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INTRODUO
O termo cromatografia atribudo ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no incio
do sculo empregou a tcnica para a separao de pigmentos presentes em folhas de plantas, atravs da
passagem de extratos de folhas, arrastados por ter de petrleo, atravs de leitos de carbonato de clcio
finamente dividido. As espcies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas
coloridas, e por isso Tswett chamou o mtodo de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein
(escrever).
A definio de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 a seguinte : cromatografia o mtodo
fsico de separao no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das
quais estacionria, enquanto a outra se movimenta numa direo definida. A mistura que contm os
componentes a serem separados dissolvida na fase mvel. Durante a passagem da fase mvel atravs da
fase estacionria, alguns componentes so fortemente retidos pela fase estacionria e por isso se movem
lentamente com o fluxo da fase mvel; enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a
fase estacionria, sendo transportados mais facilmente pela fase mvel. Devido a essas diferenas em
mobilidade, os componentes da mistura podem ser separados e analisados de forma qualitativa e/ou
quantitativa, pela prpria tcnica de cromatografia ou em conjunto com outras tcnicas experimentais, tais
como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas.
Existem vrias formas de realizar uma separao por meio de um processo cromatogrfico. Diversas
combinaes so possveis : a fase estacionria pode ser um slido, um lquido imiscvel fase mvel ou
um gel, fixado numa superfcie plana ou dentro de uma coluna; a fase mvel pode ser um lquido, um gs,
ou um fludo supercrtico (um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crtica, que
possui a vantagem de ter menor viscosidade que o lquido, mas mantendo as propriedades de interao
com os solutos). Detalhes sobre algumas dessas formas so disponveis nas referncias apresentadas ao
final do texto, ficando este texto restrito apenas apresentao de aspectos mais gerais da tcnica.
Dentre os mtodos modernos de anlise qumica, a cromatografia um dos mais empregados,
encontrando aplicaes nos mais variados ramos da pesquisa cientfica e tecnolgica, devido capacidade
que possui de separar espcies qumicas, de forma seletiva e especfica.
Troca Inica : a fase estacionria constituda de uma matriz onde so adicionados grupos funcionais
ionizveis (catinicos ou aninicos). A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com propriedades
tamponantes, escolhidas de forma a ser compatvel com o tipo de trocador usado.
PLANAR
Fase Mvel
Lquida
EM COLUNA
Gasosa
Fluido Supercrtico
Lquida
Fase Estacionria
lquida
slido
ligada
lquida
slido
ligada
slido
ligada
lquida
Tipo de Cromatografia
CP
CCD
CCD
CGL
CGS
CGFL
CSS
CSFL
CLL
slido
CLS
ligada
CE
CLFL
CTI
Sigla em
Portugus
Nome da Tcnica
Sigla em
Portugus
Nome da Tcnica
CP
cromatografia em papel
CSFL
CCD
CLL
cromatografia lquido-lquido
CCD
CLS
cromatografia lquido-slido
CGL
cromatografia gs-lquido
CE
CGS
cromatografia gs-slido
CLFL
CGFL
CTI
CSS
CB
CB
A fase estacionria
(2)
u = ( L / tM )
(3)
onde L o comprimento da coluna cromatogrfica.
Assumindo que um soluto se move ao longo da coluna cromatogrfica com a mesma velocidade da
fase mvel quando nela est dissolvido, e que ele se encontra praticamente parado quando est retido na
fase estacionria, poderamos expressar a sua velocidade linear na coluna por
v = u x (frao do tempo que o soluto permanece na fase mvel).
Essa frao, no entanto, pode ser igualada ao nmero de moles de soluto na fase mvel dividido pelo
nmero total de moles do soluto que foi injetado na coluna. Dessa forma :
onde
(4)
v = u x [ ( CM VM ) / ( CM VM + CE VE ) ] = u x { [ ( 1 / [ 1 + ( CE VE / CM VM ) ] }
VM e VE so os volumes ocupados na coluna, respectivamente, pelas fases mvel e estacionria
(5)
Figura 3 Um cromatograma tpico de uma mistura de trs componentes, indicando os dados que podem ser
obtidos e seus smbolos.
(6)
(7)
Para cada soluto, pode-se escrever a equao (7), e os valores obtidos sero especficos para cada par
(soluto - fase mvel).
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
(8)
Um outro termo, a reteno relativa ( r L,p ) , envolve a razo de tempos de reteno do componente
e de um padro, respectivamente. A reteno relativa usada para identificao de substncias e pode ser
calculada para quaisquer picos no cromatograma, livre da restrio de serem adjacentes.
Resoluo
Uma outra medida quantitativa de separao de dois componentes consecutivos num cromatograma
a resoluo ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e calculada a partir da distncia que separa os
mximos dos picos divididos pela mdia das larguras de suas respectivas bases, conforme apresentado na
Figura 4. A resoluo de uma coluna uma medida quantitativa de sua habilidade em separar dois
solutos, e definida por :
RS = ( tRB tRA ) / [ ( WA / 2 ) + ( WB / 2 ) ] = 2 ( tRB tRA ) / ( WA + WB )
(9)
(10)
Um prato terico pode ser considerado uma etapa de equilbrio no processo de distribuio de um
componente dado entre as duas fases (mvel e estacionria), de forma anloga ao prato terico de uma
coluna de destilao. Quanto maior o nmero de pratos, mais etapas de equilbrio existiriam e, dessa
forma, melhor seria a separao entre compostos no processo cromatogrfico.
Duas equaes podem ser utilizadas para estimar N, e nenhuma delas ter seu desenvolvimento
detalhado neste texto (maiores informaes podem ser obtidas nas referncias mencionadas na literatura
comentada). Ambas utilizam informaes retiradas do cromatograma experimental, que podem ser vistas
nas Figuras 3 e 4 : a primeira equao (11), utiliza o tempo de reteno tR e a largura na base W; a
segunda equao (12), considerada por alguns autores como mais confivel que a anterior, utiliza no
mais a largura do pico na sua base, mas na sua meia altura, Wh.
N = 16 ( tR / W ) 2
(11)
N = 5,545 ( tR / Wh) 2
(12)
A estimativa de H pode ser feita substituindo-se o valor de N calculado na equao (10), uma vez
que o comprimento L normalmente conhecido. Se no clculo, no lugar do tempo de reteno tR for
usado o tempo de reteno corrigido tR, o nmero de pratos chamado de nmero de pratos efetivo.
O nmero de pratos tericos e a altura equivalente a um prato so largamente empregados na
literatura e por fabricantes de equipamentos para avaliar o desempenho de colunas. No entanto, para que
esses nmeros tenham algum significado na comparao de duas colunas, fundamental que eles tenham
sido determinados nas colunas em comparao nas mesmas condies de ensaio e, principalmente, que
tenham sido determinados para o mesmo componente.
No entanto, apesar de serem frequentemente utilizados, deve-se atentar para o fato de que o uso
desses dois termos pode induzir a um erro: de fato, numa coluna cromatogrfica, jamais so atingidas
condies de equilbrio, uma vez que durante a operao uma das fases est em movimentao constante.
Efeito da vazo da fase mvel na eficincia de uma coluna
A eficincia na separao que pode ser alcanada numa coluna depende, dentre outros fatores, do
tempo mdio de contato entre as fases mvel e estacionria. Esse tempo, por sua vez, depende da vazo
da fase mvel e do dimetro da coluna (que, juntos, determinam a velocidade de escoamento da fase
mvel ao longo da coluna). Ora, a vazo da fase mvel um parmetro facilmente ajustvel, e por isso
torna-se interessante observar como varia a eficincia de uma coluna com essa vazo. Esse estudo feito
normalmente atravs da determinao de H ( com o uso das equaes (10) a (12) ) para diversos valores
de vazo ou de velocidade de escoamento. Dados tpicos de estudos desse tipo so apresentados nos
grficos da Figura 5. Ambos apresentam mnimos para H, que correspondem a valores mximos de
eficincia, para baixos valores de vazo ou velocidade de escoamento da fase mvel.
Como podemos ver na figura, os valores de mnimos para cromatografia lquida e gasosa so bem
diferentes, sendo que a velocidade correspondente a um valor de H mnimo para cromatografia em fase
lquida significativamente menor do que no caso da cromatografia gasosa. No entanto, essa vantagem da
cromatografia lquida acaba no se tornando uma vantagem prtica porque raramente vivel o emprego
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
de colunas muito longas em cromatografia lquida (o mais comum terem entre 25 cm e 1m), devido
queda de presso ao longo da coluna com o escoamento do lquido (a chamada perda de carga). J no
caso da cromatografia gasosa, muito comum serem utilizadas colunas de 50m ou mais de comprimento.
Dessa forma, o nmero total de pratos tericos e, consequentemente, a eficincia frequentemente
maior em cromatografia gasosa que em cromatografia lquida.
Figura 5 Efeito da velocidade de escoamento da fase mvel na altura de um prato terico para
cromatografia lquida e gasosa.
(b) Seleo do mtodo cromatogrfico a ser empregado.
(c) Seleo ou preparao da coluna adequada ao mtodo e mistura a ser separada (determinao do
dimetro da coluna e escolha da fase estacionria).
(d) Seleo das condies operacionais para um teste preliminar (escolha da fase mvel, da sua vazo, da
temperatura, etc...).
(e) Realizao de um teste preliminar.
(f) Avaliao do teste preliminar e estudo das mudanas a serem feitas (caso necessrias) para se atingir
a resoluo desejada com um tempo de ensaio mnimo.
(g) Estabelecimento das novas condies de ensaio (se necessrias) para a obteno da resoluo
desejada no tempo de ensaio desejado.
(h) Se no forem atingidos os objetivos, avaliar a possibilidade de trocar a tcnica escolhida inicialmente,
ou ento de empregar condies especiais de anlise.
Vamos a seguir desenvolver uma srie de equaes que sero extremamente teis como guias para
escolha de condies operacionais que podem permitir que sejam atingidos os principais objetivos de uma
anlise por cromatografia : uma separao clara de compostos, com um ensaio que dure o mnimo de
tempo possvel.
Efeito dos fatores de capacidade (k) e de seletividade (
) na resoluo
Quando dois compostos se movem atravs de uma coluna de forma muito semelhante, no
cromatograma eles podero ser representados por picos muito prximos, podendo inclusive se confundir,
como j foi visto na Figura 4. Uma coluna eficiente aquela capaz de separar esses compostos, ou seja,
aquela capaz de resolver esses picos. Vamos agora apresentar as equaes que relacionam a resoluo
com as constantes de equilbrio das reaes que regem as distribuies das espcies entre a fase mvel e a
fase estacionria, representadas pelos fatores de capacidade e seletividade.
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
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Para o desenvolvimento dessas equaes, assumimos que estamos lidando com compostos A e B que
apresentam tempos de reteno to prximos que podemos assumir que WA = WB W. A equao (9)
torna-se ento :
RS = 2 ( tRB tRA ) / ( 2W ) = ( tRB tRA ) / W
(13)
Da equao (11) podemos tirar uma relao entre W, tR e N. Se aplicarmos essa relao para o
composto B, e a substituirmos na equao (13), chegamos equao (14), que pode ser rearranjada em
termos dos fatores de capacidade ( usando a equao (7) ), resultando na equao (15) :
RS = [ ( tRB tRA ) / tRB ] x ( N / 4 )
(14)
RS = [ ( kA kB ) / ( 1 + kB )] x ( N / 4 )
(15)
A equao (15) ainda pode ser rearranjada de modo a que se possa exprimir a resoluo em termos
do fator de seletividade , se usarmos a equao (8) :
RS = ( N / 4 ) x [ ( 1 ) / ] x [ ( kB / ( 1 + kB )]
(16)
Tambm interessante obter uma equao que relacione o nmero de pratos tericos necessrio para
se conseguir uma determinada resoluo. Isso pode simplesmente ser feito atravs de um rearranjo da
equao (16), resultando :
N = 16 RS [ / ( 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB ) / kB ]2
(17)
(18)
A equao (18) pode ser combinada com a equao (17), resultando na equao a seguir, que
relaciona o tempo de reteno com a resoluo :
tRB = ( 16 RS2 H / u ) x [ / ( 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ]
(19)
11
12
RS = Q x [ ( kB / ( 1 + kB )] (16)
tRB = Qx [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ] (19)
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ANLISE QUANTITATIVA
A cromatografia vem apresentando crescente utilizao como ferramenta analtica devido sua
simplicidade, ao custo relativamente baixo, vasta gama de aplicaes possveis e possibilidade de
fornecer dados quantitativos confiveis. Este ltimo item discutir justamente alguns aspectos gerais a
respeito da obteno de dados quantitativos, que so comuns a todas as variaes dessa tcnica
experimental.
A anlise quantitativa est baseada na comparao das alturas ou das reas dos picos
correspondentes aos compostos presentes nas misturas sob anlise com aqueles obtidos a partir de um ou
mais padres. Se as condies operacionais forem bem controladas, esses parmetros (altura e rea dos
picos) variam linearmente com a composio.
15
Figura 10 Exemplo do efeito da temperatura em cromatografia gasosa. (a) anlise isotrmica a 45oC;
(b) anlise isotrmica a 145oC; (c) anlise em programao de temperatura, indo de 30oC at 180oC
(temperaturas indicadas no eixo em anexo).
Anlise baseada na altura dos picos e na rea dos picos
A altura de um pico determinada entre o ponto mximo do pico e a sua base, que determinada
traando-se uma linha que conecta a linha de base do cromatograma dos dois lados do pico, conforme
indicado na Figura 3. Essa medida normalmente pode ser feita com uma boa preciso.
Como j foi visto na Figura 9, tanto a altura quanto a largura dos picos (a altura dos picos
inversamente proporcional sua largura) podem ser alteradas ao longo do cromatograma em funo das
condies operacionais. Dessa forma, medidas quantitativas precisas s podem ser conseguidas se as
condies operacionais no levarem a alteraes na forma dos picos dos compostos e dos padres. Para
evitar esse problema, pode-se fazer a anlise quantitativa baseada no na altura dos picos, mas na rea dos
picos, que independente de efeitos de alargamento como os exemplificados na Figura 9. Dessa forma, as
reas so medidas mais confiveis do que as alturas, mas so determinadas com maior dificuldade que as
alturas (especialmente se o cromatgrafo for antigo, e no contar com interface adequada com
computador, o que ainda ocorre em muitos laboratrios pelo Brasil). Dessa forma, quando no existirem
limitaes devidas a alargamento de picos, medidas de altura podem ser usadas para anlise quantitativa.
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
16
17,4%
55,0%
18,3%
9,3%
100,0%
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
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DETETORES
Muitos tipos de detetores (mais de uma dezena) existem e so utilizados nas diversas modalidades de
cromatografia. Foge ao objetivo deste texto uma descrio dos detetores existentes, e informaes a esse
respeito podem ser encontradas nas referncias citadas na literatura comentada. Apenas sero
mencionadas a seguir algumas caractersticas do que seria o detetor ideal:
(a) Sensibilidade adequada. O que seja isso no pode ser descrito em termos quantitativos, uma vez que o
que seria o adequado difere de detetor para detetor. Pode-se dizer apenas que, atualmente, os
detetores atuais so capazes de detectar dentro de uma faixa de 10-8 a 10-15 g de composto analisado
por segundo.
(b) Boa estabilidade e reprodutibilidade.
(c) Resposta linear em vrias ordens de grandeza de concentrao de compostos analisados.
(d) Temperatura de operao podendo ir desde a temperatura ambiente at pelo menos 400oC
(temperaturas elevadas so comuns em comatografia gasosa).
(e) Pequeno tempo de resposta, independente da vazo da fase mvel.
(f) Fcil de usar e confivel (e, na medida do possvel, prova de falhas, mesmo quando utilizado por
iniciantes).
(g) Similaridade de resposta a todos os compostos (fator de resposta elevado e constante ao longo de uma
faixa elevada de concentraes), ou ento respostas seletivas e previsveis ao longo das diversas
classes de compostos analisados.
(h) Deteco no destrutiva da amostra.
(i) Baixo custo.
evidente, e no necessrio enfatizar muito, nenhum detetor apresenta todas essas caractersticas.
BIBLIOGRAFIA COMENTADA
Os seguintes livros foram utilizados na elaborao deste texto, e podem ser tomados como sendo um
conjunto bsico de referncias sobre o tema, que possui uma grande variedade de livros e peridicos em
vista da grande gama de aplicaes e da variedade de modalidades analticas.
Skoog, D.A.; Leary, J.J. Principles of Instrumental Analyseis. 4a ed. Saunders College Publishing.
Philadelphia. 1992. caps. 24-25.
Livro muito interessante, contm os fundamentos de muitas tcnicas analticas. O presente texto
apresenta fundamentalmente a estrutura do captulo 24. Uma boa referncia para quem deseja ter uma
viso geral das tcnicas de anlise instrumental mais utilizadas atualmente. Apesar de ter sido editado
h quase dez anos, ainda muito atual.
Collins, C.H.; Braga, G.L.; Bonato, P.S. (coord.) Introduo a Mtodos Cromatogrficos. 4a ed.
Campinas. Editora da UNICAMP. 1990.
Livro interessante, contm os fundamentos de muitas modalidades da cromatografia. Uma boa
referncia para quem j quer comear a se aprofundar na tcnica, e com a vantagem de ser em
portugus.. Apesar de ter sido editado h dez anos, ainda atual, porm menos detalhado que a
prxima referncia. Existe em bibliotecas da Poli e na do Instituto de Qumica.
Braithwaite, A. ; Smith, F.J. Chromatographic Methods. 5a ed. Chapman & Hall. Londres. 1996.
Este livro para quem j quer comear a se aprofundar nos mtodos cromatogrficos. Apresenta
diversas das modalidades da cromatografia de forma bastante acessvel, com um detalhamento
suficiente para aqueles que necessitam utilizar a tcnica. Recente e mais acessvel que a prxima
referncia. Existe na biblioteca do Instituto de Qumica.
Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP
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Snyder, L.R.; Kirkland, J.J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2a ed. Wiley. Nova
York. 1979.
Este livro para quem vai se aprofundar em cromatografia lquida. Apresenta fundamentos que so
aplicveis em diversas das modalidades da cromatografia, com um detalhamento maior do que o das
referncias anteriores. No fundo, apresenta os conceitos fundamentais, de uma forma mais detalhada,
e por isso bastante til, apesar dos seus mais de vinte anos. Existe na biblioteca do Instituto de
Qumica.
Para os interessados, existe um nmero muito grande de referncias, tanto na forma de livros, quanto
na de peridicos, a respeito do tema. Os interessados podem conseguir facilmente informaes a respeito
consultando o Dedalus, a partir do SIBI/USP, http://www.usp.br/sibi/. Quem no souber nem o que
Dedalus, nem o que SIBI, pergunte a uma bibliotecria de qualquer biblioteca da Poli, e ela certamente
vai explicar como funciona.
EXERCCIOS
1. Calcule o nmero de pratos tericos e o nmero efetivo de pratos de uma coluna para um composto que
apresente um tempo de reteno (tR) de 3,64 min e uma largura de pico (W) igual a 0,33min. O tempo
morto (tM) igual a 0,21 min.
2. Usando os dados apresentados na tabela abaixo (tempos de reteno corrigidos, tR), calcule os valores
do fator de separao ( ) de cada composto em relao ao alfenol. Interprete esses resultados (em outras
palavras : o que representa ser menor que 1, igual a 1 ou maior que 1?). Sabendo que o tempo morto
igual a 43 s, calcule os valores do fator de capacidade k para todos os compostos.
Composto
amobarbital
pentobarbital
fenobarbital
alfenol
metaqualona
tR (min)
3,53
4,17
5,11
6,31
10,74
Condio Operacional 1
Composto A
Composto B
tR = 5,73 min
tR = 6,36 min
W = 0,56 min
W = 0,71 min
Condio Operacional 1
Composto A
Composto B
tR = 10,52 min tR = 11,36 min
W = 0,38 min
W = 0,48 min
19
5. As reas relativas dos picos dos cinco compostos apresentados na Figura 8, e os respectivos fatores de
resposta do detetor, so dadas abaixo. Calcule a porcentagem relativa de cada composto na mistura.
Composto
1
2
3
4
5
6. Determine as larguras de dois picos, um com tempo de reteno igual a 6,00 min e outro com tempo de
reteno igual a 3,64 min, sendo que o valor do nmero de pratos tericos (o mesmo usado para os dois
picos) igual a 1600. Explique a razo pela qual os valores de largura de picos so diferentes. coerente
usar no clculo o mesmo valor de N para os dois compostos?
7. Os dados a seguir foram obtidos em uma cromatografia gs-lquido realizada numa coluna de 24,7cm
de comprimento.
Composto
A
B
C
Sabendo-se que nas condies de operao utilizadas o tempo morto igual a 3,1 min, pede-se:
(a) o nmero mdio de pratos efetivos e o desvio padro desse valor mdio;
(b) o valor da altura mdia de prato;
(c) o fator de capacidade para cada um dos trs compostos;
(d) a resoluo para os pares A/B, A/C e B/C;
(e) o fator de separao para os pares A/B, A/C e B/C;
(f) considerando o par B/C, qual seria o comprimento de coluna necessrio para ser atingida uma
resoluo igual ao dobro da calculada em (d), considerando-se a altura mdia de prato aquela
calculada em (b);
(g) considerando o par B/C, qual seria o tempo de ensaio necessrio para ser atingida uma resoluo
igual ao dobro da calculada em (d), sendo mantidas as mesmas condies de vazo de fase mvel.