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Jornal de Botânica Experimental, Vol. 55, nº 398, pp. 803±813, abril de 2004 DOI:
10.1093/jxb/erh085 Publicação de acesso antecipado em 12 de março de 2004

DOCUMENTO DE PESQUISA

Efeito de substâncias húmicas de baixo tamanho molecular na

absorção de nitrato e expressão de genes envolvidos no transporte
de nitrato em milho (Zea MaysEU.)

Silvia Quaggiotti1, Benedetto Ruperti2, Diego Pizzeghello1, Ornella Francioso3, Vitaliano Tugnoli4e Serenella
Nardi1,*

Baixado de https://academic.oup.com/jxb/article/55/398/803/467996 por convidado em 10 de novembro de 2023

1Dipartimento di Biotecnologie Agrarie, Agripolis, UniversitaÁ di Padova, Viale dell'UniversitaÁ 16, I-35020 Legnaro
(Padova), Itália
2Dipartimento di Scienze Agrarie ed Ambientali, UniversitaÁ di Udine, Via delle Science 208, I-33100 Udine, Itália

3Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali, Alma Mater Studiorum, UniversitaÁ di Bologna, Viale
Fanin 40, I-40127 Bologna, Itália
4Dipartimento di Biochimica, UniversitaÁ di Bologna, Via Belmeloro 8/2, I-40127 Bolonha, Itália

Recebido em 23 de junho de 2003; Aceito em 2 de dezembro de 2003

Abstrato
Neste estudo, uma caracterização detalhada de substâncias
húmicas de baixo tamanho molecular (LMS) de minhocas foi
realizada e essas substâncias foram usadas para estudar seu
efeito no influxo de nitrato nas raízes, no conteúdo de nitrato
nos tecidos e na expressão de genes de milho supostamente
envolvidos no nitrato. absorção no milho (Zea Mays
EU.). Os resultados mostram que a fração húmica de
baixo tamanho molecular utilizada neste estudo é dotada
da rede estrutural característica descrita para a maioria
das substâncias húmicas até agora isoladas e confirmam
Introdução
O impacto ambiental das culturas e dos sistemas de cultivo, o baixo
custo de produção e, como consequência, a necessidade de reduzir
as aplicações químicas no solo, tornaram-se objectivos importantes
na agricultura, anteriormente dominada essencialmente pela
produtividade (Gastal e Lemaire, 2002). Para evitar a poluição por
nitratos e preservar a sua margem económica, os agricultores devem
optimizar a aplicação de fertilização azotada (Hirele outros,2001), que
tem sido uma ferramenta poderosa no aumento da produtividade de
grãos nas últimas três décadas. Isto é especialmente verdade para
culturas de cereais, como o milho e o trigo, que foram seleccionados

a presença de IAA nesta fração. Os resultados mostram principalmente pela sua adaptação a uma elevada utilização de

também que a fração LMS de substâncias húmicas fertilizantes (Castelberrye outros, 1984). Além disso, os períodos de

estimula a absorção de nitrato pelas raízes e o acúmulo pousio são muitas vezes reduzidos no cultivo itinerante, levando à

do ânion ao nível da folha. Além disso, a análise da degradação irreversível do solo, a uma diminuição da capacidade de
troca catiónica (CTC) e a uma menor eficiência dos fertilizantes
expressão de genes que codificam dois supostos
minerais aplicados, especialmente
transportadores de nitrato de milho (ZmNrt2.1e
quando a perda de nutrientes móveis, como NO± 3ou K+de
ZmNrt1.1)e de dois milho H+-Isoformas de ATPase (Mha1e
a camada superficial do solo é reforçada pelas chuvas (Cahne outros,1993).
Mha2)mostram que essas substâncias podem exercer
Por estas razões, o estudo da melhoria da eficiência da absorção
efeitos diretos na transcrição gênica em raízes, como
de nutrientes pelas plantas, quer através da selecção de culturas de
mostrado para oMha2gene e efeitos de longa distância
baixo consumo, quer através da redução da quantidade de perdas
nas brotações, como observado para oZmNrt2.1gene.
minerais do solo, tem recebido atenção considerável dos cientistas

Palavras-chave: Transição gênica, substâncias húmicas, baixo nas últimas décadas. Demonstrou-se frequentemente que a aplicação

tamanho molecular (LMS), milho, teor de nitrato, influxo de nitrato, de esterco ou biomassa com diferentes níveis de humi®cação
raízes. aumenta a fertilidade do solo (Glasere outros,2002). Como
consequência, o desvendamento dos aspectos fisiológicos e

* Para quem a correspondência deve ser endereçada. Fax: +39 49 8272929. E-mail: serenella.nardi@unipd.it

Jornal de Botânica Experimental,Vol. 55, nº 398,aSociedade de Biologia Experimental 2004; todos os direitos reservados
804Quaggiottie outros.
eventos moleculares subjacentes aos efeitos das substâncias húmicas
(HS) no metabolismo das plantas e, em particular, na eficiência do uso
de nutrientes pelas plantas, tornou-se um objetivo principal para
compreender e melhorar os mecanismos envolvidos na resposta das
plantas ao estresse nutricional.
Muitos artigos mostraram que o HS pode melhorar as
propriedades físicas e químicas do solo, favorecer uma maior
concentração de íons na solução do solo e atuar como fonte e
sumidouro de nutrientes como P, N e K (Vaughane outros,
1985). Na rizosfera, uma interação entre o sistema radicular e
a matéria húmica é possível quando as moléculas húmicas
presentes na solução do solo são pequenas o suficiente para
fluir para o apoplasto e atingir a membrana plasmática.
Muitos autores demonstraram a capacidade da fração
húmica de baixo tamanho molecular (LMS) de se acumular no
apoplasto e atingir, pelo menos em parte, a membrana
plasmática (Vaughan, 1986; Muscolo e Nardi, 1999). Este
evento ocorre nas proximidades da superfície da raiz, onde a
liberação simultânea de prótons e ácidos orgânicos pela raiz
e pelos micróbios permite a dissociação das macroestruturas
húmicas e a subsequente liberação das frações bioativas de
outra forma indisponíveis (Dell'Agnola e Nardi, 1987; Piccoloe
outros,1992). Esses LMS podem entrar na planta e afetar o
metabolismo da planta, induzindo ou reprimindo a síntese
protéica (Vaughan e MacDonald, 1971; Dell'Agnolae outros,
1981), por ativação ou inibição enzimática (Butler e Ladd,
1969), e pela indução de mudanças morfofuncionais na
arquitetura da raiz (Nardi e outros,1996; Canelase outros,
2002).
Os efeitos das substâncias húmicas na captação de íons
(nitrato, sulfato e fosfato) foram discutidos por muitos autores
(Vaughane outros,1985; Chen e Aviad, 1990; Varanini e Pinton,
2001; Palmase outros,2001) e parecem ser seletivos e
quantitativamente relacionados à concentração de H2S e ao pH
do meio. Tais efeitos estão longe de serem totalmente
compreendidos, devido à natureza complexa e ainda
desconhecida das substâncias húmicas, e podem estar
relacionados a uma síndrome de efeitos fisiológicos no
metabolismo vegetal envolvendo, direta ou indiretamente, uma
modulação da captação de íons.
Foi sugerido que as frações húmicas exibem alta atividade
hormonal e, em particular, atividade semelhante à auxina
(para uma revisão, ver Nardie outros,2002). Nardie outros. (
1994), utilizando dois inibidores de auxina (TIBA=ácido 2,3,5-
tri-iodobenzóico e PCIB=ácido 4-clorofenoxi-isobutírico),
demonstrado emNicotiana plumbaginifoliaque o
componente LMS da matéria húmica é a fração dotada de
atividade semelhante à auxina, embora as vias seguidas pelo
IAA e pela fração LMS na indução de seus efeitos possam ser
um pouco diferentes.
Pintone outros. (1999), mostraram que a fração húmica
extraível com água de baixo peso molecular (WEHS) afeta a
captação de nitrato e a membrana plasmática (PM) H+-Atividade
ATPase em raízes de milho. Os autores demonstraram que
mudas de milho expostas ao WEHS apresentam maior
capacidade de absorver NO±3e uma indução mais rápida de nitrato
absorção. O mesmo padrão também foi observado para a
atividade do PM H+-ATPase, levando os autores a supor um
possível papel do WEHS na modulação da captação de nitrato
através de uma interação com o PM H+-ATPase. Mais
recentemente, Canellase outros. (2002) mostraram que os
ácidos húmicos, isolados do composto de minhoca,
induziram H no milho+- Atividade ATPase, aumentando o
conteúdo da enzima. Apesar da quantidade considerável de
dados fisiológicos e bioquímicos e dos progressos alcançados
no isolamento dos genes envolvidos na regulação do
transporte de nitratos, não existe informação disponível a
nível molecular sobre os efeitos das substâncias húmicas na
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expressão destes genes.
O transporte ativo de nitrato através da membrana
plasmática é uma etapa fundamental do metabolismo do
nitrato, exigindo transportadores de membrana
específicos e é alimentado pela diferença eletroquímica
favorável de prótons gerada pelo PM H+-ATPases (Thibaud
e Grignon, 1981; Ruiz-Cristin e Briskin, 1991; Meharg e
Blatt, 1995; Miller e Smith, 1996; Wang e Crawford, 1996).
Estudos fisiológicos demonstraram a existência de
pelo menos três NÃO diferentes± 3sistemas de absorção nas plantas, com
um sistema de transporte de baixa afinidade essencialmente não regulamentado
(LATS) ativo em alto NO externo± 3concentrações e
dois sistemas de transporte de alta afinidade, sendo um deles
constitutivo (cHATS), enquanto o outro é induzido por nitrato
(iHATS), que são ativos em baixas concentrações externas (Glass
e Siddiqi, 1995; Forde e Clarkson, 1999). Dados moleculares
estabeleceram que múltiplos membros da família de genes que
codificam supostos transportadores de nitrato estão presentes
tanto para os sistemas de alta como de baixa afinidade (Glass e
outros,2001). Aqueles que codificam os transportadores HATS,
denominadosNrt2genes, foram atribuídos à família NNP (nitrato-
nitrito porter), enquanto aqueles que codificam os
transportadores LATS, denominadosNrt1genes, à família PTR
(transportador de peptídeos), ambos pertencentes à superfamília
de transportadores de membrana MFS (Major Facilitator
Superfamily) (Forde, 2000).
O objetivo desta pesquisa foi caracterizar a composição
química e estrutura da fração LMS das substâncias
húmicas utilizadas neste estudo e verificar se o LMS tem
efeito na absorção e acumulação de nitrato no milho.
Portanto, o NÃO2±3in¯ux pelas raízes, e o nitrato
acúmulo em raízes e folhas foi determinado e o nível de
expressão de um cDNA, denominadoZmNrt2.1,codificando
um suposto transportador de nitrato de alta afinidade
(Quaggiottie outros, 2003; número de acesso AY129953) foi
avaliado em raízes e parte aérea de mudas de milho em
resposta ao tratamento com LMS. Além disso, foi isolado um
cDNA parcial de milho, altamente homólogo aos membros da
família do gene PTR (ZmNrt1.1,AY187878) e seu acúmulo de
transcritos foi medido em raízes e brotos, juntamente com o
nível de expressão de dois genes de milho que codificam dois
genes H+-Isoformas de ATPase,Mha1 (Jin e
 Efeito de substâncias húmicas na absorção de nitrato em milho805
Bennetzen, 1994; número de acesso U09989) eMha2 (Friase
outros,1996; número de acesso X85805), para esclarecer o
papel do H+-ATPases na resposta desta espécie ao
tratamento com LMS.
Materiais e métodos
Condições de cultura de minhocas
As fezes deNicodrilus (= Allolobophora (Eisen)=Aporretodea (Oerley))
caliginoso (Savigny) eAllolobophora rosea (Savigny) foram coletados
da superfície do capim-sofá não cultivado (Agropyron repensL.)
®campos da fazenda da Faculdade de Agricultura (Universidade de
Pádua) conforme já descrito em Muscoloe outros. (1999). Os solos
foram todos classificados como Cambissolo Calcário (CMc,
classificação FAO).
Extração da fração húmica LMS
Compostos húmicos foram extraídos das fezes deNicodrilus (=
Allolobophora (Eisen)=Aporrectodea (Oerley)caliginoso (Savigny) e
Allolobophora rosea (Savigny) usando 0,1 N KOH como já descrito em
Muscoloe outros. (1999). O extrato foi dessalinizado usando tubo
Visking de diálise de corte de 14 kDa (Medicell, Reino Unido) contra
água destilada. Posteriormente o extrato foi dessalinizado em troca
iônica Amberlite IR-120 (H+forma) (Stevenson, 1994). Esta fração foi
então acidificada até pH 2,1 com ácido acético glacial e nenhum
precipitado foi formado, em contraste com quando ácidos
inorgânicos foram usados para acidificação. A fração acidificada foi
dialisada usando Spectra/Pora3 tubos (corte MW 3500) contra água
destilada. A fração LMS eluída foi purificada por destilação a vácuo e
cromatografia de troca iônica (Nardie outros,1991; Músculoe outros,
1999) e depois liofilizado. O teor de carbono húmico foi medido
através do método oxidativo (Stevenson, 1994).
Transformadas de Fourier infravermelhas de reectância difusa (DRIFT)
A fração LMS foi homogeneizada com KBr (grau FT-IR, Aldrich Chemical Co.
Milwaukee, WI). Após a moagem, a mistura da amostra foi colocada sobre
o topo do copo de microamostra. Qualquer excesso de material foi
removido com uma ferramenta de ponta reta. Para o fundo, foi preparado
um copo de microamostra de KBr puro. Os espectros foram registrados
com um espectrofotômetro Nicolet Impact 400 FT-IR (Madison, WI) e
equipados com um aparelho para retância difusa (Spectra-Tech. Inc.,
Stamford, CT). Os espectros DRIFT foram registrados com 200 varreduras
coletadas a 4 cm±1resolução.
1Espectroscopia de RMN de 1H
A fração LMS (20 mg) foi dissolvida em 0,5 ml de D2O. Os espectros foram
registados com um espectrómetro Bruker ACF 250 utilizando uma sonda
multinuclear de 5 mm.1Os espectros H foram acumulados com um ponto
de dados de 16 K, uma sequência de pulso, 40°ângulo de pulso, atraso de
relaxamento de 3 s e largura de varredura de 2,5 kHz. Para obter uma
relação sinal-ruído satisfatória foram necessários 1.000 ± 2.000 exames. A
irradiação controlada foi aplicada entre as aquisições para pré-saturar o
pico de água residual. 3-trimetilsilil-propionato de sódio-2,2,3,3-d4(TSP) foi
adicionado às amostras para fornecer um padrão de mudança química. Os
espectros foram divididos em três regiões principais: hidrogênios
aromáticos (HR) de 6,0±8,0 ppm; H ligado a grupos de oxigênio no carbono
(Hco) de 4,2±3,0 ppm, e H alifático (Ha) de 3,0±0,5 ppm. De acordo com
resultados obtidos por Wilsone outros. (1983) o Hcoregião foi atribuída a
prótons decorrentes em grande parte de polissacarídeos. Wilsone outros. (
1983), Gil-Sotrese outros. (1994) e Simpsone outros. (1997) mostrou que o
Htudoregião pode ser afetada pela presença de prótons ligados a anéis
aromáticos emum, b,egposições.
13Espectroscopia de RMN de 13C
A intensidade relativa observada para um determinado valor de desvio
químico, expressa como uma fração da intensidade total do sinal
adquirido, representa a proporção desse tipo de C presente na amostra
(Baldock e Preston, 1995). O espectro foi dividido em regiões de
deslocamento químico atribuídas às classes de grupos químicos alquil C
(0±50 ppm), O-alquil C (50±100 ppm), C aromático (110±160 ppm) e
carboxil C (160±185 ppm ) e carbonila C (185±220 ppm), respectivamente
(Matherse outros,2000; Calcinhae outros,2000). Ao integrar a intensidade
do sinal contida em cada região de deslocamento químico, foi calculada a
proporção de um determinado tipo de C.
Determinação do teor de ácido indolacético
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A determinação quantitativa de IAA na fração LMS foi feita por um
ensaio imunoenzimático (ELISA) (Phytodetek-IAA, Sigma, St Louis,
MO). As soluções traçadoras e padrão foram preparadas seguindo as
instruções do fabricante. Para cada poço 100eul de fração padrão ou
LMS e 100euForam adicionados l de traçador diluído. Após uma
incubação às 4°C por 3 h, os poços foram decantados e lavados com
adição de 200eul de solução de lavagem e depois 200eul de solução
de substrato. Após 60 minutos às 37°C, 50euFoi adicionado 1 litro de
reagente de parada a cada poço e a absorbância da cor foi então lida
a 405 nm usando um leitor de microplaca 450 Biorad (Biorad,
Hercules, CA).
Material vegetal
Sementes de milho (Zea MaysL.var. Mitos, Pioneer) foram embebidos
por uma noite em água corrente e germinados no escuro aos 27°C
em papel de filtro umedecido com CaSO4 1 mM4por 96 horas (Nardie
outros,2000). As mudas foram cultivadas em 400 ml de Hoagland no.
2 solução (Hoagland e Arnon, 1950) por 14 dias como segue: 16 h de
luz a 25°C e 60% de umidade relativa, 8 h de escuridão às 18°C e 80%
de umidade relativa. As mudas foram então incubadas em soluções
contendo diferentes concentrações da fração LMS (0,25, 0,5, 0,75, 1
mg l±1C), ou 1 mM de CaSO44(controle) por mais 48 horas (Nardi e
outros,2000). As concentrações da fração LMS foram escolhidas de
acordo com Nardie outros. (2000) e experimentos anteriores (dados
não publicados) que indicaram que a concentração de 0,75 mg l±1
C expressou atividade máxima. Ao final deste período, as plantas
foram coletadas.
NÃO32±in¯ux e NÃO2± 3determinação de conteúdo
Após 48 h de incubação com LMS as mudas foram transferidas para uma
solução contendo 1,5 mM de KNO3por 5 horas. Sucessivamente, grupos de
cinco mudas foram transferidos para solução nutritiva contendo
0,5mm15NÃO± 3por 5 min, após um período de 3 min de equilíbrio em um
solução não rotulada idêntica à usada para o experimento.
Sucessivamente, as plantas foram removidas e suas raízes foram imersas
em solução nutritiva não marcada e gelada por 2 min para eliminar o
fração apoplástica do15NÃO± 3. Raízes e folhas foram colhidas
separadamente, pesado e moído em moinho de bolas. As amostras foram
analisadas com espectrometria de massa de razão isotópica de fluxo
contínuo (FINIGAN MAT Mod. Delta Plus) e a abundância de15O N nas
soluções de captação foi determinado após diluições isotópicas com
referência KNO3solução de modo que cada amostra continha
aproximadamente 100eug de N.
O nitrato foi extraído moendo 1 g de material vegetal congelado em 10
ml de HCl 10 mM e o extrato foi filtrado (0,22eum). A concentração de
nitrato foi determinada por cromatografia iônica utilizando coluna de
separação Ion-Pac AS4A-SC (Dionex, Sunnyvale, CA), com solução de K 1,8
mM.2CO3e 1,7 mM de KHCO33como eluente, em um
806Quaggiottie outros.
¯velocidade de fluxo de 2 ml min±1. A quantificação do nitrato foi obtida utilizando uma
curva de calibração.
Clonagem e sequenciamento deZmNrt1.1
OZmNRT1.1a clonagem parcial de cDNA foi realizada pelo uso de primers
degenerados para motivos de sequência conservados dos genes
transportadores de nitrato eucarióticos de baixa afinidade (Nrt1) e usando
cDNA obtido de raízes de mudas cultivadas na presença de nitrato como
modelo. Os primers utilizados foram:
f-LANT-5¢-CCGTGACGCAGGTCGARGANBTNAA-3¢e r-LANT-5¢-
GCACAGGACGCCCATCADCCARWARAA-3¢. As reações foram
realizadas com o sistema Gene Amp PCR 9700 (Applied
Biosystems, Branchburg, NJ) utilizando 0,025 Ueueu±1Taq-
polimerase (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) nas
seguintes condições: 5 min a 94°C seguido por 40 ciclos de 30 s a
94°C, 1 min a 58°C, 30s a 72°C, e 7 min de extensão final a 72°C.
Os produtos de amplificação obtidos foram subclonados no vetor
pGEM-T Easy (Promega, Milano, Itália) e plasmídeos de dez colônias
recombinantes foram sequenciados. Os plasmídeos foram
preparados utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden,
Alemanha) e sequenciados, de acordo com Sangere outros. (1977),
usando o kit Rhodamine Terminator original da ABIPRISM (Applied
Biosystem, Branchburg, NJ). As comparações de sequências foram
realizadas utilizando os programas de computador BlastX e BlastN
(NCBI, National Center for Biotechnology Information).
OZmNrt1.15¢-o clone final foi isolado pelo 5¢-Técnica RACE
conforme descrita por Schaefer (1995). O primer usado para o 5¢-
CORRIDA foi 5¢-GACCGTGTTGAGGTACGACCC-3¢.Os produtos de
amplificação obtidos foram subclonados e dez recombinantes
foram sequenciados.
Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA total foi isolado usando o kit 'Nucleon Phytopure' (Amersham-
Pharmacia, UK) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. O
cDNA da primeira fita foi sintetizado a partir de 5eug de RNA total,
após tratamento com DNase (Promega, Milano, Italia), utilizando 200
U de Transcriptase Reversa MMLV (Promega, Milano, Italia) e oligo dT
como primer, em 20eul reações, conforme descrito em Sambrooke
outros. (1989).
ZmNrt2.1, ZmNrt1.1, Mha1,eMha2análise de expressão
Experimentos de RT-PCR com primers específicos foram realizados para
avaliar o nível de expressão deZmNRT2.1, ZmNrt1.1, Mha1,e Mha2genes
em raízes e folhas de mudas tratadas e não tratadas com LMS por 48 h.
Para PCR, 1eul do cDNA obtido foi utilizado em 20eul reações, usando
0,025 Ueueu±1deTaq-polimerase (Amersham-Pharmacia-Biotech,
Piscataway, NJ). Para cada uma dessas reações foi testado um conjunto de
diferentes números de ciclos variando entre 10 e 25 para escolher aqueles
correspondentes à fase exponencial de cada gene. Cada ciclo foi composto
por uma desnaturação de 30 s a 94°C, 1 min de recozimento a 65°C e uma
extensão de 30 s a 72°C; um período de desnaturação de 5 minutos a 94°C
no início das reações e uma extensão de 7 min a 72°C no final foram
realizados para todas as reações. Primers específicos paraZmNrt2.1, Mha1,
eMha2foram desenhados com base em sequências correspondentes aos
genes disponíveis nas bases de dados e no caso deZmNrt1.1da sequência
de cDNA parcial isolada como descrito acima (Tabela 1).
Uma Ubiquitina de milho (U29162) e uma Actina de milho (J0128)
foram utilizadas como padrões internos constitutivos e os primers
utilizados foram: 5¢- CCACTTGGTGCTGCGTCTTAG-3¢ (primer direto); 5
¢-CCTTC-TGAATGTTGTAATCCGCA-3¢ (primer reverso) para Ubiquitina
e 5¢-TGTTTCGCCTGAAGATCACCCTGTG-3¢ (avançar); 5¢-TGA-
ACCTTTCTGACCCAATGGTGATGA-3¢ (reverso) para Actina.
Os produtos de PCR obtidos a partir de análises de expressão foram
sequenciados para confirmar a especificidade de amplificação de cada
gene. Para confirmar os resultados, as reações de PCR foram realizadas
em cDNAs obtidos de duas extrações de RNA diferentes realizadas em
amostras de dois experimentos independentes e repetidas pelo menos
três vezes para cada cDNA. Os produtos de PCR foram submetidos à
eletroforese em géis de agarose 1±2%, corados com brometo de etídio,
transferidos e fixados em membranas Geen-Screen (NENÔCiências da
Vida, Boston, MA). As membranas foram então hibridizadas com as sondas
de cDNA correspondentes a cada gene e lavadas com alto rigor como
descrito em Sambrooke outros. (1989) antes da exposição a filmes de raios
X a ±80°C. A hibridização foi realizada a 65°C em uma solução contendo 53
SSC, 53Solução de Denhardt, SDS 0,1% (p/v), fosfato de potássio 50 mM e
100eug ml±1esperma de arenque sonicado. As sondas foram preparadas
pelo método de priming aleatório, utilizando32O dCTP marcado com P e as
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membranas foram lavados a 65°C com 23SSC, 0,1% (p/v) SDS, com 13SSC,
0,1% (p/v) SDS e com 0,13SSC 0,1% (p/v) SDS, por 20 min cada.
Os sinais de hibridização foram quantificados utilizando o programa
LabImage 2.6 (Kapelan).
Resultados
Caracterização da fração LMS
Espectroscopia DRIFT:A interpretação do espectro DRIFT (Fig.
1) foi de acordo com espectros publicados por Baes e Bloom
(1989), Niemeyere outros. (1992), Stevenson (1994), Johnston
e outros. (1994) e Franciosoe outros. (2001, 2002). O espectro
foi dominado por uma banda larga em torno de 3200 cm-±1
atribuído an(OH) vibração de grupos carboxílicos e alcoólicos
em diferentes ambientes eletrostáticos (Bellamy, 1975); a
banda em torno de 2960 cm±1foi atribuído a assimétricon(CH)
movimentos de grupos alifáticos. A faixa forte e nítida
aparecendo em 1719 cm±1é característico de grupos carboxila
não dissociadosn(C=O) vibrações (Rao, 1963; Niemeyere
outros, 1992; Franciosoe outros,1998, 2002). Além disso, o
aparecimento de uma banda larga em 2626 cm±1foi atribuído
a n(OH) vibração de grupos carboxila (Rao, 1963). Esta banda
é, sem dúvida, devida à formação de ligações de hidrogênio
intermoleculares entre grupos OH em compostos oxigenados
(Rao, 1963). As bandas em 1612 e 1514 cm±1
provavelmente corresponde an(C=O) vibração na amida I e
ambasd(NH) en(CN) vibrações na amida II. Além disso, essas
bandas são devidas às vibrações C=C e CC nos anéis
aromáticos, respectivamente. A banda em 1413 cm±1
corresponde a d(CH2) ené(COO±) movimentos de
alongamento simétricos (Bellamy, 1975; Niemeyere outros,
1992; Stevenson, 1994). A banda aparecendo em 1220 cm±1
pode ser atribuído an(CO) vibrações de grupos álcool, fenol e
carboxila. A banda aparecendo em 1083 cm±1é atribuído ao
estiramento de CO de carboidratos e álcoois (Bellamy, 1975;
Stevenson, 1994), bem como aos movimentos de estiramento
CC de grupos alifáticos e flexão CH no plano de anéis
aromáticos.
1Espectroscopia de RMN de 1H:A região do próton aromático,
mal resolvida no espectro (Fig. 2), sugeriu que o LMS
 Efeito de substâncias húmicas na absorção de nitrato em milho807
Tabela 1.Sequências de primers específicos utilizados para análises de expressão por RT-PCR
Na primeira coluna é relatado o nome do gene e seu número de acesso, e na segunda e terceira colunas é relatada a sequência de primers forward e
reverse, respectivamente.
Avançar
ZmNrt2.1 (AY129953) 5¢-ATCTTCGGGGTCATCCCCTTTGTCT-3¢ 5
ZmNrt2.2 (AY187878) ¢-CCTATGAAACCGTCCTAGCGC-3¢ 5¢-
Mha1 (U09989) GATGCTTGCCTCTGCGGTATAC-3¢
Mha2 (X85805) 5¢-ACAAATTCGGTGTGAGGTCGATCAGG-3¢
Figura 1.Espectro DRIFT da fração húmica LMS extraída de fezes de
minhocas. As bandas correspondem an(OH) vibração de grupos
carboxílicos e alcoólicos (3200 cm±l); assimétricon(CH) movimentos de
grupos alifáticos (2960 cm±l); grupos carboxila não dissociadosn(C =
O) vibrações (1719 cm±1);n(OH) vibração de grupos carboxila (2626
cm-±l);n(C=O) vibração na amida I e ambasd(NH) e n(CN) vibrações em
amida II (1612 e 1514 cm-±l;n(CO) vibrações de álcoois, fenóis e
grupos carboxila (1220 cm-±l); Alongamento CO de carboidratos e
álcoois, bem como movimentos de alongamento CC de grupos
alifáticos (1083 cm-±l).
fração estava em um estágio inicial de humi®cação. Esta
observação foi confirmada pela região intensa e ampla
(3,0±5,0 ppm) atribuída a componentes semelhantes a
açúcar, materiais poliéteres ou grupos metoxi (Wilsone
outros,1983; Wershaw, 1985) derivados de lignina, que
podem sobreviver aos estágios iniciais da humificação. A
inspeção da região alifática revelou uma estrutura de prótons
®ner com aparência de um sinal muito bem resolvido que
pode corresponder a ácidos orgânicos de baixo peso
molecular (alifáticos) e outros componentes como éteres
(Franciosoe outros,2000). Um dupleto intenso a 1,43 ppm é
identificado como os grupos de lactato (Wilsone outros,1988;
Ventilador, 1996; Franciosoe outros, 2000). Além disso, outras
ressonâncias amplas e intensas a 0,83 ppm e 1,3 ppm são
devidas aos prótons dos grupos metila terminais das cadeias
de metileno, respectivamente (Malcolm, 1990). Em particular,
as ressonâncias mais intensas apareceram em 1,9 ppm
(acetato), 2,70 ppm (provisoriamente acetoacetato) e 3,70
ppm (indolacético) (Aldrich Library, 1993; Fan, 1996).
Reverter
5¢-CAGCGTGCACGCCATGATCAT-3¢ 5
¢-GACCGTGTTGAGGTACGACCC-3¢ 5¢-
TTCTTCTTGCTTGTGAATGCGA-3¢
5¢-TGTAGTTCTGCTGGATGGTGTCGATGT-3¢
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Figura 2.EUEspectro de H RMN da fração húmica LMS extraída de fezes de
minhocas em D2O. O espectro mostra umaHaregião (6,0±8,0 ppm) mal
resolvida, umHcoregião ampla (4,2±3,0 ppm) atribuída a componentes
semelhantes a açúcar, materiais poliéter ou grupos metoxi, e umaHtudo
região (3,0±0,5 ppm) com uma estrutura de prótons ®ner que pode
corresponder a ácidos orgânicos de baixo peso molecular.
Além disso, a presença de ácidos orgânicos de baixo
peso molecular também foi corroborada pelas bandas em
2626, 1719 e 1220 cm±1no espectro DRIFT (Fig. 1) que
foram atribuídos a vibrações de grupos COOH em
dímeros ácidos.
13Espectroscopia de RMN de 13C:O espectro de RMN (figura não
mostrada) mostrou um singleto intenso e nítido em tornodC±20,
característica de CH3grupos em cadeias alquil. Em particular, os
picos que aparecem em 20,76 (bCH3) e 183,40 (COO±) ppm
confirmou a presença de lactato conforme revelado pelo
1Espectro de RMN de 1H. De acordo com Canelase outros.
(2002) o amplo sinal observado na região entredC±44 a
±57 sugeriram o baixo nível de humi®cação da fração
LMS isolada das fezes das minhocas, devido ao aumento
do C ligado ao mono e di-O.
O pico emdC±60 é atribuído ao OCH3-grupos. A região
entredC±60 a ±70 podem ser atribuídos ao C de CO em
álcoois primários e polissacarídeos. Em particular, o ombro
ao redordC±70 indicou a presença de átomos de C ligados a N
em aminoácidos (Canellase outros,2002). O baixo sinal de C
aromático sugeriu o estágio inicial de formação
808Quaggiottie outros.
Figura 3.15NÃO± 3-in¯ux nas raízes (A) e teor de nitrato nas folhas e raízes (B). Em (B) o motivo sombreado é usado para o controle e branco para o
mudas tratadas. Valores com a mesma letra não são estatisticamente diferentes emP =0,05 pelo teste de Student±Newman±Keuls.
Mesa 2.13Espectroscopia de RMN de 13C e conteúdo de IAA
Distribuição percentual das intensidades de C (ppm) em diferentes regiões do13Espectros de ressonância magnética nuclear C e teor de ácido indolacético
(nM de IAA) da fração húmica LMS.
Intensidade relativa (área total%)
0±48 48±105
(alifático C) (peptídeo C e carboidrato)
LMS 26,6 32,7
desta fração húmica. Os picos entredC±160 a ±190
indicaram a presença de átomos de carbonil C
substituídos de forma diferente.
Quantitativamente os espectros revelaram 225% de carboxila
4,4% de fenólicos, 13,8% de aromáticos, 32,7% de peptídeos e
carboidratos e 26,6% de outros carbonos alifáticos (Tabela 2).
Conteúdo IAA:O conteúdo de IAA na fração LMS determinado
por um método de imunoensaio revelou uma concentração
de IAA de 37 nmol mg±1C, correspondendo a uma
concentração final de 27,75 nM na solução de 0,75 mg C l±1
solução (Tabela 2).
NÃO32±in¯ux e conteúdo de tecido
Experimentos de influxo de nitrato foram realizados com o objetivo
de avaliar a atividade de sistemas constitutivos e indutíveis de
captação de nitrato de alta afinidade e de baixa captação de nitrato.
sistemas globalmente ativos a 0,5 mM NO2±3. Mudas de milho
pré-tratadas com LMS por 48 horas e depois transferidas para uma
solução contendo 1,5 mM de nitrato apresentaram um valor de
influxo 70% maior que as plantas controle (Fig. 3).
No que diz respeito ao teor de nitrato nos tecidos, as raízes
das plantas tratadas e não tratadas não apresentaram diferença
significativa, enquanto o teor de nitrato nas folhas apresentou
um valor 50% maior nas mudas tratadas com LMS do que nas
folhas das plantas controle ( Figura 3).
Baixado de https://academic.oup.com/jxb/article/55/398/803/467996 por convidado em 10 de novembro de 2023
IAA (nM)
105±145 145±165 165±190
(aromático C) (fenólico C) (carboxila C)
13,8 4.4 22,5 27,75
Clonagem deZmNrt1.1e análise da expressão de
ZmNRT1.1eZmNRT2.1em raízes e brotos
Para investigar o papel da regulação transcricional dos
transportadores de nitrato de milho na indução da captação de
nitrato observada após o tratamento com LMS, avaliou-se a
expressão de dois genes que codificam supostos transportadores
de nitrato de milho em mudas tratadas e não tratadas. Para
tanto, foi utilizado um clone parcial de cDNA de 1570 pb (número
de acesso AY187878), denominadoZmNRT1.1,que codifica um
suposto transportador de nitrato de baixa afinidade, foi isolado
pelo uso de PCR degenerado e 5¢-CORRIDA. Sua expressão foi
avaliada em conjunto com a de um suposto transportador de
nitrato de alta afinidade previamente caracterizado denominado
ZmNRT2.1 (número de acesso AY129953, Quaggiotti e outros,
2003). A sequência de aminoácidos deduzida de ZmNRT1.1
mostraram um domínio conservado de cerca de 400 aminoácidos
típico da família PTR de transportadores de nitrato de baixa
afinidade e uma similaridade de sequência de 65% com um
transportador de nitrato de arroz.
A análise da expressão deZmNrt2.1,um suposto
transportador de nitrato de alta afinidade, em raízes de
mudas de milho cultivadas por 48 h na presença de LMS, não
apresentou qualquer indução em termos de acúmulo de
transcritos correspondentes a este gene, mostrando a
presença de um gene semelhante sinal constitutivo em
mudas tratadas com controle e LMS (Fig. 4).
 Efeito de substâncias húmicas na absorção de nitrato em milho809
Figura 4.Análise do acúmulo de transcritos de supostos transportadores
de nitrato de milhoZmNrt2.1eZmNrtl.lnas raízes e nas folhas das mudas
controle e tratadas com LMS. Quantificação deZmNrt2.1e ZmNrtl.1a
expressão foi realizada utilizando o método de PCR semiquantitativo na
faixa linear. O RNA total foi transcrito reversamente e amplificado por PCR
em diferentes ciclos utilizando primers específicos. Os produtos de PCR
foram transferidos e especificamente sondados e quantificados usando o
software TotalLab (Kapelan). As análises foram repetidas pelo menos três
vezes para cada cDNA obtido a partir de duas extrações diferentes de RNA.
Ubiquin foi usado como padrão interno.
No que diz respeito aos brotos (Fig. 4),ZmNrt2.1 os
transcritos não puderam ser detectados nas mudas controle,
ao contrário, nas mudas tratadas com substâncias húmicas
LMS por 48 h, foi detectada a presença de um sinal claro. Isto
indica uma indução deZmNrt2.1 acumulação de transcritos
por tratamento LMS na parte aérea.
A análise da expressão deZmNrt1.1,codificando um
suposto transportador de nitrato de baixa afinidade em
raízes e brotos (Fig. 4) de mudas de milho, mostrou a
presença de um sinal constitutivo tanto nas mudas controle
quanto nas tratadas com LMS, sem diferenças significativas
entre os órgãos e tratamentos considerado.
Expressão deMha1eMha2
Devido ao papel desempenhado por H+-ATPases na
captação de nitrato (Thibaud e Grignon, 1981; Ruiz-Cristin
e Briskin, 1991; Meharg e Blatt, 1995; Miller e Smith, 1996;
Hirsch e Sussman, 1999), a expressão de dois genes
previamente isolados, codificando dois genes de milho H+-
ATPases, denominadasMha1 (Jin e Bennetzen, 1994,
número de acesso U09989) eMha2 (Friase outros,1996;
número de acesso X85805), foi estudado no controle e em
mudas tratadas com LMS.
Análise RT-PCR deMha1o acúmulo de transcritos nas raízes
mostrou a presença de um sinal constitutivo tanto nas plantas
tratadas quanto nas não tratadas, sem alterações significativas em
termos de acúmulo de transcritos por até 48 horas de tratamento
com substâncias húmicas de baixo peso molecular (Fig. 5). Nos brotos
de mudas não tratadas,Mha1descobriu-se que os transcritos se
acumulavam em maior extensão do que nas raízes, enquanto, em
contraste, permaneciam quase indetectáveis nos brotos de mudas
tratadas com LMS (Fig. 5), sugerindo assim uma regulação negativa
daMha1expressão em tecidos da parte aérea do milho por
tratamento com LMS.
Figura 5.Análise de acúmulo de milho H+-Genes ATPaseMhal eMha2
Baixado de https://academic.oup.com/jxb/article/55/398/803/467996 por convidado em 10 de novembro de 2023
transcritos em raízes e folhas de controle e mudas tratadas com LMS.
Quantificação deMhaleMha2a expressão foi realizada pelo método de PCR
semiquantitativo na faixa linear. O RNA total foi transcrito reversamente e
amplificado por PCR em diferentes ciclos utilizando primers específicos. Os
produtos de PCR foram transferidos e especificamente sondados e
quantificados usando o software TotalLab (Kapelan). As análises foram
repetidas pelo menos três vezes para cada cDNA obtido a partir de duas
extrações diferentes de RNA. Ubiquin foi usado como padrão interno.
Tão longe quantoMha2No que diz respeito ao acúmulo de
transcritos, um sinal fraco foi detectado nas raízes de plântulas
não tratadas, enquanto um aumento significativo (8 vezes) foi
encontrado nas raízes de plântulas que foram cultivadas na
presença de substâncias húmicas LMS por 48 h (Fig. 5). Estes
resultados sugerem uma regulação positiva da transcrição do
Mha2gene em resposta ao fornecimento de ácidos húmicos. Em
contraste com as raízes, uma presença muito fraca deMha2
transcritos foram detectados na parte aérea, sem diferenças
significativas entre plântulas tratadas e não tratadas (Fig. 5).
Discussão
Neste estudo, é relatada a investigação de alguns aspectos
fisiológicos e moleculares do efeito de substâncias húmicas na
absorção de nitrato em mudas de milho através da avaliação do
influxo de nitrato nas raízes, juntamente com o teor de nitrato
nos tecidos e a análise da expressão de nitrato. genes específicos
supostamente envolvidos no processo de captação. O milho foi
utilizado pela sua relevância econômica mundial (Mann, 1999) e
pela sua importância como uma das melhores plantas modelo
para combinar estudos fisiológicos e agronômicos (Hirele outros,
2001).
Relatórios anteriores dos autores e de outros grupos
mostraram os efeitos estimuladores das substâncias húmicas nos
processos fisiológicos relacionados ao crescimento e
produtividade do milho, como a absorção de nutrientes e a
capacidade de redução (Vaughane outros,1985; Chen e Aviad,
1990; Nardie outros, 2000; Varanini e Pinton, 2001; Palmase
outros,2001). Apesar da quantidade considerável de dados
fisiológicos e bioquímicos, nenhuma informação está disponível a
nível molecular sobre os efeitos do HS na expressão de
810Quaggiottie outros.
genes específicos, embora tenha sido relatada uma ação na
síntese de proteínas por LMS (Vaughan e MacDonald, 1971;
Dell'Agnolae outros,1981; Nardie outros, 2000). Além disso, o
progresso na investigação sobre HS tem sido
consideravelmente dificultado pela falta de caracterização da
fração húmica utilizada. Para tanto, foi realizada uma
caracterização detalhada da minhoca HS por DRIFT (Diffuse
Reectance Infrared Fourier Transforms),1Mão13A
espectroscopia de RMN-13C foi realizada e essas substâncias
foram utilizadas para estudar seu efeito na absorção de
nitrato e na expressão de genes de milho supostamente
envolvidos na absorção de nitrato.
A fração húmica LMS utilizada nesta pesquisa mostrou, em
comparação com valores típicos relatados para um HA médio do
solo (Schnitzer, 1991), um alto teor de carboxila, peptídeo e
carboidrato C e um baixo teor de C alifático e fenólico. resultados
apontam que a fração húmica do LMS utilizada neste estudo
estava em estágio inicial de humi®cação, conforme descrito por
Canellase outros. (2002), com os quais partilha características
comuns. Por outro lado, estes dados também mostram que esta
fração é dotada da rede estrutural característica descrita para a
maioria das substâncias húmicas isoladas de diferentes fontes de
matéria orgânica (Clapp e Hayes, 1999) e, juntamente com os
dados relatados por Canellase outros. (2002), confirmam que
caminhos comuns levam à formação em diferentes ambientes de
frações LMS com características semelhantes. Além disso, os
resultados deste estudo confirmaram a presença de IAA na
fração LMS, conforme já encontrado por Muscoloe outros. (1998)
e por Nardie outros. (2002), através de uma abordagem
imunológica, e por Canellase outros. (2002), por meio de
cromatografia gasosa-espectrometria de massa.
Para estudar os efeitos específicos destas substâncias na
absorção de nitratos, foram medidos o influxo de nitrato nas
raízes e o conteúdo tecidual de nitrato e também foi realizada
a caracterização do acúmulo de transcritos de alguns genes
implicados no transporte de nitrato para avaliar o
envolvimento de seus regulação transcricional na
determinação da resposta do milho ao tratamento com LMS.
Nestas experiências, tanto as plântulas de controlo como as
tratadas com LMS foram transferidas durante um período de 5 horas
numa solução contendo nitrato 1,5 mM para medir o influxo de
nitrato induzido. Os resultados mostraram um fluxo de nitrato 70%
maior nas mudas tratadas com LMS do que no controle, confirmando
os resultados dos outros grupos.
O teor de nitrato nos tecidos só mostrou diferenças significativas
nas folhas, com uma quantidade maior de nitrato nas plantas
tratadas com LMS do que nas mudas controle, sugerindo que o LMS
pode estimular o acúmulo de nitrato nas folhas,
possivelmente como consequência de um NO mais eficiente2± 3absorção
e translocação para brotos.
Nas raízes, não houve aumento em termos de acúmulo de transcritos
de um gene que codifica um novo suposto transportador de nitrato de
baixa afinidade de milho, denominadoZmNrt1.1,e de um suposto
transportador de nitrato de alta afinidade previamente caracterizado,
ZmNrt2.1 (Quaggiottie outros,2003), foi encontrada em resposta
ao tratamento com LMS por 48 horas. Embora o envolvimento de
outros transportadores de nitrato na resposta radicular aos
ácidos húmicos não possa ser descartado, a ausência de
estimulação da transcrição destes dois genes, e especialmente da
deZmNRT2.1,que demonstrou ser transcricionalmente regulado
positivamente nos tecidos radiculares pela disponibilidade de
nitrato com um alto grau de correlação com a indução do
sistema iHATS para absorção de nitrato (Quaggiottie outros,
2003), sugerem que o aumento da absorção de nitrato medido
após 48 h de permanência de mudas de milho em solução
contendo LMS pode envolver mecanismos pós-transcricionais/
pós-traducionais de regulação deZmNrt2.1e/ou uma modulação
Baixado de https://academic.oup.com/jxb/article/55/398/803/467996 por convidado em 10 de novembro de 2023
indireta do processo de absorção. Este último efeito pode contar
com a ação de H+-ATPases responsáveis por gerar a diferença
eletroquímica de prótons através da membrana plasmática
essencial para a captação de nutrientes (Serrano, 1989),
considerando também que a captação de nitrato pelas plantas é
considerada um transporte secundário impulsionado pela
diferença eletroquímica de prótons gerada pela bomba de
prótons (Thibaud e Grignon, 1981; Ruiz-Cristin e Briskin, 1991;
Meharg e Blatt, 1995; Miller e Smith, 1996; Wang e Crawford,
1996). Estes resultados, não mostrando alterações no acúmulo de
transcritos doMha1gene (Jin e Bennetzen, 1994) em raízes de
mudas cultivadas na presença de LMS, sugerem que a
transcrição deste gene não está envolvida na regulação da
absorção de nitrato em resposta a este tratamento. A análise da
expressão deMha2,uma importante isoforma de H no milho+-
ATPase preferencialmente expressa em células guarda, floema e
células epidérmicas radiculares (Friase outros,1996), mostrou
forte indução em termos de acúmulo de seus transcritos em
raízes de mudas de milho cultivadas na presença de LMS por 48
h. Isto está de acordo com dados recentemente relatados por
Canellase outros. (2002), mostrando, em raízes de plantas de
milho expostas ao composto de minhoca por 7 dias, um aumento
de PM H+-Conteúdo de ATPase medido por análise de western
blot usando anticorpos criados contra a isoforma PMA2 de
Nicotiana plumbaginifolia.Os autores levantaram a hipótese de
que isso poderia ser devido a um aumento da isoforma Mha2
através de um efeito sobreMha2transcrição e, considerando que
Friase outros. (1996) demonstrado como a característica
regulatória mais significativa doMha2gene um aumento de 3
vezes em seu nível de mRNA no estado estacionário em resposta
à auxina, concluiu que a ação do LMS no PM H+-ATPase pode
contar com a ativação dependente de auxina doMha2gene. Os
presentes resultados, mostrando uma estimulação deMha2A
síntese de mRNA por LMS exclusivamente ao nível da raiz já após
48 h de tratamento, pode apoiar ainda mais esta hipótese e
sugerir um papel putativo para o IAA presente no LMS no
mecanismo de regulação da resposta da planta a substâncias
húmicas através de um efeito na expressão de genes específicos.
Além disso, estes dados, tomados em conjunto com os de
ZmNrt1.1eZmNrt2.1expressão, apontam que o aumento da
absorção de nitrato medido no milho após
 Efeito de substâncias húmicas na absorção de nitrato em milho811
o tratamento com LMS provavelmente depende da
estimulação de Mha2expressão genética e, como
consequência, da eficiência do sistema de simporte de nitrato
através da geração de uma diferença eletroquímica de
prótons mais favorável, em vez da regulação positiva de
genes que codificam transportadores específicos.
No que diz respeito aos brotos, embora os efeitos do HS na
fisiologia dos brotos sejam mediados por eventos de sinalização
raiz-broto ainda não caracterizados, a indução da síntese de
transcritos deZmNrt2.1, observado em mudas expostas ao LMS,
juntamente com a ausência de alterações significativas na
ZmNrt1.1eMha2 transcrição e uma notável regulação negativa de
Mha1 expressão, apontam que o tratamento com LMS também
afeta a expressão gênica em brotos com diferenças marcantes
em comparação com raízes.ZmNrt2.1a transcrição também
demonstrou ser regulada positivamente nas folhas de milho,
bem como nos tecidos radiculares, em resposta à disponibilidade
de nitrato e, portanto, também afirmou estar provavelmente
envolvida na translocação e compartimentação de nitrato em
todo o nível da planta (Quaggiotti e outros,2003). Por esta razão,
é possível especular que a estimulação LMS doZmNrt2.1o
acúmulo de transcritos na parte aérea, que é consistente com um
maior teor de nitrato nas folhas de plantas tratadas com LMS,
pode implicar uma translocação mais eficiente de nitrato para
seus sumidouros metabólicos e refletir uma melhor eficiência no
uso de nitrogênio, também acreditado para estar conectado a
uma remobilização de nitrogênio mais eficiente (Hirele outros,
2001). Uma vez que o papel específico de Mha1 H+- A ATPase
ainda permanece parcialmente desconhecida, o significado
fisiológico exato destes resultados que mostram a acentuada
regulação negativa da sua expressão genética exigirá estudos
futuros destinados à caracterização do papel de genes adicionais
que codificam H+-Isoformas de ATPase e uma melhor
compreensão dos fatores envolvidos nos eventos de sinalização
raiz-caule evocados em resposta ao tratamento com LMS.
Em conclusão, estes dados tomados em conjunto sugerem
que a fração LMS de substâncias húmicas estimula a absorção de
nitrato no milho, possivelmente através da regulação positiva da
síntese de mRNA do principal H do milho.+-ATPase forma Mha2.
Os resultados também sugerem que a fração LMS, além de
exercer efeitos diretos na transcrição gênica em raízes, também
pode induzir efeitos de longa distância na expressão gênica da
parte aérea, como observado para oZmNrt2.1eMha1genes.
Novos estudos devem ter como objetivo elucidar as
características da auxina contida no LMS e sua contribuição na
regulação desses processos e nas respostas globais das plantas
às substâncias húmicas.
Reconhecimentos
Agradecemos ao professor Angelo Vianello, da Universidade de
Udine, e ao Dr. David Carden, da Universidade de Pádua, pela leitura
crítica do manuscrito. Os fundos foram fornecidos pelo Programa
MURST Giovani Ricercatori 2000.
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