UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA

FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI
GUSTAVO PASSOS MEDROS
LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS
THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1

EXPERIÊNCIA 6 – CINÉTICA ENZIMÁTICA

SANTO ANDRÉ
ABRIL / 2010
 Sumário

1. OBJETIVOS.......................................................................................................................2
2. METODOLOGIA...............................................................................................................2
2.1. Materiais .....................................................................................................................2
2.2. Métodos ......................................................................................................................2
2.2.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática ......................................................2
2.2.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato ....................................................3
2.2.3. Parte 3: Efeito da Temperatura...........................................................................3
2.2.4. Parte 4: Efeito do pH ..........................................................................................4
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................4
3.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática ..............................................................4
3.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato ............................................................4
3.3. Parte 3: Efeito da Temperatura...................................................................................6
3.4. Parte 4: Efeito do pH ..................................................................................................9
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................11
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1. OBJETIVOS
O objetivo deste experimento é estudar a influência de fatores como
temperatura, .pH e concentração de substrato na atividade enzimática, no caso da
amilas salivar atuando sobre na quebra do amido.

2. METODOLOGIA
2.1. Materiais
• Erlenmeyer 150 ml.
• Gaze.
• Tubos de ensaio e estante.
• Banho-maria (~37°C)
• Banho de aquecimento fervente (~ 100ºC).
• Banho de gelo (~4°C);
• Pipetas.
• Conta-gotas.
• Lugol.
• Solução de amido 1,0 % (m/v).
• Água destilada.
• Soluções de tampão fosfato 1,0 mol/L com diferentes pH’s

2.2. Métodos
Um voluntário mastigou um pedaço de filme plástico de laboratório (Parafilm)
por aproximadamente 1 minuto e sua saliva foi coletada em um recipiente.
A amostra de saliva foi filtrada em gaze e mantida no gelo.

2.2.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática

Foram adicionados 20 mL de solução de amido 1% fervida em um erlenmeyer
de 125 mL, a amostra foi incubada a 37ºC por 3 minutos. Em seguida, adicionou-se
0,3 mL da saliva filtrada e a solução foi homogeneizada gentilmente.
Retirou-se 1,0 mL da solução e o adicionou a um tubo de ensaio (Tubo 0), o
tubo foi colocado no banho fervente e em seguida resfriado no gelo. Este processo
foi repetido para os tubos de 1 a 7 em intervalos regulares de 3 minutos.
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Para controle, foram feitos um tubo B (“branco”) com 1,0 mL de água destilada
no lugar do amido e um tubo de controle negativo com amido sem adição de saliva.
Adicionou-se uma gota de lugol em todos os tubos e observadas as diferenças
nas intensidades de coloração obtidas.

2.2.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato

Sete tubos de ensaio foram numerados e adicionou-se neles a solução de
amido 1% fervida e a água destilada sendo os volumes adicionados a cada tubo
conforme Tabela 1.
Os tubos foram colocados em banho-maria 37ºC por 3 minutos. Em seguida,
adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo em intervalos regulares de
tempo de 15 segundos. Após 3 minutos da adição de saliva a cada tubo, o
respectivo tubo foi retirado do banho-maria e mergulhado em banho de água
fervente e resfriado logo em seguida.
Após a retirada de todos os tubos, adicionou-se uma gota de lugol em cada
tubo. Para a leitura, adicionou-se 0,9 mL de água destilada na cubeta e 0,1 mL da
amostra, e foram determinadas as absorbâncias no comprimento de onde de 660
nm.

Tabela 1 – Volume de amido e água nos tubos para teste de concentração de substrato.
Tubo Amido 1% (mL) H2O (mL)
1 0,0 3,2
2 0,2 3,0
3 0,4 2,8
4 0,6 2,6
5 1,0 2,2
6 2,0 1,2
7 3,2 0,0

2.2.3. Parte 3: Efeito da Temperatura

Em três tubos de ensaio foram adicionados 1,0 mL de solução de amido 1,0%
Um primeiro tubo foi colocado a 37ºC, o segundo no gelo e o terceiro em água
fervente por três minutos para atingirem o equilíbrio térmico.
Adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo e aguardados 3 minutos.
Em seguida foi feito o teste da hidrólise do amido pela adição de uma gota de lugol.
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2.2.4. Parte 4: Efeito do pH

Foram adicionados 2,0 mL de solução de amido 1,0 % fervida em três tubos de
ensaio, em seguida adicionou-se 1,0 mL de tampão fosfato 1,0 mol/L com diferentes
pH’s conforme Tabela 2.

Tabela 2 – pH da solução tampão de fosfato 1,0 mol/L em cada um dos tubos testados.
Tubo pH do tampão
1 2,0
2 7,0
3 12,0

Os tubos foram colocados no banho a 37°C por 3 minutos. Em seguida

adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo. Após 3 minutos, os tubos
foram colocados em banho fervente, resfriados, e adicionou-se uma gota de lugol
para analisar os resultados.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática

Não realizado por escassez temporal.

3.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato

Observa-se que apartir do primeiro tubo à esquerda até o último tubo há um

degrade da coloração, isto é, partindo do primeiro tubo, que contém apenas água,
tem-se uma solução transparente e no último tubo, que contém solução 1% de
amido um tom mais intenso de azul.
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Figura 1 – Tubos do estudo do efeito da concentração de substrato após aquecer e imediatamente

após adição de lugol , da esquerda para a direita (Tubo 1
...
6) O tubo 7 (não visível na foto)
encontra-se atrás do 6.

Como o tubo número 7 ficou encoberto, pode-se analisar a figura 2:

Figura 2 – Tubos do estudo do efeito da concentração de substrato com adição do lugol sem aquecer,
da esquerda para a direita (Tubo 7
...
1).

Tal fato se deve à reação que ocorre entre o amido e o lugol, do qual obtêm-
se uma solução de coloração azul. Deste modo, conclui-se que durante o
experimento não houve reação entre o amido e a saliva, nessa reação esperava-se
que houvesse a degradação do amido formando, entre outros monossacarídeos, a
glicose, o que mudaria a coloração da solução, que passaria para um degrade em
tons de vermelho e violeta, o qual dependeria do grau de hidrólise ocorrido.
Essa reação pode não ter ocorrido pela desnaturação das enzimas presentes
na saliva, que ocorre quando a amostra é submetida a altas temperaturas. Outro
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problema que pode ter afetado o bom andamento do experimento é o tempo em que
as amostras foram submetidas à temperatura ótima, tendo em vista que a amostra
de saliva foi armazenada em uma temperatura próxima de 4°C e que sua atividade
ocorre enquanto está submetida à uma temperatura próxima a 37°C, temos que se a
amostra for resfriada antes que sua atividade enzimática seja retomada, não se têm
a degradação do amido e, portanto, têm-se apenas a reação entre amido e lugol
ocorridas nos tubos. É importante notar que a coloração não foi tão fácil de
distinguir, o que pode ter sido causado por estes pequenos erros, mas, teórica e
intuitivamente pode-se observar a tendência na coloração.
Foram retiradas amostras de cada tubo de ensaio e estas foram analisadas
no espectrofotômetro, o qual registrou valores contidos na Tabela 3:

Tabela 3 – Absorbância no teste de concentração de substrato.

Tubo Sem aquecer A 660nm Aquecido A 660nm
1 Branco (referência) Branco (referência)
2 0,40 0,01
3 0,34 0,00
4 0,69 0,11
5 0,44 0,09
6 1,20 0,03
7 0,91 0,18

A absorbância, registrada na tabela, é, basicamente, a taxa de absorção das

partículas existentes na solução, ou seja, o quanto a amostra absorve de luz.
Olhando para a tabela é difícil de distinguir um tendência lógica de
comportamento das amostras, entretanto, olhando de uma maneira grosseira e geral
nota-se que a absorbância tende a aumentar, em ambas as amostras, de acordo
com cada tubo
.

3.3. Parte 3: Efeito da Temperatura

A figura 3 mostra as diferentes colorações das soluções, todas com um aspecto

amarelado, entretanto isso não era o esperado.
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Figura 1 – Tubos para estudo do efeito da temperatura (Tubo 3
Tubo 2
Tubo 1), após serem
aquecido e com a gota de lugol.

O esperado seria uma coloração azul para os tubos 2 e 3, e uma coloração

avermelhada, para o tubo 1. Tais mudanças nas colorações justificam-se devido às
enzimas serem proteínas globulares, sendo sensíveis ao calor e podendo
desnaturar-se se a temperatura é elevada além da temperatura ótima, ou perderem
sua capacidade catalítica se a temperatura é baixa.
Devido à presença de muitos grânulos (regiões de elevada concentração de
amido) na solução, os resultados obtidos nesta parte do experimento foram
distorcidos e os resultados esperados não foram obtidos uma vez que cada solução
pode ter sido medida com uma concentração de amido diferente na solução, devido
a quantidade de grânulos que pode ter sido colocada em cada tubo. A figura 4
mostra como é de fato um deposito de amido (regiões avermelhadas) e seus
grânulos (pontos pretos) na parte interna.

Figura 4 – Estrutura das Moléculas de Amido. [2]

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No tubo 2 à temperatura de 0°C a coloração azul que seria esperada esta

relacionada com a baixa temperatura imposta no sistema, tal temperatura impede a
atividade da enzima sobre o amido, assim o amido não é degradado e reage com a
solução de lugol gerando a cor azul . No tubo 1, a temperatura de 37°C favorece a
atividade enzimática tal temperatura, a coloração avermelhada é devido a reação do
lugol com componentes gerados pela degradação do amido, no caso a reação que
ocorre é a do lugol com a amilopectina que produz uma coloração vermelha.. No
tubo 3 a temperatura de 100° C, a coloração azul esperada é explicada devido a alta
temperatura acarretar na desnaturação da amilase salivar, diminuindo a sua
atividade catalítica, desse modo o amido não sofre degradação fato constatado pela
reação do amido com a solução de lugol, dando um complexo de cor azul.
Desconsiderando o problema com os grânulos de amido, os resultados
esperados para cada uma das três temperaturas utilizadas esta parte do
experimento são os seguintes: com temperaturas muito baixas, a enzima catalisa
reações usando uma energia menor que o necessário sem a enzima exercendo
suas funções de forma muito menos eficaz do que naturalmente, já em temperaturas
elevadas a taxa de uma reação catalisada pelas enzimas aumenta porem, sob
temperaturas mais altas as enzimas são inativadas, pois nestas condições as
moléculas enzimáticas vibram e se torcem tão rapidamente que algumas de suas
ligações se rompem. Quando a temperatura alta altera a estrutura terciária, as
enzimas se tornam desnaturadas e perdem sua função, enquanto na temperatura
ambiente as enzimas exibem atividade maior do que em ambos os casos. Muitas
vezes isso está relacionado com a manutenção das atividades do metabolismo. [2]
De fato cada enzima pode ter seu próprio ponto ótimo (temperatura de
atividade máxima de uma enzima) dependendo de suas funções, características e
meio onde atuam. [2]
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3.4. Parte 4: Efeito do pH

O pH das soluções pode fazer com que os grupos ionizáveis das enzimas
tenham carga eletrica positiva, negativa ou neutra em relação ao meio. Como a
conformação da molécula se deve parcialmente as suas cargas, em certo pH a
conformação é a melhor que a molécula pode admitir, sendo chamado o pH otimo,
que pode ser observado pelo pico de atividade enzimática na figura 5. Porém o
mesmo também pode ser causador de sua desnaturação dependendo da
conformação da molécula.

Figura 5: Fonte: http://www.danaquimica.com.br/dana_alfa.html

As amostras pode ser vistas na figura 6:

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Figura 6 – Tubos para estudo do efeito do pH (Tubo 3
Tubo 2
Tubo 1) após aquecidos, com
saliva, fervidos e com a gota de lugol.

Esperava-se na parte 4 do experimento que o tubo de ensaio mais escuro

fosse o numero 2, de pH = 7. por ser o pH ideal (Vilela, A. L.M . O SISTEMA
DIGESTÓRIO.[3]), a enzima reagiu mais com o amido e produziu menos complexo
com o lugol, por isso a cor arroxeada. Já no tubo 1, o pH não era tão favorável a
reação da enzima com o amido, fazendo com que o amido que não reagiu formasse
o complexo com o lugol formando uma cor azul escuro. O tubo 1 ficou transparente
pois o lugol não forma complexos com amido em meios de pH muito elevado.
O pH, bem como as análises de coloração para cada tubo estão expressas na
Tabela 4:

Tabela 4 – Resultado do teste de pH da solução tampão de fosfato 1,0 mol/L.

Tubo pH do tampão Resultado
1 2,0 Azul escuro
2 7,0 Azul escuro / roxo
3 12,0 Transparente
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica,

4.ed. New York: Worth Publishers, 2006.
[2] Sadava, David; Heller, H. Craig; Orians, Gordon H. - Vida - A Ciência da
Biologia - Vol I - Célula e Hereditariedade, 8ª Ed. Artmed

[3]Disponível em <http://www.afh.bio.br/digest/digest1.asp>. Acesso em 27/04/2010