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  • Protocolo RT MMLV Invitrogen

    Enviado por

    Renata Budaszewski
    4 visualizações1 página
    Este protocolo descreve os passos para realizar a transcrição reversa de RNA em cDNA utilizando a enzima transcriptase reversa M-MLV. O processo envolve duas incubações: a primeira para desnaturar o RNA e a segunda para a síntese de cDNA a partir do RNA, utilizando primers específicos ou aleatórios e iniciada pela enzima M-MLV.

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    Título original

    PROTOCOLO RT MMLV INVITROGEN

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    Protocolo RT MMLV Invitrogen

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    Renata Budaszewski
    Este protocolo descreve os passos para realizar a transcrição reversa de RNA em cDNA utilizando a enzima transcriptase reversa M-MLV. O processo envolve duas incubações: a primeira para desnaturar o RNA e a segunda para a síntese de cDNA a partir do RNA, utilizando primers específicos ou aleatórios e iniciada pela enzima M-MLV.

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    de 1

    RT M-MLV INVITROGEN

    MIX 1
    H2O milliQ/ DEPC 8µl
    Primer Reverso ou Randômico 1µl Pipetar 10 µl em cada tubo na
    DNA-Free, antes de pipetar o RNA
    dNTP 10nM 1µl

    RNA (Pipetar em cada tubo na bancada da sala 2µl


    principal no lab)

    Volume Final 12µl

    TERMOCICLADOR- 1ª INCUBAÇÃO
    65ºC- 5 minutos
    Gelo- 5 minutos

    MIX 2 (Fazer na DNA-Free (tubo de 0,6ml ou 1,5ml) e guardar no -20ºC no lab até terminar a 1ª incubação)
    Tampão- 5x First Strand Buffer 4µl
    DTT 0.1m 2µl Após finalizar a 1ª incubação,
    RNaseOUT ou RNAsin 1µl pipetar 8 µl em cada tubo na
    bancada do lab
    Enzima M-MLV 1µl

    Volume Final 20µl

    TERMOCICLADOR- 2ª INCUBAÇÃO
    25ºC- 10 minutos
    (Se usar Random Primer. Se usar primer específico, usar a temperatura de anelamento do primer)
    37ºC - 50 minutos
    70ºC- 15 minutos
    10ºC - ∞

    ESPERAR DESCONGELAR TOTALMENTE E VORTEXAR OS TUBOS PARA COMPLETA


    HOMOGENEIZAÇÃO (EXCETO A ENZIMA. HOMOGENEIZAR COM O PIPETADOR).

    NÃO DEIXAR OVERNIGHT ENTRE AS INCUBAÇÕES.

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