em cromossomos homlogos
c. se localizarem em clulas diferentes de um mesmo organismo
d. terem seqncias de nucleotdeos diversas
e. no sei responder questo.

103
Anexo 2

Retirado de Temas de Biologia. Trabalhando Temas Fundamentais: Cdigo Gentico e Sntese
de Protenas. J . M. Amabis e G. R. Matho. Editora Moderna http://www.moderna.com.br

104

105
Anexo 3
Lyria Mori - Cincia Hoje 180: 33- 37, 2002.

106

107

108

109

110
Anexo 4

Esta figura faz parte do texto da pgina 65 doenas condicionadas por mecanismo
multifatorial e foi citada como figura 9.

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