GUIA DE PRÁCTICAS

DE

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Departamento de Microbiología II
Facultad de Farmacia
Universidad Complutense
28040 Madrid
 CALENDARIO DE PRÁCTICAS

LUNES MARTES MIÉRCOLES JUEVES VIERNES

-Construcción curva patrón -Representación curva patrón - Valoración de la neomicina - Valoración de la neomicina -Observación de resultados
de neomicina de neomicina producida en 48 h (y 120h) producida en 72 h (y 144h)
PRÁCTICA A -Siembra en medio de - Valoración de la neomicina - Determinación de la - Determinación de la
producción producida en 24 h (y 96h) biomasa biomasa.
PRODUCCIÓN DE -Valoración cualitativa: - Determinación de la - Control de pureza - Control de pureza
NEOMICINA Siembra de S. fradiae biomasa. - Control de pH - Control de pH
- Control de pureza -Valoración cualitativa:
- Control de pH siembra de microorganismos
indicadores
PRÁCTICA B -Siembra del preinóculo -Determinación de la -Determinación de la
densidad óptica densidad óptica
CURVA DE
CRECIMIENTO
PRACTICA C -Mutagénesis -Recuento de viables
-Determinación de la
MUTAGÉNESIS POR viabilidad
RADIACIÓN
ULTRAVIOLETA
PRÁCTICA D -Siembra de cepas en medios -Observación del -Observación del -Observación del
selectivos crecimiento crecimiento crecimiento
GENÉTICA DE -Cruce de estirpes -Siembra del diploide en
LEVADURAS medio selectivo
PRÁCTICA E -Realización de la
electroforesis
OBSERVACIÓN DE
DISTINTAS FORMAS
MOLECULARES DEL
DNA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II 1
PRÁCTICA A.

PRODUCCIÓN DE NEOMICINA POR Streptomyces fradiae 3535 Y SU VALORACIÓN

Fundamento.

Se basa en la medida de la inhibición del crecimiento de una cepa de Bacillus subtilis en un gradiente de
neomicina (antibiótico producido por el microorganismo Streptomyces fradiae) creado por la colocación de un disco
impregnado con una solución de dicho antibiótico sobre un medio de cultivo sólido. Esto da lugar a la aparición
alrededor del disco de un halo de inhibición, cuyo diámetro esta relacionado directamente con la concentración del
antibiótico.

La neomicina se obtendrá a partir del citado microorganismo en un proceso de fermentación a escala

experimental, controlándose diariamente la pureza, el pH, el crecimiento del cultivo y la producción de antibiótico.

Microorganismos empleados.

Streptomyces fradiae 3535 y Bacillus subtilis 6051

Medios de cultivo.

MEDIO PREPARACION DE INOCULO DE Streptomyces fradiae: Medio I.

Extracto de carne 3 g.
N-Z-Amina (hidrolizado de caseína).......................................... 10 g.
Glucosa ....................................................................... 10 g.
ClNa ....................................................................... 5 g.
Agua ....................................................................... hasta 1000 ml.
Ajustar el pH con NaOH 0,1 N a 7,2. Esterilizar a 121ºC, 20 minutos.

MEDIO DE PRODUCCION DE NEOMICINA: PN.

N-Z-Amina ....................................................................... 25 g.
Extracto de carne ....................................................................... 10 g.
Agua destilada ....................................................................... c.s.p. 1000 ml.
Ajustar el pH a 7,0 y esterilizar a 121ºC 20 minutos.

MEDIO NAYE:
Nutrient Broth (Difco) ............................................................... 8 g.
Extracto de levadura .................................................................. 2 g.
Agar ....................................................................... 20 g.
Agua destilada ....................................................................... c.s.p. 1000 ml.
No se ajusta el pH. Esterilizar a 121ºC, 20 minutos.

Procedimiento.

1º DIA.- Construcción de la curva patrón de neomicina: se basa en la valoración microbiológica de la neomicina,

empleando como microorganismo sensible Bacillus subtilis 6051. Se hace una serie de cinco diluciones a partir de
sulfato de neomicina en tampón fosfato 0,1 M, pH 8, preparado de la siguiente forma:
Fosfato dipotásico........................................................ 16,730 g.
Fosfato monopotásico.................................................. 0,523 g.
Agua destilada ............................................................. c.s.p. 1000 ml.
Se ajusta el pH con KOH 0,1 N antes de completar el volumen. Se esteriliza a 120ºC, 15 minutos.
La serie de cinco diluciones a partir de la solución madre (1.000 µg/ml de neomicina) será la siguiente: 500
µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml y 25 µg/ml. Con 90 µl de cada una de estas diluciones de neomicina en tampón
fosfato, se impregnarán discos de papel (12,7 mm de diámetro) los cuales se colocarán espaciados en las placas (3
discos por placa), previamente preparadas de la siguiente forma: un cultivo de B. subtilis sembrado por estría en tubos
de medio NAYE e incubado a 37ºC durante 24 h, se arrastra con 4 ml de solución salina SS, para obtener una
suspensión que debe ajustarse al 30% de transmitancia, midiendo a 630 nm, en un espectrofotómetro. Con esta
suspensión se inocula al 5/1000 un matraz que contiene el medio NAYE atemperado a 45-50ºC; a continuación se
reparte en placas a razón de 10 ml/placa. Una vez solidificado el medio se procede a la colocación de los discos, como
se indica en la siguiente figura, utilizando en cada placa la concentración 100 µg/ml como patrón interno, y poniendo
por duplicado los discos con el resto de llas concentraciones.
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Colocación de los discos en las placas de medio NAYE para la construcción de la curva patrón de neomicina.

placa 1 placa 2 placa 3

1.000 1.000 500 500 250 250

100 100 100

placa 4 placa 5

50 50 25 25

100 100

Las placas han de incubarse 1 h a 4ºC (con el fin de que el antibiótico difunda antes de que empiece a crecer el
microorganismo). Posteriormente se llevarán a incubar a 37ºC durante 24 h.
- Siembra del medio de producción: inocular 2 ml del matraz de inóculo de Streptomyces fradiae en un matraz
conteniendo 50 ml de medio líquido de producción de neomicina PN. Incubar a 28ºC en agitación (220 rpm).
- Determinación de la biomasa: centrifugar 1 ml del cultivo del matraz del medio PN recién inoculado a 8.000
rpm, 1 minuto, en tubo eppendorf estéril y transferir a otro tubo el sobrenadante. El volumen del sedimento celular
obtenido en la anterior centrifugación se calculará por comparación con una batería de tubos con volúmenes conocidos.
- Control de pureza: a partir del sedimento anterior se realizará la siembra por estria en placa del medio de agar
nutritivo (AN). Incubar a 37ºC durante 24 h, al cabo de las cuales no debe aparecer ningún microorganismo que no sea
S.fradiae. Así mismo debe hacerse una observación microscópica en fresco (una gota de la suspensión entre porta y
cubre, objetivo de 40x, diafragma semicerrado) y una tinción por el método de Gram (objetivo de 100x, aceite de
inmersión, diafragma abierto).
- Control de pH: a partir del sobrenadante anterior se realizará la medida del pH del medio PN.
- Valoración cualitativa de la neomicina producida por S.fradiae: se basa en comprobar si el antibiótico
producido por nuestra cepa es activo frente a diversos microorganismos. Sembrar una estría con asa con una cantidad
abundante de células a partir del sedimento anteriormente obtenido por centrifugación en una placa con medio AN.
Incubar a 28°C, durante 72 horas.

2º DIA.- Medida del diámetro de los halos de inhibición y representación de la curva patrón de neomicina: se realizará
la medida del diámetro de los halos de inhibición y se calculará la concentración de neomicina de la siguiente manera:

Cálculo de la concentración de neomicina:

∅m100 = ∅1001 + ∅1002 + ∅1003 + ∅1004 + ∅1005

5

por ej.: ∅c 500 = ∅m 500 + (∅m 100 − ∅1002 )

Fc2 (factor de correción de la placa 2)

∅m = diámetro medio
∅c = diámetro corregido
Fc = factor de corrección de cada placa
Subíndices = número de placa

A continuación se construirá la curva patrón de neomicina, representando en papel semilogarítmico, concentraciones de

neomicina (ordenadas) frente a diámetros de los halos de inhibición (abcisas). Esta representación gráfica debe dar una
línea recta.
-.Valoración de la neomicina producida en 24 h. (1ª valoración): se trata de determinar la concentración de
neomicina producida durante este tiempo de incubación; para ello se ha de proceder de la siguiente forma: centrifugar 1
ml del cultivo del matraz del medio PN a 8.000 rpm, 1 minuto, en tubo eppendorf estéril y transferir a otro tubo el
sobrenadante en condiciones estériles. Con 90 µl de este sobrenadante, impregnar 3 discos, colocándolos espaciados en
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una placa de medio NAYE, previamente inoculada con B.subtilis y preparada como se indica anteriormente. Llevar a
4°C durante 1 h. e incubar a 37ºC durante 24 h.
- Determinación de la biomasa: el volumen del sedimento celular obtenido en la anterior centrifugación se
calculará por comparación con una batería de tubos con volúmenes conocidos.
- Control de pureza: a partir del sedimento anterior se realizará la siembra en placa del medio AN así como la
observación microscópica en fresco.
- Control de pH: a partir del sobrenadante anterior se realizará la medida del pH del medio PN.

3º DIA.- Medida del diámetro de los halos de inhibición, obtenidos en la 1ª valoración y determinación de la
concentración de neomicina por interpolación en la curva patrón de la media de los 3 diámetros.
De la misma manera que el día anterior se realizará:
- Valoración de la neomicina producida en 48 h (2ª valoración):
- Determinación de la biomasa.
- Control de pureza.
- Control de pH:

4º DIA.- Medida del diámetro de los halos de inhibición, obtenidos en la 2ª valoración y determinación de la
concentración de neomicina.
De la misma manera que los días anteriores se realizará:
- Valoración de la neomicina producida en 72 h (3ª valoración).
- Determinación de la biomasa.
- Control de pureza.
- Control de pH.

- Valoración cualitativa: sembrar distintos microorganismos, tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, haciendo una estría perpendicular, desde las proximidades del
crecimiento del Streptomyces hasta el borde de la placa. Incubar a 37ºC, 24h.

5º DIA.- Medida del diámetro de los halos de inhibición, obtenidos en la 3ª valoración y determinación de la
concentración de neomicina.
- Control de pureza: verificar mediante la observación de la placa de agar nutritivo sembrada el día anterior la
pureza del cultivo de producción.
- Valoración cualitativa: observación del crecimiento/no crecimiento de los distintos microorganismos, lo cual
indicará si son presuntamente sensibles al antibiótico producido por nuestra cepa.
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PRÁCTICA B .

DETERMINACIÓN DE UNA CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANA.

Fundamento.

Las fases de crecimiento de una población bacteriana pueden determinarse midiendo la turbidez del cultivo.
Aunque dicha turbidez no es una medida directa del número de células, su incremento es una indicación del crecimiento
bacteriano.
Para estas determinaciones se utiliza un espectrofotómetro, en el cual la luz pasa a través del cultivo bacteriano
hasta alcanzar una célula fotoeléctrica conectada a un galvanómetro. A medida que la concentración celular aumenta, el
cultivo se hace más turbio, y se reduce la cantidad de luz transmitida que alcanza la célula fotoeléctrica, como
consecuencia de la difracción de la luz por parte de las células.
El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión (cantidad de luz
transmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor derivado del porcentaje de transmisión, correspondiente al
log del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la suspensión (Io) y la de la luz transmitida por la suspensión
(I). A = log Io/I.
Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido adecuado, generalmente el
crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un período de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se
observa un incremento exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta
fase es la más significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parámetros
cinéticos del crecimiento (µ, q) se mantienen constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentración de los
nutrientes esenciales disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a
detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las células lentamente se mueren, lisándose en
algunos casos, en una última fase de muerte celular.
El objetivo de esta práctica es definir las fases de crecimiento en un cultivo de Escherichia coli, mediante la
determinación de la absorbancia de la suspensión celular a diferentes tiempos de incubación.

Microorganismo utilizado.

Escherichia coli TG1.

Medio de cultivo.

LB:
Triptona ....................................................................... 10 g.
Extracto de levadura .................................................... 5 g.
ClNa ....................................................................... 10 g.
Agua destilada ............................................................ c.s.p. 1.000 ml

Medida del crecimiento en Spectronic 20D.

1.- Encender el aparato manteniéndolo 5 minutos de precalentamiento antes de realizar la lectura.

2.- Fijar la λ=600 nm, para absorbancia máxima de E.coli y mínima del medio de cultivo.

3.- Fijar el 0 del aparato con el botón A hasta que la aguja mida 0% transmitancia.

4.- Colocar el control correspondiente al medio de cultivo sin inocular en el lugar de las muestras y mover el
botón B hasta que la aguja registre el 100% de transmitancia.

5.- Para medir las muestras, tomar 1 ml de cultivo bien homogeneizado en un tubo y situarlo en el lugar de las
muestras y anotar la absorbancia (D.O.).
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Procedimiento.

1ºDIA .- Preparación del preinóculo: se siembra un tubo con 10 ml de medio líquido LB con E.coli TG1, y se cultiva a
37ºC en agitación a 180 r.p.m. en un agitador orbital durante 15-20 h.

2º DIA .- A partir de este cultivo reciente, se siembra con pipeta estéril un volumen determinado en un matraz con 25
ml de LB, y se mide la D.O. en el espectrofotómetro. Esta medida corresponde al tiempo 0.
Situar el matraz en un incubar orbital a 37ºC y 180 r.p.m. La D.O. debe medirse cada 15 min, teniendo cuidado de agitar
el matraz antes de tomar la muestra para realizar las medidas.

3º DIA .- Realizar dos últimas lecturas de D.O.

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PRÁCTICA C.

MUTAGÉNESIS POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA.

Fundamento.

La obtención de células mutantes de muy diversos microorganismos tiene una tremenda importancia
tanto en el campo industrial, con objeto de mejorar determinadas características en una cepa concreta, como en
investigación básica. Dado que las mutaciones espontáneas ocurren en una proporción muy baja, cuando se pretende
obtener mutantes de una población microbiana las células se someten a tratamientos mutagénicos con objeto de
aumentar la frecuencia con la que acontecen estas mutaciones. De esta manera podemos incrementar hasta 100 veces la
frecuencia de las mutaciones sin provocar unos valores de muerte celular excesivamente elevados y sin que aparezcan
dobles mutantes con una frecuencia significativa. Frente a la mutagénesis química, la inducida por radiaciones ofrece la
ventaja de una manipulación más cómoda. En esta práctica, someteremos a un cultivo de E. coli a un tratamiento
mutagénico con radiación ultravioleta, la cual altera fundamentalmente el DNA por la formación de dímeros de
pirimidinas. El recuento de células viables tras dicho tratamiento nos servirá para determinar la agresividad del proceso
y para poder averiguar cuales serían las condiciones óptimas para llevar a cabo una búsqueda de mutantes en la cepa
utilizada en la práctica.

Microorganismos utilizados.

Se utilizan las cepas Escherichia coli GY752 (RecA+) y Escherichia coli GY754 (RecA-)
Medios de cultivo.

LB:
Triptona ....................................................................... 10 g.
Extracto de levadura .................................................... 5 g.
ClNa ....................................................................... 10 g.
Agua destilada ............................................................. c.s.p. 1000 ml.
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 0,1 N. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

LB SOLIDO:
Añadir agar al 2% a la formulación del medio LB.

Procedimiento:

1ºDIA.- A partir de un cultivo de DO 0.1 (108 células/ml) de cada cepa se hacen diluciones decimales seriadas. De la
dilución 10-4 se siembran 100 µl por extensión en superficie con pipeta Pasteur estéril en forma de cayado, en dos placas
de LB.
Cada grupo de trabajo someterá a ambas placas sembradas a una dosis diferente de radiación UV de una
longitud de onda de 254 nm (0, 10s, 20s, 40s, 60s, 80s, 100s, 2m, 3m, 5m). La lámpara de UV está ajustada a una
distancia tal que se producen 4 erg/mm/segundo.
Incubar las placas en oscuridad a 37ºC (con el fin de evitar el fenómeno de fotorreactivación).

2º DIA.-

Determinar mediante recuento de colonias la concentración de células viables antes y después del tratamiento
mutagénico.
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PRÁCTICA D

GENÉTICA DE LEVADURAS
Fundamento.

Saccharomyces cerevisiae, es un microorganismo de gran importancia, tanto en el campo de la industria como

en el de la investigación básica. Está directamente implicado en la obtención de muchos productos como son: vino,
cerveza, pan, enzimas, vitaminas, ATP, etc.
Por otra parte, ha sido un modelo biológico de elección para el desarrollo de la Bioquímica y de la Genética,
desde sus comienzos con los estudios de la fermentación por Pasteur, pasando por la investigación de infinidad de vías
metabólicas, hasta hoy en que la Biología Molecular está en pleno auge. Si Escherichia coli ha sido el material más
empleado en investigación dentro del mundo procariota, Saccharomyces cerevisiae es su equivalente como modelo de
célula eucariótica.
Saccharomyces cerevisiae, levadura perteneciente a la clase Ascomycetes, orden Endomycetales y familia
Saccharomycetaceae, presenta un ciclo de vida haplodiplobióntico (figura 1), aunque la alternacia de las fases no es
necesariamente regular.
Las células son esférico-elipsoidales. Se reproduce asexualmente por gemación (proceso de división celular
típico en estas levaduras que va acoplado a la mitosis). La reproducción sexual ocurre por conjugación entre dos células
de tipo sexual opuesto (a, α) con formación de un zigoto diploide (doble número de cromosomas), que al germinar
inicia la fase diploide del ciclo biológico . Estas células diploides, que como las haploides se multiplican asexualmente
por gemación, cuando se encuentran en condiciones carenciales de fuente de nitrógeno, pueden sufrir un proceso de
esporulación con una división reduccional (meiosis: reducción del número de cromosomas a la mitad), que conduce la
formación de un asca con cuatro ascosporas haploides, redondas o ligeramente ovaladas (Figura 1).

Figura 1. CICLO BIOLÓGICO DE Saccharomyces cerevisiae

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En esta práctica vamos a cruzar dos estirpes (que han de ser haploides y de tipo sexual opuesto), cuyos
genotipos son diferentes. Son estirpes que poseen mutaciones que las hacen diferentes de las estirpes silvestres de las
que proceden (alelo silvestre y alelo mutante); estas mutaciones se llaman marcadores genéticos.
Hay marcadores genéticos de muchos tipos; concretamente vamos a emplear dos tipos diferentes de marcadores
genéticos nutricionales:
- Marcadores de aminoácidos: las estirpes que los poseen se llaman estirpes auxótrofas (a diferencia de la
estirpe silvestre de que proceden que es protótrofa para ese marcador); estos mutantes no pueden crecer sin la presencia
en el medio de cultivo de un determinado aminoácido, pues no pueden sintetizarlo por sí mismos.
- Marcadores de azúcares: estas estirpes mutantes no pueden crecer utilizando un determinado azúcar como
única fuente de carbono (a diferencia de la estirpe silvestre de que proceden que sí lo puede utilizar).

Estirpes empleadas.

Estirpes Marcadores genéticos Fenotipo

UCM.-1 MATα, gal2 α, Gal-

UCM.-2 MATa, ade2 a, Ade-

Medios de cultivo.

MEDIO COMPLETO (YEPD):

Extracto de levadura .................................................... 10 g
Peptona ....................................................................... 20 g
Glucosa ....................................................................... 20 g
Agar ....................................................................... 20 g
Agua destilada ............................................................ c.s.p. 1.000 ml
Ajustar el pH a 6,8 con NaOH 0,1 N. Esterilizar a 121ºC, 20 minutos.

MEDIO MINIMO (MM):

Nitrógeno base sin aminoácidos .................................. 7g
Glucosa ....................................................................... 20 g
Agar ....................................................................... 20 g
Agua destilada ............................................................ c.s.p. 1.000 ml
Ajustar a pH 6,8 con NaOH 0,1 N. Esterilizar a 121ºC, 20 minutos.

MEDIO MINIMO CON GALACTOSA (MMGALACTOSA):

Procédase del mismo modo que en el MM, sustituyendo la glucosa por galactosa.

MEDIO MINIMO SUPLEMENTADO CON AMINOACIDOS:

Procédase del mismo modo que en el MM, adicionando en cada caso el aminoácido correspondiente:
MM + adenina: 20 mg de adenina/1000 ml

Procedimiento.

1º DIA.- Mezclar con el asa de siembra una gran cantidad de células de dos estirpes de tipo sexual opuesto A y B,
previamente crecidas en YEPD. Incubar a 28ºC.
Sembrar una pequeña cantidad de células de las estirpes A y B en los medios selectivos apropiados (MM,
MMgalactosa y MM+adenina) para determinar su fenotipo.
2º DIA.-Observación al microscopio de células haploides gemando, de zigotos y de ascas con ascosporas, con objetivo
de 40 aumentos en preparaciones entre porta y cubre.
Observación de un micromanipulador.
Transferir el diploide a una placa de medio selectivo MMgalactosa. Incubar a 28ºC dos días.

3º DIA.- Comprobación del crecimiento de las estirpes haploides en los diversos medios selectivos.
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PRÁCTICA E

OBSERVACIÓN DE DISTINTAS FORMAS MOLECULARES DEL DNA

Fundamento.

La electroforesis de DNA en geles de agarosa es el método más común y útil para el estudio rutinario del
tamaño de las moléculas de DNA así como, de manera aproximada, de su cantidad. Aplicando una diferencia de
potencial entre un extremo y otro del gel, podemos separar los fragmentos de DNA en función de su tamaño, ya que su
mayor o menor velocidad de migración dependerá de éste. Si utilizamos fragmentos marcadores de tamaño conocido de
forma paralela, podremos asímismo estimar por comparación, el tamaño de las moléculas de DNA problema. En ésta
práctica, elaboraremos un gel de agarosa al 0,7% y llevaremos a cabo la electroforesis de muestras que contienen
plásmidos tanto cerrados como cortados tras su digestión con diversas enzimas de restriccin, así como DNA genómico.

Procedimiento.

1.-Preparación del gel y desarrollo de la electroforesis:

- Pesar en un vaso de precipitados la agarosa (normalmente se prepara del 0.6 al 2% según el tamaño de los fragmentos
a separar). En nuestro caso 0.7%.
- Añadir el volumen de tampón TB (Tris-base 89 mM, EDTA Na 2,5 mM, ácido bórico 8,9 mM pH 8.3) necesario (25
ml en la cubeta pequeña y unos 80 ml en la cubeta mediana).
- Calentar en horno microondas hasta disolución total.
- Una vez que la solución esté transparente (y sin hervir) se detiene la calefacción y se enfría a 50ºC. En aquellos geles
que lleven bromuro de etidio éste se añade ahora hasta una concentración de 0.3 µg/ml.
- Se nivela el soporte sobre el que irá situada la cubeta y se coloca el "peine" para formar los pocillos.
- Cuando la temperatura de la agarosa ronde los 40ºC se vierte ésta en la cubeta. Al verter la agarosa se debe tener
precaución para que no se formen burbujas (se debe verter muy despacio y sobre un borde). Se deja enfriar tapando con
papel de aluminio para que la luz no altere el bromuro de etidio.
- Cubrir el gel con el tampón, tras haber retirado el peine con mucho cuidado. Para ello se va dejando caer desde un
borde el tampón, hasta cubrir el gel.
- Una vez sumergido el gel se añaden las muestras a los pocillos. Se introduce la punta de una pipeta en el pocillo y se
deja caer lentamente, cuidando de que no se formen burbujas. Además de las muestras problema, se añadirán muestras
patrón con DNA de diferente tamaño molecular.
- Se conectan los electrodos a la fuente cuidando la polaridad y se seleccionan los niveles de intensidad o voltaje
deseados (normalmente el voltaje empleado es de 60 a 100 voltios).
- Una vez que el colorante llega al final del gel, los geles se pueden observar en un transiluminador de luz UV para
localizar las bandas deseadas (pues presentan, tras tinción con bromuro de etidio, una fluorescencia apreciable).

2.- Preparación de la muestra:

A 1 µl de la solución de DNA plasmídico extraído, se añade tampón TE y tampón de muestra para tener un volumen
total de 20 µl (17 µl TE + 2 µl tampón de muestra 10 veces concentrado ).

Tampón de muestra 10X:

50% sacarosa
50 mM EDTA
0,1% azul de bromofenol(como indicador del frente)
0,01% SDS
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EJERCICIOS A REALIZAR

PRÁCTICA A.

1.- Representar en papel semilogarítmico la curva patrón de neomicina (concentraciones de neomicina (µg/ml) en
ordenadas frente a diámetro (mm) de los halos de inhibición en abcisas).

2.- Representar en una misma gráfica, en papel milimetrado, la variación de los tres parámetros determinados (pH,
biomasa y concentración de neomicina en el medio) con respecto al tiempo, solapando los datos obtenidos en los dos
matraces de producción utilizados en la práctica.

3.- Comentar que relación se observa entre el crecimiento en biomasa y la producción del antibiótico-

4.- Interpretación de los resultados de la valoración cualitativa.

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PRÁCTICA B.

1.- Representar gráficamente los datos para obtener la curva de crecimiento (DO frente a tiempo de incubación tanto en
papel milimetrado como en papel semilogarítmico).

2.- Calcular tg (a partir de la representación semilogarítmica) y µmax. Alternativamente (en caso de disponer de
calculadora con análisis de regresión) calcule la ecuación de la recta coorespondiente al periodo de crecimiento
exponencial.

3.- Razonar si aumenta, disminuye o se mantiene cada uno de estos parámetros (tg, µmax y biomasa final) en cada uno de
los siguientes casos:

a) Si se partiera de un inóculo (cel/ml) inicial cinco veces más concentrado.

b) Si se utilizara un medio con concentración doble de nutrientes.
c) Si el crecimiento se realizara a diferente temperatura.
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PRÁCTICA C

1.- Calcular la viabilidad tras el tratamiento mutagénico. Representar graficamente el % de supervivencia frente al
tiempo de exposición a UV obtenido en los diferentes grupos.
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PRÁCTICA D

1.- Resultados del crecimiento de A y B en los distintos medios selectivos.

2.- De las cepas A y B manejadas, ¿cual corresponde con UCM-1 y con UCM-2 en función del crecimiento en los
diversos medios selectivos?

3.- Escribe el genotipo y fenotipo del diploide obtenido. Tras análisis de las tétradas obtenidas después del proceso de
esporulación de dicho diploide, ¿cuántas ascosporas serán Gal- y cuántas Ade- en cada asca?.¿De que depende la
frecuencia de co-existencia de ambos marcadores en los haploides obtenidos?

4. ¿Qué medios utilizarías para comprobar los marcadores genéticos de estas dos cepas haploides?

Fenotipo Genotipo

α, Ura-, His- MATα, ura3, his4

a, His-, Leu- MATa, his3, leu2

y ¿qué medio para seleccionar el diploide obtenido en el cruce de ambas?

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PRÁCTICA E

1.- El análisis por electroforesis de los plásmidos sin cortar muestra la existencia de bandas de diferente movilidad, ¿a
qué corresponde cada una?

2.- ¿Qué ocurriría si un plásmido de DNA circular fuera digerido con una enzima de restricción que tuviera un único
sitio de reconocimiento en la secuencia nucleotídica del plásmido? ¿Y si tuviera 2?