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Capitulo 5 Vol2 PDF
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Captulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves
Anna Christina Rosa Guimares
Clulas em cultivo so um modelo de funo fisiolgica muito contraditrio, devido perda de caractersticas que ocorre durante o seu desenvolvimento em cultura. A proliferao in vitro difere daquela in vivo. Assim, por
mais prximo que esse modelo esteja da realidade, o processo in vitro ainda
causa problemas para o desenvolvimento celular. Sua adeso clula clula e
clula matriz reduzida, no possui as caractersticas (heterogeneidade e
arquitetura tridimensional) de um tecido in vivo, uma vez que seu meio nutricional
e hormonal est modificado.
Clulas que, num momento anterior, cresciam tridimensionalmente agora
se encontram em um meio que favorece o espalhamento, a migrao e a
proliferao de clulas no especializadas que expressem diferentes funes. A
Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de Clulas do Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Sade (INCQS), Fiocruz.
A organizao de um laboratrio voltado pesquisa com clulas depende da sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar. De
maneira geral, o laboratrio necessita dos seguintes espaos:
rea para lavagem e esterilizao;
rea para preparo de meios;
rea para incubao e observao das culturas;
rea para manipulao assptica das culturas.
Para trabalhos com culturas de clulas, inmeros instrumentos so necessrios, tais como: cmara para contagem, pipetador automtico, micropipetas,
estante para tubos, alm de uma variedade de vidrarias e reagentes necessrios
para preparo de meios de cultura e solues.
As salas devem ser sinalizadas com smbolo universal de risco biolgico,
com acesso restrito equipe tcnica de apoio.
2.3. Limpeza, desinfeco e esterilizao
A vidraria utilizada para cultura de clulas deve ser exclusiva e processada separadamente das demais.
A vidraria deve ser lavada imergindo-a em gua com detergente neutro a
5%, durante 12 horas, e enxaguando-a 3 a 4 vezes em gua comum, e 2 a 3
vezes em gua destilada. O material limpo deve apresentar uma pelcula uniforme de lquido nas paredes aps o ltimo enxgue. Caso no haja a formao
desta pelcula, o material dever ser submetido a novo processo de lavagem,
pois significa que h traos de gordura ou qualquer sujidade no material.
Frascos muitos sujos, com resduos aderidos, devem ser lavados com
soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% em cido sulfrico concentrado1:9), que requer muito cuidado no uso devido presena
do cromo IV (Cr+4). Muitos materiais necessitam de uma lavagem prvia, sob
agitao durante 5 a 10 minutos, em soluo detergente.
A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120C,
por aproximadamente 6 horas. O material limpo e seco no deve conter
qualquer tipo de resduo, mancha, colorao e/ou opacidade; caso contrrio,
o material deve ser submetido a um novo processo de lavagem.
A montagem e embalo podem ser realizados com envelopes e/ou bolsas prprios para esterilizao, ou ainda material do tipo no tecido. Deve
ser evitado o uso de papel Kraft por gerar aerossis.
Assim, medida que a gua sai, ela se congela no exterior, deixando a clula
desidratada. Nesse processo, a gua do meio externo congelada formando
cristais que podem se reorganizar no exterior da clula. A formao de cristais
e reorganizao dentro da clula leva ao rompimento da membrana celular,
matando as clulas. Isso impedido com o processo lento de congelamento.
Figura 4. Esquema do congelamento lento.
Quando o congelamento lento, a viabilidade das clulas descongeladas maior do que a das congeladas pelo mtodo rpido, ou seja, quando
imersas diretamente no nitrognio lquido.
Mesmo controlando-se a velocidade de congelamento em 1 a 2C por
minuto e tendo o cuidado com a formao dos cristais, a clula sofrer muitos
danos nesse processo. Assim, para aumentar a viabilidade celular, utilizam-se
crioprotetores.
Crioprotetores so substncias que, sob diferentes mecanismos moleculares,
tornam a membrana das clulas protegidas dos cristais. Os crioprotetores mais
utilizados so o glicerol e o dimetilsufrido (DMSO).
O efeito protetor do glicerol se relaciona com a sua capacidade de
ligao com a gua e sua baixa dissociao com sais, diminuindo a osmolaridade
Quando se trabalha com experimentos que necessitam do uso de clulas em cultura necessria a avaliao constante das clulas. Umas das formas
de se avaliar o crescimento celular utilizando-se mtodos de quantificao
celular. Quantificar uma cultura significa dizer quantas clulas se encontram em
determinada garrafa de cultivo.
A quantificao utilizada para definir a viabilidade celular, as condies
de crescimento e o incio de experimentos nos quais o nmero de clulas
utilizado deve ser preciso.
Existem duas maneiras de se quantificar clulas em cultura. Na forma
direta, conta-se diretamente o nmero de clulas presente na garrafa de cultivo; a forma indireta feita por meio da quantificao de determinadas estruturas celulares, como protenas, ou pela medio do metabolismo celular.
Como forma de quantificao direta, o mtodo mais utilizado a contagem em cmara de Neubauer. No mtodo indireto existem muitas tcnicas
baseadas no metabolismo celular ou at mesmo na dosagem de macromolculas
presentes na clula, como as protenas ou o DNA.
Para a contagem em cmara de Neubauer, as clulas devem estar totalmente individualizadas. Para clulas aderentes, necessrio fazer uma tripsinizao
prvia, o que no feito no caso de clulas no aderentes.
Para no ocorrer a contagem de uma clula mais de uma vez, deve-se fazer
uma marcao em forma de L nos quadrados, para que, ao aparecerem clulas
em cima das linhas, se contem somente as que estiverem sobre a marcao.
Para a anlise de viabilidade celular utiliza-se o corante azul de Trypan,
que no atravessa membranas ntegras. Assim, clulas vivas no permitem a
passagem do corante e, logo, no adquirem nenhuma colorao. Como as
clulas mortas tm suas membranas danificadas, ocorre o fluxo de corante para
o interior da clula fornecendo uma colorao azul.
Entre os mtodos de contagem indireta mais utilizados esto o teste de
brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazlio (MTT) e o
ensaio de colorao por Coomassie Brillant Blue R-250 (CBBR 250).
A colorao por CCBR-250 se baseia na capacidade do corante de
corar protenas celulares. Assim, faz-se uma curva padro com concentraes
celulares conhecidas e tambm as leituras das amostras de cultura. Para isso,
deve-se corar a cultura e depois eluir a soluo corante, sendo lida em
espectrofotmetro.
O ensaio do MTT se baseia na reduo do MTT, um sal tetrazlico,
pela desidrogenase mitocondrial de clulas viveis para formar como produto o
azul de Formazan. O ensaio mede a respirao celular, que proporcional
quantidade de Formazan produzida, e ao nmero de clulas viveis em cultura.
A vantagem desse mtodo a contagem somente do nmero das clulas
viveis, o que no ocorre com o mtodo de CBBR 250.
3.4. Conceitos bsicos e controle da qualidade de cultivos
celulares
normal; ou
entrar numa fase ps-mittica prolongada permanecendo num estado
de quiescncia e, se devidamente estimuladas, podem mais tarde ingressar em ciclo no fim de G1.
A regulao adequada do ciclo celular, com o controle correto da
sntese de substncias reguladoras (ciclinas dependentes de quixases - CDK) e
inibidoras (inibidores de CDK), fundamental para o desenvolvimento normal
dos organismos multicelulares. Uma falha nesse controle pode acarretar uma
superproduo desnecessria de clulas, frequentemente com resultados malficos, como a formao de tumores (cncer).
A dinmica do processo de diviso celular muito complexa. Ela ocorre
por meio de uma srie de eventos e processos nucleares e citoplasmticos de
forma coordenada e possui mecanismos de controle rigoroso envolvendo genes
e protenas regulatrias que atuam em diferentes etapas do ciclo celular.
Em cultura, as clulas de uma populao normalmente apresentam-se em
diferentes fases de ciclo celular. Se todas as clulas de determinada populao
estivessem na mesma etapa do ciclo celular, essa populao estaria em sincronismo
celular. Uma variedade de tcnicas e substncias pode sincronizar clulas em
fases especficas do ciclo celular. Por exemplo, o arraste reversvel de clulas
em G1 pode ser obtido com a deduo de soro ou aminocido isoleucina; e
o inibidor de microtbulos, o nocodazol, empregado para sincronizar clulas
na mitose.
Clulas normais em cultura possuem um padro de crescimento representado por uma curva sigmoidal (Figura 8) denominada curva de crescimento.
Essa curva reflete as fases de adaptao das clulas s condies ambientais,
disponibilidade de nutrientes e ao suporte de ancoragem necessrios para
promover a produo de novas clulas.
A determinao da curva de crescimento importante para a caracterizao de uma cultura de clulas. A biologia celular modifica-se em cada
fase da curva, sendo importante o controle do estgio em que as clulas
sero coletadas, quando ser realizado o repique da cultura, ou quando
novos nutrientes sero adicionados.
Manter a assepsia em cultura algo muito difcil. O material esterilizado erroneamente, a manipulao sem cuidado e, principalmente, a falta de
higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminao de uma cultura.
Bactrias, fungos, leveduras e micoplasmas so os principais contaminantes
das culturas celulares.
Em casos de contaminao, importante avaliar onde a clula foi cultivada, quais os meios e solues utilizados e qual tcnico fez a manipulao. Isso
impede que, em caso de contaminao pontual, esta se espalhe para outras
culturas do laboratrio, alm permitir a investigao dos principais motivos da
contaminao, a fim de elimin-la.
3.6.1. Contaminao bacteriana
As bactrias so organismos procariontes com capacidade de proliferao muito rpida e que, na maioria das vezes, conseguem crescer em qualquer
condio. Elas esto presentes no ar, nas superfcies, no trato digestivo humano etc.
Micoplasmas so contaminantes comuns de culturas de clulas, microorganismos procariotos desprovidos de parede celular que possuem uma membrana lipdica em bicamadas, imperceptveis na visualizao por microscpio
tico invertido.
De difcil localizao por se aderir membrana da clula, o micoplasma
prejudicial, pois retira do meio os nutrientes necessrios, em particular a
arginina. O metabolismo dos micoplasmas , em parte, dependente do
metabolismo celular.
Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de colorao fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA. Assim, ao observarmos uma cultura
contaminada em microscopia de fluorescncia possvel visualizar o ncleo da
clula e o seu contorno, que formado pelo material gentico dos micoplasmas
aderidos membrana.
Contaminar uma cultura com micoplasmas muito fcil, pois eles se
encontram na via respiratria humana; porm, a descontaminao envolve a
Leveduras so fungos unicelulares muito comuns em cultura. Caracterizam-se por serem menores do que as clulas animais. Multiplicam-se principalmente por brotamento, formando na cultura estruturas caractersticas na forma
de esferas menores anexadas a esferas maiores.
4. Meios de cultura e solues utilizadas em cultivos
celulares
aminocidos vitaminas
Arginina
Cistina
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina
sais
NaCl
outros
Glicose
Penicilina
KCl
Estreptomicina
Vermelho de
NaH2PO4 fenol
Soro
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
protenas (necessrias
em meios sem soro
quimicamente definidos)
Insulina
Transferrina
Factores
especficos de
crescimento
H+ + Na+ + 2HCO3-
Apesar da sua constituio qumica, os meios de cultivo so usualmente suplementados com 5% a 20% de soro, pois as clulas em cultura
tambm necessitam de fatores de crescimento, hormnios, protenas e
peptdeos, nucleosdeos, lipdeos e inibidores que podem ser supridos por
esse fluido animal.
Deve-se utilizar um soro fetal certificado, estril, inativado a 56 oC por
30 minutos, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Atualmente, os soros
esto disponveis comercialmente e os mais utilizados em cultivos celulares so
os soros de origem bovina, de cavalo e humano. O soro obtido do plasma,
Existem muitas aplicaes para a cultura de clulas. As primeiras aplicaes se relacionam com a produo de anticorpos monoclonais. Os anticorpos
monoclonais tm sua maior aplicao nos imunoensaios, como o ELISA. Alm
disso, esses anticorpos tambm so muito utilizados associados a marcadores
radioativos em imunocintilografia.
Os anticorpos monoclonais so produzidos em clulas denominadas
hibridomas, que resultam da fuso de clulas de mieloma murino com linfcitos
B produtores de um determinado anticorpo. As clulas do hibridoma so
imortais e produzem anticorpos, assim como a sua precursora.
Vrias protenas diferentes de anticorpos comercializadas so produzidas a partir de cultura de clulas. Eritropoietina humana, fator VIII para
hemofilia, dentre outras, so produzidas em clulas cultivadas, pois necessi-
O termo terapia celular identifica uma tcnica com o objetivo de restabelecer a funo ou a estrutura de um tecido por meio da utilizao de clulas,
e vem sendo utilizada no caso de traumas, doenas degenerativas ou agresses
aos tecidos do corpo.
Para a terapia celular, necessrio ressaltar a importncia do conhecimento da clula em seu ambiente original, pois informaes sobre a estrutura do
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