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Avaliação da

qualidade de produtos
à base de Trichoderma

18 a 20 de setembro de 2012
Embrapa Meio Ambiente - Jaguariúna, SP
IV CURSO TEÓRICO E PRÁTICO

Avaliação da qualidade de produtos à base de


Trichoderma

Trichoderma é o principal agente de biocontrole de doenças de


plantas comercializado no Brasil. A maioria dos produtos comerciais à base
de Trichoderma está em processo de registro no MAPA. Com isso, surgiu a
necessidade de padronizar as metodologias para a avaliação da qualidade
desses produtos, tanto para o setor de qualidade das biofábricas quanto
para os órgãos de fiscalização. Assim, no âmbito do projeto Qualibio foram
desenvolvidas metodologias para realizar essas avaliações, com a
participação da Embrapa Meio Ambiente, Embrapa Arroz e Feijão, Empresa
de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais - Epamig/Viçosa, Instituto
Biológico - IB, Ceplac/Cepec e Universidade Federal de Pelotas – UFPel.
Essas metodologias estão sendo transferidas à sociedade por meio
do “Curso Teórico e Prático – Avaliação da qualidade de produtos à base de
Trichoderma”. Até o momento foram realizados dois cursos na Embrapa
Meio Ambiente, Jaguariúna-SP e um na Universidade Federal de Lavras,
Lavras-MG, com retorno positivo dos participantes, que já estão utilizando
as metodologias como rotina nos laboratórios.
O uso das metodologias padronizadas está auxiliando na promoção e
legalização dos produtos, bem como em garantir a sua qualidade e

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efetividade, repercutindo na melhoria dos produtos biológicos nacionais e
consequentemente aumentando seu mercado consumidor.
PROGRAMAÇÃO
18/09/2012
8:30h – Abertura – Wagner Bettiol
9:00h - Importância da padronização de metodologias para avaliação da
conformidade de produtos contendo agentes de biocontrole – Marcelo A. B.
Morandi
9:30h – Aspectos gerais sobre Trichoderma como agente biológico para o
controle de doenças de plantas – Cleusa M. M. Lucon
10:30h – coffee break
11:00h – Metodologias para quantificação de Trichoderma para formulados
em pó-molhável, esporos concentrados e grânulos – Zayame Vegette Pinto
12:00h - Almoço
14:00h – Preparo e execução das metodologias para a análise quali-
quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma spp.– Zayame
V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely
Nascimento,Patrícia E. Haddad.
15:30h- coffee break
16:00h - Continuação do preparo e execução das metodologias para a
análise quali-quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma
spp.– Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos
Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.

19/09/2012
8:00h – Leitura do número de esporos ativos e germinados ao microscópio
óptico – Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos
Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.
10:30h – coffe break

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11:00h- Contagem do número de esporos ao microscópio óptico - Cleusa
M. M. Lucon, Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos
Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.
12:00h - Almoço
14:00h - Identificação molecular e morfológica de Trichoderma – Ricardo
HaraKava.
15:30h- coffe-break
16:00h - Preservação de isolados de Trichoderma – Cleusa M. M. Lucon e
Zayame V. Pinto
16:00h – Avaliação de contaminantes presentes em produtos a base de
Trichoderma - Cleusa M. M. Lucon e Zayame V. Pinto

20/09/2012
09:00h – Avaliação do teste de microgotas - Zayame V. Pinto, Cleusa M.
M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E.
Haddad.
10:00h – Determinação do número de UFC de Trichoderma. Zayame V.
Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely
Nascimento, Patrícia E. Haddad.
10:30h - coffe-break
11:00h – Análise dos resultados e discuusão – Wagner Bettiol, Marcelo A.
B. Morandi, Zayame Vegette e Cleusa M. M. Lucon.
13:00h Almoço e visita a casa de vegetação onde Trichoderma é utilizado
em larga escala.
17:00h - Encerramento

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ÍNDICE

I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS


BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL,
GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA.
I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS
I.II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –
PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS
I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE
FORMADORA DE COLÔNIA

II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS


BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO.
II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS
II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –
PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS
II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE
FORMADORA DE COLÔNIA

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I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL,
GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA.

I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios
por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de
suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio
de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.

2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.

3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.

4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;

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- Autoclave;
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta de 10 mL e 1000 µL;
- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 µL;
- Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro);
- Microscópio óptico;
- Contador manual;
- Agitador magnético;
- Barra magnética.
5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000 mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm por 20
minutos.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
6.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser
realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratação.

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6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em
cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
6.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 6.6 e 6.7 (diluição seriada), utilizando o
tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios,


de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.
Concentração de conídios* Diluição para contagem
≥ 109 10-4
≤ 108 10-3
*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas
diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por
subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao
microscópio óptico.

6.9 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de


tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento;
6.10 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de
uma micropipeta;

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6.11 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a
lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de
Neubauer;
6.12 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de
conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a
contagem e reduzindo erros;
6.13 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou
400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados
(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por
campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas


dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas
linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam
contados duas vezes.

Campo 1

Campo 2

Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer.

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E1 E2 E5

E3 E4

Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de


conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.

7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS


Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição:
Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}
Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por 103 e, quando utilizada a
diluição 10-4, por 104.
Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está
disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos
e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja
sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises.

8. REPETIÇÃO

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Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na
câmara de Neubauer para contagem.

Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade


de produtos à base de Trichoderma.

9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

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I. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –
PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS

1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios
viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de
conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos
conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.
2 – APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3 – AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4 – EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;
- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;
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- Placas de Petri descartável esterilizadas;
- Agitador magnético;
- Barra magnética.

5 – SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1.000 mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20 g;
- Ácido lático: 20 g;
- Água destilada: 20 g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magnético dentro de capela de exaustão de gases.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
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esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
7.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma série de diluição para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve
ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratação.

7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90


rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
7.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluição seriada), utilizando o
tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.

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Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de
acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.
Concentração de conídios Diluição
≥109 10-4
≤ 108 10-3
*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e
escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme
observação ao microscópio óptico.

7.9 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de


tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento.
7.10 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µL da diluição apropriada em placas de
Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma
placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µL da suspensão


para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.

7.11 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro.


7.12 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em
função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µL)
em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco
pontos por placa) (Figura 1).
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7.13 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x.
7.14 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 -
Glossário).
7.15 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100
conídios por ponto.
7.16 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.
7.17 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula:
Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100
Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição,
separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem.

Conídio ativo não


germinado
Conídio germinado

Conídio inativo

Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não


germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação.

8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma diluição seriada (itens 7.6 e 7.8). Da diluição selecionada, deve-se colocar
cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.10 e Figura 1).

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Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade
de produtos à base de Trichoderma.

9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

11. GLOSSÁRIO
Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.
Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho
em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo.

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Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do conídio.
Conídios inativos: conídios não viáveis.
Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
conídio.
Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados.
Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios.
Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se
desfazem na presença de água.
Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande
estabilidade.

I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE


FORMADORA DE COLÔNIA

1 – PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de
colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o
diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado
diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias
formadas pelo Trichoderma.
2 – APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3 – AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
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ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4 – EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta para 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
- Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
- Placas de Petri descartável esterilizada;
- Alça de Drigalski esterilizada;
- Agitador magnético;
- Barra magnética;
- Microscópio óptico;
- Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente.
5 – SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm
por 20 minutos.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
18
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e
para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 – PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:

7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do início da análise.
7.1.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90
g do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para
cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem
deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar
maior tempo de hidratação.

19
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
7.1.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando
o tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.

Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição
apropriada.
Informação do fabricante Diluir até
105 10-6
106 10-7
107 10-8
108 10-9
109 10-10
1010 10-11
1011 10-12
1012 10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.

20
7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µL de cada diluição preparada para a
superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na
Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa.

7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por
no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;
7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e
selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três
gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de
colônia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40
minutos antes do início da análise.
7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a
superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton;
7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça
de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma alça de Drigalski.

21
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da
solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton com alça de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
número de colônias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para
verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da
visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.
7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e
conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas,
deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3).

22
Figura 2. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade
de produtos à base de Trichoderma.

9– CONTAGEM DE COLÔNIAS
Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:
UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.

Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias.

10 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.
11. LIMPEZA

23
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

24
II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO.

II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios
por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de
suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio
de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.

2. APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.

3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.

4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;

25
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta de 10 mL e 1000 µL;
- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 µL;
- Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro);
- Microscópio óptico;
- Contador manual;
- Agitador magnético;
- Barra magnética.
5. SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000 mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm por 20
minutos.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
6.2 Pesar 0,1g do produto em erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com
solução salina com Tween a 0,1 % (corresponde às diluição 10-3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda
pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra
para evitar maior tempo de hidratação.

6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90


rpm.

26
6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em
cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (obter a suspensão 10-4). Descartar a ponteira em seguida. Utilizar para a
contagem a diluição apropriada segundo a Tabela 1.
6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios,


de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.
Concentração de conídios* Diluição para contagem
9
≥ 10 10-4
< 108 10-3
*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas
diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por
subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao
microscópio óptico.

6.8 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de


tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento;
6.9 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de uma
micropipeta;
6.10 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a
lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de
Neubauer;
6.11 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de
conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a
contagem e reduzindo erros;

27
6.12 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou
400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados
(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por
campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas


dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas
linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam
contados duas vezes.

Campo 1

Campo 2

Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer.

E1 E2 E5

E3 E4

Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de


conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.

28
7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS
Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição:
Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}
Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Para obter a concentração do produto original, o resultado obtido deve ser multiplicado
pela diluição utilizada. Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por
103e, quando utilizada a diluição 10-4, por 104.
O resultado final será a média das 4 repetições.
Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está
disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos
e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja
sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises.

8. REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na
câmara de Neubauer para contagem.

29
Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade
de produtos à base de Trichoderma.

9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –


PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS
30
1. PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios
viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de
conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos
conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.
2 – APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3 – AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4 – EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;
- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;
- Placas de Petri descartável esterilizadas;
- Agitador magnético;
31
- Barra magnética.

5 – SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1.000 mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20 g;
- Ácido lático: 20 g;
- Água destilada: 20 g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magnético dentro de capela de exaustão de gases.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
32
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 – PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do início da análise.
7.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9
g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10 -3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8).
A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira
amostra para evitar maior tempo de hidratação.

7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90


rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida. Escolher a diluição apropriada segundo
a Tabela 1.
7.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de


acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.
Concentração de conídios Diluição
≥109 10-4
< 108 10-3
*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e
escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme
observação ao microscópio óptico.

33
7.8 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de
tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento.
7.9 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µL da diluição apropriada em placas de
Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma
placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µL da suspensão


para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.

7.10 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro.


7.11 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em
função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µL)
em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco
pontos por placa) (Figura 1).
7.12 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x.
7.13 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 -
Glossário).
7.14 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100
conídios por ponto.
7.15 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.
7.16 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula:
34
Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100
Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição,
separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem.

Conídio ativo não


germinado
Conídio germinado

Conídio inativo

Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não


germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação.

8 - REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma diluição seriada (itens 7.6). Da diluição selecionada, deve-se colocar
cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.9 e Figura 1).

35
Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade
de produtos à base de Trichoderma.

9 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

11. GLOSSÁRIO
Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.
Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho
em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo.
36
Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do conídio.
Conídios inativos: conídios não viáveis.
Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
conídio.
Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados.
Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios.
Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se
desfazem na presença de água.
Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande
estabilidade.

II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE


FORMADORA DE COLÔNIA

1 – PRINCÍPIO
Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de
colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o
diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado
diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias
formadas pelo Trichoderma.
2 – APLICAÇÃO
Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3 – AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,
número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura

37
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser
analisado.
4 – EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta para 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
- Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
- Placas de Petri descartável esterilizada;
- Alça de Drigalski esterilizada;
- Agitador magnético;
- Barra magnética;
- Microscópio óptico;
- Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente.
5 – SOLUÇÕES
Solução salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Água destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm
por 20 minutos.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
38
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;
-Água destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e
para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.
Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 – PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:

7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do início da análise.
7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para
99,9 g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10 -3). Devem ser
realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada

39
pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação
de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação.
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no
Erlenmeyer.
7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou
colocar em agitador magnético por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3), com auxílio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida.
7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três
vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das
passagens.
7.1.8 Para obter a diluição 10-5 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando
o tubo da diluição anterior (10-4). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição
apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.

Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição
apropriada.
Informação do fabricante Diluir até
105 10-6
106 10-7
107 10-8
108 10-9
109 10-10
1010 10-11
1011 10-12
1012 10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.

40
7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µL de cada diluição preparada para a
superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na
Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa.

7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por
no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;
7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e
selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três
gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de
colônia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40
minutos antes do início da análise.
7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a
superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton;

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7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça
de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma alça de Drigalski.
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da
solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de
Triton com alça de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
número de colônias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para
verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da
visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.
7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e
conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIÇÃO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas,
deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3).

42
Figura 2. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade
de produtos à base de Trichoderma.

9– CONTAGEM DE COLÔNIAS
Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:
UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.

Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias.

10 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE


Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme
recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição
dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as
mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

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11. LIMPEZA
Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o
local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

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Wagner Bettiol
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -
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Jaguariúna, SP. bettiol@cnpma.embrapa.br

Marcelo Augusto Boechat Morandi


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Zayame Vegette Pinto


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Rosely Nascimento
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Elen Ribeiro dos Santos Agostini


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Cleusa Maria Mantovanello Lucon


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Ricardo Harakava
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Patrícia E. Haddad
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