Resumo: Aula estrutura dos ácidos nucleicos

O DNA de Neandertal
- O DNA tem mais de 30.000 anos, os neandertais viveram na Europa e Oeste
da Ásia há ~ 200.000 anos.
- Descendentes da África não tem os genes de Neandertal
- Em algum momento os neandertais cruzaram com o Homo sapiens, e os
genes dos neandertais ainda sobrevivem nos povos da Ásia e da Europa.

A natureza do material genético

- Muitas pessoas contribuíram para a nossa compreensão da estrutura do
DNA.
- A história se iniciou com Friedrich Miescher, que realizou os primeiros
estudos químicos sistemáticos do núcleo da célula em 1868. Miescher obteve
glóbulos brancos do sangue a partir de pus que coletou de bandagens
cirúrgicas descartadas. Ele isolou com cuidado o núcleo e então rompeu as
membranas nucleares, liberando uma substância ácida rica em fósforo que
chamou de nucleína. A nucleína, um ácido nucleico, era um novo tipo de
polímero químico, diferente de todos os outros identificados previamente.
- Por volta da virada do século, Albrecht Kossel investigou a estrutura química
dos ácidos nucleicos, tanto o DNA como outra molécula semelhante chamada
de RNA, e descobriu que elas continham bases nitrogenadas, ou compostos
básicos contendo nitrogênio. Kossel identificou cinco tipos de bases
nitrogenadas: adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) e uracila (U).
- Em 1910, outros investigadores determinaram que as bases nitrogenadas
eram componentes de uma unidade maior chamada de nucleotídeo, que
consiste em um grupamento fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada. O
DNA é composto pelos nucleotídeos A, G, C e T, e o RNA, pelos nucleotídeos
A, G, C e U.

Experimento de Griffith
Na década de 1940, Oswald T. Avery e colaboradores no Instituto Rockefeller,
na cidade de Nova Iorque, mostraram que o DNA é o composto químico da
herança. Seu ponto de início foi uma observação feita em 1928 pelo
microbiologista inglês Frederick Griffith, que estudou a bactéria causadora da
pneumonia, Streptococcus pneumoniae. Existem dois tipos desse
pneumococo: virulento (célula S) e não virulento (célula R). Griffith observou
que a bactéria virulenta produzia colônias lisas quando crescidas em placas de
Petri, mas as colônias de uma cepa não virulenta pareciam rugosas. A
diferença na aparência dependia de uma cápsula de cobertura presente
apenas nas cepas virulentas. Griffith descobriu que bactérias virulentas mortas
por calor transformavam bactérias não virulentas vivas em bactérias virulentas.
A bactéria não virulenta adquiria o traço de colônia lisa da bactéria morta por
calor. Os resultados sugeriram que o material genético que codificava as
cápsulas permanecia intacto mesmo depois que a bactéria virulenta (colônia
lisa) tivesse sido morta, e que esse material poderia entrar em outra célula e
recombinar-se com seu material genético.
Avery, MacLeod e McCarty reproduziram os resultados de Griffith e analisaram
o extrato das bactérias virulentas mortas por calor por sua natureza química e
fator transformante. Os pesquisadores removeram, de forma seletiva, DNA,
RNA ou proteínas do extrato das bactérias virulentas mortas por calor mediante
tratamentos com DNase, RNase ou proteases (enzimas que degradam
especificamente um desses componentes). O extrato tratado com DNase
perdeu a capacidade de transformar células não virulentas de colônias rugosas
em cepas virulentas de colônias lisas. Os pesquisadores então extraíram DNA
das bactérias virulentas, purificaram-no de proteínas e RNA contaminantes e
mostraram que esse DNA puro ainda era capaz de transformar bactérias não
virulentas em cepas virulentas. Em 1944, Avery e colaboradores relataram
suas conclusões surpreendentes de que o DNA era o carreador da informação
genética.

DNA (ferramentas analíticas)

- Ultracentrifugação
-Eletroforese
- Espectrofotometria de absorção ultravioleta
- Análises químicas elementares

DNA (material genético)

- DNA e RNA absorvem luz à 260 nm
- Na década de 1940, geneticistas duvidavam de que o DNA seria o material
genético uma vez que o DNA é uma repetição monótona de quatro bases.
- Em 1953, Watson & Crick publicaram o modelo estrutural da dupla hélice de
DNA e Chargaff já havia demonstrado que as quatro bases não estavam
presentes em proporções iguais.

Experimento de Hershey e Chase

Em 1952, Martha Chase e Alfred Hershey realizaram um experimento, hoje
clássico, cujos resultados convenceriam o mundo de que o DNA é o material
genético. Eles usaram um vírus bacteriano, composto principalmente por
proteína e DNA, e planejaram determinar quais desses componentes carrega o
material hereditário. O bacteriófago T2, ou fago T2, assim como outros vírus
bacterianos, consiste em uma capa proteica e um centro de DNA.
Aproveitando-se do fato de que o enxofre é encontrado em proteínas, mas não
no DNA, e que o fósforo é encontrado no DNA, mas não em proteínas, eles
prepararam o fago T2 marcado radiativamente utilizando 35S (apenas a
proteína é marcada radiativamente) ou 32P (apenas o DNA é marcado
radiativamente). Permitiu-se que as duas amostras do fago T2 se ligassem à
sua bactéria hospedeira, Escherichia coli, em dois frascos separados. Após a
infecção, as bactérias foram transferidas para um liquidificador e agitadas para
retirar qualquer material do fago T2 a partir do lado externo das paredes das
células bacterianas. As células foram coletadas por centrifugação, deixando o
fago não ligado no sobrenadante. Os resultados foram claros: o DNA marcado
com 32P foi transferido para dentro das células, enquanto as proteínas
marcadas com 35S permaneceram no sobrenadante. Portanto, é o DNA que
realiza o programa genético do fago. Na verdade, os fagos da progênie
produzidos nas células infectadas continham 32P, e não 35S, prova adicional
de que o DNA é o material genético. Embora experimentos anteriores,
realizados por Avery, sugerissem que o DNA era o material genético, o
experimento de Hershey e Chase finalizou esta importante conclusão e inspirou
Watson e Crick na sua busca para determinar a estrutura do DNA.
- Os experimentos clássicos de biologia molecular realizados por Griffith, Avery,
MacLeod, Mccarty, Hershey e Chase combinados revelaram que o DNA é o
elemento genético.

A natureza química dos polinucleotídeos

- Todos os ácidos nucleicos são cadeias quimicamente ligadas de
nucleotídeos, as unidades básicas ou blocos construtores do DNA e RNA.
- Um nucleotídeo é uma molécula composta por três componentes típicos: uma
base heterocíclica, um açúcar de cinco carbonos denominado pentose e um
grupamento fosfato.
- Cada base deriva de um de dois compostos originais uma purina ou uma
pirimidina, que são bases nitrogenadas.
- Nos nucleosídeos, a ligação covalente de uma base (no N-9 das purinas e N-
1 das pirimidinas) ao carbono 1 (C-1') da pentose forma uma ligação glicosídica
(especificamente uma ligação N-beta-glicosídica) que envolve a perda de uma
molécula de água.
- Para formar um nucleotídeo, um grupamento fosfato é ligado covalentemente
ao carbono 5' (C-5') da pentose formando um éster, também com perda
concomitante de uma molécula de água.
- Quatro bases diferentes são encontradas no DNA: duas são purinas, adenina
(A) e guanina (G), e duas pirimidinas, citosina (C) e timina (T). O RNA também
contém quatro tipos de bases. As duas purinas são as mesmas do DNA:
adenina e guanina, e, como no DNA, uma das pirimidinas é a citosina.
Contudo, a segunda principal pirimidina no RNA é a uracila (U) em vez da
timina. Raramente, a timina ocorre no RNA ou a uracila no DNA.
- Os ácidos nucleicos possuem dois tipos de pentoses. As unidades
nucleotídicas repetidas do DNA contêm a2'-desoxi-D-ribose, enquanto as
unidades nucleotídicas do RNA contêm D-ribose. A D-ribose possui um grupo
hidroxila ligado ao carbono 2', enquanto a 2'-desoxi-D-ribose não apresenta
esse grupo funcional.
- No DNA, a pentose é a 2'-desoxirribose, que não possui o grupo hidroxila no
carbono 2 ' (em vermelho); no RNA, o açúcar é a ribose, que inclui a 2'-
hidroxila. Uma ligação glicosídica liga o carbono 1' da ribose ou desoxirribose à
base; o beta indica a direção da base em relação ao anel da pentase.
- Iniciando pelo fosfato mais próximo à ribose, os três fosfatos costumam ser
designados alfa, beta e gama·
- DNA X RNA
Pentose (2’- desoxirribose no DNA versus ribose no RNA), a composição das
bases (timidina versus uracila), normalmente o DNA tem fita dupla, geometria
do açúcar (o carbono da posição 2 aponta para o 5 no DNA).
- As células também possuem nucleotídeos com o grupamento fosfato em
posições diferentes do carbono 5'. Por exemplo, ribonucleosídeos 2',3'-
monofosfato cíclicos são intermediários estáveis, e ribonucleosídeos 2'-
monofosfato ou ribonucleosídeos 3'-fosfato são produtos finais da hidrólise do
RNA por enzimas denominadas ribonucleases. Outras variações são
adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP) e guanosina 3',5'-monofosfato
cíclico (cGMP), que são importantes sinalizadores químicos do estado
metabólico da célula.
- A adenosina 5'-monofosfato, com o grupamento fosfato no C-5', é o
nucleotídeo de adenosina mais comum, e o único encontrado no RNA. Os
nucleotídeos adenosina 2'-monofosfato, adenosina 3'-monofosfato e adenosina
2',3'-monofosfato cíclico são formados pela hidrólise enzimática ou alcalina do
RNA. A adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP) é uma molécula de
sinalização acumulada quando a célula apresenta uma disponibilidade limitada
de nutrientes.
- Os nucleotídeos sucessivos no DNA e RNA são ligados covalentemente por
um grupamento fosfato "conector': no qual o grupamento 5'-fosfato de um
nucleotídeo é ligado ao grupamento 3'-hidroxila do próximo nucleotídeo,
formando uma ligação fosfodiéster.
- Um ácido nucleico curto, contendo 50 nucleotídeos ou menos, é geralmente
denominado oligonucleotídeo; um ácido nucleico mais longo é chamado de
polinucleotídeo.
- O DNA é mais estável que o RNA. Pois, como o componente açúcar do DNA
não possui um grupo 2'-hidroxila, não é facilmente hidrolisado em condições
alcalinas, o que torna o esqueleto do DNA inerentemente mais estável quando
comparado ao do RNA.
- As purinas e pirimidinas possuem várias propriedades químicas que afetam a
estrutura e, portanto, a função dos ácidos nucleicos. As bases de purinas e
pirimidinas comuns ao DNA e RNA são sistemas de anéis conjugados, com
ligações simples e duplas alternadas entre os átomos do anel.
- As bases livres, de purinas e pirimidinas, podem exibir duas ou mais formas,
chamadas de tautômeros, dependendo do pH
- Tautômeros das purinas e pirimidinas. Cada purina ou pirimidina apresenta
uma forma dos vários isômeros que diferem quanto à localização de um átomo
de hidrogênio e uma ligação dupla (tautômeros). A figura mostra dois
tautômeros para cada uma das bases mais comumente encontradas nos
ácidos nucleicos. O tautômero predominante em pH fisiológico para cada base
está à esquerda. As formas tautoméricas predominantes são encontradas no
DNA e no RNA e participam do pareamento de Watson-Crick.
- Reações enzimáticas que envolvem a transferência de um grupamento metil
de uma molécula para outra em geral envolvem o substrato S-adenosil
metionina(adoMet), que consiste em uma adenosina ligada a uma metionina.

Estrutura do DNA
- Na década de 1940, Erwin Chargaff e colaboradores fizeram uma importante
descoberta que forneceu evidências para a estrutura do DNA. Utilizando
amostras de DNA isoladas de diversos organismos diferentes, observaram que
as quatro bases do DNA ocorriam em diferentes proporções e que estas eram
características para cada espécie.
- Essas associações quantitativas, denominadas de regras de Chargaff, foram
subsequentemente confirmadas por vários pesquisadores. Além de serem
fundamentais para o estabelecimento da estrutura tridimensional do DNA,
esses achados forneceram evidências sobre o modo como a informação
genética é codificada no DNA e transmitida de uma geração para outra.
- As descobertas de Chargaff impuseram limitações importantes nos possíveis
modelos para a estrutura do DNA. Ao mesmo tempo, Rosalind Franklin e
Maurice Wilkins utilizavam o potente método de difração de raios X para
analisarem fibras de DNA (ver Como Sabemos). Mostraram que o DNA produz
um padrão de difração de raio X característico. Esse padrão foi usado por
Watson e Crick para deduzir que as moléculas de DNA são helicoidais, com
duas periodicidades ao longo do eixo maior: uma principal.de 3,4 A e uma
secundária de 34 A.
- Com os dados de difração obtidos por Franklin e Wilkins, Watson e Crick
propuseram que o DNA era composto por duas cadeias polinucleotídicas
enroladas como uma hélice dupla torcida para a direita.
- As bases são posicionadas de modo a formar pontes de hidrogênio entre
as cadeias, de acordo com os pareamentos preferenciais de A com T e G com
C.
- As duas superfícies desiguais formadas pela torção da hélice são chamadas
de sulco maior e sulco menor. As fitas de DNA sempre apresentam uma
direção - ou polaridade - definida devido à forma assimétrica da ligação
química dos nucleotídeos que as compõem. Na hélice dupla, as duas fitas
possuem direções opostas, e as hélices são denominadas antiparalelas.
- Em termos químicos, isso quer dizer que uma cadeia segue na direção 5'-3' e
a outra, na direção 3'-5'. A orientação antiparalela das fitas de DNA é mais
favorável energeticamente do que a configuração paralela, por conta da
geometria das bases componentes. Além disso, a hélice dupla de DNA quase
sempre está torcida para a direita. Raras vezes, hélices torcidas para a
esquerda são observadas. Por convenção, as hélices são consideradas com
orientação para a direita, a menos que outra orientação seja especificada.
- O diâmetro da hélice é 20 A, a distância da base uma para a outra é 3,4 A.
- Uma volta da hélice é 34 A=10,5 pares de base.
- O diâmetro de A com T é maior (tem maior volume molar, a densidade é
menor)
- O empilhamento hidrofóbico (empilhamento das bases) auxilia na redução do
contato das bases com a água, e as interações de empilhamento são muito
importantes na estabilização da estrutura tridimensional dos ácidos nucleicos
(DNA e RNA). Esse empilhamento também envolve uma combinação de
interações de vander Waals e eletrostáticas entre as bases.
- A estrutura de Watson e Crick é conhecida como forma B do DNA, ou B-DNA.
Como é a estrutura mais estável para uma molécula aleatória de DNA em
condições fisiológicas, B-DNA é o padrão de referência em qualquer estudo
das propriedades do DNA.
- As duas variantes estruturais bem caracterizadas por cristalografia de raios X
são a forma A (A-DNA) e a forma Z do DNA (Z-DNA).
- O A-DNA é favorecido em várias soluções com ausência relativa de água.
Neste caso, o DNA também está disposto em duas hélices orientadas à direita,
porém a hélice é mais larga e o número de pares de bases por volta é 11, em
vez de 10,5 como no B-DNA. Enquanto os pares de bases no B-DNA inclinam-
se levemente na direção negativa - isto é, abaixo do plano - em relação ao
plano perpendicular ao eixo da hélice, os pares de bases do A-DNA estão
inclinados para cima do plano cerca de +20°.
- A forma Z é um desvio mais radical do B-DNA; a diferença mais óbvia é a
rotação da hélice à esquerda. São 12 pares de bases por volta, e a estrutura
tem uma aparência mais delgada e alongada. O esqueleto do DNA assume
uma aparência de zigue-zague (daí sua denominação Z). Algumas sequências
nucleotídicas adotam a hélice Z torcida à esquerda mais prontamente do que
outras. Exemplos proeminentes são sequências em que pirimidinas são
alternadas com purinas, em especial alternância entre resíduos C e G, ou
resíduos 5-metil-C e G.
- A ocorrência do A-DNA nas células não é confirmada, mas há evidências de
alguns segmentos de Z-DNA em cromossomos bacterianos e eucarióticos.
- Regiões nas quais as duas fitas complementares possuem a mesma
sequência quando lidas de 5' - 3' e 3' - 5' são chamadas de palíndromos e
ocorrem com relativa frequência no DNA cromossômico. Na linguagem escrita,
um palíndromo é uma palavra, frase ou sentença com sequência idêntica
quando lida de frente para trás e de trás para frente; dois exemplos são
ARARA e SUBI NO ÔNIBUS. Em biologia, o termo é aplicado a regiões do
DNA de fita dupla onde a sequência de uma fita é idêntica à sua complementar;
por exemplo 5'-GAATTC-3' é um palíndromo porque a sua sequência
complementar também é 5'-GAATTC-3'.
- Os palíndromos são formados por repetições invertidas adjacentes, que
ocorrem em uma das fitas de DNA ou nas duas fitas da hélice dupla. Um
arranjo relacionado é a repetição espelhada, na qual a sequência repetida
invertida não constitui um palíndromo.
-Os tríplex são formados por sequências longas contendo apenas pirimidinas
ou apenas purinas em determinada fita.
- Tetraplex: sequências de DNA com alta proporção de resíduos G. Ex. nos
telômeros.
- Fitas de DNA com sequências invertidas podem formar estruturas de grampo
ou cruciformes, envolvidas na recombinação e regulação da expressão gênica.
Formas de triplex ou tetraplex de DNA ocorrem raramente e podem atuar no
seu metabolismo.
- Motivo I (pesquisar)

Estrutura do RNA

- Os vírus são pequenos agentes infecciosos constituídos de genoma e

capsideo proteico
–Não possuem atividade metabólica própria
–Quando um vírus infecta uma célula hospedeira, a maquinaria celular é
desviada e começa a produzir as proteínas virais
–Genes virais são replicados e utilizados para a produção de proteínas virais
que montar em partículas de vírus
- Genoma do vírus, classificação de Baltimore (olhar slide)
- A grande variação das funções do RNA reflete uma diversidade estrutural
muito mais rica do que a observada nas moléculas de DNA. A propensão do
RNA em adotar formas curvadas compactas foi inicialmente revelada na
década de 1970, com a determinação das primeiras estruturas de diversas
moléculas de RNA
- Essas estruturas mostraram que uma fita simples de RNA é dobrada sobre si
mesma, formando pequenos segmentos de bases pareadas unidos por regiões
não pareadas. Tal propriedade, denominada estrutura secundária do RNA,
permite que as moléculas de RNA se dobrem produzindo inúmeras formas
diferentes que servem a várias funções biológicas distintas.
- A estrutura secundária do tRNA forma uma folha de trevo com quatro hélices
que se unem em uma junção central. A estrutura contém diversos pares de
bases não Watson-Crick e alças. A estrutura tridimensiona l do tRNAPhe (um
tRNA específico para fenilalanina na síntese proteica), determinada por
cristalografia de raios X, é mostrada como um diagrama de fitas.
- Assim como no DNA, as fitas pareadas no RNA são antiparalelas e tendem a
adotar uma conformação helicoidal com inclinação para a direita estabilizada
pelas interações de empilhamento de bases. Contudo, ao contrário do DNA, os
segmentos com bases pareadas do RNA estão intercalados por vários outros
pareamentos de bases não Watson-Crick, como pareamentos entre A-A e G-U.

Propriedades químicas e termodinâmicas dos ácidos nucleicos

- O DNA nativo sofre desenrolamento reversível e separação das fitas
(desnaturação) pelo aquecimento ou extremos de pH. Sequências de DNA
ricas em pares de bases G = C apresentam temperaturas de desnaturação
mais altas do que DNAs ricos em pares de bases A=T.
- A hibridização, ou pareamento de bases entre duas fitas de ácidos de origens
diferentes, é a base de técnicas importantes para o estudo e isolamento de
genes e RNAs específicos.
- Mutações são alterações permanentes na estrutura do DNA que alteram a
informação genética codificada. A desaminação da citosina é uma mutação
química comum no DNA que pode danificar o código genético se não for
corrigida pela célula. A desaminação de ácidos nucleicos virais pode ser usada
como uma defesa contra infecções virais.
- Resíduos específicos de A e C são, em geral, metilados enzimaticamente
após a síntese de DNA. A E. coli utiliza a metilação para distinguir entre seu
próprio DNA e o DNA estranho e para facilitar o reparo de pares de bases
errôneos que surgem devido a erros na replicação.
- Em eucariotos, a metilação do DNA costuma inibir a expresão gênica. O RNA
pode ser quimicamente modificado por enzimas que introduzem um
grupamento metila ou acetila em sítios específicos ou alteram uma base
nucleotídica de alguma outra forma. Essas modificações parecem estabilizar as
estruturas de RNA e influenciar o reconhecimento do RNA por proteínas.
- Polímeros de DNA e RNA com qualquer sequência podem ser sintetizados
por procedimentos simples e automatizados, que envolvem métodos de síntese
química e enzimática. A síntese em fase sólida de DNA e RNA ocorre na
direção 3' ~ 5', usando nucleotídeos quimicamente protegidos. Esses
nucleotídeos são seletivamente desprotegidos e acoplados à cadeia
polinucleotídica crescente em ciclos sucessivos.