Tcnicas Histolgicas

A tcnica histolgica visa a preparao dos tecidos destinados ao estudado

microscopia de luz. O exame ao microscpio feito geralmente por luz transmitida, o
que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, necessria a
obteno de fragmentos dos tecidos que sero coletados em lminas muito finas e
transparentes.
Viso Geral do Processamento de Tecidos
Os tecidos a serem processados para estudo ao microscpio devem ser preparados de
modo a preservar sua estrutura original ao mximo possvel. Entretanto, isso no
possvel e todos os preparados apresentam artefatos, que so alteraes produzidas nas
clulas pelas tcnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das tcnicas histolgicas
com a seguinte seqncia: fixao dos tecidos, desidratao, incluso, microtomia (corte
em fatias finas), colorao e montagem de lminas. Essas etapas sero descritas adiante.
OBTENO DO MATERIAL E FIXAO
Uma boa preparao histolgica se inicia com o uso correto das tcnicas de obteno do
material. Os cuidados devem ser observados j no sacrifcio dos animais de laboratrio
para o estudo histolgico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratrio o
sacrifcio pode ser obtido atravs de tcnicas como, traumatismo brusco, intoxicao
(overdose de anestsico) e perfuso/imerso.
Objetivos da fixao
A fixao paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os
tratamentos posteriores. A fixao evita a autlise celular, impede a proliferao de
microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos
posteriores. O fixador deve causar o mnimo de dano ao tecido e produzir o mnimo de
artefatos. A escolha adequada da soluo fixadora ir variar de acordo com o material
que ir ser usado para a incluso. A soluo de glutaraldedo 2,5% em tampo fosfato
0,1M, pH 7,4 ou a soluo formalina neutra tamponada (NBF) so comumente
usadas. Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos
aminos das protenas, atravs de pontes de hidrognio. O glutaraldedo possui dois
grupos aldedos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem
estabelecer pontes de hidrognio entre as protenas. As molculas de formaldedo, no
entanto, possuem apenas um grupamento aldedo, sendo um fixador menos eficiente
para alguns tipos de protenas.
A tcnica da perfuso para lavagem e fixao do tecido.
Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos por exemplo, uma tcnica que
resulta em boas preparaes consiste na perfuso cardaca. Este mtodo simula o
funcionamento do sistema circulatrio, uma vez que injeta os vasos do espcime com
solues qumicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da
circulao sangunea atravs de lavagem feita com uma soluo salina de pH neutro.
Posteriormente, processa-se ento a fixao atravs da injeo de soluo fixadora. Em
ambos os casos, as solues so impulsionadas nos vasos atravs de tubos que se
conectam uma bomba peristltica e um grande vaso do animal a ser perfundido, com
o arco artico por exemplo. Neste ponto, importante regular a presso de injeo da
soluo, que no pode exceder a presso do sangue, pois de outro modo, artefatos por
fixao so produzidos. Outro fator importantssimo para que a tcnica da perfuso seja
bem sucedida a ausncia de sangue coagulado nos vasos. Para evitar esse imprevisto,
conveniente administrar heparina diluda a 1:50 (Liquenine) ao animal 10 minutos antes
da etapa de sacrifcio. A filtrao criteriosa das solues tambm um cuidado que
evita a obstruo dos pequenos vasos e o consequente iimpedimento do fluxo da
soluo atravs dos tecidos.
A tcnica de fixao por imerso
Alm da perfuso cardaca, pode-se tambm recorrer fixao por imerso, ainda muito
utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume
do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ao da periferia para o
centro do material. As pores perifricas do material so primeiramente fixadas em
relao as suas pores mais internas. A boa penetrao de qualquer fixador est
diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com
o tipo de tecido, com a fixao de um encfalo, por exemplo, a fixao por imerso
seria um mtodo condenvel, devido dificuldade de penetrao da soluo. Para estes
casos sugere-se recorrer ao mtodo da perfuso.
DESIDRATAO , INCLUSO E MICROTOMIA
Objetivos
Para a observao ao microscpio de luz a espessura da seco do tecido presente em
uma lmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de
luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio
endurecedor, ou seja meio de incluso. Desta forma ser possvel a obteno de cortes
delgados, obtidos no processo de microtomia.
Tipos de incluses e a importncia da desidratao
A incluso pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas
plsticas, como o glicol metacrilato. Aps a fixao com as solues aquosas de
glutaraldedo ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a gua
presente nos tecidos no miscvel em substancias apolares como a parafina e as resinas
de incluso. A desidratao ser feita atravs de imerso numa bateria de solues
alcolicas em concentraes graduais e crescentes. A graduao pode ser iniciada, se
necessrio, a partir de 50% e terminando finalmente em lcool absoluto. A graduao
nas concentraes imprescindvel para que ocorra a desidratao homognea dos
tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.
Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de incluso. Caso de
parafinas, o tecido deve ser tratado com uma substncia de transio. A incluso em
parafina precedida pelo uso de substncias qumicas como o xilol, este miscvel tanto
em lcool quanto em parafina. Aps a remoo do lcool, o tecido passa por uma
infiltrao em parafina lquida, esta mantida em estufa a 56C (ponto de fuso) e
posteriormente o mesmo transferido para o molde contendo parafina lquida. Em
poucos minutos a parafina endurecer e obter-se- portanto, o "bloco" de parafina
contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da incluso em resina como o
glicol metacrilato, o tecido infiltrado com uma resina de infiltrao por uma noite, e
ento includo no molde contendo a resina ainda lquida, sendo que esta endurece aps
algumas horas. Como no caso da parafina, aps o endurecimento, obtm-se um bloco de
resina que contm o fragmento de tecido em seu interior. Os blocos sero a partir desta
etapa levados para a microtomia e consequente obteno das seces, que sero ento
coletadas em lminas de vidro. No caso de incluso em parafina, aps a microtomia, o
tecido tratado com xilol novamente para remoo da parafina e rehidratado, para que
possa ser submetido colorao.
COLORAO
Objetivo da colorao
Os cortes de tecidos apresentam-se incolores aps a microtomia. A colorao visa
contrastar as estruturas teciduais. A ao da maioria dos corantes se baseia na interao
entre os radicais cidos ou bsicos dos elementos qumicos dos mesmos com os dos
tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como ser descrito adiante.
Corantes cidos e Bsicos
Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina um corante bsico que carrega uma carga
positiva na poro da molcula que ir conferir cor ao tecido. Corantes bsicos reagem
com componente aninicos das clulas e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos,
cidos nuclicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das
protenas. A habilidade de grupos aninicos reagirem com corantes bsicos chamada
basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes bsicos so denominadas
basfilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes bsicos incluem
heterocromatina, nuclolo, RNA ribossmico, matriz extracelular da cartilagem. A
hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes cidos reagem com
componentes catinicos das clulas e tecidos. Quando usados juntamente com corantes
bsicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmticos e fibras
extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.
Outros exemplos:corantes cidos: fucsina cida, azul de anilina e orange G; bsicos:
azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.
Outras tcnicas de colorao
Hematoxilina e eosina so corantes adequados para evidenciar caractersticas
estruturais, mas eles no so capazes de revelar todos componentes celulares. Outras
tcnicas de colorao so disponveis para evidenciar diferentes componentes.
Colorao pela prata Algumas substncias intra e extracelulares promovem a reduo
do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras
reticulares dos linfonodos, por exemplo.
Associao de corantes - a somatria de corantes diferentes, como o Tricrmico de
Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e hematoxilina
Aps a colorao as lminas so montadas ou seja, os fragmentos so protegidos pela
cobertura com lamnulas de vidro. Esta colada na lmina atravs de substncias
selantes como por exemplo o Entellan. Aps a secagem, as lminas podem ser
observadas ao microscpio de luz.