Apostila Microbio - 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE
MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
Roteiro de Aulas Práticas de Microbiologia e Imunologia
ÍNDICE
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO -------------------------------------------------------- 3
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS -------------------------------------------- 9
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS -------------19
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO ---------------22
VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS ------------27
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS -----------------33
VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO --------------------------------------------------37
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------41

Esterilização e Desinfecção 3
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO
Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes

físicos ou químicos de todas as formas de vida microbiana
(vírus, bactérias, fungos e esporos) presentes num material.
A esterilização pode ser realizada por agentes físicos e
químicos.
⇒ ESTERILIZAÇÃO POR MÉTODOS FÍSICOS
1. Calor Úmido
1.1. Autoclavação - É um processo de esterilização pelo
vapor sob pressão em câmaras conhecidas como “autoclaves”
onde vapor de água é mantido em temperatura acima de
100oC, pelo emprego de pressão maior que a atmosférica, a
uma temperatura de 121oC. O tempo de exposição depende do
material a ser esterilizado. Este processo é utilizado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos, meios
de cultivo e outros.
1.2. Tindalização ou esterilização fracionada - Processo
de esterilização na temperatura de 100oC durante 30
minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias
consecutivos. Este processo é usado na bacteriologia para
a esterilização de certos meios de cultura que se alteram
em temperaturas elevada, como meios contendo açúcares,
leite etc.
2. Calor Seco
2.1. Forno de Pasteur - Neste processo são empregados
fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e
mantida pelo tempo necessário para que haja
esterilização. É realizada em temperatura de 170-180oC,
em estufas elétricas por 1 a 2 horas. O material a ser
esterilizado deve ser distribuído de modo uniforme para
facilitar a distribuição do calor que emana das paredes
laterais e da base da estufa. Este processo é indicado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos
passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais
impermeáveis como ceras, pomadas, pó e óleos.
2.2. Incineração - É um processo usado para materiais
descartáveis e carcaça de animais utilizados em
experimentos.
2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de
Bunsen utilizado em rotina de laboratório para
esterilização de alças de platina e bordas da boca de
tubos e balões.
3. Filtração - É um processo usado para esterilização de

gases e líquidos tais como soros, soluções de enzimas e
vitaminas, açúcares, que não podem ser submetidos ao
calor. A filtração consiste em passar o material a ser
esterilizado por filtros de poros muito pequenos que não
permitem a passagem de bactérias e fungos.
3.1. Tipos de filtros:
Disco de amianto - Filtro de SEITZ
Membrana de ester de celulose- Millipore
Filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) –
removem quase todos os microrganismos maiores que
0,3μm de diâmetro. São utilizados para reduzir o
número de micróbios transmitidos pelo ar.
4. Radiações
4.1. Radiação ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na
esterilização do ar e de ambientes. Na indústria de
alimentos são aplicados para esterilização de
superfícies de pães, xaropes, sacos plásticos, garrafas
de água mineral, carnes mantidas sob refrigeração.
Porém, seu uso é limitado, devido a seu baixo poder de
penetração, pois trata-se de radiação não ionizante.
4.2- Raios gama e raios X (radiações ionizantes)têm alto
poder de penetração. Raios gama tem sido empregado na
esterilização de certas vacinas e sanitização de
alimentos embalados.
⇒ MÉTODOS QUÍMICOS
• Glutaraldeído 2% - As soluções de glutaraldeído são

indicadas para esterilização ou desinfecção de instrumentos
médicos cirúrgicos sensíveis ao calor, equipamentos de
anestesia gasosa, fibroscópios, partes ópticas de
endoscópios etc. Exposição em torno de 18 horas.
• Formaldeído (Solução Alcoólica 8%) - A fórmula alcoólica
apresenta 8% de Formaldeído. Sua atividade germicida é
atribuída à inativação de proteínas e ácidos nucléicos
microbianos. Exposição em torno de 18 horas.
• Formaldeído (solução aquosa 10%) - As soluções aquosas além
de não liberar vapores irritantes não possuem os
inconvenientes das soluções alcoólicas sobre lentes de
equipamentos ópticos e artigos de poliestireno e borracha
em exposições prolongadas. Exposição em torno de 18 horas.
⇒ MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
• Estes métodos associam o produto químico com o uso de
equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e
a segurança dos profissionais de saúde, sendo utilizado
para materiais termosensíveis.
• 1 – Esterilização por óxido de etileno: A esterilização é
realizada à baixa temperatura em torno de 54ºC durante 8 a
12 horas. Para materiais de implantes e próteses se

recomenda uma aeração ambiental em torno de 7 dias.
• Esterilização por vapor de formaldeído à baixa temperatura:
A esterilização por vapor de formaldeído é realizada em
autoclaves, em concentrações baixas em torno de 2% sob
forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73ºC e
82ºC durante 90 e 180 minutos.
Precauções - As precauções recomendadas para estas soluções

consistem em utilizar luvas ou pinças para o manuseio de
artigos nelas imersas e, nos casos das soluções alcoólicas,
mantê-las em cubas de esterilização fechadas em ambientes
ventilados.
DESINFECÇÃO E ASSEPSIA
* Desinfecção - A Desinfecção consiste na destruição ou
redução dos microrganismos na forma vegetativa, presentes
num material inanimado ou superfícies inertes, mediante a
aplicação de agentes físicos ou químicos. A desinfecção não
implica a eliminação de todos microrganismos viáveis, porém
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies
ou local tratado.
* Assepsia - É o termo usado para designar o processo de
desinfecção de tecidos vivos. Os anti-sépticos são
preparações contendo substâncias microbiocidas ou
microbiostáticas podendo ser usadas na pele, mucosas e
ferimentos. Exemplos: soluções alcoólicas, soluções
iodadas, soluções de permanganato de potássio, formulações
à base de sais de prata, iodóforos, etc.
Obervações:
− Não são recomendados a utilização de iodofóros no recém-
nascido, pois pode ocorrer absorção transcutânea de iodo
com supressão da função tireoideana.
− Para a finalidade de antissepsia, não são permitidas as
formulações contendo mercuriais orgânicos, acetona,
quaternários de amônio, hipoclorito a 0,5%, éter e
clorofórmio.
A desinfecção pode ser realizada por agentes físicos e
químicos.
• AGENTES FÍSICOS:
1.0. Pasteurização - É um processo empregado na indústria de
alimentos que elimina microrganismos patogênicos (bacilos
tíficos, paratíficos e desintéricos, brucelas,
estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o
leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a
temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15
segundos.
Os tempos e as temperaturas de pasteurização dependem do
método e do produto a ser tratado. A pasteurização não é
um processo de esterilização, uma vez que esporos e

bactérias não patogênicas podem permanecer viáveis.
1.1. Água Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de
lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados
por imersão em água a 100oC durante 10 minutos.
• AGENTES QUÍMICOS:
Principais compostos utilizados em desinfecção e assepsia:
– Álcoois - soluções a 70% e 80%

– Fenóis e Derivados - Fenol, Cresóis, Ac. salicílico e Ác.
Benzóico.
– Halogênios - Iodo, Iodóforos (Polivinil Piralidona-
Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sódio ou cálcio).
– Metais Pesados - Mercúrio (Mercúrio Cromo, Mertiolato),
Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre).
– Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta de
Genciana, Azul de Metileno.
– Detergentes Sintéticos
-Aniônicos: laurilsulfato de sódio
-Catiônicos: cloreto de cetilpiridínio.
– Oxidantes - Água oxigenada, permanganato de potássio.
– Ácidos, Álcalis - Ác. Sulfúrico, Ác. clorídico, soda
(NaOH).
NOTAS:
As seguintes precauções deverão ser tomadas para evitar
a sobrevivência de microrganismos contaminantes, falhas de
esterilização ou a recontaminação dos artigos esterilizados,
independentes do processo de esterilização.
1. A escolha do processo de esterilização

− Processo de esterilização mais eficaz é o vapor saturado
sob pressão, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes
químicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser
esterilizado.
2. Limpeza prévia
− A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, sangue, pus
e outras secreções) protege os microrganismos contaminantes
do contato indispensável com o agente esterilizante. Por
outro lado, quanto menor for o número de microrganismos
presentes, maior será a possibilidade de esterilização.
Assim, é necessário lavar cuidadosamente todos os artigos
em soluções desencrostantes (hiploclorito de sódio,
detergentes sintéticos etc), e enxaguá-los abundantemente
com água corrente e no último enxague com água destilada ou
deionizada antes de submetê-los a qualquer processo de
esterilização.
3. Invólucros e pacotes
− Os invólucros devem permitir o contato dos artigos com o

agente esterilizante, bem como mantê-los livres de
microrganismos durante a estocagem. A permeabilidade ao
vapor e ao óxido de etileno, a impermeabilidade a
partículas, a ruptura e a flexibilidade são as
características mais importantes para a seleção de um
invólucro.
4. Estocagem
− Após a esterilização, é essencial que os pacotes estejam
íntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade
dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da
câmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel
condensa na temperatura ambiente, criando uma pressão
negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente através
do invólucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando-
se penetrar pelo ar e retendo células, partículas
bacterianas ou não. Se este invólucro não estiver íntegro,
os artigos no pacote sofrerão recontaminação. A umidade
além de diminuir a resistência de invólucros de papel,
facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtração do
ar. Para evitar a contaminação posterior, recomenda-se o
uso de cestos metálicos.
− Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos
possível, sempre com delicadeza e estocados em ambientes
limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno
de 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando não
utilizados.
5. Medidas Preventivas
− Uso de luvas, Avental e, se necessário, máscara.
− Materiais contaminados por agentes patógenos devem ser
esterilizados antes de serem descartados.
− Após o manuseio de materiais contaminados por agentes
microbianos, lavar cuidadosamente as mãos com sabão ou
soluções detergentes antissépticas, como soluções aquosas
de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina
a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de
clorofenol.
Aula Prática - Análise do efeito da ação de anti-sépticos
relacionada ao crescimento bacteriano.
Objetivo: Observar o efeito de anti-sépticos sobre o

crescimento bacteriano na superfície da pele das mãos.
Materiais:
“Swab” estéril
Placa com meio de cultura Ágar nutriente.
Anti-sépticos: Sabão líquido e Solução álcool-iodado e
álcool 70%
Técnica:
1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,
sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a placa.
2. Lavar as mãos com água corrente e sabão líquido, deixar a
água escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta
dos dedos sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a
placa rapidamente.
3. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool iodado
2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos
sobre o meio de cultura, como item 2.
4. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool 70%.
Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o
meio de cultura, como item 2.
5. Incubar a 37ºC por 24 horas.
OBS:
• Esta prática deverá ser realizada com apenas um aluno de
cada grupo.
• Para observação da eficácia dos anti-sépticos, utilizar
dedos diferentes.
Resultado:
Ação dos Agentes Crescimento Bacteriano
Álcool Iodado
Álcool 70%
Sabão
Sem anti-sépticos
Técnicas de Coloração de Bactérias 9
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS
As técnicas de coloração iniciadas por Paul Erlich e

Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbiólogo distinguir
as células bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e
arranjo celular e diferenciá-las de acordo com as suas
características tintoriais. Os corantes são divididos em dois
grupos: os ácidos e os básicos. Os corantes básicos são sais
com base corada que se unem eficazmente a substratos ácidos,
tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul
de metileno, cristal violeta, fucsina básica, safranina). As
bactérias comportam-se como material nuclear e desse modo,
quase todos os corantes utilizados em bacteriologia são
corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a corar mais
eficientemente os substratos básicos, como o citoplasma.
MORFOLOGIA
As células bacterianas são caracterizadas
morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.
− Tamanho - as bactérias são microscópicas medindo desde 0,3
por 0,8μm até 10 por 25μm. As espécies de maior interesse
médico medem entre 0,5 a 1μm por 2 a 5μm.
− Forma - as bactérias podem ser classificadas quanto a forma

em três grupos básicos:
Cocos - células esféricas.
Bacilos - células cilíndricas, em forma de bastonetes.
Espirilos - células espiriladas. Algumas delas se comportam
como bacilos curvos, em forma de vírgula, que podem ser
denominados víbrios. Ex: Vibrio cholerae.
Arranjos - Grupamentos bacterianos.
Dependendo do plano e do número de divisões através das

quais as bactérias continuam unidas, podem aparecer os
seguintes arranjos:
1.Cocos
Pares: diplococos (ex.: gonococos)
Cadeias: (ex.: estreptococos)
Tétrades ou cúbicos (Sarcina)
Cocos em cachos (ex.: estafilococos)
2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como células

isoladas, porém ocasionalmente, pode-se observar: bacilos
aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos).
Após a divisão de algumas bactérias, podem ocorrer
movimentos característicos, por exemplo:, um movimento em
chicotada pode levar as bactérias a posições paralelas.
Divisões repetidas e seguidas desses movimentos determinam

posições semelhantes a letras chinesas características do
bacilo diftérico.
PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO BACTERIANO PARA COLORAÇÃO
1-Preparação a partir de meio líquido

Usando alça de platina estéril, colocar duas a três
alíquotas de cultura bacteriana preparada em meio líquido
sobre a superfície de uma lâmina de microscopia.
Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares
de dentro para fora e deixar o esfregaço secar a temperatura
ambiente. Em seguida, realizar a fixação passando duas a três
vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen.
2-Preparação a partir de meio sólido

Colocar uma pequena gota de água destilada numa lâmina.
Com alça de platina colocar sobre a lâmina uma pequena porção
do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lâmina e
prosseguir a preparação como no item anterior.
3-Preparação a partir de material biológico

Usando um swab estéril (zaragatoa), friccionar a
superfície da mucosa ou lesão oral por exemplo e fazer um
esfregaço circular na superfície de uma lâmina. Deixar secar
à temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de
ensaio e executar a fixação, como no item anterior.
COLORAÇÃO SIMPLES
Técnica de coloração caracterizada pelo uso de apenas um
corante, permitindo a observação da forma, tamanho e
grupamento da célula bacteriana. Esta técnica de coloração é
bastante utilizada para a detecção de cocos que causam
meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de líquido
cefalorraquidiano (LCR).
MÉTODO
1)Preparar o esfregaço bacteriano em lâminas;
2)Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno, aguar
dar 5 minutos e desprezar o corante na pia;
3)Lavar a lâmina rapidamente em água corrente, secar com
papel de filtro ou à temperatura ambiente (sem esfregar) e
observar em objetiva de imersão.
RESULTADO
Visualizar, descrever a morfologia e arranjo das
bactérias existente na lâmina.
COLORAÇÃO DE GRAM (Coloração diferencial)

Este método de coloração foi empiricamente desenvolvido
pelo bacteriologista dinamarquês, Christian Gram, em 1884, e
permite distinção entre diferentes bactérias que podem
mostrar uma morfologia similar, porém com propriedades
tintoriais diferentes. A coloração de Gram classifica as
bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
1)cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta,

aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;
2)cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o
lugol na pia;
3)inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona até que não haja
desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a
lâmina rapidamente em água corrente.
4)cobrir a lâmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos.
Lavar, secar e observar em objetiva de imersão.
NOTAS
1)O Cristal violeta só se liga a parede celular bacteriana
após a adição da solução de lugol (mordente)
2)O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco.
3)O material dos corantes empregados na técnica,
principalmente sedimento do cristal violeta, poderá
aparecer como artefato.
4)O descoramento para mais ou menos é resultante da incorreta
diferenciação pelo álcool-acetona.
5)A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental
na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células
Gram Positivas freqüentemente se tornam Gram Negativas.
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas
envelhecidas podem causar danos à parede da célula, como por
exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-
acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo cristal violeta
poderá ser retirado da célula, nessa fase de coloração.
RESULTADO
Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as
bactérias nas lâminas de acordo com o seu comportamento
diante dos corantes de Gram:
Bactérias Gram positivas → coradas em roxo
Bactérias Gram negativas → coradas em rosa
INTERPRETAÇÃO
A coloração de Gram classifica as bactérias em Gram
positivas ou Gram negativas. O mecanismo da coloração de
Gram, se refere à composição da parede celular, sendo que as
Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e
ácido teicóico, e as Gram negativas, uma fina camada de
peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta

por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e
lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o
tratamento com o álcool (ou álcool-acetona) extrai os
lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas.
Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser
retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas. A
parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de
sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.
COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)

A coloração de Ziehl-Neelsen é o método para a pesquisa
de bacilos álcool ácido resistentes (BAAR) incluindo-se o
bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactérias
atípicas. Este método de coloração se baseia na propriedade
das micobactérias de se corarem inicialmente pela
carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa solução de fenol-
álcool-água) e resistirem a uma descoloração por álcool-
ácido.
Através desta coloração, podemos visualizar um grupo
restrito de bactérias que possuem sua parede celular
constituída de lipídeos em grande concentração, devido a
presença de cêras e ácidos graxos de cadeia longa(ácidos
micólicos), que conferem à célula a característica de álcool-
ácido resistência.
COLETA DO MATERIAL
1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia.
2- Obter, de preferência o primeiro escarro da manha antes da
ingestão de alimentos.
3- Orientar o paciente para escovar os dentes com água (não
utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes,
inclusive com gargarejos.
4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir
profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta
estéril.
5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra
após nebulização.
6- Enviar ao laboratório o mais breve possível.
O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares

são impróprias para análise bacteriológica, pois não são
representativas do processo infeccioso.
PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO
Colocar as amostras em lâminas (novas e desengorduradas)
com aplicador de madeira. Escolher a partícula mais densa ou
uma mistura da amostra, quando só existirem pequenas
partículas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a
amostra em 1/3 da lâmina, deixar secar à temperatura ambiente
e fixar como no procedimento anterior.
Técnica:
1)Cobrir toda a lâmina com fucsina fenicada.
2)Com auxílio de uma chama, aquecer a lâmina, pela sua parte
inferior até emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o
corante esfriar. Aguardar 5 minutos, não deixando o corante
nem ferver nem secar.
3)Lavar a lâmina com água corrente, suavemente.
4)Inclinar a lâmina descorar com solução álcool ácido
clorídrico, até não sair mais corante.
5)Lavar a lâmina com água corrente.
6)Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno de
Loeffler durante 30 segundos.
7)Lavar a lâmina em água corrente.
8)Deixar secar e observar ao microscópio, com a objetiva de
imersão.
Notas:
1.Na coloração de Ziehl, o aquecimento não deve ser feito
muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas até
ligeira emissão de vapores.
2.A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras
estruturas que foram diferenciadas, para o efeito
contrastante ou distinção entre as bactérias e células
presentes no material.
RESULTADO:
Visualizar, esquematizar e classificar as bactérias
existentes nas lâminas. A classificação deverá ser quanto à
resistência ou não das bactérias ao descoramento em álcool
ácido.
Bactérias álcool ácido resistente (BAAR) permanecem
coradas de vermelho pela fucsina.
Bactérias não álcool ácido resistente (BNAAR) não retém
a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE GRAM
Preparação do Cristal de Violeta:

Cristal violeta 1g
Ácido fênico 2g
Álcool absoluto 10ml
Água destilada 100ml
Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o

álcool. Juntar aos poucos o ácido fênico, misturando sempre,
de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água
pouco a pouco, misturando bem. Filtrar após 24 horas de
repouso, em papel de filtro.
Preparação do Lugol:
Iodo 1g
Iodeto de potássio 2g
Triturar o iodo com o iodeto de potássio em gral de

vidro. Juntar a água e misturar bem. Preparar em quantidade
que seja usada antes de 30 dias.
Preparação de álcool acetona:

Álcool 800ml
Acetona 200ml
Unir os dois componentes e misturar bem.
Preparação da Fucsina para Coloração de Gram:

Fucsina 2,5g
Álcool etílico 100ml
A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser

preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem.
Para usar 10ml da solução em 90ml de água destilada, isto é,
diluir a 10% em água destilada.
Armazenamento de corantes:
Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro
âmbar em local onde as condições ambientais sejam favoráveis,
com temperatura entre 20 e 25ºC (T.A.) e sem teor de umidade.
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN

Preparação de Fucsina fenicada:
Fucsina básica 1g
Álcool a 95% 10ml
Fenol fundido 5g
Dissolver num gral o corante no álcool. Adicionar aos

poucos o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma
mistura bem homogênea. Juntar a água pouco a pouco, lavando o
gral.
Filtrar após 24 horas de repouso.
Ácido clorídrico
Álcool 95% 100ml
Ácido clorídrico (dens. 1,19) 1ml
Azul de Loeffler
A)Azul de metileno 10,3g
Álcool a 95% 30ml
B)Solução de hidrato de sódio a 0,01% 1ml
Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em água destilada.

Meios de Cultivo Bacteriano 16
_______________________________________________________________________
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO
Meios de cultivo são compostos de água e de nutrientes

essenciais ao crescimento de microrganismos.
Basicamente, um meio de cultivo deve conter além de
extrato de carne para o fornecimento de proteínas,
carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sódio.
A constituição de um meio de cultivo adequado é bastante
variada e depende das exigências nutricionais do
microrganismo.
Os meios de cultivo são utilizados para o isolamento e
identificação de microrganismos, testes para controle de
esterilização ambiental, análise de alimentos e de água, etc.
Os meios de cultivo podem ser preparados no laboratório
de microbiologia de duas formas: (1) a partir de seus
ingredientes básicos, (2) dos desidratados disponíveis
comercialmente, ou podem ser comprados prontos para uso em
tubos de ensaio ou placas de Petri.
Didaticamente, os meios de cultivo podem ser
classificados quanto à consistência e quanto à função.
a) Quanto à consistência: o meio pode ser líquido, semi-sólido

e sólido.
− Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão
dissolvidos em aquosa. São os caldos (“broth”).
− Meio semi-sólido: Esse meio possui na sua composição além
dos nutrientes, ágar (polissacarídeo extraído de algas
marinhas) a 0,5%.
− Meio sólido: É um meio que possui na sua composição
nutrientes e um teor de 1,5% de ágar. Apresentado em placas
ou tubos inclinados ou não.
b) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,

seletivo, diferenciador e de manutenção.
− Meio enriquecedor ou enriquecido: É aquele que permite o
crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de
fatores de crescimento.
Ex.: BHI, Ágar sangue, Ágar chocolate.
− Meio seletivo: É aquele que contém substâncias que inibem o
crescimento de certos microrganismos, sem impedir o
crescimento de outros.
Ex.: Ágar SS (Salmonella, Shigella)
− Meio diferenciador ou indicador: É empregado para detectar
colônias bacterianas com propriedades distintas. As
bactérias acidogênicas são conhecidas pela ação da cor do
indicador ácido-base adicionado ao meio. As bactérias que
hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas zonas claras
produzidas nos meios contendo suspensões de amido.
Bactérias hemolíticas são visualizadas pelas alterações
produzidas no ágar sangue. Os produtores de gás sulfídrico
_______________________________________________________________________
formam uma zona escura de sulfito ferro no meio contendo
excesso de ferro.
Ex.: Ágar EMB, Ágar sangue.
− Meio de manutenção: É um meio utilizado para estocagem e
deve ser de baixo teor nutritivo para evitar a rápida morte
celular, devido a eliminação de substâncias tóxicas
resultantes do metabolismo dos microrganismos.
Ex.: Ágar Nutriente.
Preparação:
Um fator que influencia na preparação do meio de cultivo
é a temperatura. Ao preparar um meio de cultivo não podemos
manter à temperatura ambiente uma solução não estéril por
mais de uma hora, devido a possibilidade de evaporação da
água e de crescimento microbiano. Alguns componentes são
utilizados pelos microrganismos e os demais, pelo efeito da
evaporação, se concentram. Após preparados os meios devem ser
esterilizados pelo processo de esterilização adequada.
Técnica
Preparação de meio líquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-
Infusion).
Componentes do meio:
Infusão de coração ................... 250g
Infusão de cérebro ................... 200g
Peptona ............................... 10g
Dextrose................................ 2g
Cloreto de Sódio ....................... 5g
Fosfato de Sódio ..................... 2,5g
Água destilada ...................... 100ml
Execução
a)Adicionar 100ml de água destilada aos ingredientes
previamente pesados;
b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen
ou forno de microondas;
c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml
por tubo. Colocar tampão de algodão em cada tubo;
d)Autoclavar (121ºC por 15 a 20 minutos).
Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou

Ágar Gelose.
Componentes do meio:
Extrato de Carne ....................... 3g
Peptona ................................ 5g
Ágar ................................. 15g
Água destilada ..................... 1000ml
_______________________________________________________________________
Conservação dos meios de cultivo
Após preparados, os meios devem ficar à temperatura

ambiente até o esfriamento total. Quando a quantidade de meio
preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve
ser armazenado em geladeira dentro de sacos plásticos para
evitar desidratação. Quando a quantidade de meio for grande e
não de uso imediato, deve ser distribuído em frascos com
rolha, selados com tampas de alumínio e logo após
autoclavados.
A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode
ser conservada à temperatura ambiente durante anos e outros
que contenham substâncias termolábeis em sua composição são
guardados em geladeiras.
Para usar frascos de meio líquido, abrimos o selo de
alumínio, retiramos a rolha de borracha com cuidados
assépticos e, em ambiente estéril, transferimos o meio para
tubos estéreis (através de pipetas).
Para usar frascos de meio sólido, fundimos o ágar
imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno
de microondas a temperatura de 100oC. Após a fusão do ágar
abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha e
transferimos o meio para tubos (através de pipetas estéreis)
ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura
ambiente.
Isolamento e Identificação de Bactérias Gram Positivas 19
_______________________________________________________________________
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS
Em se tratando de material clínico para ser submetido a

exame bacteriológico este deve ser colhido antes da
administração de antimicrobianos, porque se a bactéria for
sensível àquele antibiótico, dificilmente ela crescerá nos
meios de cultura. A bactéria poderá estar morta no momento da
colheita ou então ter o seu crescimento inibido pelo
antimicrobiano presente no material clínico.
1- ISOLAMENTO - As bactérias podem ser cultivadas in vitro em

meios de cultura que lhes forneçam todas as condições
nutricionais e ambientais necessárias ao seu crescimento.
As culturas são feitas pela semeadura dos materiais
clínicos em meios sólidos distribuídos em placa de Petri, em
tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.
Depois de semeados os meios devem ser incubados em
temperatura e atmosfera adequadas. O período de incubação
varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactéria.
A grande maioria das bactérias pode ser cultivada em 24 a 48
horas. Exceções são feitas para o cultivo de Neisseria (14-
16hs) e Mycobacterium (até 21 dias).
Material para colheita e isolamento:
Abaixador de língua
"Swab"
Ágar sangue
Procedimento:
Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto
da superfície do meio distribuído em placa e semear pela
técnica de estrias. Incubar a placa a 37ºC por 24h e fazer a
identificação bioquímica e diferenciação de atividade
hemolítica e enzimática.
2- IDENTIFICAÇÃO:
2-1 Gênero: Streptococcus
As espécies de maior interesse clínico são:

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus pneumoniae.
_______________________________________________________________________
Atividade hemolítica
Os estreptococos podem ser classificados de acordo com o
atividade hemolítica no no meio de ágar sangue em:
a)β-hemolíticos: quando lisam completamente as hemácias

(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona
clara ao redor da colônia.
b)α-hemolíticos: quando causam lise incompleta das
hemáceas com liberação de pigmento verde (redução da
hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor
da colônia.
c)γ-hemolítico: ausência de atividade hemolítica.
Morfologia celular:
Corados pelo método de Gram, aparecem como Gram
positivos esféricos ou lanceolados, de tamanho variável,
isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.
Diferenciação bioquímica:
Estreptococos α-hemolíticos
Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para
diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensível a optoquina)
de estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o
Teste de Solubilidade em Bile. As bactérias solúveis em Bile
são da espécie Streptococcus pneumoniae, as bactérias
insolúveis em Bile são de estreptococcos viridescentes.
Estreptococos β-hemolíticos
Os estreptococos β-hemolíticos elaboram carboidratos
grupo-específicos. Estes carboidratos são utilizados em
reações de precipitação com anti-soros específicos, que
possibilitem a separação dos grupos. Grupo A é representado
pelo Streptoccus pyogenes.
1. O Teste de sensibilidade à Bacitracina permite separar os
estreptococos do grupo A (cerca de 85%) dos demais grupos.
Nos resultados de identificação baseados nesta prova deve-
se indicar estreptococos β-hemolíticos do grupo A pelo
teste de Bacitracina.
2. Pyr Teste – Baseado na hidrólise enzimática da L-
pyrrolidonyl-beta-naphtylamide. Destina-se a identificação
do Streptococcus pyogenes. A hidrólise através da enzima L-
pyrroglutamyl-aminopeptidase, presente nesta bactéria é
verificada através da reação do PYR Reagente com a beta-
naphtylamide livre que forma uma base de SHIFF de coloração
vermelha-cereja.
_______________________________________________________________________
2-2 Gênero Staphylococcus
As três espécies de maior interesse clínico são:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus.
Morfologia celular
São cocos Gram positivos que podem apresentar-se
isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em
cachos.
Identificação e diferenciação
a)Atividade enzimática
Prova de coagulase:
A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura em
caldo. Incubar em banho-maria a 37ºC e verificar a intervalos
de 30 minutos, se há formação de coágulo. O Staphylococcus
aureus é produtor de coagulase.
O Staphylococcus epidermidis, não produtor de coagulase, é
usualmente considerado não patogênico mas pode estar
envolvido em certas situações clínicas: endocardite
bacteriana, em cirurgia com prótese, em transplante de medula
e em cateterismo venoso (Manual de Procedimentos Básicos em
Microbiologia Clínica – Ministério da Saúde).
b)Sensibilidade a novobiocina
Teste de novobiocina
Preparar uma suspensão em caldo e semear em ágar. Colocar um
disco de novobiocina (5mg), incubar a 37ºC por 24 horas e
verificar a formação de um halo de inibição de 14mm.
Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente a droga)
do S. epidermidis (sensível a droga). O S. saprophyticus é
causa relativamente freqüente de infecção do trato urinário
em pacientes jovens.
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 22
___________________________________________________________________________
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO
Introdução:
A análise da sensibilidade das bactérias aos agentes
antimiccrobianos está relacionada à várias técnicas ou
métodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a
sensibilidade e a resistência de determinado microrganismo a
antimicrobianos.
DETERMINAÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTÉRIAS
A identificação de bactérias isoladas de espécimens

clínicas necessita de teste complementar para determinar o
perfil de sensibilidade daquela espécie frente a
quimioterápicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas
disponíveis no combate àquela infecção, são estudadas por
grupos (aminoglicosídeos, betalactâmicos, fluorquinolonas,
macrolídeos, peptídeos e sulfas) e em concentrações
padronizadas (proporcionais às concentrações atingidas no
soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in
vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado
isolado bacteriano são selecionadas pela seletividade tóxica,
efeitos secundários, facilidade de administração (oral e
parenteral), e pelos custos do tratamento. Várias técnicas
foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby,
Bauer & Turck (1966) é utilizada mundialmente por apresentar
resultados rápidos e seguros.
Um segundo tipo de teste de sensibilidade é realizado
utilizando-se espécies não patogênicos, para fins de pesquisa
básica, quando se deseja estudar mecanismos de ação das
drogas ou modelos de resistência antimicrobiana ou ainda para
marcar uma população. Neste caso, são determinados os grupos
de drogas e a concentração mínima inibitória (CMI) por método
quantitativo.
Objetivos:
1) Avaliação da atividade e do espectro de ação de novos
agentes antimicrobianos;
2) Nos estudos de populações bacterianas, para estabelecer o
padrão de sensibilidade sob o efeito seletivo de
antimicrobianos;
3) Como marcadores epidemiológicos.
Fundamento: Substâncias antimicrobianas são incorporadas ao

meio de cultivo (líquido ou ágar), em concentrações
inibitórias para aqueles organismos sensíveis. A concentração
é dada em μg/ml ou Unidades Internacionais (UI).
___________________________________________________________________________
Métodos:
1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas
são bactericidas para determinada espécie bacteriana numa
determinada concentração. Ex.: Técnica de Kirby
Bauer(1966).
2.Quantitativo - Pesquisa que concentração de determinada
droga antimicrobiana é inibitória para uma espécie
bacteriana isolada. Determinação da concentração mínima
inibitória (CMI).
Método de difusão com disco (Técnica Kirby Bauer):

Difusão da droga, sob forma de disco ou comprimido na
superfície do meio sólido.
1. Padronização do inóculo bacteriano:
A partir da placa original da cultura bacteriana do
microrganismo a ser testado são transferidas 4 a 5 colônias
para um meio de cultura líquido (Caldo-Soja-Caseína, Caldo
BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a
4 horas. A densidade do inóculo deve ser comparada com a
escala de turbidez de McFarland (ácido sulfúrico + cloreto de
bário), equivalente a 104 bactérias por ml de meio.
2. Semeio: Realizado através de “swab” estéril embebido no

inóculo bacteriano e passado em toda a área da superfície do
meio ágar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar
secar por 2 minutos.
Com auxílio de uma pinça estéril colocar sob a
superfície do meio inoculado os discos de antibióticos em
pontos eqüidistantes (30 mm).
Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela
população bacteriana por 18-24h.
Leitura: Observar halo de inibição em torno do disco de

antimicrobiano. O diâmetro deste halo é medido em mm
(halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards). Para
cada agente antimicrobiano, o diâmetro do halo poderá ser
interpretado como sensível (S), resistente (R) ou
intermediário (I).
Teste E: Método de difusão mais avançado que permite estimar

a concentração mínima inibitória (CMI), a mais baixa
concentração de antibiótico que impede o crescimento
bacteriano. Uma tira revestida de plástico contendo um
gradiente de concentração do antibiótico, e a CMI pode ser
lida em uma escala impressa na tira.
Utilização de Drogas de baixa difusão: moléculas grandes e

polarizadas. Considerar pequenos halos como sensíveis.
Drogas de alta difusão: moléculas pequenas e apolares.

Considerar halos com maiores diâmetros que os padrões.
___________________________________________________________________________
Considera-se uma população sensível a determinada droga
quando esta população é inibida por concentração três ou mais
vezes inferior a concentração que a substância atinge no
sangue. Amostras resistentes são inibidas por concentrações
intermediárias.
Ex.: Droga X atinge concentração sérica de 32μg/ml.
Populações que são inibidas por 8μg são consideradas
sensíveis e aquelas inibidas por concentrações acima de 16μg
consideradas resistentes.
Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretação:

1.Utilização de meio muito ricos ou muito pobres em
composição de "simular" falsos microrganismos resistentes ou
sensíveis.
2.Utilização de inóculos muito concentrados (densos) e
formação de tapetes de células mortas entre bactérias vivas e
a droga.
3.Para algumas infecções como difteria (C. diphteriae),
meningite meningocócica não são realizados antibiogramas.
Utilizam-se drogas de escolha.
4.Devido a variabilidade de marcas de resistência a
drogas devem ser realizados sempre nas bactérias
Enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli
soropatogênicas e para Mycobacterium tuberculosis).
5.Observar a concentração da droga que impregna o papel
de filtro que compõe o disco ou comprimido.
6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.
Seleção de substâncias antibióticas:

Bactérias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,
Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para
Staphylococcus não precisa testar Ampicilina e Carbenicilina
(Produtores de betalactamases). A meticilina representa
betalactâmico (penicilina) não degradada pela betalactamase.
Bactérias gram negativas (Enterobacteriaceae):

Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas,
Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.
Infecções urinárias: Ampicilina, Ac. Nalidíxico,

Nitrofurantoínas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas.
Para infecções por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,

Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina.
Para infecções por cêpas de Anaeróbios: Bacteróides,

Peptococos, Fusobactérias e Clostrídios: Clindamicina,
Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.
Microrganismos de referência
Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.
coli (ATCC25922).
___________________________________________________________________________
Teste esses microrganismos de referência, pelo método
que foi descrito, usando discos de antibióticos
representativos daqueles a serem empregados no teste de
isolados clínicos.
Comparações de resultados para os microrganismos-

controle de teste para teste oferecem uma verificação na
reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos
discos-teste.
Limitações do método
O método de interpretação descrito aqui se refere a
patógenos de crescimento rápido e não deve ser aplicado a
microrganismos de crescimento lento, para os quais os
critérios dos halos não são apropriados. E para antibióticos
que se difudem lentamente em ágar, ex: polimixina B.
___________________________________________________________________________
Tabela 1.
Limites para interpretação do antibiograma com 24
antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica.
Zonas de inibição (em mm)
Antibacteriano Símb. Conc. Resistente Interme Sensível
disco diário
Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou mais
Ampicilina ao
testar
microrganismos AP 10mcg 11 ou menos 12-13 14 ou mais
Gram-negativos e
enterococos
Ampicilina ao
testar
estafilococos e AP 10mcg 20 ou menos 21-28 29 ou mais
microrganismos
sensíveis à
penicilina G
Ampicilina ao
testar Haemophilus AP 10mcg 19 ou menos ___ 20 ou mais
sp.
Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou mais
Carbenicilina ao
testar Proteus sp. CR 100mcg 17 ou menos 18-22 23 ou mais
E E. coli.
Carbenicilina ao
testar Pseudomonas CR 100mcg 13 ou menos 14-16 17 ou mais
aeruginosa
Cefalotina ao
relatar 18 ou mais
sensibilidade a CF 30mcg 14 ou menos 15-17
todas as
cefalosporinas
Clindamicina ao
relatar
sensibilidade à CL 2mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais
clindamicina e à
lindomicina
Cloranfenicol CO 30mcg 12 ou menos 13-17 18 ou mais
Colistidina CL 10mcg 8 ou menos 9-10 11 ou mais
Eritromicina EL 15mcg 13 ou menos 14-17 18 ou mais
Estreptomicina ET 20mcg 11 ou menos 12-14 15 ou mais
Gentamicina GN 20mcg 12 ou menos 13-14 15 ou mais
Konanilcina KN 30mcg 13 ou menos 14-17 18 ou mais
Nalidíxico, ácido AN 30mcg 13 ou menos 14-18 19 ou mais
Neomicina NO 30mcg 12 ou menos 13-16 17 ou mais
Nitrofurantoína NT 300mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais
Novoblocina NV 30mcg 17 ou menos 18-21 22 ou mais
Oxocilina OX 6mcg 9 ou menos 10-13 14 ou mais
Penicilina G. ao
testar PN 10un. 20 ou menos 21-28 29 ou mais
Estafilococos
Penicilina G. ao
testar outros PN 10un. 11 ou menos 12-21 22 ou mais
microrganismos
Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou mais
Sulfazotrin
(Sulfatomoxazol + SFT 25mcg 10 ou menos 11-15 16 ou mais
Trimetoprin)
Sulfonamidas SF 300mcg 12 ou menos 13-16 17 ou mais
Tetraciclina TT 30mcg 14 ou menos 15-18 19 ou mais
Tobramicina TB 10mcg 12 ou menos 13-14 15 ou mais
Vancomicina VC 30mcg 9 ou menos 10-11 12 ou mais
Isolamento e Identificação de Bactérias Gram Negativas 27
___________________________________________________________________________
VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
As bactérias Gram-negativas incluem vários gêneros de

bacilos fermentadores de carboidratos (Enterobactérias) ou
não fermentadores de carboidratos (Ex.: Pseudomonas,
Acinetobacter). Os bacilos mais freqüentemente isolados de
amostras clínicas em laboratórios de microbiologia pertencem
a família Enterobacteriaceae e são denominados
enterobactérias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus,
Serratia, etc.). Esses bacilos estão amplamente distribuídos
na natureza e são encontrados principalmente no trato
intestinal do homem e de animais.
O isolamento e identificação das bactérias Gram-
negativas baseiam-se principalmente em reações bioquímicas
que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo
bacteriano.
1 - ISOLAMENTO
Para o isolamento dos bacilos Gram-negativos são
utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.
a) Meios de isolamento
Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Hektoen (HE), Ágar
MacConkey, Ágar Verde Brilhante, Ágar Eosina Azul de Metileno
(EMB), Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Bismuto
Sulfito.
b) Técnica de semeio para isolamento

Transferir o inóculo bacteriano para um ponto da
superfície do meio de cultivo distribuído em placa e semear
pela técnica de estrias utilizando a alça de platina
flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a
diferenciação e identificação bioquímica.
2 - IDENTIFICAÇÃO (Provas bioquímicas)
2-1. Fermentação de carboidratos (lactose, sacarose,

glicose)
Nos sistemas de provas bacteriológicas o processo de

fermentação é detectado por observação visual das mudanças de
cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos ácidos
são formados pelas bactérias.
a) Princípio
Os testes de fermentação de carboidratos determinam a
capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado
___________________________________________________________________________
açúcar, incorporado numa concentração de 0,5 a 1,0% em meio
base de vermelho de fenol, produzindo ácidos com ou sem gás.
b) Meio: base de vermelho de fenol

Indicador de pH: Vermelho de fenol
Ácido (cor amarela) - pH < 6,8
Alcalino (cor rosa) - pH > 8,4
Neutro (cor laranja) - pH = 7,4
c) Técnica
Transferir, com alça de platina estéril, uma colônia
bacteriana isolada para o meio líquido vermelho de fenol
adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC
por 18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: cor amarela -- presença de ácido (carboidrato
fermentado)
NEGATIVO: cor rosa -- ausência de ácido (Carboidrato não
fermentado)
2-2 Ágar TSI (Ágar Tríplice-açúcar-ferro)
a) Princípio
No meio TSI distribuído em tubos de ensaio observa-se a
fermentação ou não dos açúcares (lactose, glicose e sacarose)
pelas bactérias Gram-negativas, com produção ou não de gás
CO2. Também pode se observar a formação de H2S (gás sulfídrico
ou sulfeto de hidrogênio) pela sua reação com o sulfato
ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de
sulfeto ferroso que se manifesta por uma reação visível de
cor negra.
b) Meio TSI
Neste meio, além do ágar e das fontes de carbono e de
nitrogênio, também estão presentes o tiossulfato de sódio que
é uma fonte de enxofre para a produção de H2S e o indicador
de pH vermelho de fenol,que já foi visto no tópico anterior.
c) Técnica
Transferir a colônia bacteriana isolada para o meio TSI,
utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculação
deverá ter a profundidade de 2/3 do meio em uma única picada.
Em seguida, fazem-se estrias na superfície inclinada. Incubar
a 37oC por 18-24h.
d) Resultado e interpretação
O resultado é obtido pela visualização da mudança de cor
no pico (superfície inclinada) e no fundo (profundidade) do
tubo de ensaio contendo o ágar TSI:
___________________________________________________________________________
• Pico alcalino/fundo alcalino - Ausência de fermentação dos
açucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.
• Pico alcalino/fundo ácido - Fermentação apenas da glicose.
Ex: Shigella.
• Pico alcalino/fundo ácido e negro - Fermentação da glicose
e produção de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter.
• Pico ácido/fundo ácido - Fermentação dos três açucares. Ex:
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros
componentes do grupo coliforme.
2-3. Motilidade
a) Princípio e meio
O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade
bacteriana deve ser semi-sólido (0,5% de agar) para permitir
a difusão de bactérias móveis.
b) Técnica
Inocular em uma única picada a colônia bacteriana
isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estéril.
Incubar a 37oC por 18-24h.
c) Resultado
A motilidade bacteriana é detectada pelo exame
macroscópico do meio para se observar uma zona de crescimento
difuso (turbidez) que parte da linha de inoculação feita com
a agulha de platina.
2-4. Citrato
a) Princípio
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o
citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo e
crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrogênio
presente no meio também será, havendo liberação da amônia com
a conseqüente alcalinização do meio.
b) Meio: Ágar Citrato de Simmons

Este é um meio sólido no qual a única fonte de carbono é
o citrato de sódio, tendo como indicador de pH o azul de
bromotimol.
c) Técnica
A bactéria em estudo é inoculada na superfície do ágar
inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfície do meio,
utilizando-se a alça de platina flambada. Incubar a 37oC por
18-24h ou até 3 dias, se necessário.
d) Resultado
POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilização do citrato
___________________________________________________________________________
NEGATIVO: meio verde (neutro) - Não utilização do citrato
2-5. Teste da lisina descarboxilase
a) Princípio
Determinar a habilidade enzimática de uma determinada
bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a
subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina
alcalina (cadaverina).
b) Meio LIA (Ágar lisina ferro)

Este meio contém como indicador o púrpura de
bromocresol:
Ácido: cor amarela -- pH < 5.2
Neutro a básico: cor púrpura -- pH = 6.8
c) Técnica
A bactéria teste é inoculada em uma única picada no meio
LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina
estéril. Em seguida, fazem-se estrias na superfície
o
inclinada. Incubar a 37 C por 24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio púrpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilação
da lisina e conseqüente formação de aminas.
NEGATIVO: meio amarelo (ácido) - Não ocorreu a descarboxilação

da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria
fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.
2-6. Teste de Indol
a) Princípio
Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol
a partir da molécula de triptofano. Quando ocorre a
degradação deste aminoácido por bactérias que possuem a
enzima triptofanase ocorre a formação de: Indol, ácido
pirúvico e amônia. Este teste é útil para diferenciar a
E.coli (indol positiva) de outras enterobactérias.
b) Meio e reativo
• Caldo Triptofano
• Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composição: p-
dimetilaminobenzaldeído, HCL concentrado, álcool
isoamílico (Kovac), álcool etílico absoluto (Ehrlich).
c) Técnica
Inocular o caldo triptofano com a bactéria em estudo e
incubar a 37oC por 18-24h. Em seguida, adicionar gotas do
reativo de Kovac no tubo.
d) Resultado
___________________________________________________________________________
O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície do
meio após a adição do reativo indica a presença de indol e
uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de
álcool quando o indol produzido reage com o p-
Dimetilaminobenzaldeído presente nos reativos de Ehrlich ou
de Kovac.
2-7. Teste de urease
a) Princípio
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar
enzimaticamente a uréia pela urease com a formação de duas
moléculas de amônia (NH3), resultando na alcalinização do
meio.
b) Meio caldo uréia

Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,
já visto anteriormente.
c) Técnica
Inocular o caldo uréia com uma alça de platina carregada
de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por
18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presença de urease
NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausência de urease
3 – MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO AUTOMATIZADOS
3-1. Sistema API 20E (bio Mérieux) – Identificação de

Enterobactérias
O sistema de identificação API 20E consiste em tiras

plásticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contêm os
substratos desidratados (meio de identificação bioquímica) e
uma câmara plástica de incubação com tampa frouxa. Cada
compartimento possui um pequeno orifício superior através do
qual a suspensão bacteriana diluída em solução salina ou água
destilada estéril pode ser inoculada com uma pipeta. A ação
bacteriana sobre o substrato produz mudança de cor que é
interpretada visualmente em 24 horas a 35ºC. O fabricante
fornece folhas de trabalho para registro das interpretações
visuais das reações coloridas, que em seguida são convertidas
em número do biótipo de 7 dígitos, levando a identificação da
espécie bacteriana.
Os 20 substratos incluídos para identificação de
enterobactérias são: ONPG, arginina diidrolase, lisina
descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de
hidrogênio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-
___________________________________________________________________________
Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol,
ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.
Pelo sistema API 20E são identificadas mais de 100
espécies de bactérias Gram-negativas. Esse sistema é um dos
mais utilizados nos laboratórios clínicos e de pesquisa.
Obs: Também são comercializados outros sistemas API para
identificação de bactérias Gram-positivas.
3-2. Sistema VITEK

O sistema VITEK (bio Mérieux) é um sistema
computadorizado que consiste em um módulo gerador de vácuo,
leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de
computador. Este sistema é utilizado com cartões de teste
VITEK para identificação bacteriana e provas de
susceptibilidade a antibióticos, totalmente automatizadas.
Este sistema permite a identificação de enterobactérias em 8
horas, sendo aceito como um método confiável para
identificação rápida de bacilos Gram negativos nos
laboratórios de microbiologia clínica.
Cada cartão de identificação possui 30 testes
bioquímicos que não necessita adição de reagentes, evitando
erros. VITEK é capaz de detectar mais de 300 espécies de
microrganismos (bactérias Gram-negativos e Gram-positivos e
leveduras).
Aspectos Microscópicos e Macroscópicos dos Fungos 33
________________________________________________________________________
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS
Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos,

obtendo sua alimentação a partir de matéria orgânica
inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos.
Estes microrganismos causam doenças humanas, em animais e
vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou
mofos) e as leveduras. Os bolores são filamentosos e
pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma
unicelular.
Conhecer os aspectos microscópicos e macroscópicos dos
fungos é de extrema importância para a identificação destes
organismos que são agentes etiológicos de processos
infecciosos, de reações de hipersensibilidade imediata e
tardia e produtores de micotoxinas.
A coleta do material é o primeiro passo para
obtenção de um resultado laboratorial confiável. Deve-se
sempre questionar o paciente em relação ao uso de medicações
antifúngicas tópicas e/ou sistêmicas. Caso o paciente esteja
fazendo uso da medicação, o mesmo deverá ser orientado a
suspendê-la por um período de 15 dias, em caso de uso tópico
e 1 mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico. Esta
suspensão deve ser realizada com autorização médica.
É de grande importância que todos os espécimes
clínicos encaminhados para diagnóstico laboratorial, venham
acompanhados de uma ficha, que contenha no mínimo as
seguintes informações: identificação e procedência do
paciente, tempo de evolução da lesão, localização e aspectos
clínicos da lesão, possíveis contatos com animais e solo, uso
de drogas.
1)ASPECTOS MICROSCÓPICOS DOS FUNGOS
1.1- Exame microscópico direto
O diagnóstico microbiológico e imunológico das micoses

pode ser feito pelo exame microscópico direto, exame
histopatológico, cultivos, testes intradérmicos, pesquisa de
anticorpos séricos e de antígenos. O exame microscópico
direto é o método mais usado no diagnóstico de rotina das
micoses por ser rápido e sensível, permitindo a visualização
do fungo e em muitas ocasiões, sua identificação. É
importante salientar que a realização do cultivo
paralelamente ao exame direto é imprescindível para um
completo diagnóstico laboratorial micológico.
A técnica de preparação para o exame direto, varia de
acordo com o material biológico a ser investigado e da
suspeita clínica da etiologia do processo.
♦ Preparação do exame direto com amostras clínicas densas

(p.ex.: escamas epidérmicas, ungueais e pêlos):
________________________________________________________________________
a) Clarificar a amostra clínica, já sobre a lâmina, com 1 gota

da solução de hidróxido de potássio (KOH) a 10-20%;
b) Aquecer suavemente a lâmina na chama do bico de Bunsen; o
calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina
presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar
10 minutos, tempo necessário para clarear o material de
fundo.
c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodão
(ou azul de Amann);
d) Cobrir com lamínula;
e) Examinar ao microscópio com objetiva de 40X.
Exemplos de algumas características morfológicas dos
fungos:
célula brotante
Pseudo-micélio Hifa cenocítica Hifa septada
Hifa artrosporada
Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp
A- Macroconídeos
B- Microconídeos
________________________________________________________________________
♦ Preparação da lâmina a partir do cultivo de fungos:
a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-algodão;

b) Retirar uma pequena porção da colônia (do micélio
reprodutivo ou aéreo, no caso dos fungos filamentosos) e
colocar sobre a lâmina;
c) Cobrir com lamínula;
d) Observar ao microscópio com objetiva de 40X.
Após o preparo da lâmina podemos visualizar os aspectos
microscópicos dos fungos.
Observações:
9 As amostras de consistência líquida e relativamente claras
podem ser examinadas diretamente ao microscópio após a
mistura em uma gota de solução salina em lâmina de vidro.
9 A utilização do corante lactofenol azul-algodão é
importante porque o fenol inviabializa os microrganismos
vivos e o azul-algodão cora a quitina, presente nas paredes
das células fúngicas.
1.2- Aspectos microscópicos dos fungos filamentosos ou bolores

O fungo filamentoso se origina a partir de um esporo,
que emite um filamento tubular microscópico, chamado hifa,
que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas
denominado micélio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo
(aéreo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou
septos e são chamadas hifas septadas, outras não possuem
septos e são chamadas hifas cenocíticas .
Microscopicamente, os bolores são identificados
principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificação
e hifas. Os esporos são muito importantes na classificação
dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente,
pelas características morfológicas dos esporos.
A análise conjunta das características microscópicas,
em geral, permite a classificação genérica do fungo. A
definição da espécie, geralmente, é tarefa de laboratórios de
referência.
1.3- Aspectos microscópicos das leveduras

Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares
com forma oval ou arredondada. A reprodução assexuada das
leveduras ocorre principalmente por gemulação ou brotamento.
Algumas vezes, após a gemulação, as leveduras e as células-
filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como
pseudomicélio (p.ex., Candida). As leveduras também podem se
reproduzir sexuadamente através de ascosporos ou
basidiosporos. Portanto, a observação microscópica de
estruturas assexuadas e sexuadas é bastante empregada na
identificação genérica das leveduras.
________________________________________________________________________
2) ASPECTOS MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS (Observação macroscópica
das colônias em meio sólido).
Ao contrário do que se verifica no estudo das
infecções bacterianas, em que o cultivo é o principal método
diagnóstico, nas infecções fúngicas ele é um complemento do
exame microscópico direto. As razões que podem contribuir
para isso, são o crescimento lento dos fungos e as
dificuldades para cultivar alguns deles.
O isolamento primário, seguido da correta
identificação dos agentes etiológicos, é uma condição
indispensável para o diagnóstico laboratorial das micoses, e,
para tanto, a escolha do meio de cultura adequado é uma
tarefa de extrema importância.
Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser
utilizada num laboratório de micologia, atendendo a diversos
fins, tais como: isolamento primário do fungo a partir dos
espécimes clínicos, a identificação taxonômica dos gêneros e
espécies, a estocagem e manutenção em micoteca, e, mais
recentemente a execução de testes de susceptibilidade frente
a diferentes antifúngicos.
A seleção do meio a ser empregado deve, basicamente,
levar em consideração o tipo de amostra biológica a ser
semeado e a suspeita clínica.
Apesar da variedade de meios de cultivo
disponíveis(muitos vendidos pronto para uso, outros
preparados artesanalmente), o ágar Sabouraud ainda é o meio
mais utilizado dentro de um labotatório de micologia. A esse
meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o
cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o
isolamento em espécimes clínicas possivelmente contaminadas
por bactérias e fungos anemófilos (fungos que apresentam suas
estruturas de reprodução comumente vetorizadas por correntes
de ar). O meio de Sabouraud é o principal meio de cultura
utilizado na micologia médica. É utilizado para o cultivo
primário geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns
dimórficos), emespecial para Dermatofítos, uma vez que as
principais características macro e microscópicas desse
grupamento fúngico são descritas a partir do seu crescimento
nesse meio.
Porém é importante salientar que alguns fungos
filamentosos dos gêneros Aspergillus, Fusarium,
Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcus
neoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido na
presença da cicloeximida.
As características principais deste meio são o seu pH
ácido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna mais
seletivo para fungos, dificultando o crescimento bacteriano.
Entretanto, o meio não é totalmente impediente para
bactérias, por esta razão deve ser acrescido de antibióticos
que inibem o crescimento destes microrganismos. O
clorafenicol é um dos antibióticos mais utilizados, pela
comodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado na
autoclave e pelo seu amplo espectro de ação.
________________________________________________________________________
A composição do ágar Sabouraud foi,inicialmente
proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904,
e vem apresentando diversas modificações com o passar dos
anos, com alterações na quantidade de alguns componentes,
tais como a dextrose e a adição de substâncias inibidoras ,
como o clorofenicol e a cicloeximida.
COMPOSIÇÃO DO MEIO ÁGAR SABOURAUD:

Dextrose (glicose) ---- 20g
Peptona -------------- 10g
Ágar ------------------ 20g
Água ---------------- 1.000ml
pH final = 5.6
Dissolver agar, peptona e dextrose em água destilada,

aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a
121°C.
OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOS

FUNGOS: ágar batata dextrose, ágar malte, ágar fubá, ágar
extrato de levedura glicose, etc.
________________________________________________________________________
2.1- Aspectos macroscópicos dos fungos filamentosos
A morfologia das colônias dos fungos filamentosos é um
importante dado e pode auxiliar bastante em sua
identificação. Para isso são feitas observações quanto à
textura, cor, topografia, consistência, contorno da colônia,
etc.
TEXTURA– A textura da colônia refere-se às características

dos micélios aéreos em seu conjunto e pode ter aspecto:
• ALGODONOSO OU COTONOSO: micélio aéreo denso e alto;
• AVELUDADO: micélio aéreo baixo, lembrando veludo;
• PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido
à densa produção de conídias;
• CÉREO OU GLABROSO: superfície lisa, pois não produzem
micélio aéreo.
COR- A colônia pode ser branca, amarelada, acinzentada,

alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso e
anverso da colônia e os anéis concêntricos de diferentes
cores são aspectos a serem considerados na identificação.
CONSISTÊNCIA- A colônias pode ser pastosa, branda, coriácea,

mole, etc.
CONTORNO- A colônia pode ser circular, oval, elíptica,

irregular, etc.
2.2- Aspectos macroscópicos das leveduras

A maioria das leveduras cresce adequadamente a 30oC ou
à temperatura ambiente em ágar Sabouraud. Características
como cor, consistência, bordos, superfície e topografia
também são observadas em meios de cultivo sólidos. Com 2 a 3
dias de incubação formam-se colônias de cor branca a creme,
amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa,
mucóides ou secas, lisas ou enrugadas.
A habilidade da levedura crescer a 37oC é uma
característica importante; a maioria das leveduras
patogênicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprófitas não
crescem em temperaturas mais elevadas.
________________________________________________________________________
ASPECTOS DAS COLÔNIAS FÚNGICAS QUANTO AO RELEVO

1. Cerebriformes
2. Rugosas
3. Apiculadas
4. Crateriformes
___________________________________________________________________________
ASPECTOS DE COLÔNIAS FÚNGICAS QUANTO À TEXTURA

1.Algodonosas
2.Furfuráceas
3.Penungentes
4.Arenosas
5.Veludosas
6.Glabrosas
Reações Antígeno - Anticorpo 41
VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO
Introdução teórica
A exposição de epítopos (antígenos=imunógenos) a um

sistema de células e tecidos imunologicamente competentes,
origina estimulação de linfócitos B e T . Os primeiros(LB),
diferenciam-se após divisões mitóticas, em plasmócitos que
são células munidas de um Sistema de membranas (Golgi e
RE)próprios de células produtores e secretoras de proteínas.
Estas proteínas são glicoproteínas globulares com função de
se combinar quimicamente com os elementos que formam parte do
epítopo que deu origem a todo este fenômeno celular e
secretor.
Os linfócitos T, ao serem estimulados, secretam
interleucinas, que são proteínas cuja função é estimular
outros linfócitos T e B (interleucinas 2,4) macrófagos, NK,
linfócitos citotóxicos (interferon gama)por exemplo.
Apenas discutiremos, por enquanto, a ação das
globulinas produzidas pelos plasmócitos: Os anticorpos ou
imunoglobulinas.
AÇÕES IN VITRO: Reações antígeno anticorpo
Estas acontecem entre a porção Fab das moléculas de

anticorpo e o epítopo dos imunógenos. Nesta porção Fab, é que
se estabelecem ligações não covalentes fracas como :pontes de
Hidrogênio, ligações eletrostáticas, hidrófobas e mediante
forças de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligações que
se estabelecem e mantêm unidos o complexo antígeno-
anticorpo, fica fácil entender o conceito de especificidade,
pois somente poderão se formar estas ligações em número
suficiente para se manterem estáveis, SE O ANTICORPO
REALMENTE FÔR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPÍTOPO. Se as ligações se
formam também a nível de estrutura primária e secundária do
anticorpo, formando numerosas ligações de curto alcance, o
complexo é estável.
Então, numa primeira instancia, deve haver interação

química entre imunógeno (antígeno quando falamos de reação in
vitro
E FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande número de
moléculas do complexo antígeno-anticorpo, tendem a formar
malhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros ou
como sedimento fino, dependendo da condição física do
antígeno. Se particulado (hemácias, bactérias, protozoários)
se observam grumos; se solúvel, se forma fino precipitado com
o imunocomplexo.
ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES:
¾ Através das reações sorológicas pode-se pesquisar
anticorpos contra um determinado antígeno bacteriano,
parasitário, micótico, ou até mesmo contra componentes do
próprio indivíduo como acontece nas doenças autoimunes.
Nestes casos ,variações no título de anticorpos indicam
evolução ou involução da doença ou infecção. Já ,quando
interessa utilizar estas reações para detectar antígenos
circulantes no soro ou plasma, basta saber se estes existem
ou não, as reações podem ser apenas qualitativas. Se quiser
quantificar o antígeno, basta comparar o resultado com
concentrações de padrões bem quantificados.
¾ Título: é a maior diluição do soro que ainda reage
positivamente numa reação antígeno-anticorpo. Assim, um
alto título indica uma grande quantidade de anticorpos(foi
necessário diluir muito os anticorpos presentes para que
estes desaparecessem na unidade de volume pré-fixada. Ex.:
título 1/10<1/455.Este último contém mais anticorpos que
1/10,pois foi necessário diluir os soros 455 vezes, para
que não ficasse mais anticorpos no tubo de ensaio.
¾ Sensibilidade da reação; Qualidade de uma determinada
técnica, que permite detectar pequenas quantidade s de
antígeno ou anticorpo no material analisado. Por exemplo,as
técnicas imunoenzimáticas, detectam <1μg de anticorpo ou
antígeno, enquanto que as reações que utilizam
radioimunoensaio, detectam anticorpos ou antígenos na ordem
de picogramas.
¾ Especificidade: Qualidade de uma técnica que permite que a
reação antígeno anticorpo aconteça com epítopos que são
exclusivos de uma determinada doença. Quando há reação com
outros epítopos, outros anticorpos também entram a somar na
reação, e estamos frente a reações cruzadas ou falso
positivas
¾
REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO DIRETA
Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas
antigênicas insolúveis em sua forma integra ou fragmentada.
Hemácias, bactérias, fungos e protozoários podem ser
aglutinados diretamente por anticorpos.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÀO
Ao reagir antígenos solúveis com seus respectivos anticorpos,
formam se redes que tendem a precipitar. Nesta reação é
possível observar que as reações antígeno-anticorpo dependem
das concentrações do antígeno e dos anticorpos presentes.
Assim se formará um complexo estável quando Antígeno e
anticorpo estejam em concentrações equivalentes, de outro
modo, haverá dissolução do complexo e o precipitado não se
forma, embora haja Ag e Ac.
As reações de precipitação hoje em dia, são executadas em
meios semi sólidos como géis de agarose (gel neutro,
incolor).
Tanto antígeno e anticorpo podem difundir neste meio,
dependendo do seu tamanho molecular, até encontrar as
proporções ótimas de antígeno anticorpo, então precipitam
formando linhas ou halos de precipitação no local. Varias
aplicações existem na rotina laboratorial para estas
técnicas:
Imunodifusão radial
Imunodifusão dupla
Imunoeletroforese
Contra imunoeletroforese
REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO –TÉCNICA DE VDRL
Teste não treponêmico para o diagnóstico de Sífilis: VDRL
A técnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory)

é um exemplo de reação de floculação, cujo objetivo é a
pesquisa de anticorpos em um indivíduo com suspeita de
sífilis, sendo esta doença causada pela espiroqueta Treponema
pallidum sub-espécie pallidum.
A técnica de VDRL pode ser realizada através dos métodos
qualitativo e quantitativo. É utilizada como triagem
sorológica para a pesquisa de anticorpos em um indíviduo com
suspeita de sífilis e também para acompanhamento da resposta
terapêutica do paciente positivo, através da titulação dos
anticorpos. A cardiolipina é o antígeno utilizado na técnica
que pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de um
fosfolípideo que atualmente é preparado a partir do coração
bovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente,
ocorre produção de um anticorpo denominado “reagina” na
sífilis, que reage com este complexo de cardiolopina-
lipoproteína. Não se sabe exatamente por que a reagina é
produzida; todavia, não se trata de um anticorpo específico
contra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substância
lipóide, e é possível que esta substância seja
suficientemente semelhante ao complexo de cardiolipina-
lipoproteína para que os anticorpos produzidos contra o
antígeno lipóide dos espiroquetas também possam reagir com a
cardiolipina.
Um fato de grande importância nesse teste de triagem
sorológica para Sífilis , é que nem todo sifilítico comprovado
através de provas treponêmicas, produz reação positiva para
essa prova de VDRL. Outro dado de grande importância
laboratorial, é o fato de cerca de 2% de pacientes na sífilis
primária e secundária serem falsamente negativos devido a um
excesso de antígenos (fenômeno conhecido como pró-zona).
Devido a esta ocorrência a OMS, sugeriu a realização desse
teste de triagem, qualitatiamente e quantitativamente na
diluição de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meio
de diagnóstico laboratorial.
Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falso-
positivos, sem possuir a doença ou terem se submetido a algum
tipo de exposição. Segue abaixo as principais causas de
resultados falso-positivos:
1. Infecções virais ou bacterianas e em muitos estados
febris, como hipersensibilidade ou vacinação;
2. Doenças sistêmicas crônicas, com presença de anticorpos
antifosfolípideos;
3. Doenças reumatóides do colágeno;
4. Doenças infecciosas como Malária e Tuberculose;
5. Doenças treponêmicas não-sifilíticas, como bouba,
pinta, Borrelia (doença de Lyme) ou febre recidivante.
Material para um grupo
Método qualitativo
VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automática

de 50 μl, lâminas, luva descartável, óculos protetor.
Procedimento:
• Sobre a lâmina limpa marcar retângulos.
• Colocar 50 μl de da amostra do soro positivo e do soro
negativo.
• Colocar uma gota do antígeno (cardioplina).
• Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivém
para que ocorra a reação Antígeno-Anticorpo e observar a
presença ou não de floculação na lâmina.
Leitura dos resultados:

O resultado observado pela floculação que ocorrerá,
poderá ser uma floculação leve, moderada ou intensa,dependerá
da presença do título dos anticorpos no soro do indivíduo.
TESTE RÁPIDO DE TRIAGEM QUALITATIVA PARA DETECÇÃO DE
ANTICORPOS PARA HIV 1/2.
O teste rápido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos é um teste de

triagem, que usa um coquetel de antígenos para detectar
anticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue total
humano. O teste se baseia nas tecnologias de
imunocromatografia e fluxo lateral.
Resumo:
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é um retrovírus,
identificado em 1983 como agente etiológico da Síndrome de
Imunodeficiência Adquirida. A AIDS é caracterizada por
alterações em função e número na população de linfócitos T (T
helper), que desempenha um papel chave na resposta
imunológica do hospedeiro humano, deixando os portadores
deste vírus suscetíveis a infecções oportunistas e certas
malignidades.
O HIV é constituído por uma molécula de RNA, protegida
por um capsídeo e um envelope. O envelope do vírus é o
principal alvo da resposta imune. A presença do vírus faz com
que o sistema imune dos pacientes produza anticorpos anti-
HIV. A detecção destes anticorpos deve ser usada como parte
do diagnóstico laboratorial para o HIV 1/2. Ensaios de ELISA,
Imunofluorescência, Western Blot, técnica da Cadeia de
Polimerase (PCR) entre outros, complementam o diagnóstico
laboratorial definitivo para AIDS.
PRINCÍPIO DO TESTE:
O Teste Rápido HIV- 1/2 – Bio-Manguinhos emprega a
combinação de uma proteína conjugada com partículas de ouro
coloidal e antígenos de HIV 1/2 ligados a uma fase sólida
(membrana). A amostra é aplicada ao respectivo poço (S),
seguida da adição de um tampão de corrida. O tampão
proporciona o fluxo lateral dos componentes liberados,
promovendo a ligação dos anticorpos aos antígenos. Os
anticorpos presentes, em casos positivos, se ligam às
proteínas específicas conjugadas ao ouro coloidal. No caso de
uma amostra ser positiva o complexo “imuno-conjugado” migra
na membrana de nitrocelulose, sendo capturado pelos antígenos
fixados na área do TESTE(T), produzindo uma linha roxo/rosa.
Na ausência de anticorpos para HIV 1/2, a linha não aparece
na área do teste. Nos dois casos, a amostra continua a migrar
na membrana produzindo uma linha roxo/rosa na área de
CONTROLE(C), o que caracteriza o funcionamento adequado dos
reagentes.
COLETA DA AMOSTRA:
O teste Rápido HIV 1/2, Bio-Manguinhos é realizado com soro,
plasma, ou sangue total humano.
Soro: o soro é obtido do sangue total coletado assepticamente

por punção venosa em tubo sem anticoagulante. Aguardar o
sangue coagular a temperatura ambiente e centrifugar a
2000rpm, durante 10 minutos. Separar o soro do coágulo para
evitar hemólise.
Plasma: coletar o sangue total em tubo com anticoagulante,

centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos e separar o plasma
sobrenadante.
Sangue total: Coletar o sangue em tubo com EDTA, heparina ou

citrato de sódio. Para sangue de ponta digital, utilizar a
lanceta, conforme as instruções, desprezando a primeira gota.
Coletar a segunda gota com a alça coletora descartável.
Para todos os materiais, seguir as instruções do procedimento

do teste, como demonstrado a seguir.
Procedimento para interpretação dos resultados a seguir:

Referências Bibliográficas 50
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. AMATO NETO, V. et al. Antibióticos na Prática Médica.
2. BAILEY, R. et al. Diagnóstico Microbiológico.Editora médica Pan

Americana S.A 1973. 3a ed.
3. JAWETZ, E. et al. Microbiologia Médica. 18. ed. Guanabara

Koogan, 1996.
4. KONEMAN E.W.; ALLEN S.D.; JANDA W.M.; SCHRECKENBERGER P.C. & WINN JÚNIOR W.C.
Diagnóstico Microbiológico Texto e Atlas colorido 5aed. Medsi,
2001.
5. LACAZ, C.L. Micologia Médica, 1995.
6. PELCZAR M.J., CHAN E.C.S; KRIEG N.R. Microbiologia: conceitos e

aplicações. v.1, 2a ed. Makron Books, 1996.
7. ROITMAN, I. Tratado de Microbiologia. Vol. 1.
8. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O F.; CANDEIAS J.A N.;

Microbiologia. 3a. ed. Atheneu, 2002.
9. RAVEL, Richard. LABORATÓRIO CLÍNICO: APLICAÇÕES CLÍNICAS DOS

DADOS LABORATORIAIS. 6ª edição. Editora Guanabara Koogan, 1995.
10. SIDRIM, J.J.C & ROCHA, M.F.G. MICOLOGIA MÉDICA À LUZ DE

AUTORES CONTEMPORÂNEOS. Editora Guanabara Koogan, 2004.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE

II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS -------------------------------------------- 9

III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16

IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS -------------19

V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO ---------------22

VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS ------------27

VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS -----------------33

VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO --------------------------------------------------37

IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------41

Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes

⇒ ESTERILIZAÇÃO POR MÉTODOS FÍSICOS

3. Filtração - É um processo usado para esterilização de

• Glutaraldeído 2% - As soluções de glutaraldeído são

12 horas. Para materiais de implantes e próteses se

Precauções - As precauções recomendadas para estas soluções

um processo de esterilização, uma vez que esporos e

– Álcoois - soluções a 70% e 80%

1. A escolha do processo de esterilização

− Os invólucros devem permitir o contato dos artigos com o

Objetivo: Observar o efeito de anti-sépticos sobre o

Ação dos Agentes Crescimento Bacteriano

II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS

As técnicas de coloração iniciadas por Paul Erlich e

− Forma - as bactérias podem ser classificadas quanto a forma

Arranjos - Grupamentos bacterianos.

Dependendo do plano e do número de divisões através das

2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como células

Divisões repetidas e seguidas desses movimentos determinam

PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO BACTERIANO PARA COLORAÇÃO

1-Preparação a partir de meio líquido

2-Preparação a partir de meio sólido

3-Preparação a partir de material biológico

COLORAÇÃO DE GRAM (Coloração diferencial)

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

1)cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta,

peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta

COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)

O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE GRAM

Preparação do Cristal de Violeta:

Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o

Triturar o iodo com o iodeto de potássio em gral de

Preparação de álcool acetona:

Preparação da Fucsina para Coloração de Gram:

A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN

Dissolver num gral o corante no álcool. Adicionar aos

Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em água destilada.

III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO

Meios de cultivo são compostos de água e de nutrientes

a) Quanto à consistência: o meio pode ser líquido, semi-sólido

b) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,

Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou

Após preparados, os meios devem ficar à temperatura

IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS

Em se tratando de material clínico para ser submetido a

1- ISOLAMENTO - As bactérias podem ser cultivadas in vitro em

Material para colheita e isolamento:

2-1 Gênero: Streptococcus

As espécies de maior interesse clínico são:

a)β-hemolíticos: quando lisam completamente as hemácias