Curso: Produção e Certificação de Materiais de Referência

Janaína Marques Rodrigues – Inmetro/Dimci/Dquim - Fevereiro/2012

Exemplos de Cálculo da Incerteza de Medição na Certificação de

Materiais de Referência: Estudos de Homogeneidade, Estabilidade e
Caracterização

1) Estudo de Homogeneidade
Em geral, os resultados de um estudo de homogeneidade são avaliados pela análise de
variância (ANOVA),1,2 que permite calcular o desvio padrão entre as unidades de um material de
referência (sbb) e o desvio padrão da repetitividade do método de medição (sr). Os exemplos
apresentados neste tópico ilustram como estes desvios padrão são utilizados para o cálculo da
incerteza inerente à homogeneidade do material de referência certificado (MRC).
Para se entender como a tabela de ANOVA é gerada, recomenda-se a leitura da referência 1.
Para se habilitar o software Excel para o cálculo da ANOVA em versões do Office
anteriores ao Office 2007 deve-se seguir os seguintes passos:

a) Ir em Ferramentas e clicar em Suplementos;

b) Marcar a opção “Ferramentas de Análise". A partir daí o Excel está habilitado para
realizar o cálculo;
c) Ir em Ferramentas e clicar em Análise de Dados;
d) Marcar a opção ANOVA: fator único (one-way ANOVA);
e) Aberta a janela de ANOVA: fator único, marcar:
f) O intervalo de entrada (dados que se quer analisar a homogeneidade);
g) No caso do exemplo onde se tem diferentes amostras, marcar a opção agrupado por linhas
(se as diferentes unidades do MRC estiverem agrupadas em linhas);
h) Marcar Alfa = 0,05 (nível de confiança de 95 %);
i) Se preferir, marcar a opção para a tabela ANOVA ser gerada em uma nova planilha, ou
marcar uma célula dentro da planilha atual;
j) Ao clicar em ok, uma tabela ANOVA é gerada. Esta tabela contém os dados da análise de
variância para a homogeneidade das amostras.

Para se habilitar o software Excel para o cálculo da ANOVA no Office 2007 deve-se seguir
os seguintes passos:

a) Clicar no botão Office;

b) Clicar em Opções do Excel;
c) Clicar em Suplementos;
d) No campo Gerenciar, clicar em Suplementos do Excel;
e) Clicar no botão Ir;
f) Na janela Suplementos, marcar Ferramentas de Análise e clicar em ok;
g) Na barra de tarefas do Excel, clicar em Dados;
h) No campo Análise, clicar em Análise de Dados;
i) Seguir os mesmos passos da instrução anterior (Office anterior ao Office 2007) a partir da
letra d.

1
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1.1) Exemplo 01: Determinação de bário em solo (barro).3

Tabela 1: Estudo de homogeneidade de bário em solo.*

Desvio
Amostra Replicata 1 Replicata 2 Replicata 3 Média n
padrão
#0118 323 301 310 311 11 3
#0201 340 334 316 330 12 3
#0383 320 321 309 317 7 3
#0442 315 338 321 325 12 3
#0557 326 338 325 330 7 3
#0666 325 302 304 310 13 3
#0791 324 331 317 324 7 3
#0918 310 310 331 317 12 3
#1026 336 321 328 328 8 3
#1133 310 328 312 317 10 3
#1249 314 314 302 310 7 3
#1464 329 300 299 309 17 3
#1581 320 329 311 320 9 3
#1607 322 312 311 315 6 3
#1799 332 317 299 316 17 3
#1877 313 294 293 300 11 3
#1996 324 314 335 324 11 3
#2000 321 342 316 326 14 3
* Dados em mg/kg, expressos em base seca.

Tabela 2: Tabela de ANOVA (one-way layout).

Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 3488,98 17 205,23 1,69 0,092 1,92
Dentro dos grupos 4372,67 36 121,46

Total 7861,65 53

Na tabela de ANOVA tem-se:

SQ = soma dos quadrados;
gl = graus de liberdade;
MQ = média dos quadrados.

O desvio padrão entre os grupos (amostras) é determinado pela Equação 1:

MQ entre
− MQ
dentro
Equação 1
s bb
=
n
Substituindo os valores da Tabela 2:

sbb = 5,28 mg/kg

2
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A contribuição percentual (%H) de sbb para a homogeneidade é expressa pela Equação 2:

 sbb 
% H =   ⋅ 100 Equação 2
 médiageral 

Sendo a média geral equivalente a 318,31 mg/kg, o %H é igual a 1,66 %. Este valor é a
contribuição da heterogeneidade das amostras (do lote em estudo) para a incerteza de uma amostra
(uma unidade do MRC).

A repetitividade do método também é avaliada, sendo calculada pela Equação 3.

sr = MQdentro Equação 3

Substituindo os valores da Tabela 2:

sr = 11,02 mg/kg

A repetitividade do método contribui 3,46 % para a homogeneidade.

Aqui a repetitividade do método não se limita somente ao equipamento, mas sim a todo
tratamento que é dado à amostra (unidade do MRC) que está sendo estudada.

1.2) Exemplo 02: Homogeneidade entre amostras (between-bottle homogeneity) considerando

a repetitividade limitada do método.2

Estudo: Homogeneidade de um lote candidato a MRC. Propriedade em estudo: atividade

enzimática em tecido de rim de suíno.
Matriz liofilizada.
Unidades do candidato a MRC: 101.
O candidato a MRC foi checado quanto à contaminação enzimática, o teor de água e o
conteúdo de oxigênio residual.

No estudo de homogeneidade 20 ampolas foram analisadas em triplicata por 2 dias (n = 6).

Os resultados obtidos pela ANOVA estão na Tabela 3.

Tabela 3: Resultados da ANOVA.

Média 67,78 IU/L
MQentre 1,76 IU2/L2
MQdentro 1,63 IU2/L2
sr 1,88 %
sbb 0,22 %
ubb 0,29 %

O desvio padrão entre as amostras é calculado pela Equação 1, sendo sbb = 0,147 IU/L, que é
equivalente a 0,22 % (Equação 2).

3
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A repetitividade do método é calculada pela Equação 3, sendo sr = 1,28 IU/L, que é
equivalente a 1,89 %.

É importante observar que sr > sbb, ou seja, a repetitividade do método é mais significativa
que a variação entre as amostras calculada pela Equação 1. Neste caso, é mais conveniente calcular
o desvio padrão entre as amostras, considerando a contribuição da repetitividade do método para a
heterogeneidade, o que é feito pela Equação 4.

MQ dentro 2
Equação 4
u bb
=
n
⋅4
gl MQdentro

Substituindo os valores da Tabela 3:

1,63 4 2
u bb
=
6
⋅
100

ubb = 0,196 IU/L

Sendo a variação inicialmente estimada entre as amostras (sbb = 0,147 IU/L) menor do que a
influência do desvio padrão da repetitividade na heterogeneidade (ubb = 0,196 IU/L), este valor é
utilizado como o limite máximo para a heterogeneidade das amostras, logo a incerteza inerente à
homogeneidade é ubb = 0,196 IU/L.

1.3) Exemplo 03: O teste F.

O Valor de F deve ou não ser utilizado como critério para definir se um lote de material de
referência candidato a certificação é ou não homogêneo?

Em busca desta resposta, a seguinte consulta foi enviada a um especialista membro do ISO
REMCO:

Dear,
I was studying ISO GUIDE 35 and I would like to check with you if the following
interpretation of ISO GUIDE 35 approach is correct: The homogeneity of the material should be
checked by ANOVA (two-way or one-way depends on the variables). So, with the ANOVA table
(from two-way ANOVA or one-way) the sbb and the sr are calculated. The ubb (uncertainty related to
homogeneity) is calculated combining sbb and sr.The decision if the material is or not homogeneus
comes from the contribution of ubb to the certified property value, from how much ubb impact on
the certified value of the material and not from the F test. So, is this interpretation correct? If yes, is
there any criterion to evaluate the uncertainty of analysis? For example, for a RM used in
proficiency testing, ISO 13528 gives the "not more than 30% of the overall uncertainty" criterion.
Do you think that it is also applicable to CRM?

Make sure that your answer will be very useful for us.
I would like to thank you in advance.
Kind regards,
Janaína.

4
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Resposta:

Dear Janaína,

Regarding the issue concerning homogeneity, ISO Guide 35 is telling you to determine u(bb),
which can be taken as the s(bb) from an ANOVA. There is no need to combine the s(bb) from the
ANOVA with anything else in order to estimate the contribution to the uncertainty of the assigned
value, unless your homogeneity test is suffering from poor repeatability. The F-test tells you only
whether the repeatability of the experiment was sufficient to demonstrate inhomogeneity; it does
not necessarily tell you that the material is homogeneous!

Regarding the 30 % in ISO 13528, this figure is based on the deliberation that if s(bb) is less than
30 % of the uncertainty of the assigned value, s(bb) does not need to be taken into account as it
vasnishes when combining the uncertainty components. If feasible, you may want to use this
criterion to set a target for your batch sample preparation; it is important however to realise that for
some RMs it is not possible to meet this criterion. Failing the criterion does not mean that the RM is
not useful; it only means that there is some contribution from the batch inhomogeneity.

I hope this answer helps.

Best wishes,
Especialista membro do ISO REMCO

Em adição a esta consulta:

O artigo Uncertainty calculations in the certification of reference materials. 1. Principles of

analysis of variance4 relata o seguinte: "Na abordagem clássica do ANOVA o teste F é importante
para testar a significância da razão da média dos quadrados (MQ). Contudo, este teste é muito
sensível à não normalidade dos dados, conduzindo desta forma a resultados falso-positivos ou falso
negativos." Em outro trecho do mesmo artigo tem-se: "As variâncias obtidas pela ANOVA podem
ser usadas diretamente na avaliação da incerteza em concordância com o GUM (Guide to the
Expression of Uncertainty in Measurements). Este método de avaliação é menos sensível à
distribuição dos dados. Mesmo que a distribuição dos dados desvie consideravelmente da
distribuição normal, a ANOVA pode ser aplicada."

É importante observar que o método a que o artigo4 se refere, é a ANOVA de uma forma
abrangente, considerando a contribuição dos desvios, e não somente o teste F.
As Figuras 1, 2, 3 e 4 retratam exemplos de estudos de homogeneidade onde a
heterogeneidade das unidades dos candidatos a MRC é comparada com a incerteza de certificação.5

5
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Figura 1: Estudo de homogeneidade onde a heterogeneidade detectada é significante

(Fcalculado > Fcrítico), porém é desprezível em relação à incerteza de certificação (unc. cert.).

Figura 2: Estudo de homogeneidade onde não é detectada qualquer heterogeneidade

(Fcalculado < Fcrítico), mas uma possível heterogeneidade pode ser significante se comparada à
incerteza de certificação (unc. cert.).

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Figura 3: Estudo de homogeneidade onde tanto a heterogeneidade detectada é significante

(Fcalculado > Fcrítico), quanto esta também é significante se comparada à incerteza de certificação (unc. cert.).

Figura 4: Estudo de homogeneidade onde a heterogeneidade detectada é significante

(F calculado > Fcrítico), sendo também comparável à incerteza de certificação (unc. cert.).

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1.4) Exemplo 04: Formato alternativo para um estudo de homogeneidade entre amostras
(between-bottle homogeneity).3

No estudo apresentado neste exemplo, a repetitividade do método (sr) é equivalente à

repetitividade da medição (smeas), pois foram realizadas cinco replicatas de uma mesma amostra
(unidade) de um candidato a MRC. A variação global entre as amostras foi obtida através da análise
de nove amostras com uma única replicata cada, sendo expressa por uc(bb). Esta variação é calculada
através da Equação 5.

2 2
uc ( bb ) = sbb + s r Equação 5

Neste exemplo3, a incerteza da homogeneidade (contribuição da incerteza da

homogeneidade para a incerteza de uma unidade do MRC) é expressa por sbb, que é calculado
através da substituição dos valores de uc(bb) e sr na Equação 7.

A Tabela 4 apresenta os resultados obtidos neste estudo.

Tabela 4: Estudo de homogeneidade para determinação de selênio em tecido de mexilhão.

5 replicatas de uma Resultados de 9
mesma amostra diferentes amostras
(mg/kg) (mg/kg)
1,907 1,872
1,917 1,874
1,961 1,928
1,901 1,833
1,834 1,944
1,840
1,726
1,952
1,861
Média 1,904 1,870
Desvio padrão 0,046 0,070
Coeficiente de
2,40 % (sr) 3,72 % (uc(bb))
variação
2 2
sbb sbb = uc ( bb ) − sr = 2,84 %

Para o uso desta abordagem na estimativa da incerteza da homogeneidade, é vital que os

resultados de todas as análises sejam obtidos pela mesma técnica.

Vantagens do uso desta forma alternativa:

a) Utiliza um número menor de análises do que o requerido pela ANOVA;
b) É uma alternativa para se conduzir um estudo de homogeneidade quando a repetitividade
das medições não pode ser realizada. Neste caso sr pode ser estimada de outras fontes
(incerteza do tipo B), como dados de validação, dados do manual da qualidade do
laboratório ou alguma outra fonte.

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Desvantagens do uso desta forma alternativa:

a) Resultados menos significativos, já que a repetitividade do método não é reduzida por um

maior número de replicatas;
b) Conduz a uma incerteza elevada para o MRC.

2) Estudo de Estabilidade

Para se habilitar o software Excel para o cálculo da ANOVA em conjunto com a análise de
regressão em versões do Office anteriores ao Office 2007 deve-se seguir os seguintes passos:

a) Ir em Ferramentas e clicar em Suplementos;

b) Marcar a opção “Ferramentas de Análise. A partir daí o Excel está habilitado para
realizar o cálculo;
c) Ir em Ferramentas e clicar em Análise de Dados;
d) Ir em Análise de Dados e clicar em Regressão;
e) Marcar o intervalo de dados y (y representa o mensurando - a propriedade em
certificação);
f) Marcar o intervalo de dados x (x representa o período de análise);
g) Marcar um x na janela nível de confiança (nível de confiança de 95 %);
h) Se preferir, marcar a opção para a tabela ANOVA ser gerada em uma nova planilha, ou
marcar uma célula dentro da planilha atual;
i) Ao clicar em ok, uma tabela ANOVA com análise de regressão é gerada.

Para se habilitar o software Excel para o cálculo da ANOVA em conjunto com a análise de
regressão no Office 2007 deve-se seguir os seguintes passos:

a) Clicar no botão Office;

b) Clicar em Opções do Excel;
c) Clicar em Suplementos;
d) No campo Gerenciar, clicar em Suplementos do Excel;
e) Clicar no botão Ir;
f) Na janela Suplementos, marcar Ferramentas de Análise e clicar em ok;
g) Na barra de tarefas do Excel, clicar em Dados;
h) No campo Análise, clicar em Análise de Dados;
i) Seguir os mesmos passos da instrução anterior (Office anterior ao Office 2007) a partir da
letra d.

A Tabela 5 apresenta os resultados do estudo de estabilidade de curta duração para o MRC

de etanol em água.

Tabela 5: Dados para a estimativa da incerteza inerente ao transporte.

DIAS (X) [ETOH, %] (Y)
0 0,08910
2 0,08890
4 0,08925
7 0,08905

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A Tabela 6 é a tabela de ANOVA com a análise de regressão. Nesta tabela os coeficientes b1
e b0 estão nominados como Variável X 1 e intercessão, respectivamente.

A partir da geração da tabela com os dados de regressão, calcula-se a incerteza inerente à

estabilidade. Esta incerteza é calculada pela Equação 8, multiplicando-se o valor para o erro padrão
(s(b1)), correlacionado com a linha referente à Variável X 1, pelo tempo do estudo (t).

u estab . = s ( b 1 ) ⋅ t Equação 6

Assim,

uestab. = 3,39E-05 ⋅ 7 = 0,0002373 = 0,000237 g etanol/100 g solução.

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Tabela 6: Análise de regressão dos dados de estabilidade para as amostras de etanol a partir do software Excel:
RESUMO DOS RESULTADOS

Estatística de regressão
R múltiplo 0,13534311
R-Quadrado 0,01831776
R-quadrado ajustado -0,47252336
Erro padrão 0,00017515
Observações 4

ANOVA
gl SQ MQ F F de
significaç
ão
Regressão 1 1,14E-09 1,14E-09 0,0373191 0,864656
Resíduo 2 6,14E-08 3,07E-08
Total 3 6,25E-08

Coeficientes Erro Stat t valor-P 95% 95% superiores Inferior Superior

padrão inferiores 95,0% 95,0%
Interseção 0,08905374 0,000141 633,1535 2,494E-06 0,088448 0,089658912 0,08844856 0,08965891
Variável X 1 6,5421E-06 3,39E-05 0,193182 0,8646569 0,000139 0,000152251 0,00013916 0,00015225

RESULTADOS DE RESÍDUOS

Observação Y previsto Resíduos

1 0,08905374 4,63E-05

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2 0,08906682 -0,00017
3 0,08907991 0,00017
4 0,08909953 -5E-05

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3) Caracterização

3.1) Exemplo 01: Caracterização utilizando a análise da variância 2

Conforme relatado no Anexo B, item B6 do ISO Guide 352, o exemplo a seguir é

retirado da caracterização de um material de referência, baseado no método de
referência IFCC para γ-glutamiltransferase (GGT) a uma temperatura de medição de
37 °C. A certificação foi baseada no acordo entre os resultados obtidos nos diferentes
laboratórios, todos eles utilizando o mesmo procedimento de operação padrão (POP)
para medir a concentração catalítica a 37 °C. Cada participante recebeu sete tubos de
ensaio do material GGT liofilizado, junto com amostras para controle interno de
qualidade, o POP, o procedimento de reconstituição e as planilhas de dados para os
resultados relatados e as informações solicitadas. Três tubos de ensaio foram
reconstituídos a cada 2 dias, e uma medição da concentração catalítica do GGT em cada
tubo de ensaio foi realizada no dia da reconstituição. Os tubos de ensaio contendo
calibradores disponíveis comercialmente foram distribuídos com o MRC a fim de obter
meios independentes de avaliação da qualidade.
A rastreabilidade dos procedimentos de gravimetria, volumetria e termometria foi
demonstrada e documentada. A rastreabilidade do procedimento de espectrofotometria
foi garantida por meio de soluções de dicromato de potássio certificadas.
Previamente foi decidido que um desvio padrão relativo intralaboratorial de mais de 2,5 %
não poderia ser aceito para as medições de certificação. Um laboratório excedeu este
limite. Visto que os resultados deste laboratório também apresentaram desvio para o
material de controle de qualidade (amostra-controle), decidiu-se não utilizar esses
dados. Os resultados individuais, em conjunto com as médias dos laboratórios de seis
medições, desvios padrão e RSDs de 12 laboratórios aceitos são apresentados na Tabela
7.
Tabela 7: Dados de caracterização de um estudo interlaboratorial para GGT.

Resultados experimentais Média SD RSD

Laboratório
IU/L IU/L IU/L %
lab 01 118,1 118,9 119,0 118,1 118,1 119,2 118,6 0,5 0,4
lab 04 112,6 112,6 110,6 114,0 114,0 114,0 113,0 1,3 1,2
lab 05 111,9 113,7 110,3 112,4 113,0 110,9 112,0 1,3 1,1
lab 07 111,1 111,4 115,1 109,3 111,0 109,7 111,3 2,1 1,8
lab 08 113,0 115,0 112,6 112,6 113,7 113,1 113,3 0,9 0,8
lab 09 113,3 112,4 113,8 110,2 112,5 114,4 112,8 1,5 1,3
lab 10 114,0 115,3 114,9 113,7 114,3 112,8 114,2 0,9 0,8
lab 11 116,8 116,9 117,4 116,7 117,0 116,6 116,9 0,3 0,2
lab 13 112,6 113,0 113,7 111,7 113,6 111,0 112,6 1,1 1,0
lab 14 114,9 115,5 114,5 115,7 115,5 115,4 115,3 0,5 0,4
lab 15 117,1 118,6 117,9 116,4 117,7 118,4 117,7 0,8 0,7
lab 16 113,9 112,5 111,0 111,1 110,8 112,4 112,0 1,2 1,1

A análise de variância (one-way layout) foi utilizada para o tratamento dos dados da
Tabela 7.

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A
Tabela 8 apresenta os resultados.

Tabela 8: Resultados da ANOVA dos dados da Tabela B.7

Fonte da SQ gl MQ
variação
Entre grupos 388,64 11 35,33
Dentro dos 76,45 60 1,27
grupos
Total 465,09 71

A média global é computada a partir da Equação 7.

p ni
1 1 8 216,9
x= p ∑∑ xij = 12 × 6 8 216,9 = 72
= 114,12 IU/L Equação 7
∑ ni i =1 j =1

i =1

Como o conjunto de dados está completo (cada um dos grupos contém n = 6

resultados), a média global também pode ser computada como a média das médias,
conforme apresenta a Equação 8.
p
1 1
x=
12 ∑ xi = 12 1 369,5 = 114,12 IU/L Equação 8
i =1

A incerteza associada à média global é calculada pela Equação 9.

sL2 s2
u  x  =
5,68 1,27
+ r = + = 0, 49 = 0,70 IU/L Equação 9
  p n⋅ p 12 72

Onde:

s r2 = MS within = 1,27 Equação 10

e
MS among − MS within 35,33 − 1,27
sL2 = = = 5,68 Equação 11
n0 6

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4) Bibliografia
1
Miller, J. C. e Miller, J. N., Statistics for Analytical Chemistry, 3a edição, Ellis
Horwood Series in Analytical Chemistry.
2
ISO-Guide 35. Reference materials - General and statistical principles for certification.
Third edition. 2006.
3
Van der Veen, A.M.H.; Linsinger, T.; Pauwels, J. Uncertainty calculations in the
certification of reference materials. 2. Homogeneity study. Accreditation and Quality
Assurance. 6:26-30, 2001.
4
Van der Veen, A.M.H.; Pauwels, J. Uncertainty calculations in the certification of
reference materials. 1. Principles of analysis of variance. Accreditation and Quality
Assurance. 5:464-469, 2000.
5
Pauwels, J.; Lamberty, A.; Schimmel, H. Homogeneity testing of reference materials.
Accreditation and Quality Assurance. 3:51-55, 1998.

15