Captulo XIX - Vitaminas

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355/IV Determinao de carotenides em produtos naturais Os carotenides, pr-vitamina A, amplamente distribudos nos vegetais e animais, representam um grupo de pigmentos naturais lipossolveis com tonalidades que variam do amarelo ao vermelho. Na sua maioria, estes pigmentos so tetraterpenos constitudos por oito unidades de isopreno (C5H8), com duplas ligaes conjugadas que compem o sistema cromforo. As principais fontes de carotenides no reino vegetal so: cenouras, frutas e verduras. Nos alimentos, alm de contriburem com a cor, alguns pigmentos carotenides atuam como pr-vitamina A. Os principais carotenides ( e carotenos), precursores da vitamina A em produtos naturais, so determinados por cromatografia em coluna e por espectrofotometria UV/VIS. O mtodo apresentado baseia-se na extrao com solventes orgnicos, saponificao e separao dos carotenides por cromatografia em coluna. Os carotenides alfa e beta so identificados pela posio relativa dos pigmentos na coluna e pelos espectros de absoro na regio UV/VIS. Material Balana analtica, rotavapor, cilindro de nitrognio, trompa dgua, l de vidro, liqidificador com copo de vidro (ou agitador mecnico), espectrofotmetro UV/ VIS, papel de alumnio, papel de filtro, coluna cromatogrfica de vidro de (2,5 x 50) cm de altura ou 2 x 25 cm, kitassatos de 500 e 250 mL, frascos Erlenmeyer com tampa de 500, 250, 100 e 50 mL, bqueres de 250 e 100 mL, basto de vidro, funil de vidro, bales volumtricos de 50 e 100 mL, funil de separao com torneira de teflon de 500 mL, funil de Bchner e proveta 100 mL.

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Reagentes xido de magnsio para cromatografia em coluna Celite ter de petrleo com faixa de destilao (30-60)C Hidrxido de potssio Metanol Acetona Sulfato de sdio anidro Soluo de hidrxido de potssio a 10% m/v Pese 10 g de hidrxido de potssio, dissolva em metanol e complete a 100 mL. Fase estacionria Pese o xido de magnsio e a celite na proporo (1:2). Transfira para um frasco fechado. Agite bem para homogeneizar, antes do empacotamento da coluna cromatogrfica. Procedimento Adapte a coluna a um kitassato de 500 mL, coloque um pouco de l de vidro na parte inferior da coluna e adicione aos poucos a mistura preparada com xido de magnsio-celite (1:1), com auxlio da trompa dgua, at aproximadamente 10 a 15 cm. O empacotamento deve ficar uniforme, sem sulcos ou falhas e no muito compactado. Triture e homogeneze 500 g da amostra e pese aproximadamente 10 g. Extraia os pigmentos com acetona resfriada com auxlio do liqidificador ou agitador mecnico. Filtre atravs de um funil de Bchner. Repita esta operao at o resduo ficar incolor. Junte todos os extratos de acetona contendo os carotenides e armazene sob a proteo da luz. Coloque 100 mL de ter de petrleo no funil de separao. Adicione, aos poucos, a soluo de acetona contendo os pigmentos extrados, acrescentando gua aps cada adio. Agite, e aps a separao das duas fases, descarte a camada aquosa com acetona (inferior). Repita esta operao lentamente, evitando emulses, at a eliminao da acetona. Os pigmentos so transferidos para a fase etrea. Lave mais quatro ou cinco vezes a fase etrea para eliminar totalmente algum resduo de acetona. Recolha a fase etrea em um frasco Erlenmeyer com tampa de 500 mL e guarde para a saponificao, protegendo da luz. Saponifique os pigmentos com adio de uma soluo de KOH a 10% em metanol na proporo de 1:1 em relao ao volume do extrato de ter de petrleo. Agite e deixe esta mistura em repouso por aproximadamente 12 horas temperatura ambiente. Elimine os resduos de KOH com sucessivas lavagens com gua em funil de separao. Adicione pequena poro de sulfato de sdio anidro para retirar a gua residual da amostra. Cromatografia em coluna Evapore a soluo anterior em rotavapor, at aproximada652 - IAL

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mente 20 mL temperatura de 35C ou sob corrente de nitrognio. Na coluna, previamente compactada e conectada trompa dgua, adicione ter de petrleo para umedec-la evitando ressecamento. Junte a amostra e observe as separaes das fraes de carotenides. Continue adicionando ter de petrleo at a ntida separao das fraes, atingindo assim o fim da coluna. A 1a frao separada o -caroteno, de cor amarela clara, podendo tambm ser separada com o uso de uma soluo de 2% de acetona em ter de petrleo. A 2a frao separada o -caroteno, de cor alaranjada, podendo tambm ser separada com o uso de uma soluo a 5% de acetona em ter de petrleo Essas duas fraes so as que possuem maior atividade de vitamina A e de maior interesse. Recolha, separadamente, as fraes. Se na separao for utilizada acetona, ela dever ser retirada com sucessivas lavagens com gua no funil de separao. Adicione pequena poro de sulfato de sdio anidro. As fases etreas so evaporadas, completadas a um determinado volume com solvente e as absorbncias lidas no espectrofotmetro UV/VIS. Na 1a fase, o - caroteno identificado e quantificado por espectrofotometria na regio do visvel, cujo espectro caracterstico apresenta trs picos mximos de absoro, respectivamente em: 421, 443 e 472 nm. Na 2a fase etrea, o -caroteno identificado e quantificado por espectrofotometria na regio do visvel, cujo espectro caracterstico apresenta trs picos mximos de absoro em: 425, 448 e 475 nm. Clculo

A = absorbncia mxima obtida no espectro de absoro V = volume do solvente no qual se encontra dissolvido o carotenide (mL) P = massa da amostra integral (g) Nota: a absortividade do -caroteno em ter de petrleo no = 444 nm corresponde a 2800 e a do -caroteno no = 453 nm corresponde a 2592. Referncias bibliogrficas DAVIES, B.H. Carotenoids. In: GOODWIN, T.W. Chemistry and biochemistry of plants pigments. 2. ed., v. 2, London: Academic Press, 1976. p. 38-165. RODRIGUES, R.S.M. Carotenides com atividade pr-vitamnica A de hortalias
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folhosas e suas alteraes com o cozimento. 1988. 140 f. Tese (Mestre em Cincia dos Alimentos) - Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo, So Paulo. RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; RAYMUNDO, L.C.; LEE, T.C.; SIMPSON, K.L.; CHICHESTER, C.O. Carotenoid pigment changes in ripening Momordica charantia fruits. Ann. Bot., London, v. 40, p. 615-624. 1976. RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. A guide to caratenoid analysis in foods. Washington, D.C.: ILSI Press International Life Sciences Institute, 1999. 64 p. 356/IV Determinao de -caroteno em massas alimentcias Os carotenides so importantes do ponto de vista nutricional, porque alguns deles, alm da funo de corante, podem converter-se em vitamina A. O -caroteno e o -apo-8carotenal so os que demonstram maior atividade provitamnica A. Nas massas alimentcias brasileiras, tais como, o macarro, cujo contedo natural de carotenides insuficiente, tecnicamente recomendvel adicionar -caroteno. H muitos anos, os fabricantes brasileiros de massas alimentcias vm utilizando esta prtica como alternativa para o enriquecimento com ovos. O mtodo analtico apresentado consiste na extrao do -caroteno com solvente orgnico, remoo dos cidos graxos e outros interferentes por saponificao, identificao e quantificao por espectrofotometria de absoro na regio UV/VIS. Material Liqidificador, balana analtica, chapa eltrica com agitador, cilindro de nitrognio, espectrofotmetro UV/VIS, papel de filtro, papel de alumnio, balo de fundo chato com junta esmerilhada 24/40 de 250 ou 300 mL, condensador de bola, funis de separao de cor mbar com torneira de teflon de 250 e 500 mL, bqueres de 25, 250, 400 e 500 mL, bales volumtricos de 50 e 100 mL, funil de vidro e basto de vidro. Reagentes lcool isento de aldedos e perxidos Glicerina ter de petrleo com faixa de destilao (30-60)C Sulfato de sdio anidro Soluo de hidrxido de potssio a 30% m/v Pese 30 g de hidrxido de potssio, dissolva em gua destilada e complete o volume a 100 mL.
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Soluo alcolica de fenolftalena a 1% m/v - Pese 1 g de fenolftalena, dissolva em lcool e complete o volume a 100 mL. Procedimento Pese 5 g de amostra, previamente triturada e homogeneizada, em um balo de fundo chato com junta esmerilhada 24/40 de 250 mL ou de 300 mL. Coloque 10 mL de glicerina e agite. Adicione 50 mL de lcool isento de aldedos e perxidos, 10 mL de hidrxido de potssio a 30% e aquea em refluxo, mais ou menos a 40C, por 30 minutos. Esfrie e transfira a soluo para um funil de separao de 250 mL e extraia o -caroteno com duas pores consecutivas de 25 mL de ter de petrleo. Rena os extratos etreos em um segundo funil de separao de 500 mL e lave com pores de 50 mL de gua, agitando suavemente at que a fase aquosa no d colorao rsea, pela adio de algumas gotas da soluo indicadora de fenolftalena. Filtre em funil de vidro contendo sulfato de sdio anidro para um balo volumtrico de 50 mL e complete o volume com ter de petrleo. Determine a absorbncia em espectrofotmetro a 450 nm, usando ter de petrleo como branco. Nota: se outras substncias estiverem presentes na amostra, passveis de extrao com o -caroteno, h necessidade de separ-las por cromatografia em papel, utilizando uma alquota do extrato etreo e uma soluo de acetona a 2% em ter de petrleo como fase mvel. O -caroteno migra com o solvente apresentando um Rf maior que as demais substncias interferentes. Clculo

A = absorbncia a 450 nm obtida no espectro de absoro C = quantidade da amostra em 100 mL de ter de petrleo. Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz, v.1, Mtodos qumicos e fsicos de alimentos. 3. ed., So Paulo: IMESP, p. 382-383. 1985. LA ASSOCIACIN DE QUMICOS DE VITAMINAS, INC. Mtodos de Anlisis de Vitaminas. Traduo de M. Soledad G. Chamarro y Cludio Fernndez Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 91-114. Titulo original: Methods of Vitamin Assay.
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PEREIRA,M.R. Beta-caroteno em macarro fortificado e avaliao da metodologia analtica. 1997. 95 f. Tese (Mestre em Cincia da Nutrio) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas - SP. 357/IV Determinao de vitamina A em alimentos A vitamina A, alm de ser essencial na manuteno do crescimento normal das clulas e na diferenciao dos tecidos epitelial e sseo, tambm est relacionada com a fisiologia da viso. Sua deficincia pode causar xeroftalmia (cegueira noturna). H indicao de que esta vitamina influencie elementos especficos do sistema imune. Por outro lado, convm salientar que quantidades excessivas tm efeito txico no organismo. No estado natural, esta vitamina encontrada somente nos animais, sendo isolada da frao insaponificvel de lipdios. A fonte mais rica de vitamina A o fgado de peixes, sendo que determinados tecidos podem conter quantidades significativas. Basicamente, a molcula de vitamina A um lcool, o retinol, que est presente nos alimentos e tecidos como steres combinados com cidos graxos de cadeia longa, como o cido palmtico. Este mtodo baseia-se na medida da colorao azul instvel, resultante da reao da vitamina A com o tricloreto de antimnio (reagente Carr Price) e vlido para a determinao de vitamina A em alimentos, enriquecidos ou no, raes e misturas vitamnicas (premix). No aplicvel para produtos contendo pr-vitamina A (carotenos). A anlise compreende as seguintes etapas: converso dos steres de vitamina A forma alcolica correspondente por saponificao, extrao e determinao colorimtrica. Material Colormetro com faixa de leitura de 500 a 700 nm, cilindro de nitrognio, placa aquecedora com agitador, tubos de colormetro, balana analtica, balo com boca esmerilhada de 250 mL, condensador de refluxo, bales volumtricos de cor mbar de 50 e de 100 mL, funis de separao de cor mbar de 250 e de 500 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipetas volumtricas de 5 e 10 mL, funis de vidro de 5 cm de dimetro e basto de vidro. Reagentes lcool isento de aldedos e perxidos lcool Glicerina ter de petrleo (30-60)C Anidrido actico Sulfato de sdio anidro Clorofrmio Soluo de hidrxido de potssio 30% m/v. Soluo de fenolftalena
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cido clordrico, lcool comercial ou clorofrmio comercial Para descontaminao da vidraria que entrou em contato com reagente Carr-Price. Soluo-padro de vitamina A Pese certa quantidade do padro retinol necessria para preparar uma soluo que contenha de 8 a 15 unidades internacionais (UI) de vitamina A, em lcool isoproplico. Na disponibilidade do padro de acetato de vitamina A, pese com preciso 0,1 g e saponifique de acordo com o procedimento abaixo descrito. Extraia o saponificado com trs alquotas de ter de petrleo, respectivamente de 40, 30 e 30 mL e lave com gua para eliminar o excesso de hidrxido de potssio, verificando pela reao negativa com fenolftalena. Colete as fases em balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com ter de petrleo. Pipete uma alquota de volume conhecido e evapore sob corrente de nitrognio. Dissolva o resduo em quantidade suficiente de lcool isoproplico para se obter concentrao final entre 8 e 15 UI de vitamina A por mL. Nota: prepare esta soluo sempre no dia da anlise. Reagente de Carr-Price Dissolva 25 g de tricloreto de antimnio com clorofrmio e transfira para um balo volumtrico de 100 mL, completando o volume com o mesmo solvente. Deixe esta soluo em repouso de um dia para outro, em frasco de cor mbar, bem fechado e sob refrigerao. Este reagente estvel por dois meses. Procedimento Preparao da amostra Para alimentos secos e misturas vitamnicas (premix), colete de 600 a 800 g do total da amostra. Armazene em frasco bem fechado, em local seco e escuro e no perodo mximo de uma semana. As amostras lquidas devem ser conservadas sob refrigerao temperatura at 8C. Antes de iniciar a anlise, deixe a amostra temperatura ambiente e homogeneze bem. Margarina, manteiga e creme vegetal devem ser armazenadas em refrigerador. No exponha a amostra luz e ao calor. Antes de iniciar a anlise amolea a amostra, corte-a e tome pequenas partes ao acaso. No misture e nem agite a amostra, pois isto causar a separao da gua, que um processo irreversvel. Para guard-la, embrulhe sem homogeneizar e refrigere. Saponificao da amostra Adicione, diretamente em um balo de boca esmerilhada de 250 mL, uma quantidade de amostra que contenha at 50 UI de vitamina A. Adicione 10 mL de glicerina e agite. Adicione 50 mL de lcool e 10 mL de soluo aquosa de hidrxido de potssio a 30%. Aquea em placa aquecedora, sob refluxo e com agitao por 30 minutos. Esfrie e transfira a soluo para o funil de separao mbar de 250 mL. Extraia a vitamina A com duas pores de ter de petrleo, respectivamente, 30 e 20 mL ou, se necessrio, com trs pores, respectivamente, 40, 30 e 20 mL. Transfira os extratos
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etreos para um segundo funil de separao mbar de 500 mL e lave com pores de 50 mL de gua, agitando suavemente, at que a fase aquosa no apresente mais reao alcalina pela adio de 2-3 gotas de fenolftalena. Filtre com sulfato de sdio anidro para um balo volumtrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com ter de petrleo (soluo A). Ajuste o colormetro ou o espectrofotmetro para 100% de transmitncia ou zero de absorbncia a 620 nm, usando gua na cubeta ou no tubo do colormetro. Transfira uma alquota da soluo A correspondente a 10-50 UI de vitamina A para um tubo do colormetro e evapore sob nitrognio at secagem. Dissolva o resduo da evaporao com 3 mL de clorofrmio, adicione 4 gotas de anidrido actico e 7 mL do reagente de CarrPrice. No perodo de at 15 segundos aps a adio do reagente Carr-Price, mea a 620 nm a absorbncia da colorao desenvolvida, usando a gua como referncia. Curva-padro Transfira, individualmente, cinco alquotas da soluo-padro, contendo concentraes de 10 a 50 UI de vitamina A com incrementos de 10 UI para um tubo do colormetro e siga como em procedimento da amostra. Com os dados obtidos construa uma curva-padro. Clculo Determine a quantidade de vitamina A correspondente, utilizando a curva-padro previamente estabelecida. Use a tabela abaixo para a converso de UI em g de vitamina A e derivados e de beta-caroteno.
1 UI de vitamina A 1 UI de vitamina A 1 UI de vitamina A 1 g de palmitato de vitamina A 1 UI de vitamina A 0,3 g de acetato de vitamina A 0,54 g de palmitato de vitamina A 1,8 g de beta-caroteno 0,55 g de acetato de vitamina A 0,3 g de equivalente em retinol (ER)*

*1 equivalente em retinol (ER) = 1 g de retinol 358/IV Determinao de vitamina A em matria-prima Este mtodo baseia-se na determinao da vitamina A por espectrofotometria de absoro na regio do ultravioleta. Material Balana analtica, espectrofotmetro UV/VIS, cubetas de quartzo, placa aquecedora com agitador magntico, cilindro de nitrognio, bales volumtricos cor mbar de 100 mL, balo redondo de 250 mL com fundo chato e boca esmerilhada adaptvel a um refrigerante para refluxo, condensador de refluxo, pipetas graduadas e volumtricas de vrios
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volumes, funis de vidro de 5 cm de dimetro e basto de vidro. Reagentes Glicerina Soluo de hidrxido de potssio 30% m/v lcool isento de aldedos e perxidos ter de petrleo (30-60)C Soluo de fenolftalena Sulfato de sdio anidro lcool isoproplico Procedimento Pese, com preciso, cerca de 0,1 g da amostra e saponifique como descrito no procedimento 357/IV. Extraia com trs pores, respectivamente, 40, 30 e 30 mL de ter de petrleo e lave os extratos etreos com gua at que a gua da lavagem no apresente reao alcalina com 2-3 gotas de fenolftalena. Filtre em filtro com sulfato de sdio anidro e transfira quantitativamente para um balo volumtrico de 100 mL. Complete o volume com ter de petrleo. Retire uma alquota de volume conhecido desta soluo e evapore sob nitrognio. Dissolva o resduo em quantidade suficiente de lcool isoproplico para se obter uma soluo com concentrao de 8 a 15 UI de vitamina A por mL. Determine a absorbncia a 325 nm, que o comprimento de onda de mxima absoro da vitamina A e tambm a 310 e 334 nm, para efetuar a correo de outras substncias que possam interferir na determinao. Utilize lcool isoproplico como branco. Clculos

A = Absorbncia L = espessura da cubeta em cm C = quantidade da amostra em gramas contida em 1000 mL da soluo em isopropanol 5700 = fator de converso de unidades espectrofotomtricas em gravimtricas 0,3 = fator de converso de g em UI Referncias bibliogrficas CARR, F.H.; PRICE, E.A. Colour reactions attributed to vitamin A. Biochem. J., v. 20, p. 497-501. 1926.
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INSTITUTO ADOLFO LUTZ, Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP p. 381-382, 1985. , ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1045-1047 (method 924.29). BALL, G.M.F. Fat-soluble vitamin assays in food analysis A Comprehensive Review. London: Elsevier Applied Science, 1988. 326 p. 359/IV Determinao de vitamina B1 em alimentos A vitamina B1, tambm conhecida como tiamina, encontrada em alimentos naturais e em outros materiais biolgicos. As leveduras, os germes de cereais e as nozes so ricos em vitamina B1. Este mtodo fundamenta-se na quantificao da fluorescncia produzida em condies padronizadas, do composto tiocromo que originrio da oxidao da tiamina com soluo alcalina de ferricianeto de potssio. Nos produtos naturais, a extrao da vitamina B1 somente possvel aps a hidrlise cida e enzimtica, que transforma a forma combinada da vitamina em tiamina livre. Material Espectrofotmetro de fluorescncia, estufa, banho-maria, liqidificador, papel de filtro qualitativo, papel indicador de pH, funil de separao tipo pra de 125 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, tubos de ensaio de 20 cm, bales volumtricos de 25, 100, 200 e 1000 mL, provetas de 100 e 200 mL, bqueres de 25, 50, 100 e 200 mL, funil de vidro, pesa-filtro de 25 mL com tampa e dessecador com slica gel. Reagentes Vitamina B1 padro lcool metlico lcool isobutlico Sulfato de sdio anidro lcool (isento de aldedos e perxidos) Trate o lcool com zinco e hidrxido de sdio e destile. Soluo de ferricianeto de potssio a 1% m/v Soluo de hidrxido de sdio a 30% m/v Soluo de cido sulfrico 0,05 M Soluo de acetato de sdio Em um bquer de 100 mL, pese 34,5 g de acetato de sdio e dissolva em aproximadamente 50 mL de gua. Transfira para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua.
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Soluo de diastase Pese, com preciso, 0,3 g de diastase e complete o volume de 5 mL com soluo de acetato de sdio. Soluo-padro de vitamina B1 (5 g/mL) Pese, com preciso, cerca de 50 mg de vitamina B1, previamente seca em estufa a 110C, durante 2 horas at peso constante. Faa diluies sucessivas de modo que a ltima soluo contenha cerca de 5 g de vitamina B1 por mL. Conserve em geladeira. Procedimentos Produtos enriquecidos Prepare as solues dos produtos a analisar de modo que a soluo final contenha (2,5-5) g de vitamina B1 por mL. Adicione 10 mL de soluo de cido sulfrico 0,05 M para melhor dissoluo. Complete o volume com gua. Selecione dois funis de separao: A, para anlise e P, para o padro. Adicione, seqencialmente: 10 mL de gua aos funis A e P, 2 mL de lcool metlico aos funis A e P, 1 mL da soluo da amostra ao funil A, 1 mL da soluo-padro ao funil P, 1 mL da soluo de ferricianeto de potssio a 1% aos funis A e P e 1 ml da soluo de hidrxido de sdio a 30% aos funis A e P. Agite levemente e espere dois minutos. Extraia o tiocromo formado, adicionando 10 mL de lcool isobutlico em cada funil. Agite fortemente cerca de um minuto e meio e deixe em repouso durante um a dois minutos. Elimine a camada aquosa. Passe a camada alcolica para tubos de ensaio limpos, secos e marcados A e P. Coloque cerca de 200 mg de sulfato de sdio anidro em cada tubo de ensaio. Pipete 5 mL para bales volumtricos de 25 mL, limpos e secos (A e P). Pipete 5 mL de lcool isobutlico para balo volumtrico de 25 mL, limpo e seco e marcado B (branco). Complete o volume e homogeneze com lcool destilado, livre de aldedos e substncias fluorescentes. Leia em espectrofotmetro de fluorescncia, ajustando o 100% da escala com a soluo-padro de 5 g/mL de vitamina B1 ou conforme especificaes do fabricante do aparelho e o zero com o branco. Use luz de excitao de 365 nm e de emisso de 435 nm. Produtos naturais Pese uma quantidade suficiente da amostra ou mea um volume, tal que a soluo final contenha at 5 g de vitamina B1 por mL. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 150 mL de soluo de cido sulfrico 0,05 M (para amostra de levedura, adicione gua), misture, deixe em banho-maria em ebulio durante 30 minutos e agite de vez em quando. Retire do banho-maria e deixe esfriar temperatura ambiente. Adicione 5 mL da suspenso de diastase preparada recentemente, ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com a soluo de acetato de sdio. Incube a amostra a (45-50)C em banho-maria, durante duas horas. Esfrie temperatura ambiente e transfira para um balo volumtrico de 100 ou 200 mL e complete o volume com cido sulfrico 0,05 M (para amostra de levedura, complete com gua). Agite, filtre e recolha em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Em seguida, proceda com em produtos enriquecidos. Nota: a vitamina B1 sensvel luz, portanto evite a claridade durante a anlise. Determine, periodicamente, o teor da vitamina B1 padro.
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Clculo

La = leitura da amostra P = nde /mL do padro A = n de mL da soluo de M g ou mL da amostra M = massa ou volume da amostra ou, simplificando:

Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 383-385. , ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1045-1047 (method 924.29). STROHECKER, R.; HENNING, H. Vitamin Assay. Tested Methods. Traduo de D.D. Libman. 1 ed. Germany: Verlag Chemie GMBH, 1966. p. 65-90. Titulo Original: Vitamin-Bestimmungen, Er probte Methoden. LA ASSOCIACIN DE QUMICOS DE VITAMINAS, INC. Mtodos de Anlisis de Vitaminas. Traduo de M. Soledad G. Chamarro y Cludio Fernndez Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 115-135. Titulo original: Methods of Vitamin Assay. 360/IV Determinao da vitamina B12 em matria-prima Material Balana analtica, espectrofotmetro UV/VIS com registrador, termmetro, bqueres de 10, 25 e 50 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 4, 5 e 10 mL, bales volumtricos de 25, 50, 100, 200 e 1000 mL, dessecador com slica gel e pesa-filtro com tampa de 25 mL.

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Reagentes Vitamina B12 padro Slica gel com indicador de umidade Procedimento Dilua, em gua, uma quantidade da amostra de maneira que a concentrao de vitamina B12 esteja na faixa de concentrao de (20-40) g/mL. Faa a leitura da absorbncia no espectrofotmetro UV/VIS nos comprimentos de onda: 361 nm (se o princpio ativo for cianocobalamina), 351 nm (hidroxicobalamina) e 550 nm (mistura das vitaminas: B1, B6 e B12). Notas A vitamina B12 (cianocobalamina) dever conter, no mnimo, 96% de pureza e no mximo 100,5%, calculado em relao matria seca. O mtodo no aplicvel para mistura de vitamina B12 com vitamina B2, pois h interferncia da cor amarela da vitamina B2. Clculos Mistura de vitaminas (leitura em 550 nm):

Apenas cianocobalamina (leitura em 361 nm):

Apenas hidroxicobalamina (leitura em 351 nm):

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Referncias bibliogrficas FARMACOPIA BRASILEIRA. 3. ed. So Paulo: Organizao Andrei Editoria S.A., 1997. p. 198-200. STROHECKER, R.; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Traduo de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p.151-172. Ttulo Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden. THE MERCK INDEX. 8. ed. Rahway, U.S.A.: MERCK & CO., 1968. p. 97, 547, 1112-1113. KUTSKY R.J. Handbook of Vitamins e Hormones. Paris: Van Nostrand Reinhold Company.1973. p. 62-70. 361/IV Doseamento microbiolgico de vitamina B12 Material Balana analtica, espectrofotmetro UV/VIS, placas de Petri estreis, pipetas de 1, 5, 10 e 25 mL, pipetas micromtricas, bastes de vidro, bqueres de 10, 20, 30, 50, 100, 200, 250 e 500 mL, termmetro, tubos de ensaio para meios de cultura, frascos Erlenmeyer de 30, 50, 100, 250 e 500 mL, pina anatmica reta, discos de papel para dosagem de antibitico, papel de pH, almofariz com pistilo e papel de filtro. Reagentes Soluo salina Pese 20 g de cloreto de amnio, 4 g de nitrato de amnio, 8 g de sulfato de sdio, 4 g de fosfato de potssio monobsico, 12 g de fosfato de potssio dibsico e 0,823 g de sulfato de magnsio. Adicione 1000 mL de gua. Aquea at a dissoluo dos sais. Distribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121C, durante 20 minutos. Soluo-tampo de fosfato (pH=3) Pese 9,7 g de fosfato de potssio monobsico e transfira para um balo volumtrico de 1000 mL. Adicione 50 mL de soluo de cido fosfrico a 1% e complete o volume com gua. Soluo-padro estoque de vitamina B12 Pese 100 mg de vitamina B12, previamente dessecada. Transfira para um balo volumtrico de 100 mL. Ajuste o volume com a soluotampo de fosfato. Dilua esta soluo adequadamente de tal modo que a concentrao da vitamina seja aproximadamente 50 g/mL. Determine a concentrao de vitamina B12 por meio da leitura da absorbncia a 361 nm, utilizando a relao: 1 g/mL de vitamina B12 = Absorbncia 0,0207

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Microorganismos: Escherichia coli 313-3, Mutantie ou 113 ATCC Meio para manuteno do germe Pese 5 g de agar, 1,5 g de peptona, 0,375 g de extrato de carne, 0,75 g de extrato de levedura, 1 g de hidrolizado de casena, 0,25 g de glicose e adicione 250 mL de gua. Aquea a mistura at a dissoluo e filtre. Distribua em tubos de ensaio e autoclave a 121C, por 15 minutos. Deixe solidificar com os tubos inclinados. Meio para doseamento Pese 6 g de glicose, 15 g de agar e adicione 1000 mL de gua. Aquea a mistura at dissoluo. Distribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121C, durante 15 minutos. Procedimento Prepare duas solues da amostra de tal modo que a mais concentrada tenha no mximo 1 g/mL e a menos concentrada, no mnimo, 0,5 g/mL de vitamina B12. Utilize a soluo-tampo de fosfato como diluente. Repique o microrganismo assepticamente nos tubos contendo o meio de manuteno do germe. Incube por 24 horas a 37C. Lave o tubo onde houve crescimento intenso de microrganismos com 5 mL de gua estril para obter uma suspenso do germe que apresente leitura espectrofotomtrica de 10% de transmitncia no comprimento de onda 650 nm. Auxilie a retirada do germe com ala de nquel-cromo at descolamento total das colnias. Funda o meio de doseamento e adicione a soluo salina na proporo de 1:3 de meio. Esfrie este meio at a temperatura de (48-50)C e inocule com a suspenso do germe. Para cada 100 mL de meio preparado, inocule 2 mL de suspenso. Homogeneze bem e distribua em placas de Petri estreis (10 a 15 mL por placa). Deixe solidificar. Prepare duas solues-padro de vitamina B12 a partir da soluo-padro estoque de vitamina B12 de concentraes rigorosamente determinadas, semelhantes s concentraes das amostras. Com o auxlio de uma pina anatmica reta, coloque quatro discos de papel para dosagem de antibitico na placa preparada e marcada, sendo o primeiro disco na posio do eixo inferior, outro no eixo superior, um direita e outro esquerda. Com uma pina anatmica reta, molhe o disco de papel na soluo-padro de concentrao baixa (aproximadamente, 0,5 g/ mL), eliminando o excesso de lquido com duas batidas rpidas sobre a borda do bquer com a soluo. Coloque os discos em todas as placas, na posio inferior do eixo. Em seguida, faa o mesmo procedimento com a soluo-padro de concentrao mais alta (aproximadamente 1 g/mL) na posio superior do eixo. Em seguida, proceda de forma semelhante com a amostra de concentrao mais baixa (aproximadamente 0,5 g/mL). Repita o processo com as solues das amostras nos discos direita e esquerda. Deixe em repouso por 30 minutos temperatura ambiente antes de incubar a 37C, por 24 horas. Aps o perodo de incubao, faa a leitura no aparelho medidor de halos.

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Clculo Os clculos devem ser efetuados, relacionando-se o tamanho dos halos formados nos discos para anlise de antibiticos dos padres com os halos dos discos das amostras e suas respectivas concentraes.

Aa = mdia das leituras da amostra de maior concentrao Pa = mdia das leituras do padro de maior concentrao Ab = mdia das leituras da amostra de menor concentrao Pb = mdia das leituras do padro de menor concentrao Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos. So Paulo: IMESP, 3. ed. 1985. p. 401-404. 362/IV Determinao de vitamina B2 em alimentos A Riboflavina ou vitamina B2 um pigmento amarelo-esverdeado amplamente distribudo nas clulas vegetais e animais. Este mtodo aplicado para cereais e alimentos enriquecidos. A riboflavina apresenta fluorescncia amarelo-esverdeada sob luz ultravioleta. Num intervalo de pH 3-5, a fluorescncia depende exclusivamente da concentrao de riboflavina. Esta vitamina, por ser de decomposio muito fcil luz, no usada como padro. Usa-se uma soluo de fluorescena que apresente maior estabilidade luz e, dependendo da diluio, sua fluorescncia semelhante da vitamina B2, com um fator de correo.

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Material Espectrofotmetro de fluorescncia, banho-maria, balana analtica, papel de filtro qualitativo, liqidificador ou blender, papel indicador de pH, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, bales volumtricos de 25, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, bqueres de 25, 100, 200, 250 e 500 mL, provetas de 50, 100 e 200 mL, funil de vidro e pesa-filtro de 25 mL com tampa. Reagentes Riboflavina padro Fluorescena Ditionito de sdio Slica gel com indicador de umidade cido actico glacial Soluo de hidrxido de sdio a 30% m/v Soluo de cido sulfrico 0,05 M Soluo de cido actico a 5% v/v Soluo de acetato de sdio Pese 34,5 g de acetato de sdio e dissolva em gua. Transfira para balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua. Soluo de diastase Para a anlise de cada amostra, pese 0,3 g de diastase e complete com 5 mL da soluo aquosa de acetato de sdio. Soluo de Riboflavina (A) Pese 25 mg de Vitamina B2, previamente seca em estufa 110C durante 2 horas. Transfira para um balo volumtrico de 1000 mL com ajuda de 750 mL de gua, adicione 1,4 mL de cido actico glacial, agite e coloque em banho-maria a 50C at dissoluo completa. Complete o volume com gua. Guarde em geladeira. (1 mL desta soluo contm 25 g de vitamina B2 ). Soluo-estoque de fluorescena (B) Pese 50 mg de fluorescena, transfira para um balo volumtrico de 1000 mL com ajuda de 250 mL de gua. Adicione 2 mL de soluo de hidrxido de sdio a 30%, caso a fluorescena no seja solvel. Complete o volume com gua. Guarde em geladeira. (1 mL dessa soluo contm 50 g de fluorescena). Soluo de trabalho de fluorescena (C) Faa diluies da soluo (B) em um balo volumtrico e complete o volume com gua, de modo a obter uma soluo aproximadamente 0,15 g de fluorescena por mL. Fator de correo da soluo de trabalho de fluorescena Determine o fator de correo da fluorescena, fazendo algumas diluies de vitamina B2 (soluo A), da seguinte maIAL - 667

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neira: pipete 4 mL da soluo A e dilua at 100 mL com gua. Pipete 10 mL desta nova soluo para um balo volumtrico de 100 mL e complete com gua (soluo D). Um mL desta soluo contm 0,1 g de vitamina B2. Ajuste o zero do espectrofotmetro de fluorescncia usando gua e o 100 do aparelho com soluo de fluorescena de trabalho (C). Faa a leitura da soluo da vitamina B2 (soluo D), usando a luz de excitao de 440 nm e de emisso de 530 nm. Calcule o fator de correo usando a frmula:

L = leitura da riboflavina. Procedimento Produtos enriquecidos Pese uma quantidade suficiente da amostra para obter, na soluo final, no mximo 0,1 g de vitamina B2 por mL. Adicione 10 mL de soluo de cido actico a 5%, aquea em banho-maria entre (40-50)C durante 15 minutos. Esfrie e complete o volume com a soluo de cido actico a 5%. Determine a fluorescncia desta soluo em espectrofotmetro de fluorescncia, usando luz de excitao de 430 nm e de emisso de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a soluo de trabalho de fluorescena e o zero com gua. Aps a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sdio para a destruio da vitamina B2. Leia novamente no espectrofotmetro de fluorescncia. Considere como leitura da amostra (La), a diferena entre estas duas leituras. Alimentos naturais Pese uma quantidade suficiente da amostra, tal que a soluo final tenha 0,1 g de vitamina B2 por mL. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 150 mL de cido sulfrico 0,05 M (para amostra de levedura, use gua). Misture e deixe em banho-maria temperatura de ebulio, durante 30 minutos, agitando de vez em quando. Deixe esfriar temperatura ambiente e adicione 5 mL de suspenso de diastase preparada recentemente. Ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com soluo de acetato de sdio e incube a (4050)C em banho-maria, durante duas horas. Retire e esfrie temperatura ambiente, transfira para balo de 100 ou 200 mL e complete o volume com cido sulfrico 0,05 M (para levedura, complete com gua). Filtre em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Faa diluio com soluo aquosa de cido actico a 5% de tal modo que a soluo final tenha no mximo 0,1 g de vitamina B2 por mL. Determine a fluorescncia desta soluo em espectrofotmetro usando a luz de excitao 440 nm e emisso de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a soluo de trabalho de fluorescena e o zero com gua. Aps a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sdio,
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para a destruio da vitamina B2. Leia novamente no espectrofotmetro de fluorescncia. Considere como leitura da amostra (La), a diferena entre estas duas leituras. Nota: a vitamina B2 sensvel luz, evite claridade durante a anlise. Clculo

La = leitura da amostra F = fator da fluorescena A = diluio da amostra M = massa ou volume da mostra Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v1, Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo., 1985. p. 357-385. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1053-1054 (method 924.29). LA ASSOCIACIN DE QUMICOS DE VITAMINAS, INC. Mtodos de Anlisis de Vitaminas. Traduo de M. Soledad G. Chamarro y Cludio Fernndez Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 137-157. Titulo original: Methods of Vitamin Assay. STROHECKER, R; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Traduo de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p. 68-122. Ttulo Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden. 363/IV Determinao de vitamina B6 em matria-prima A Vitamina B6 encontrada em grande nmero de alimentos de origem animal e vegetal. Na maioria das vezes, est associada s protenas e ao amido; raras vezes na forma livre. A vitamina B6 pode ser encontrada em trs formas: piridoxina, piridoxal e piridoxamina. Os mtodos de anlise no so especficos para nenhuma das formas e o resultado em conjunto expresso como Vitamina B6.
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Material Balana analtica, pesa-filtro, frasco Erlenmeyer de 250 mL, funil de vidro, proveta graduada de 50 mL, pipeta volumtrica de 5 mL, banho-maria, bureta de 25 mL, dessecador e basto de vidro. Reagentes cido perclrico 0,1 M Soluo de acetato de mercrio 6% m/v cido actico glacial Violeta cristal Slica gel com indicador de umidade Procedimento Pese, com preciso, cerca de 0,4 g da amostra da matria prima e transfira quantitativamente para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Dissolva com 40 mL de cido actico e 5 mL de acetato de mercrio a 6% em cido actico. Se necessrio, aquea em banho-maria at completar a dissoluo. Resfrie e titule com cido perclrico 0,1 M, usando como indicador violeta cristal. Faa um branco com procedimento idntico ao exposto, mas sem a amostra. Clculo Calcule o teor em porcentagem de vitamina B6 na matria prima analisada, considerando que cada mL de HClO4 gasto na titulao equivale a 20,56 mg de vitamina B6 (C8H11NO3. HCl). Nota: nas matrias primas, o teor de vitamina B6 dever ser no mnimo 98% e no mximo 100,5%, aps dessecao em estufa a vcuo com slica gel indicadora de umidade. Referncia bibliogrfica FARMACOPIA BRASILEIRA. 3. ed. So Paulo: Organizao Andrei Editora S.A., 1977. p. 323. 364/IV Determinao de vitamina C com iodato de potssio Este mtodo aplicado para a determinao de vitamina C ou cido L-ascrbico, em alimentos in natura ou enriquecidos, quando a quantidade da referida vitamina for maior que 5 mg e baseia-se na oxidao do cido ascrbico pelo iodato de potssio.
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Tabela de Converso
1,0 g de cido ascrbico 1,0 g de ascorbato de sdio 1,0 UI (Unidade Internacional) 1,214 g de ascorbato de sdio 0,889 g de cido ascrbico 0,05 mg de cido ascrbico

Material Papel de filtro qualitativo, dessecador, estufa, balana analtica, bqueres de 50 e 250 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, pipetas graduadas de 1 e 10 mL, pipeta volumtrica de 10 mL, buretas de 10 e 25 mL, bales volumtricos de 100 e 1000 mL, funil de vidro, basto de vidro e proveta de 50 mL. Reagentes Soluo de cido sulfrico a 20% v/v Soluo de iodeto de potssio a 10%, m/v Soluo de amido a 1%, m/v Soluo de iodato de potssio 0,02 M Seque 5 g de iodato de potssio em estufa a 110oC e esfrie. Pese 3,5668 g, transfira para um balo volumtrico de 1000 mL e complete com gua (1 mL iodato de potssio 0,02 M = 8,806 mg de cido ascrbico). Soluo-padro de iodato de potssio 0,002 M Pipete 10 mL da soluo de iodato de potssio 0,02 M e dilua at 100 mL com gua em balo volumtrico (1 mL de iodato de potssio 0,002 M equivale a 0,8806 mg de cido ascrbico). Procedimento Homogeneze a amostra e pese uma quantidade que contenha ao redor de 5 mg de cido ascrbico. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 300 mL com auxilio de aproximadamente 50 mL de gua. Adicione 10 mL de soluo de cido sulfrico a 20%. Homogeneze e, se necessrio, filtre para outro frasco Erlenmeyer, lavando o filtro com gua e logo aps com 10 mL da soluo de cido sulfrico a 20%. Adicione 1 mL da soluo de iodeto de potssio a 10% e 1 mL da soluo de amido a 1%. Titule com soluo de iodato de potssio at colorao azul. Dependendo da quantidade de vitamina C contida na amostra, utilize soluo de iodato de potssio 0,02 M ou 0,002 M. Analise sempre a amostra em duplicata e faa uma prova em branco. Clculo

V = volume de iodato gasto na titulao

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F = 8,806 ou 0,8806, respectivamente para KIO3 0,02 M ou 0,002 M P = n de g ou mL da amostra Referncias bibliogrficas FARMACOPIA BRASILEIRA. 3. ed. So Paulo: Organizao Andrei Editora S.A., 1977. p. 82-83. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1 Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 393. , 365/IV Determinao de vitamina C pelo mtodo de Tillmans Este mtodo usado para amostras com baixo teor de vitamina C, por exemplo, sucos de frutas. Baseia-se na reduo do corante sal sdico de 2,6-diclorofenol indofenol por uma soluo cida de vitamina C. Material Microbureta, dessecador, balana analtica, papel de filtro, pipetas volumtricas de 1, 4 e 10 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, provetas de 50,100, 200 e 500 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bales volumtricos de 100 e 200 mL, funil de vidro e basto de vidro. Reagentes cido ascrbico Sal sdico do 2,6-diclorofenol indofenol Soluo ndigo carmim a 0,5% Soluo cida Dissolva 15 g de cido metafosfrico em 40 mL de cido actico. Adicione 450 mL de gua, agite e filtre. Soluo-padro de vitamina C Pese 100 mg de vitamina C, previamente dessecada, dissolva em 100 mL de soluo cida em balo volumtrico. Dilua 10 vezes com a mesma soluo cida. Soluo de Tillmans Dissolva 42 mg de bicarbonato de sdio em 50 mL de gua. Adicione 50 mg de 2,6-diclorofenol indofenol. Agite at a dissoluo do corante. Dilua at 200 mL com gua em balo volumtrico e filtre. Padronizao da soluo de Tillmans Em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, pipete 4 mL da soluo diluda da vitamina C e 6 mL da soluo cida. Adicione 50 mL de gua e
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titule com soluo de Tillmans at obter uma colorao ligeiramente rosada e estvel por 15 segundos. Faa um branco, substituindo a soluo de vitamina C por soluo cida e desconte no clculo do fator. Calcule o fator (F) da soluo de Tillmans conforme a relao:

Nota: armazene a soluo de Tillmans em frasco escuro e na geladeira. Toda vez que usar, padronize com soluo recm-preparada de vitamina C. Procedimento Polpas e Sucos de Frutas Esprema a polpa da fruta e filtre atravs de tecido fino, limpo e seco ou em papel de filtro. Utilize, no mnimo, 10 mL do filtrado e adicione igual volume de soluo cida. Agite, filtre e titule uma alquota de 10 mL do filtrado conforme descrito na padronizao da soluo de Tillmans. Faa um branco constitudo de 10 mL da soluo cida e com volume de gua igual ao da soluo do corante gasto na titulao da amostra e titule. Os ons Fe2+, Sn 2+ e Cu2+ presentes na amostra a ser analisada, interferem neste mtodo. Nestes casos, previamente determinao da vitamina C verifique a presena dos interferentes, procedendo como descrito: adicione duas gotas da soluo de azul de metileno 0,05% a 10 mL da mistura 1:1 constituda da amostra de suco e do reagente cido. O desaparecimento da cor do azul de metileno em 5 a 10 segundos indica a presena das substncias interferentes. Pode-se tambm verificar a presena dos ons interferentes, adicionando-se a 10 mL da amostra o mesmo volume da soluo de HCl (1+3) e cinco gotas de ndigo carmim a 0,05%. O desaparecimento da cor em 5-10 segundos indica a presena de substncias redutoras. Clculo

V = volume da soluo de Tillmans gasto na titulao F = fator da soluo de Tillmans A = mL da amostra utilizada

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Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlises de Alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 394-395. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1058-1059 (method 967.21). 366/IV Determinao espectrofotomtrica de vitamina C por reduo de ons cpricos Este mtodo aplicvel para a quantificao de cido ascrbico (vitamina C), em baixas concentraes em alimentos pigmentados, naturais e industrializados. Material Espectrofotmetro UV/VIS com cubetas de 1 cm de espessura, liqidificador, agitador mecnico, balana analtica, bqueres de 50 e 100 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL, provetas de 50 e 100 mL, bales volumtricos de 50 e 100 mL, funil de vidro, provetas de 25 e 50 mL com tampa, frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa e frasco Erlenmeyer de 25 mL. Reagentes Acetato de sdio 2,2-Biquinolena (cuprona) Tolueno lcool isoamlico cido sulfrico cido ascrbico padro Uria Clorofrmio lcool Acetato de cobre (II) mono-hidratado Soluo de cido metafosfrico a 5% m/v Soluo A (Branco) Pipete 2 mL da soluo de cido metafosfrico a 5%, transfira para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua.
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Soluo-tampo de acetato de sdio e cido actico 1 M, pH = 4,6 com 1,5% de uria Pese 13,6 g de acetato de sdio (no caso de se usar o acetato de sdio anidro, pese 8,2 g) e dissolva em 100 mL de gua (soluo I). Mea 6 mL de cido actico, transfira para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua (soluo II). Misture as solues I e II, adicione 3 g de uria e mea o pH. Soluo 2,2-biquinolena (cuprona) a 0,4% em tolueno m/v. Soluo de acetato de cobre (II) a 0,075% em lcool isoamlico m/v Reagente de complexao (Soluo C) Transfira 95 mL da soluo de acetato de cobre II 0,075% em lcool isoamlico para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com 5 mL de soluo de cuprona 0,4% em tolueno. Esta soluo dever ser recm-preparada. Soluo de cido sulfrico 0,05 M. Soluo-padro I de cido ascrbico a 1 mg/mL Pese 0,1 g de cido ascrbico padro e dissolva em um balo de 100 mL com gua. Soluo-padro II a 20 g/mL Transfira 2 mL da soluo de cido ascrbico de concentrao de 1 mg/mL (Padro I) para um balo volumtrico de 100 mL e adicione 2 mL da soluo de cido metafosfrico a 5% e complete o volume com gua. Nota: proteja as solues de cido ascrbico da luz. Procedimentos Amostras lquidas Pese 50 g da amostra, transfira para um liqidificador e adicione 100 mL da soluo de cido metafosfrico a 5%. Agite, na velocidade mxima durante 1 a 3 minutos. Dependendo da concentrao de vitamina C na amostra, transfira 5 a 20 g do extrato para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua. Agite e retire uma alquota de 30 mL da soluo e descarte. Adicione ao balo 5 mL de clorofrmio e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem. Amostras slidas Pese de uma a quatro gramas da amostra e transfira para um frasco Erlenmeyer juntamente com 10 mL da soluo de cido metafosfrico a 5% e 10 mL de cido sulfrico 0,05 M. Agite, em agitador mecnico, por 30 minutos. Transfira 10 g do homogeneizado para um balo volumtrico de 50 mL e complete o volume com gua. Agite e retire 10 mL da soluo e descarte. Adicione 5 mL de clorofrmio ao balo e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem. Pipete 5 mL da camada aquosa lmpida para os tubos de reao (provetas de 25 mL com tampa). Adicione 1 mL da soluo-tampo e 5 mL da soluo complexante. Agite fortemente durante 90
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segundos e deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (lcool isoamlico) e transfira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de lcool e agite levemente. Prepare um branco, pipetando 5 mL da soluo A diretamente no tubo de reao e prossiga como o tratamento da amostra. Leia as absorbncias das amostras a 545 nm, usando o branco como referncia. Nota: todos os solventes utilizados na preparao das solues devem ser de alto grau de pureza, pois os contaminantes de carter redutor interferem na reao. Curva-padro Pipete, diretamente, nos tubos de reao (ou provetas de 25 mL com tampa), alquotas de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 mL da soluo-padro II correspondente, respectivamente, a 10, 20, 30, 40 e 50 g de cido ascrbico e complete at 5 mL com a soluo A. Adicione 1 mL da soluo-tampo e 5 mL da soluo complexante. Agite fortemente durante 90 segundos. Deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (lcool isoamlico) e transfira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de lcool. Agite suavemente. Repita o mesmo procedimento com o branco constitudo de 5 mL da soluo A e sem a adio dos padres. Faa a leitura das absorbncias a 545 nm, usando o branco como referncia. Construa a curva-padro. Clculo

A = g de vitamina C determinada na curva-padro B = gramas de amostra contida nos 5 mL do tubo de reao Referncias bibliogrficas BADOLATO, M.I.C.B.; SABINO, M; LAMARDO, L.C.A.; ANTUNES, J.L.F. Estudo comparativo de mtodos analticos para determinao de cido ascrbico em sucos de frutas naturais e industrializados.Cinc.Tecnol. Aliment.,Campinas, v. 16. n. 3, p. 206-210, 1996. CONTRERAS-GUZMN, E.; STRONG III,F.C.; GUERNELLI, O. Determinao de cido ascrbico (vitamina C), por reduo de ions cpricos. Qumica Nova, v. 7, n. 2, p. 60-64, 1984.

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367/IV Determinao de vitamina E (tocoferis totais) A vitamina E essencialmente uma vitamina lipossolvel e age como antioxidante na estabilizao de lipdios insaturados. Esta vitamina inclui oito compostos que ocorrem naturalmente e esto distribudos em duas classes designadas como tocoferis e tocotrienis com diferentes atividades biolgicas. O d--tocoferol (5,7,8-trimetiltocol) apresenta a maior atividade biolgica e a forma mais disponvel de vitamina E em alimentos. As melhores fontes de vitamina E so os leos de sementes vegetais, tais como: soja, milho, girassol, nozes, gros integrais e o grmen de trigo. Muitos alimentos so adicionados de vitamina E, por exemplo, margarinas, molhos para salada, entre outros. Nos alimentos naturais, este mtodo determina tocoferis totais e nos enriquecidos, o -tocoferol. Baseia-se na reduo de ons ferro (III) e posterior quelao do ferro (II) com --dipiridila para determinao de tocoferis e tocotrienis. Alguns cuidados devem ser tomados nesta anlise, tais como: usar solventes puros e sem contaminao com oxidantes e redutores, observar rigorosamente o tempo de reao e evitar a exposio luz. Previamente reao colorimtrica, a amostra deve ser saponificada para eliminar os lipdios presentes, liberar os tocoferis e hidrolisar os steres de tocoferis. Material Espectrofotmetro UV/VIS ou colormetro (400 a 600 nm) e respectivos tubos, cubetas de vidro (se usar espectrofotmetro), placa aquecedora com agitadores magnticos, balana analtica, cronmetro, cilindro de nitrognio, balo de 250 mL com boca esmerilhada adaptvel a um refrigerante de refluxo, condensador de refluxo, funis de separao mbar de 250 e 500 mL, funis de vidro com 5 cm de dimetro, bales volumtricos mbar de 25, 50 ou 100 mL, provetas de 50 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL, bastes de vidro e papel de filtro Whatman n 4. Reagentes lcool, isento de substncias oxidantes ter de petrleo (30-60)C Soluo alcolica de cloreto de ferro III a 0,25% m/v (recm-preparada) Soluo alcolica de --dipiridila a 0,6% m/v Soluo de EDTA a 0,35% m/v Soluo de fenolftalena cido piroglico Hidrxido de potssio em lentilhas Sulfato de sdio anidro dl--Tocoferol lcool absoluto
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Soluo-padro de dl--tocoferol Pese 100 mg de dl--tocoferol, transfira quantitativamente para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com lcool absoluto. Retire uma alquota e dilua em lcool absoluto para se obter uma concentrao de 80 g/ mL. Conserve esta soluo sob refrigerao a 5C. Determine a absorbncia a 292 nm (mxima absoro) e calcule a concentrao de vitamina E com a frmula:

A = Absorbncia P = massa em gramas da amostra em 100 mL de etanol Soluo alcolica de cloreto de ferro III 0,25% m/v Soluo alcolica de -dipiridila 0,6% m/v. Armazene esta soluo em frasco mbar ou opaco, a 5C. Procedimentos Alimentos slidos, raes e premix devem ser homogeneizados e armazenados em local com baixa umidade e sob a proteo da luz. A amostras lquidas devem ser conservadas sob refrigerao temperatura menor que 8C, em frasco hermtico. Antes de iniciar a anlise, deixe estabilizar temperatura ambiente. As gorduras necessitam de aquecimento prvio e homogeneizao, antes da retirada da amostra para anlise. Saponificao da amostra Pese diretamente em um balo de 250 mL com boca esmerilhada, uma quantidade de amostra que contenha de 1 a 10 mg de vitamina E. Adicione 50 mL de lcool e 100 mg de cido piroglico. Aquea com refluxo em placa aquecedora, sob agitao, por 20 minutos. Aps 1 minuto de aquecimento, adicione, pelo condensador, 1 g de pastilhas de hidrxido de potssio (uma pastilha por vez). Depois de 20 minutos de refluxo, esfrie em banho de gelo e lave o aparelho de refluxo com pequenas quantidades de gua. Transfira a amostra saponificada quantitativamente para um funil de separao mbar de 250 mL e extraia a vitamina E com duas pores consecutivas de 30 e 20 mL ou trs de 40, 30 e 20 mL. Transfira quantitativamente com gua, os extratos etreos para um funil de separao de cor mbar de 500 mL. Lave os extratos etreos com alquotas de 50 mL de gua, agitando suavemente, at que a fase aquosa no apresente mais colorao rsea pela adio de algumas gotas de soluo alcolica de fenolftalena. Filtre, em funil contendo sulfato de sdio anidro, para balo volumtrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com ter de petrleo. Evapore at a secura, sob nitrognio, o solvente
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de um volume do extrato etreo que contenha entre 10 e 100 g de vitamina E. Dissolva o resduo em 7 mL de lcool, ao abrigo da luz. Adicione 1 mL de --dipiridila e 1 mL de soluo de cloreto de ferro III. Cronometre 2 minutos e 30 segundos e adicione 1 mL da soluo de EDTA. Espere mais 2 minutos e 30 segundos e determine a absorbncia a 520 nm. Acerte previamente o 100% de transmitncia do aparelho com um branco preparado com os referidos reagentes e nas mesmas propores. Determine a quantidade de vitamina E correspondente, usando a curva-padro. Curva-padro Pipete, em tubos do colormetro, volumes da soluo-padro de -tocoferol que contenham em cada tubo, aproximadamente de 20-100 g de -tocoferol, em incrementos crescentes de 20 g. Adicione a cada tubo 1 mL da soluo alcolica de -dipiridila e uma quantidade de lcool tal que atinja o volume total da mistura de 7 mL. Proteja os tubos da luz e adicione em cada um deles 1 mL da soluo de cloreto de ferro III. Espere 2 minutos e 30 segundos e leia a absorbncia no colormetro ou no espectrofotmetro, utilizando o comprimento de onda 520 nm. Acerte o 100% da transmitncia do aparelho com o branco. Clculo Determine a quantidade de vitamina E correspondente usando a curva-padro estabelecida. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlises de Alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 395-396. 368/IV Determinao de vitamina E em matria-prima Material Espectrofotmetro UV/VIS, placa aquecedora com agitao, balana analtica, cilindro de nitrognio, balo de 250 mL com boca esmerilhada adaptvel a um refrigerante de refluxo, condensador de refluxo, funis de separao mbar de 250 e 500 mL, funis de vidro com 5 cm de dimetro, bales volumtricos mbar de 25, 50 ou 100 mL, provetas de 50 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL e papel de filtro Whatman n 1. Reagentes lcool isento de substncias oxidantes ter de petrleo (30-60)C
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Hidrxido de potssio em lentilhas Sulfato de sdio anidro Procedimento Pese 0,1 g da amostra e saponifique conforme descrito no mtodo 367/ IV. Extraia a vitamina com trs pores consecutivas de 40, 30 e 30 mL de ter de petrleo. Lave os extratos com gua at reao incolor pela adio de algumas gotas do indicador fenolftalena. Filtre, em funil com papel de filtro contendo sulfato de sdio anidro, transfira para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com ter de petrleo. Tome uma alquota e evapore o ter de petrleo sob nitrognio. Dissolva o resduo em lcool e transfira quantitativamente para um balo volumtrico e complete o volume com o mesmo solvente. Determine a absorbncia da amostra no comprimento de onda 292 ou 289 nm, conforme o mximo de absoro no espectro obtido. Clculos Para absorbncia mxima a 292 nm:

Para absorbncia mxima a 289 nm:

L = leitura da absorbncia P = massa em gramas da amostra Referncias bibliogrficas BALL, G.M.F. Fat-soluble assays in food analysis. A Comprehensive Review. London: Elsevier Applied Science. 1988. 326 p. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1071-1074 (method 971.30). 369/IV Determinao de niacina e nicotinamida A niacina, tambm denominada de cido nicotnico, vitamina PP ou vitamina B3, uma das vitaminas importantes do complexo B para a nutrio humana e animal. A
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niacina faz parte de duas coenzimas conhecidas, a coenzima I e a coenzima II, que so essenciais para um grande nmero de sistemas enzimticos. A nicotinamida, amida do cido nicotnico, tambm biologicamente ativa. Essas vitaminas so encontradas em carnes, pescados, leveduras e cereais. Nos produtos naturais, a niacina est ligada a outros compostos qumicos, havendo a necessidade de ser liberada por hidrlise qumica ou enzimtica, antes da determinao analtica. Este mtodo baseia-se na reao entre a niacina e o bromocianognio (CNBr) , resultando um composto pirindio que em contato com o cido sulfanlico, forma um complexo amarelo com mximo de absoro em 450 ou 470 nm. Material Autoclave, chapa eltrica, espectrofotmetro ou colormetro, balana analtica, frascos Erlenmeyer de 50 e 250 mL com tampa, pipetas de 1, 2, 5, 10 e 20 mL, bales volumtricos de 50, 100 e 200 mL, bqueres de 250 e 400 mL, basto de vidro e almofariz com pistilo. Reagentes cido nicotnico padro Hidrogenofosfato de sdio (Na2HPO4. 7 H2O) Diidrogenofosfato de potssio (KH2PO4) Cianeto de potssio Soluo saturada de bromo cido sulfanlico Hidrxido de amnio cido clordrico cido sulfrico lcool Hidrxido de sdio Hidrxido de clcio Sulfato de amnio Soluo de cido sulfrico 0,05 M Soluo de cianeto de potssio a 5% m/v Soluo-estoque de cido nicotnico Dissolva 50 mg de cido nicotnico, padro de referncia, previamente seco e guardado no escuro em dessecador sobre pentxido de fsforo, em lcool a 25% e dilua at 500 mL. Guarde em geladeira. 1 mL desta soluo contm 100 g de cido nicotnico.
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Soluo-padro I de cido nicotnico a 10 g /mL Separe uma pequena poro da soluo-estoque e deixe atingir a temperatura ambiente. Dilua 10 mL desta soluo at 100 mL com gua. Soluo-padro II de cido nicotnico a 4 g /mL Transfira uma pequena poro da soluo-estoque e deixe atingir a temperatura ambiente. Dilua 2 mL desta soluo at 50 mL com gua. Soluo de hidrxido de amnio diluda Dilua 5 mL de NH4OH a 250 mL com gua. Soluo de cido clordrico diludo Dilua 1 mL de cido clordrico em 5 mL de gua. Soluo-tampo de fosfato (pH = 8) Dissolva 60 g de hidrogenofosfato de sdio e 10 g de diidrogenofosfato de potssio em gua morna e dilua at 200 mL. Soluo saturada de bromo Misture, em capela qumica, 25 g de bromo com 284 mL de gua fria. Agite e use no dia seguinte. Guarde a soluo na geladeira. Soluo de bromocianognio a 10% Coloque aproximadamente 30 mL da soluo saturada de bromo em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Junte, gota a gota, com uma bureta, soluo de cianeto de potssio a 5% at desaparecimento da cor amarela. Prepare esta soluo em capela qumica. Notas Alternativamente, aquea 370 mL de gua a 40C e adicione 40 g de bromocianognio (disponvel comercialmente). Agite at dissolver, esfrie e dilua a 400 mL. Guarde em refrigerador com a informao sobre a toxicidade deste reagente. O cianeto de potssio e o bromocianognio so reagentes extremamente txicos; trabalhe na capela, com luvas e mscara. Soluo de cido sulfanlico a 10% Adicione hidrxido de amnio em pores de 1 mL a uma mistura de 20 g de cido sulfanlico e 170 mL de gua, at que o cido sulfanlico se dissolva. Ajuste o pH a 4,5 com cido clordrico 1+5, usando papel indicador universal de pH. Dilua a 200 mL com gua. A soluo dever ficar quase incolor. Use esta soluo em preparaes farmacuticas, raes e alimentos no cereais. Soluo de cido sulfanlico a 55% Adicione 27 mL de gua e 27 mL de amnia a 55 g de cido sulfanlico. Agite at dissoluo, amornando se necessrio. Ajuste o pH a 7 com
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algumas gotas de amnia ou de cido clordrico 5 M, usando papel indicador universal e dilua at 100 mL. Guarde no escuro. Use esta soluo em produtos cereais (trigo, milho, arroz, aveia). Procedimento Ajuste o colormetro/espectrofotmetro para 100% de transmitncia e/ ou zero de absorbncia a 450 nm para preparados farmacuticos, raes e alimentos no cereais ou 470 nm para produtos cereais, usando um branco preparado simultaneamente com os reagentes nas mesmas propores das amostras. Raes e alimentos no cereais Pese ao redor de 28,35 g da amostra em frasco Erlenmeyer, adicione 200 mL de cido sulfrico 0,05 M. Misture e aquea durante 30 minutos, em autoclave a 15 libras de presso. Esfrie, ajuste o pH a 4,5 com hidrxido de sdio 10 M, usando como indicador verde de bromocresol, dilua at 250 mL com gua e filtre. Pese 17 g de sulfato de amnio e transfira para um balo volumtrico de 50 mL, pipete uma alquota de 40 mL da soluo da amostra, dilua at a marca com gua e agite vigorosamente. Filtre, misture bem e use uma alquota de 1 mL para desenvolvimento da cor. Em caso de amostras contendo 16 mg de cido nicotnico por 454 g, a soluo final contm 3,2 g de cido nicotnico por mL. Pipete uma alquota de 40 mL da soluopadro II de cido nicotnico (4 g/mL) sobre 17 g de sulfato de amnio em um balo volumtrico de 50 mL e dilua com gua. Este padro contm 3,2 g/mL. Proceda a reao como para alimentos no cereais e raes. Produtos cereais (aveia, milho, trigo, arroz) Faa um branco dos reagentes e cinco diluies da soluo-padro I como descrito a seguir: coloque 1,5 g de hidrxido de clcio em seis frascos Erlenmeyer de 250 mL, pipete respectivamente, 0, 5, 10, 15, 20 e 25 mL da soluo padro I (10 g/mL). Pese, cuidadosamente cerca de 2,5 g da amostra contendo aproximadamente 100 g de cido nicotnico e transfira para outro frasco contendo 1,5 g de hidrxido de clcio. Adicione gua em todos os frascos em torno de 90 mL, autoclave durante 2 horas sob presso de 15 libras. Misture bem enquanto ainda quente. Esfrie, transfira para bales volumtricos de 100 mL e dilua. Se necessrio, guarde em geladeira por alguns dias. Transfira aproximadamente 50 mL do sobrenadante de cada balo para tubos de centrfuga, coloque em banho de gelo por 15 minutos ou em geladeira por 2 horas. Centrifugue durante 15 minutos e pipete 20 mL do sobrenadante de cada tubo para tubos de centrfuga contendo 8 g de sulfato de amnio e 2 mL de soluo-tampo de fosfato. Agite para dissolver e aquea a (55-60)C. Centrifugue por mais cinco minutos. Filtre em papel de filtro qualitativo, refiltrando, se necessrio, at obter soluo incolor. Proceda a reao como o descrito para produtos cereais.

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Procedimento analtico para alimentos no cereais e raes Adicione soluo de cido sulfanlico, soluo de bromocianognio, em capela, com buretas ou pipetas automticas. O cianeto de potssio e o bromocianognio so reagentes extremamente txicos. Trabalhe na capela, com luvas e mscara. Use a soluo-padro II de cido nicotnico (4 g/mL) e prepare os tubos como segue:

Branco do padro 1,0 mL da soluo-padro 5,0 mL de gua 0,5 mL de hidr. de amnio diludo 2,0 mL de cido sulfanlico a 10% 0,5 mL de ac. clordrico diludo Branco da amostra 1,0 mL da soluo da amostra 5,0 mL de gua 0,5 mL de hidr. de amnio diludo 2,0 mL de cido sulfanlico a 10% 0,5 mL de ac. clordrico diludo

Soluo-padro 1,0 mL da soluo-padro 5,0 mL de bromocianognio 0,5 mL de hidr. de amnio diludo 2,0 mL de cido sulfanlico a 10% 0,5 mL de gua Soluo da amostra 1,0 mL da soluo da amostra 5,0 mL de bromocianognio 0,5 mL de hidr. de amnio diludo 2,0 mL de cido sulfanlico a 10% 0,5 mL gua

Prepare, separadamente, um branco para cada amostra. Pipete a soluo-padro e a soluo da amostra para os respectivos tubos (no caso do branco do padro ou do branco da amostra, adicione gua). Adicione todas as solues subseqentes num s tubo e faa a leitura da cor antes de passar para o outro tubo, comeando com o branco padro e a soluo-padro; agite o tubo no vortex para homogeneizar o lquido, adicione cido sulfanlico e agite novamente. Imediatamente adicione 0,5 mL de cido clordrico diludo e misture. Coloque no colormetro e, com o branco, ajuste o zero de absoro do aparelho, usando o comprimento de onda 450 nm, dentro de aproximadamente 30 segundos aps a adio da soluo de cido sulfanlico. Leia imediatamente a absorbncia da soluopadro no comprimento de onda de 450 nm (a cor alcana o mximo de intensidade em 1 minuto e, aps a adio do cido sulfanlico, permanece no mximo por 2 minutos). A seguir, leia a absorbncia de cada amostra com o respectivo branco, usando este para fixar o zero de absoro do aparelho. A concentrao de cido nicotnico proporcional absoro, se o padro e a soluo da amostra tiverem aproximadamente a mesma concentrao.

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Procedimento analtico para cereais Selecione um tubo adicional para o branco do padro, para cada srie de determinaes, mas no adicione bromocianognio. Prepare os tubos da seguinte maneira:

Branco dos reagentes 5 mL de gua (em tubos em p no banho de gelo) 10 mL de bromocianognio e vedando o tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de cido sulfanlico a 55%

Branco do padro 5 mL de soluo-padro 10 mL de gua Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de cido sulfanlico a 55% Soluo-padro 5 mL de padro 10 mL de bromocianognio e vedando tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de cido sulfanlico a 55%

Branco da amostra 5 mL de soluo da amostra 10 mL de gua Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de cido sulfanlico a 55% Soluo da amostra 5 mL de soluo da amostra 10 mL de bromocianognio e vedando tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de cido sulfanlico a 55%

Com o comprimento de onda a 470 nm, fixe a 100% de transmitncia, com o branco dos padres e leia a transmitncia dos outros tubos, de 12 a 15 minutos aps a adio do cido sulfanlico. Lance em grfico a absoro dos padres, menos a do branco dos reagentes, contra a concentrao do cido nicotnico, em g/mL. Neste grfico, determine a concentrao correspondente absorbncia da amostra, tendo esta leitura sido feita aps a fixao dos 100% de transmitncia do aparelho com o branco da amostra.

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Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 397-401. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1054-1057 (method 961.14). STROHECKER, R.; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Traduo de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p. 189-201. Ttulo Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden.

Colaboradores Myrna Sabino, Leda C. A. Lamardo, Everaldo de Cerqueira, Sandra A. Navas e Emiko I. Inomata
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