LUCAS MIYAKE OKUMURA

INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS DE Uncaria tomentosa Will DC.

CURITIBA 2008

LUCAS MIYAKE OKUMURA

INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS DE Uncaria tomentosa Will DC.

Projeto de monografia apresentado ao Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran, como requisito do grupo PET Farmcia. Orientadora: Professora Dra Juliana Bello Baron Maurer. Co-orientadora: Profa Dra Fabiola R. Stevan Hancke (Universidade Positivo) Colaboradores: Acad. Andreia Beraldo (Cincias Biolgicas - UPPR) Enf. Snia Hutul e Dr Rui Cepil (Programa de Fitoterapia de Londrina) Profa Dra Iara Taborda de Messias (Dep Patologia Mdica - UFPR) Profa Fernanda Bovo (Dep de Farmcia - UNICENTRO)

CURITIBA 2008

SUMRIO 1 2 3 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.4 4 5 6 6.1 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.2.1 6.2.2.2 6.2.2.3 TEMA............................................................................................................. INTRODUO............................................................................................... REVISO BIBLIOGRFICA......................................................................... ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO, PROPRIEDADES QUMICAS E FUNES BIOLGICAS DA AGP............................................................................................................... MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA......................................... Consideraes gerais sobre o sistema imune............................................... Macrfagos.................................................................................................... Sistema complemento................................................................................... PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS............................................................................... MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa Will DC. (UNHA DE GATO)...................................................................................................... OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS....................................................... JUSTIFICATIVA............................................................................................ MATERIAIS E MTODOS............................................................................. MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE.............................................. EXPERIMENTOS BIOLGICOS................................................................... 1 2 3 3 4 5 5 7 8 10 11 12 13 13 13 14 14 14 15 15 16 17 17 17 18 18 19 19 20 22 23 24 29

Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal........................................ Modelos experimentais utilizando macrfagos.............................................. Obteno de macrfagos peritoneais............................................................ Produo de xido ntrico.............................................................................. Determinao da viabilidade celular e da contagem de clulas (Azul de Tripan e MTT)................................................................................................ 6.2.2.4 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz..................... 6.2.2.5 Reteno de lisossomos................................................................................ 6.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento........................... 6.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho........................ 6.2.3.2 Avaliao da via alternativa........................................................................... 6.2.3.3 Avaliao da via clssica............................................................................... 6.3 Delineamento experimental e anlise estatstica..................................... 6.4 Aspectos bioticos e de biosegurana..................................................... Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa Will DC. no 6.5 Programa de Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais .................................................................. 7 CRONOGRAMA............................................................................................ 8 RECURSOS................................................................................................... REFERNCIAS............................................................................................................. ANEXO..........................................................................................................................

1 TEMA

O tema do projeto a ser desenvolvido a investigao das propriedades imunomoduladoras de arabinogalactana-protenas (AGPs), extradas da Uncaria tomentosa DC. (unha de gato), utilizando modelos animais in vitro.

2 INTRODUO Desde os primrdios, os povos antigos j faziam o uso de plantas para curar feridas, doenas e infeces. Porm, na poca nada se sabia devido aos conceitos primitivos sobre farmacologia alm da escassa tecnologia. Por isso, pouco se compreendia sobre as molculas envolvidas nos processos biolgicos, e muito menos sobre a sua estrutura (PAULSEN B. S., 2001). Com o avano da cincia, novos mtodos de pesquisa foram criados e aperfeioados, e hoje, sabe-se que certos constituintes de plantas, como polissacardeos e proteoglicanos, so compostos bio-ativos no organismo. Estas substncias apresentam efeitos biolgicos, como exemplo, a imunomodulao, a qual pode ter como resultado a ativao ou supresso do sistema imune. Mleculas que atuam como moduladores da resposta imunolgica so conhecidos como modificadores da resposta biolgica (MRB). Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria por seus ausentes ou diminudos efeitos colaterais. A avaliao da atividade biofarmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se tornado um promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas. Vrios exemplos de polissacardeos e glicoconjugados vegetais que apresentam efeitos biolgicos como imunomoduladores j foram descritos (DIALLO D. et al., 2000; CLASSEN B. et al., 2005; CLASSEN B., 2007, entre outros). Estes estudos relataram o efeito biolgico imunomodulador, utilizando diferentes sistemas animais, de arabinogalactanas, pectinas e/ou arabinogalactana-protenas (AGPs), obtidas de espcies vegetais com interesse fitoterpico como, por exemplo, Echinaceae purpurea Moench, Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitag., Malva silvestris lus. nivea Priszter, Panax ginseng C. A. Mey, Plantago major L. e Calendula officinalis Hohen .

3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO, PROPRIEDADES QUMICAS E SUAS FUNES BIOLGICAS

Arabinogalactana-proteinas so uma famlia de proteoglicanas complexas, includas no grupo de glicoprotenas vegetais ricas em hidroxiprolina (HRGPs), encontradas em vegetais inferiores e superiores, de vrios grupos taxonmicos (CLARKE et al., 1979). Em plantas superiores, as AGPs ocorrem em folhas, caules, razes, orgos florais, sementes, e em grandes quantidades em troncos de algumas angiospermas e gimnospermas (FINCHER et al., 1983). As AGPs esto presentes em membranas celulares, na matriz extracelular e em gomas de exsudatos. Culturas de clulas derivadas de diferentes tecidos vegetais produzem AGPs e as secretam no meio de cultura (FINCHER et al., 1983; KREUGER & VAN HOLST, 1993). Do ponto de vista estrutural, a poro glicdica (90% m/m) das AGPs apresenta-se constituda, principalmente, de D-galactopiranose e L-arabinofuranose. A cadeia principal constituda de unidades de -D-galactopiranose unidas por ligaes do tipo O-3, O-6 e O-3,6, podendo estar substitudas por unidades de Larabinofuranose, podendo tambm apresentar outros monossacardeos menos abundantes, como -L-Arap, -L-Rhap, -D-Glcp e -D-GlcpA, como extremidades terminais no redutoras (FINCHER et al., 1983). Considerando a estrutura qumica da poro glicdica, as AGPs so classificadas como arabinogalactanas tipo , que correspondem as arabino-3-6-galactanas (FINCHER et al., 1983). Com relao poro protica, as AGPs geralmente apresentam menos de 10% (m/m) de contedo protico, o qual , usualmente, rico em hidroxiprolina/prolina (Hyp)/(Pro), alanina (Ala), serina (Ser) e treonina (Thr) (CLARKE et al., 1979).

Tem-se atribudo s AGPs vrias funes como lubrificante, umectante e agente de adeso, baseando-se na sua localizao extracelular e em suas propriedades fsicas e qumicas (CLARKE et al., 1979; FINCHER et al., 1983). Recentemente, tem-se relatado que as AGPs apresentariam vrias funes relacionadas com o crescimento e desenvolvimento vegetal, tanto em nvel vegetativo, como reprodutivo e celular (SERPE & NOTHNAGEL, 1996; MAJEWSKASAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001). Vrios estudos sugerem que as AGPs podem estar envolvidas, por exemplo, na formao de xilema, no crescimento e na germinao do tubo polnico, nos processos de expanso e proliferao celular, no estabelecimento de identidade celular, no controle de embriognese somtica e da morte celular programada (SERPE & NOTHNAGEL, 1996; MAJEWSKA-SAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001; MOTOSE et al., 2004; PETTOLINO et al., 2006).

3.2 MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA

Mleculas que atuam como moduladores da resposta imunolgica so conhecidos como modificadores da resposta biolgica (MRB) (BOHN & BEMILLER, 1995). Os MRB podem atuar, por exemplo, na mediao da atividade de macrfagos, do sistema complemento e nos mecanismos de adeso celular. Esta importante classe de biomoduladores principalmente utilizada como agentes antineoplsicos (BOHN & BEMILLER, 1995). Neste grupo esto includos frmacos que atuam direta ou indiretamente sobre as clulas tumorais. O efeito indireto dos biomoduladores est relacionado com a intensificao da resposta imunolgica a clulas neoplsicas. Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria

por seus ausentes ou diminudos efeitos colaterais. Desta forma, a avaliao da atividade bio-farmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se tornado um promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas (BOHN & BEMILLER, 1995; MORETO et al., 2003).

3.2.1 Consideraes gerais sobre o sistema imune

O sistema imunolgico dividido em dois grandes ramos: o sistema inato e o adaptativo. O sistema inato caracteriza-se por responder aos estmulos de maneira no especfica (ABBAS et al., 2003). Este composto por clulas, como neutrfilos, eosinfilos, basfilos, moncitos, macrfagos e clulas NKs (natural killers), e por fatores solveis, incluindo, o sistema complemento, protenas de fase aguda, e enzimas (ABBAS et al., 2003). O sistema imune adaptativo caracteriza-se por responder ao antgeno de modo especfico, apresentando memria, no qual, se incluem as clulas linfcitos T e B e as imunoglobulinas (ABBAS et al., 2003). Essa diviso didtica e elementos do sistema inato podem agir como efetores do sistema adaptativo. Considerando os objetivos do presente projeto, sero enfatizados aspectos mais relevantes sobre os macrfagos e o sistema complemento.

3.2.2 Macrfagos

Os macrfagos tm um papel crtico na resposta imunolgica, pois, so clulas efetoras importantes para a eliminao de microorganismos, exercendo um papel central como mediadores entre o sistema imune inato e a adquirido. As

principais funes dos macrfagos demonstram que estes estariam envolvidos com o processo inflamatrio, capacidade fagoctica, processamento e apresentao de antgenos, co-ativao de linfcitos T e B, angiognese, processo de cicatrizao, alm da atividade citotxica contra clulas tumorais e microorganismos (ABBAS et al., 2003). O mecanismo microbicida utilizado pelo macrfagos, inclui duas vias oxidativas, NADPH oxidase e oxido ntrico sintase, as quais, respectivamente, esto envolvidas na sntese de nion superxido (O2-) e xido ntrico (NO) (ABBAS et al., 2003). Os macrfagos tambm so capazes de produzir uma variedade de citocinas como as interleucinas (IL), interferon (IFN) e fator de necrose tumoral- (TNF-). Os macrfagos realizam essas funes efetoras somente depois que so ativados por ligantes exgenos (p. ex, microorganismos) ou endgenos (p. ex, citocinas, clulas tumorais). A expresso de uma grande diversidade de molculas de superfcie, ou seja, vrias classes de receptores, capacita os macrfagos em reconhecer uma variedade de ligantes tanto endgenos como exgenos (GORDON, 2002). Vrias classes de receptores j foram identificadas (GORDON, 2002), cada classe apresenta uma determinada especificidade e a interao entre o ligante e o receptor tambm provocar uma resposta especfica. Apesar dos diferentes receptores exercerem funes distintas, o objetivo final culmina na ativao de respostas celulares convergentes. Vrias classes de receptores apresentam especificidade de reconhecimento mediada por carboidratos. Pode-se sugerir que este tipo de especificidade explicaria em parte, o efeito de vrios polissacardeos sobre diferentes aspectos de ativao de macrfagos (SUZUKI et al. 1985; ARINAGA et al. 1992; JOHNSON et al. 1992; ROSS & VETVICKA, 1993; GORDON, 2002). Uma vez que os macrfagos agem como clulas efetoras e mediadoras do sistema imune, estudos visando a aplicao de molculas que modulem o aumento da funo

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macrofgica podem contribuir na teraputica de doenas infecciosas bacterianas e neoplasias (POPOV et al., 1999).

3.2.3 Sistema complemento

O sistema do complemento compreende um grupo de, pelo menos, 18 protenas plasmticas que atuam em conjunto com o sistema imunolgico, na defesa do organismo contra infeces ou invaso por substncias estranhas (ABBAS et al., 2003). A reao do sistema do complemento ocorre em cadeia e completa a defesa organizada pelo sistema imunolgico. Freqentemente, as protenas do

complemento conferem proteo imunitria, at que os anticorpos sejam produzidos; o complemento tambm potencializa os efeitos da resposta dos linfcitos T e das imunoglobulinas. Considerando, principalmente, os eventos de reconhecimento que iniciam a ativao do sistema complemento, este dividido em trs vias, sendo estas a via Clssica, Alternativa e da Lectina (ABBAS et al., 2003). Na via clssica de ativao do complemento, esta ocorre em resposta ligao das

imunoglobulinas IgM ou IgG aos microorganismos invasores. A via alternativa de ativao do complemento corresponde sua ativao pelos microorganismos cuja superfcie tm antgenos protegidos por cpsulas de polissacardeos. Esta via alternativa permite a fagocitose pelos macrfagos, independente da fixao dos anticorpos. Outra via do complemento a via mediada por lectina, que ativada pela ligao de uma protena ligadora de manose, nas superfcies de bactrias e fungos. As trs vias levam ligao covalente de um fragmento particular de um componente do complemento (fragmento C3b de C3) a superfcie do patgeno. Os fragmentos do C3 so tambm opsoninas, molculas que podem ser reconhecidas

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pelos receptores de superfcies dos macrfagos. Os receptores C3R mediam a interao entre os macrfagos e neutrfilos com os patgenos; assim, a opsonizao de um patgeno pelo complemento facilita a fagocitose e a destruio da mesma forma que a opsonizao com anticorpos (ABBAS et al., 2003). As Arabinogalactanas tipo II, pectinas cidas, AGPs obtidas de diferentes plantas de uso medicinal mostraram-se molculas moduladoras do sistema complemento (YAMADA et al., 1985; CLASSEN et al., 2002; THUDE et al., 2006). Desta forma, considerando que o sistema complemento um importante mediador do processo de inflamao, a investigao da atividade biolgica de molculas que possam modular o sistema complemento, mais especificamente, inibir a cascata de ativao deste sistema, torna-se de grande relevncia teraputica para diversas doenas como artrite reumtica e desordens degenerativas.

3.3 PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS

A utilizao de plantas com efeitos medicinais objetivando promover a cura de doenas, vem desde pocas muito antigas. Recentes estudos indicam um aumento no uso de plantas como medicamentos alternativos ou complementares aos industrializados. A crise econmica, o alto custo das medicaes industrializadas, alm dos efeitos colaterais causados pelas drogas sintticas, so alguns fatores que contriburam para o aumento da fitoterapia (SIMES, 1989). considerado fitoterpico toda preparao farmacutica (extratos, tinturas, pomadas e cpsulas) que utiliza como matria-prima parte de plantas, como folhas, caules, razes, flores e sementes, com conhecido efeito farmacolgico. O uso adequado dessas preparaes traz uma srie de benefcios para a sade humana ajudando no

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combate a doenas infecciosas, disfunes metablicas, doenas alrgicas e traumas diversos, entre outros. Associado s suas atividades teraputicas est o seu baixo custo; a grande disponibilidade de matria-prima principalmente nos pases tropicais; e a cultura relacionada ao seu uso. Em relao aos componentes glicdicos presentes em plantas medicinais, vrios estudos tm sugerido que as AGPs apresentam potenciais aplicaes na medicina (PAULSEN, 2001; PETTOLINO et al., 2006). Tm sido descritos vrios estudos relatando diferentes efeitos biolgicos imunomoduladores de AGPs (PAULSEN, 2001 e 2002; CLASSEN, 2002; PETTOLINO et al., 2006). As principais atividades biolgicas encontradas esto relacionadas com modulao da atividade de macrfagos (fagocitose e liberao de citocinas), do sistema complemento e atividade tumoral. Assim, importante destacar que apesar das vrias atividades biolgicas relatadas, poucos trabalhos enfocam especificamente a atividade biolgica de AGPs, exceo verificadas para as espcies vegetais Echinaceae purpurea e Echinaceae pallida Britton (CLASSEN et al., 2000, 2002, 2005; THUDE et al., 2006; PETTOLINO et al., 2006; CLASSEN, 2007). Outro fator de extrema relevncia a falta da correlao entre a atividade biolgica observada e a estrutura qumica das molculas testadas. Desta forma, imprescindvel a caracterizao prvia da estrutura qumica de molculas a serem testadas para que possa ser possvel estabelecer uma relao entre os eventuais efeitos biolgicos observados e a estrutura qumica das molculas (BOHN & BEMILLER, 1995). Deve-se considerar que aspectos relacionados estrutura da molcula, como composio

monossacardica neutra e cida, tipos de ligaes glicosdicas, presena ou ausncia de ramificaes, presena e caractersticas de grupos substituintes,

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tamanho da massa molecular e conformao tridimensional, tm correlaes entre o tipo de atividade biolgica e o grau de eficincia das molculas testadas.

3.4 MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa (UNHA DE GATO)

Esta planta medicinal, pertencente Famlia Rubiaceae, pode ser encontrada em toda a amaznia peruana e principalmente nas bacias dos rios da selva central do Peru. Apresenta vrias propriedades medicinais, sendo utilizada primariamente pelos Incas e ndios locais da no tratamento de doenas como artrite, gastrite, reumatismo e inflamaes em geral. A planta tambm benfica para o tratamento de doenas reumticas e musculares, principalmente na terceira idade e indicada no tratamento de enfermidades reumticas como a osteoartrite artrite reumatide. Os princpios ativos de maior interesse so os alcalides oxindlicos pentacclicos (rinocofilina, mitrafilina, isoteropodia A, pterodifina, isorincofilina e isomitrafilina) e os compostos glicosdeos do cido quinvico que demonstram ser os responsveis pelos efeitos antiinflamatrios. Atualmente, unha-de-gato est sendo estudada tanto como agente microbiano como no tratamento de doenas como o cncer e Aids, em razo de seu poder modulador do sistema imunolgico (BIESKI, 2006).

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4 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS

O objetivo geral desse projeto estudar as propriedades imunomoduladoras de AGPs obtidas de Uncaria tomentosa. De forma mais especfica, os objetivos so:

1. Avaliar o efeito de AGPs sobre a atividade de macrfagos, avaliando alteraes de morfologia celular e do burst respiratrio (produo de xido ntrico e reteno e lisossomos); 2. Avaliar o efeito modulador de AGPs sobre o sistema complemento; 3. Correlacionar a estrutura qumica das molculas-teste com as atividades biolgicas encontradas; 4. Coletar informaes sobre o conhecimento e a utilizao popular da Uncaria tomentosa; 5. Coletar os dados sobre aplicao da Uncaria tomentosa na fitoterapia clnica; 6. Divulgar os resultados obtidos com o intuito de reforar a utilizao da U. tomentosa como fitoterpico.

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5 JUSTIFICATIVAS

As plantas medicinais tm sido a base dos principais produtos indicados para a sade desde a Antigidade. O reconhecimento do valor delas como recurso clnico, farmacutico e econmico cresce progressivamente em vrios pases. O Brasil um pas de grande biodiversidade vegetal. Alm disso, possui uma rica diversidade tnica e cultural e detm valioso conhecimento tradicional relacionado ao uso de plantas medicinais. Desta forma, considerando os vrios aspectos como: (a) efeitos biomoduladores de AGPs encontradas na parede celular vegetal, como mediadores do resposta imunolgica; (b) propriedades fisco-qumicas das AGPs, como alta solubilidade em solues aquosas ou salinas; (c) relevncia na descoberta de novos modificadores da resposta biolgica para uso na teraputica de vrias doenas; (d) escassez de dados na literatura sobre as propriedades imunomoduladoras de AGPs presentes na espcie vegetal Uncaria tomentosa

(unha de gato) e o conhecimento popular sobre essa planta sobre o seu uso como fitoterpico; e finalmente (e) aspectos scio-econmicos da utilizao de plantas medicinais. Ento de forma resumida, o presente projeto prope a avaliao da atividade bio-imunomoduladora de AGPs, em modelos animais in vitro, respeitando sempre os aspectos bioticos. Afim de reforar e/ou desmistificar o uso da Uncaria tomentosa como planta medicinal de acordo com o uso popular.

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6. MATERIAIS E MTODOS

6.1 MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE

O material vegetal da espcie Uncaria tomentosa (unha-de-gato) (raiz) ser gentilmente cedido pela Fundao Herbarium, Colombo (PR). O material vegetal in natura ser submetido extrao para obteno da frao de protenas solveis (SPF), de acordo com a metodologia descrita por SCHULTZ et al (2002). A frao SPF ser submetida precipitao seletiva com reagente de Yariv (-glucosil)3 (GANE et al., 1995), para obteno da frao de AGPs. O reagente de Yariv ser preparado de acordo com o mtodo de YARIV et al. (1962). Para os ensaios biolgicos, alm das fraes de AGPs da unha de gato, tambm sero utilizadas como fonte AGPs, a goma arbica (Sigma Chem. Co.) e o extrato de Echinacea purpurea L. Moench (Bioherb, Laboratrio Qumico Farmacutico Tiaraju Ltda).

6.2 EXPERIMENTOS BIOLGICOS

O estudo da ativao do sistema imune por arabinogalactana-protenas ser realizado com pesquisas bibliogrficas, reviso de artigos e prticas laboratoriais na Universidade Positivo e Hospital de Clnicas. Os experimentos biolgicos sero constitudos por uma anlise, detalhada a seguir, os quais verificam a imunomodulao mediada por AGPs em macrfagos e eritrcitos. Vale ressaltar que todos os procedimentos respeitaro os princpios bioeticos em todas as etapas.

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6.2.1 Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal

Todas as solues utilizadas para o cultivo celular sero preparadas com gua ultra pura ou bidestilada. Todo o material utilizado, como vidrarias e solues aquosas no-termolbeis, ser esterilizado em autoclave a temperatura de 120C e 1 atm de presso por 30 min. A esterilizao das solues termolbeis, tais como meio de cultura, sero realizadas por filtrao sob presso atravs de membranas de acetato-nitrato de celulose (0,22 m).

6.2.2 Modelos experimentais utilizando macrfagos

6.2.2.1 Obteno de macrfagos peritoneais Ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus) do biotrio da Universidade Positivo, com aproximadamente trs meses de vida, pesando em torno de 300-350 g sero utilizados para a obteno dos macrfagos peritoneais. Aps o sacrifcio dos animais em cmara de gs, ser inoculado 10 ml de uma soluo estril de salina tamponanda (PBS) mantida a 0C na cavidade peritoneal. As clulas do exsudato peritoneal sero aspiradas e acondicionadas em tubos plsticos estreis, mantidos a 4 C at sua utilizao. As clulas sero centrifugadas por 1200 rpm por 7 minutos a 4 C e as clulas (pellet) sero ressuspensas em PBS estril. Para os experimentos, a suspenso celular (105 clulas.ml-1) ser distribuda em placas de cultura estreis de 24 poos com o meio de cultura essencial de Earle, na ausncia (controle) e na presena das molculas-teste e, em seguida, as placas sero mantidas em estufa incubadora de CO2 por 48 horas (MORETO et al., 2003).

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6.2.2.2 Determinao da contagem e da viabilidade celular (mtodos de Azul de Tripan e do MTT) Na determinao da viabilidade celular e da contagem das clulas, ser realizada pela tcnica do corante vital azul de Tripan (PHILLIPS, 1973). Este corante penetra apenas em clulas em que a membrana plasmtica perdeu sua integridade. As clulas coradas portanto, so consideradas como no viveis. A suspenso de clulas ser diluda 50 vezes em soluo salina tamponada (PBS), e contadas utilizando cmaras de Neubauer e microscpio ptico. A soluo de Azul de Tripan ser preparada a 0,4% (m/v) em PBS. Para cada ml da suspenso celular ser utilizado 0,1 ml da soluo do corante. A percentagem de clulas viveis ser calculada atravs da seguinte relao: % clulas viveis = n de clulas no coradas/n de clulas totais x 100. Neste trabalho sero utilizadas somente as suspenses celulares com viabilidade acima de 95%.

Outro mtodo para se determinar a viabilidade celular, ocorrer pelo mtodo do MTT (brometo de (3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazlio, Sigma Chem. Co., St. Louis, USA) ser realizada de acordo com a metodologia descrita por REILLY et al. (1998). Segundo o princpio do mtodo, as clulas viveis e metabolicamente ativas reduzem o sal tetrazlio, formando cristais de formazan solveis em 0,1ml de DMSO, possuindo cor roxa caracterstica. Para anlise da viabilidade as clulas sero incubadas por 3 h a 37 C em atmosfera de 5% CO2 em 180 ml de soluo balanceada de Hanks (HBSS) mais 20 ml de soluo de MTT a 500 mg.ml-1, de modo a obter-se uma concentrao final em MTT de 5 mg.ml-1. A seguir, o excesso de MTT ser removido e os cristais de formazan formados sero dissolvidos em DMSO. A leitura da absorbncia em 550 nm, com filtro de 655 nm

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como referncia, ser realizada em leitor de microplacas, utilizando-se o solvente DMSO como branco (REILLY et al., 1998).

6.2.2.3 Produo de xido ntrico

A avaliao da produo de xido ntrico (NO) ser realizada indiretamente, a partir da determinao da concentrao de nitrito, o qual um produto estvel da reao de produo de NO no sobrenadante das culturas de macrfagos. Alquotas de 100 l de cada sobrenadante sero centrifugadas (2000 rpm, por 5 min), transferidas para placas de 96 poos e misturadas em igual proporo com o reagente de Griess. Este reagente, na presena de nitrito, reage produzindo um composto de cor lils. A densidade ptica (D.O.) de cada amostra ser ento determinada em leitor de microplaca em 540nm. A concentrao de nitrito, presente no sobrenadante das amostras ser calculada em relao a curva padro (10 M 80 M), utilizando como padro de nitrito de sdio diludo em meio de cultura (MORETO et al., 2003).

6.2.2.4 Reteno de lisossomos

Para esta anlise ser utilizado o mtodo descrito por PIPE et al. (1995), onde em uma placa do tipo ELISA ser depositado 100 l da soluo de macrfagos, 100 l de extrato nas respectivas diluies e 20 l de vermelho neutro a 2%. Aps 30 minutos, a placa ser centrifugada por 5 minutos a 1.500 rpm. O sobrenadante ser descartado e os poos lavados com PBS para eliminar o vermelho neutro que no ser internalizado pelas clulas. Posteriormente, 100 l de soluo de extrao ser

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adicionado para solubilizar o vermelho neutro que estava dentro dos lisossomos. Esta solubilizao possvel porque o vermelho neutro um corante catinico que se difunde atravs da membrana celular e, uma vez presente no lisossomo, fica aprisionado devido mudana de cargas causada pelo pH cido do sistema lisossomal. Finalmente, aps 30 minutos, a placa ser analisada a 550 nm utilizando o espectrofotmetro (Microplate reader Bio-rad - Benchmark). Vale ressaltar que os dados sero expressos em nm/ 2x105 clulas.

6.2.2.5 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz As lamnulas que sero obtidas dos poos sero fixadas com soluo de Bouin, durante 5 minutos temperatura ambiente e rotineiramente coradas com Hematoxilina-Eosina, Giemsa e Hematoxilina-Azul de Alcian. A montagem da lmina permanente ser realizada com resina Entelan (CUNHA, 2006).

6.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento Modelo experimental utilizando eritrcitos

6.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho

Para a avaliao da hemlise sero utilizadas suspenses de eritrcitos de carneiro (via clssica) e de coelho (via alternativa). Para o preparo da suspenso de eritrcitos de carneiro sero colhidos, por puno venosa, 5 mL de sangue de carneiro em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo anticoagulante Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos a 1000 g. Os eritrcitos do

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pellet sero lavados trs vezes com tampo HEPES e aps a centrifugao final, ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final de 0,6%. Para o preparo da suspenso de eritrcitos de coelho foram colhidos, por puno cardaca, 5 mL de sangue de coelho em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo anticoagulante Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos 1000 g. Os eritrcitos do pellet sero lavados trs vezes com Tampo HEPES/EGTA com Mg+2 aps a centrifugao final, ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final de 0,6%.

6.2.3.2 Avaliao da via alternativa

Alquotas de 100 l dos soros dos camundongos (grupos controle e teste) sero incubados em tubos do tipo eppendorfs com 50 l da suspenso de

eritrcitos de coelho 0,6% em HEPES/EGTA com Mg+2, seguido da adio de 50 l do mesmo tampo. Os tubos sero incubados durante 90 minutos a 37 C Os tubos sero centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos e o sobrenadante transferido para placas de fundo chato para posterior leitura a 405 nm.

6.2.3.3 Avaliao da via clssica

Para obteno de anticorpos anti - hemcias de carneiro, sero inoculados IP em camundongos suos com peso entre 20-30g, 200 l de suspenso estril, de eritrcitos de carneiro 2%. O soro desses animais ser obtido seis dias aps a inoculao. O soro obtido ser incubado a 50C por 30 minutos para inativao do complemento. Sero incubados em tubos do tipo eppendorfs 80 l dos soros de

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camundongos (duplicata para cada grupo experimental) com 50l da suspenso de eritrcitos de carneiro 0,6% em Tampo Hepes e ainda 50 l de anticorpo antieritrcitos de carneiro diludo 1/10 em mesmo tampo. Os tubos sero incubadas por 90 minutos 37 C e ento centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante transferido para placas de fundo chato para leitura a 405 nm. Os resultados obtidos de ambas as vias (percentagem de inibioda hemlise) sero comparados com soros controles incubados apenas som o veculo dos extratos onde a hemlise ser considerada como 100% de hemlise (sistema complemento 100% ativado).

6.3 Delineamento experimental e anlise estatstica Para os ensaios biolgicos em macrfagos, cada tratamento consistir de 10 repeties (1 repetio = 1 poo da placa de cultura). Cada experimento ser repetido pelo menos duas vezes. Para os ensaios biolgicos utilizando eritrcitos humanos, cada experimento ser realizado em duplicata sendo repetido pelo menos quatro vezes. Para os experimentos de ensaios de hemlise, os experimentos sero repetidos trs vezes para concentrao a ser escolhida. Todos os dados obtidos nos ensaios com macrfagos, viabilidade celular e teste de fixao de complemento e inibio de hemlise sero submetidos a anlise de varincia ANOVA. Para avaliar as diferenas entre os tratamentos e controle ser utilizado o teste de Tukey, que permite estabelecer a diferena mnima significante entre duas mdias. Os resultados sero expressos como mdia desvio padro (mdia dp) sendo considerados estatisticamente significativos os valores comparados ao nvel de significncia de p0,05.

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6.4 Aspectos bioticos e de biosegurana

As atividades referentes ao bio-ensaios utilizando animais de laboratrios ou sangue humano sero realizadas respeitando os critrios exigidos pelo conselho de tica e pesquisa da Universidade Federal do Paran.

6.5 Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no Programa de Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais

A coleta das informaes sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no Programa de Fitoterapia de Londrina ser realizada empregando o uso de formulrio ou questionrio semi-estruturado (MARTIN, 1995), destacando os aspectos com relao s indicaes, modo de administrao, efeitos colaterais, contra-indicaes e principais resultados obtidos. O pblico alvo para esta etapa ser os profissionais envolvidos no Programa de Fitoterapia de Londrina. A metodologia empregada para coleta de informaes sobre o conhecimento e a utilizao popular da Uncaria tomentosa, incluir o uso de formulrio semiestruturado (MARTIN, 1995), abordando os aspectos como tipos de plantas utilizadas e suas propriedades medicinais, tipos de doenas, o modo de administrao e o conhecimento sobre efeitos txicos ou colaterais das plantas utilizadas (Anexo 1). O pblico alvo para esta etapa estaro localizados em centros comunitrios ou associaes de bairro, de preferncia populao de adultos e idosos, os quais, trazem consigo os conhecimentos populares adquiridos por herana. A escolha da comunidade ser feita em momento oportuno.

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importante destacar que a divulgao das informaes tcnico-cientficas sobre a Uncaria tomentosa, ou qualquer outra espcie medicinal no tero o propsito de incentivar a automedicao, nem indicar qualquer forma de tratamento de quaisquer doena, nem substituir ou alterar qualquer tratamento sem o consentimento mdico. Todo o material bibliogrfico dever ser publicado ou transmitido de acordo com as normas tcnicas das legislaes vigentes*.

*(http://www.anvisa.gov.br, ANVISA Resoluo - RE n 88, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determina a publicao da "Lista de referncias bibliogrficas para avaliao de segurana e eficcia de fitoterpicos", Resoluo - RE n 89, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Lista de registro simplificado de fitoterpicos" Resoluo - RE n 90, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para a realizao de estudos de toxicidade pr-clnica de fitoterpicos" Resoluo - RE n 91, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para realizao de alteraes, incluses, notificaes e cancelamentos ps registro de fitoterpicos", http://www.ibpm.org.br/legislao)

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7 CRONOGRAMA

PERODO DE EXECUO ETAPA Reviso bibliogrfica Elaborao do projeto Apresentao do projeto Preparo de materiais, solues e reagentes Isolamento e caracterizao de AGPs presentes em Uncaria tomentosa Experimentos biolgicos em macrfagos: produo de xido ntrico, reteno de lisossomos e anlises morfolgicas Experimentos biolgicos em eritrcitos: via clssica e via alternativa do sistema complemento Anlises dos resultados e redao de trabalhos cientficos Coleta de informaes etnobotnicas em comunidades nativas e no programa de fitoterapia Elaborao da monografia Defesa da monografia X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X MAR X X ABR X X MAI X X JUN X X X X X JUL X AGO X SET X OUT X NOV X DEZ X

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8 RECURSOS FINANCEIROS

Os equipamentos e reagentes dos experimentos sero todos cedidos pelas instituies de ensino: Universidade Federal do Paran (Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular; Departamento de Patologia Mdica), Universidade Positivo e UNICENTRO (campus Guarapuava).

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ANEXO FORMULRIO PARA PESQUISA DE CAMPO ETNOBOTNICA ETNOFARMACOLGICA DA UNHA DE GATO (Uncaria tomentosa Will DC.) E

1. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADO N: ________________________ 1.1. Nome.................................................................................................................................................... 1.2. Sexo [ ] masculino [ ] feminino 1.3. Endereo: R: .........................................................................Bairro: .................................................. 1.4. [ ]rea urbana [ ] rea rural 1.5. Religio ou Crena............................................................................................................................... 1.6. Idade: .............anos 1.7. Profisso:............................................................................................................................................. 1.8. Estado civil [ ] solteiro(a) [ ] casado(a) outro:............................................................................ 1.9. Idade e nmero de pessoas que vivem na mesma casa:...................................................................... 1.10. Local de Nascimento, cidade e estado:.............................................................................................. 1.11. Onde foi criado (a), cidade e estado: ................................................................................................ 1.12. Grau de instruo ou escolaridade: [ ] analfabeto [ ] alfabetizado [ ] 1 grau completo [ ] 2 grau completo [ ] 3 grau completo Outros:....................................................................... 1.13. Renda familiar [ ] <1SM* [ ] 1 a 3 SM [ ] >3SM [ ] conta prpria *SM salrio mnimo 2. CONHECIMENTO GERAL SOBRE A FITOTERAPIA E PLANTAS MEDICINAIS 2.1. Compare a alopatia com a fitoterapia, citando vantagens e desvantagens. 2.2. Voc acredita que o uso de plantas medicinais no tratamento complementar alopatia? Pode ser usado como terapia nica? 2.3. Voc conhece e utiliza alguma planta de carter medicinal? E a unha de gato? Cite a(s) outra(s). 2.4. Qual(is) a(s) doena(s) que voc conhece na(s) qual(is) utiliza o tratamento base de plantas medicinais ? 2.5. Cultiva alguma planta medicinal? Como cultiva essas plantas? 2.6. Voc acredita na fitoterapia? Voc acha que esta terapia seja utilizada no combate ou controle de alguma doena? 2.7. Como adquiriu informaes sobre o tratamento de sintomas ou doenas usando plantas? [ ] Com familiar que conhecia o assunto [ ] Em livros [ ] Experincia pessoal Outros:.................................................................................................................................................... 2.8. Sabe qual a origem do conhecimento da pessoa que lhe ensinou, caso tenha aprendido com algum?.......................................................................................................................... 2.9. Ensina para outras pessoas? [ ]Sim [ ] No Como:.....................................................................................................................................................

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3. CONHECIMENTO ESPECFICO DAS PLANTAS MEDICINAIS Nome popular da planta Descrio da planta (Como a reconhece)

Indicao no tratamento, contra-indicao e efeitos colaterais (sintomas)

Parte utilizada da planta e melhor poca de colheita* Modo de extrao para no matar a planta (se for raiz ou caule) Freqncia e quantidade da dose administrada

Modo de preparo

Modo de Conservao

Observaes

* Estao do ano, fase da lua, hora do dia e/ou estado da florao 4. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADOR 4.1. Nome: .................................................................................................................................................. 4.2.Idade:..............................................................4.3.Profisso:................................................................ 4.4. Contato:................................................................................................................................................