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Qumica Bioinorgnica 2012/2013

MEDIO DO POTENCIAL REDOX DO CITOCROMO C POR ESPECTROFOTOMETRIA DE UV/VISVEL


Henrique Fernandes e Joo Rodrigues Data da realizao: 18 de maro de 2013; Data do relatrio 20 de maro de 2013

RESUMO
Com este trabalho pretende-se medir o potencial de oxidao-reduo do citocromo c (cyt c), uma protena globular de pequenas dimenses e que se encontra presente nas mitocndrias, desempenhando um papel fundamental no transporte de electres, fora motriz da cadeia respiratria. Esta protena, constituda por uma cadeia polipeptdica de 104 resduos de aminocidos, permite o transporte de electres atravs de oxidaes e redues do io de ferro do seu grupo prosttico. O espectro UV/Vis da protena na sua forma oxidada, cyt c Fe!! , diferente do da forma reduzida, cyt c Fe!! , verificando-se nesta ltima forma uma banda de absoro adicional, a 550 nm. Atravs da utilizao dos ies hexacianoferrato (II) e hexacianoferrato (III) - ( )! !! e ( )! !! , respectivamente determina-se o potencial redox do cyt c, atravs da adio de alquotas de soluo ( )! !! /cyt c a uma soluo ( )! !! /cyt c.

REAGENTES E INSTRUMENTAO REAGENTES


Hexacianoferrato (II) de potssio (K4[Fe(CN)6]) 99% da Carlos ERBA e hexacianoferrato (III) de potssio (K3[Fe(CN)6]) 99,0% da Sigma-Aldrich para a preparao de 5,00 cm3 de duas solues com igual concentrao, 100 mmol dm-3. Citocromo c extrado do corao de cavalo e conservado no congelador em tampo fosfato 50 mmol dm-3 e pH 7. Ditionito de sdio (Na2O4S2) quimicamente puro da Panreac.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Como resultados da preparao de trs solues com meios diferentes obtiveramse trs espectros de absorvncia, de 300,0 a 800,0 nm, correspondente a soluo de citocromo c em soluo com hexacianoferrato (III); soluo aquosa de ditionito de sdio, um agente redutor; e hexacianoferrato (II). Os espectros esto apresentados na Figura 1.
4,000 3,500 3,000 2,500 2,000

Espetros de absorvncia de solues com citocromo c em diferentes meios

EQUIPAMENTOS
Balana analtica AG204 Mettler Toledo com um alcance de 210g e uma incerteza de 0,1mg. Espectrofotmetro UV/Visvel Spectrophotometer 8500 UV-Vis com recolha de dados por computador.

1,500 1,000 0,500 0,000 -0,500 300,0

400,0

500,0

/nm

600,0

700,0

800,0

Figura 1 Espectros de absorvncia para a soluo de citocromo c e hexacianoferrato (III)

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

Qumica Bioinorgnica 2012/2013


(tubo 1), curva a vermelho; soluo de citocromo c e ditionito de sdio (tubo 2), curva a verde; soluo de citocromo c e hexacianoferrato (II) (tubo 3), curva a azul. Os valores obtidos com recurso ao espectrofotmetro encontram-se sumariados em tabela anexo a este documento.

De seguida (Figura 2) apresenta-se uma ampliao do grfico apresentado na Figura 1, de modo a evidenciar o comportamento espectrofotomtrico em torno do comprimento de onda alvo, 550,0nm.

1,000 0,900 0,800 0,700 0,600

Espetros de absorvncia de solues com citocromo c em diferentes meios

0,64946 0,573979

0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 450,0

0,228378

470,0

490,0

510,0

530,0

550,0

570,0

590,0

/nm
Figura 2 Pormenor do espectro apresentado na Figura 1 para o intervalo de comprimentos de onda de 450,0nm a 600,0nm. De igual forma, a curva a vermelho corresponde soluo de cyt c e hexacianoferrato (III); a curva a verde, a soluo de cyt c e ditionito de sdio; e a curva a azul, a soluo de cyt c e hexacianoferrato (II). Os valores apresentados no grfico correspondem s absorvncias a 550,0nm para cada um dos tubos.

No que diz respeito soluo onde foi adicionado o ditionito de sdio ao cyt c, num ensaio subsequente procedeu-se adio de pequenas pores de ditionito

de sdio e mediu-se a absorvncia da soluo, aps devida homogeneizao, a 550,0nm. Os resultados obtidos encontramse sumariados na Tabela 1.

Tabela 1 Valores de absorvncia da soluo do tubo 2 (cyt c e ditionito de sdio) aps sucessivas adies de pequenas pores de ditionito de sdio slido (uma pequena poro corresponde a uma microsptula de ditionito de sdio).

Pores adicionados A550,0

0 0,7042

1 0,9292

2 0,9584

3 1,0325

4 1,2274

5 0,9723

6 1,1007

Aps a ltima adio de ditionito de sdio, voltou a traar-se o espectro de Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

absorvncia par a anova soluo. O espectro em causa est apresentado na

Qumica Bioinorgnica 2012/2013 Figura 3 onde comparado com o espectro respectivo com apenas uma adio de ditionito de sdio.

Espetro de absrovncia do citocromo c em solues aquosas de ditionito de sdio


2,500

2,000

1,500

A
1,000

0,500

0,000 300,0

350,0

400,0

450,0

500,0

/nm

550,0

600,0

650,0

700,0

750,0

800,0

Figura 3 Espectros de absorvncia das solues de cyt c em soluo aquosa de ditionito de sdio de baixa concentrao (curva a verde); e da mesma soluo com concentrao mais elevada de ditionito de sdio (curva a laranja).

Por fim, procedeu-se adio de volumes sucessivos da soluo do tubo 1 (cyt c e hexacianoferrato (III)) ao tubo 3 (cyt c e hexacianoferrato (II)). As adies foram de 7,5 L para os primeiros 6 ensaios, sendo

os ltimos e 3 de adies de 15 L. Aps a adio da soluo do tubo 1 ao tubo 3 era medida a absorvncia a 550,0nm para a soluo resultante. Os valores obtidos esto sumariados na Tabela 2.

Tabela 2 Valores da absorvncia da soluo do tubo 3 por adio de um certo volume da soluo do tubo 1, sendo que as adies eram sucessivas e as medies eram feitas aps a adio de um certo volume. Apresenta tambm os valores para as fraces de cyt c (Fe2+) e (Fe3+), concentraes de [Fe(CN)6]4- e [Fe(CN)6]3-, assim como os logaritmos das razes das fraces de cyt c (Fe2+) e (Fe3+) e [Fe(CN)6]4- e [Fe(CN)6]3-.
Vadicionado do tubo 1 (L) A550,0 2+ cyt c (Fe ) 3+ cyt c (Fe ) (Fe!! ) log (Fe!! ) 4- |[Fe(CN)6] | -3 (mol dm ) 3- 4 |[Fe(CN)6] |X10 -3 (mol dm ) log [ [
! ! !!

7,5
0,4572 0,543 0,457 0,076 0,00998 0,249 2,60

7,5
0,3932 0,391 0,609 -0,192 0,00995 0,498 2,30

7,5
0,3572 0,306 0,694 -0,356 0,00993 0,744 2,12

7,5
0,3380 0,260 0,740 -0,453 0,00990 0,990 2,00

7,5
0,3254 0,231 0,769 -0,524 0,00988 1,23 1,90

7,5
0,3214 0,221 0,779 -0,547 0,00985 1,48 1,82

15
0,3067 0,186 0,814 -0,641 0,00980 1,96 1,70

15
0,3028 0,177 0,823 -0,668 0,00976 2,44 1,60

15
0,3029 0,177 0,823 -0,667 0,00971 2,91 1,52

!! |

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

Qumica Bioinorgnica 2012/2013 A frao de cyt c (Fe2+) foi calculada com base nas absorvncias medidas para as amostras (A550,0) e as absorvncias a 550,0nm para o tubo 1 e 2 recorrendo seguinte expresso !! =
!!!",! !!!!" !"#$ ! !!!" !"#$ ! !!!!" !"#$ !

(1)

onde a A550,0 corresponde aos valores apresentados na Tabela 2 e os valores de A550 tubo 1 e A550 tubo 2 podem ser lidos no espectro de absorvncia apresentado na Figura 2. No que diz respeito ao valor da frao de cyt c (Fe3+) este calculado por diferena em relao frao de cyt c (Fe2+), ou seja !! = 1 !!
0,200 0,100

As concentraes de hexacianoferrato (II) e hexacianoferrato (III) so calculadas tendo em conta os fatores de diluio a partir da soluo inicial de concentrao 0,100 mol dm-3. Sendo que ocorre uma primeira diluio na preparao da soluo do tubo 1, e sucessivas diluies aquando da adio dos respectivos volumes do tubo 1 para o tubo 3. So aplicados os logaritmos de base 10 para as razes entre as fraes de !! e !! , bem como para as concentraes de [Fe(CN)6]4- e [Fe(CN)6]3-. Todos os clculos foram efectuados recorrendo ao Microsoft Excel Mac 2011 e esto disponveis em folha de clculo anexo.

(2)

log[cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)]

0,000 -0,100 -0,200 -0,300 -0,400 -0,500 -0,600 -0,700 -0,800 1,50

log[cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)] = 0,756 log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-} - 1,93 x0=2,55 R = 0,9874

1,70

1,90

2,10

2,30

2,50

2,70

log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-}
Figura 4 Representao grfica de log [cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)] em funo de log{[Fe(CN)6]4/[Fe(CN)6]3-}. Os pontos assinalados a verde correspondem a todos os pontos obtidos experimentalmente, contudo apenas os pontos assinalados a vermelho foram considerados para o traado da regresso linear dado o afastamento do nico ponto no considerado para o efeito. Para alm da equao da reta e quadrado do coeficiente de correlao tambm est calculado o valor da intercepo da reta com o eixo das abcissas, valor calculado ao igualar log[cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)] a zero.

A partir da regresso linear obtida e representada na Figura 4, possvel obter o valor de log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-} Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

como descrito na legenda da Figura 4. Este valor, 2,55, permite calcular o valor do

Qumica Bioinorgnica 2012/2013 potencial da semirreao dos hexacianoferratos atravs da expresso = ! 2,303
!" !"

bandas de absoro, sendo uma delas a banda a 550 nm. Atravs da equao (3), dos valores exibidos na tabela 2, e da regresso linear de log [cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)] em funo de
log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-}, obteve-se um valor do potencial redox do citocromo c de 279 mV,

log!"

| !" !" ! !! | | !" !" ! !! |

(3)

onde E0 igual a 430 mV e o valor de 2,303


!" !"

= 59,16 mV para

as

condies

padro. Por substituio do valor obtido experimentalmente obtm-se que o potencial da semirreao dos ferratos 279 mV, sendo este o potencial de reduo do cyt c.

CONCLUSES
Relativamente aos grficos das figuras 1 e 2 verifica-se que apenas as solues correspondentes aos tubos 2 e 3 apresentam um pico de absorvncia a 550 nm, caracterstico da forma reduzida do cyt, que no observado no espectro correspondente ao tubo 1, pelo que se conclui que, na presena de hexacianoferrato (III), o citocromo se encontra oxidado, enquanto que, na presena de hexacianoferrato (II), este se encontra reduzido. A presena deste pico de absoro pode ser explicada pela teoria de campo de ligado: dado que o io de ferro se encontra coordenado por quatro tomos de azoto da porfirina substituda, de campo intermdio, e por um azoto de uma histidina e um enxofre de uma metionina, ambos de campo forte, este apresenta um carcter de spin alto. Enquanto que a forma oxidada apresenta o io central do grupo prosttico sob a forma !! , este possui 5 eletres nas orbitais d, um em cada uma delas, pelo que no h bandas de absoro permitidas por multiplicidade de spin, da no apresentar a banda a 550 nm. Para o caso da forma reduzida, o io apresenta-se sob a forma !! , com 6 eletres nas orbitais d, 2 nas ! , e 4 nas !! , trs com o mesmo spin e um com spin contrrio, levando existncia de diferentes microestados com a mesma multiplicidade de spin, o que origina Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

o que ligeiramente superior ao intervalo de valores apresentado na literatura (256266 mV). Esta variao pode ser justificada pelo facto de estarmos a assumir que estivemos a trabalhar em condies padro, e pelo facto de no termos controlado a temperatura das solues, sendo esta um fator importante na equao de Nernst. Para minimizar esses efeitos, as solues deviam ter sido termostatizadas e as absorvncias deviam ter sido medidas num espectrofotmetro que possusse sistema de controlo de temperatura. No que diz respeito aos espectros representados na Figura 2, verifica-se uma maior absorvncia a 550,0nm para a soluo com hexacianoferrato (II) do que com hexacionoferrato (III), isto significa que o cyt c absorve mais radiao a 550,0nm quando se encontra na forma reduzida, pois o hexacianoferrato (II) tende e reduzir o cyt c e o hexacioneferrato (III) tende a oxidar o cyt c. Esta evidncia constatada pelo ensaio onde se recorre ao ditionito de sdio, um redutor. Este, quando adicionado ao cyt c reduz o cyt c o que leva a um aumento da absorvncia da soluo, sobretudo a 550,0 nm.

BIBLIOGRAFIA
Daveport, H. E. e Hill, R., Proc. R. Soc. London Ser. B 1952, 139, 327-347 Craig, D.B. e Nichols, E. R., J. Chem, Ed. 2006, 83, 1325-1326 Wallace, C. J. A.; Proudfoot, A. E. I. Biochem. J. 1987, 245, 773-779.