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O miR-216b transmitido pelo esperma
modula a proliferação celular
durante o desenvolvimento inicial do embrião via
Recebido: 21 de fevereiro de 2019 Maíra Bianchi Rodrigues Alves1, Rubens Paes de Arruda1, Tiago Henrique Câmara De Bem2,
Aceito: 28 de junho de 2019 ShirleyAndrea Florez-Rodriguez1, Manoel Francisco de Sá Filho1,3, Clémence Belleannée4,
Publicado: xx xx xxxx Flávio Vieira Meirelles2, Juliano Coelho da Silveira 2, Felipe Perecin 2 &
EneivaCarlaCarvalho Celeghini1
O potencial de fertilização do sêmen depende dos atributos morfológicos, funcionais e moleculares do esperma.
Recentemente, os microRNAs de esperma (miRNAs) demonstraram ser promissores em relação à sua
associação com diferentes fenótipos de fertilidade. No entanto, seu papel na regulação da fertilidade ainda precisa ser
determinado. Nós postulamos que os miRNAs do esperma podem regular o desenvolvimento embrionário inicial. A
partir desta perspectiva, a qualidade espermática e 380 miRNAs espermáticos foram investigados em sêmen congelado-
descongelado de touros de alta (HF; 54,3±1,0% taxa de prenhez) e baixa (LF; 41,5±2,3%) fertilidade. Dos nove
miRNAs que apresentaram níveis diferentes nas células espermáticas, o miR-216b estava presente em níveis mais
baixos nas células espermáticas HF e zigotos. Entre os genes-alvo do miR-216b (K-RAS, BECN1 e JUN), o K-RAS,
relacionado à proliferação celular, revelou um nível mais elevado em embriões bicelulares com HF. A taxa de primeira
clivagem, o número de células do blastocisto e o número de divisões também foram maiores na IC. Além disso,
usando um modelo baseado em embriões polispermáticos, demonstramos um aumento nos níveis de miR-216b em
zigotos associados à entrada de células espermáticas. Nossos resultados lançam luz sobre um possível mecanismo
de contribuição paterna envolvendo o miR-216b transmitido pelo esperma que modula os níveis de miR-216b
em zigotos e K-RAS em embriões de duas células. Essa modulação pode regular o desenvolvimento inicial, interferindo na primeira cliv
Todos os atributos do esperma, incluindo características morfológicas, funcionais e moleculares, são importantes para a fertilidade
masculina1,2 . Pela complexidade desses atributos, o registro das taxas de prenhez é o procedimento mais satisfatório que permite
avaliar o potencial de fertilização do sêmen; no entanto, isso é caro e trabalhoso3 . Assim, uma investigação sobre a eficiência de
cada atributo do esperma como um preditor da fertilidade masculina é essencial para aprofundar nossa compreensão de suas
contribuições relativas. Nesse contexto, os espermatozóides devem ter a capacidade de: (1) chegar ao local da fertilização; (2)
fertilizar o óvulo; e (3) contribuir para o desenvolvimento embrionário inicial2 . Os aspectos morfológicos e funcionais do esperma,
aqui referidos como atributos de qualidade do esperma (SQA), estão diretamente relacionados à capacidade do espermatozóide de
alcançar o oviduto e fertilizar o óvulo. Motilidade espermática, anormalidades, integridade da membrana, função da mitocôndria e
status do DNA são exemplos de SQA que geralmente mostram alta correlação com a fertilidade masculina. Como tal, os SQA são
frequentemente usados para avaliar o potencial de fertilidade de lotes de sêmen congelado-descongelado1,4–6 . No entanto, como
o potencial de fertilidade masculina depende de várias características do esperma7 , restringir a avaliação a essas características
pode ser insuficiente para prever a fertilidade de algumas amostras de sêmen8 . As assinaturas moleculares do esperma estão
frequentemente ligadas à sua contribuição para o desenvolvimento embrionário inicial, que envolve a entrega do seguinte ao
embrião: DNA do esperma, mRNAs, proteínas e RNAs não codificantes, como microRNAs (miRNAs) que parecem estar relacionados
a espermatozoides saudáveis e potencial de fertilidade masculina2,9,10.
MicroRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes (~22 nt) que apresentam alto grau de conservação entre as
espécies e estão envolvidas na modulação da tradução de proteínas11. A via de biogênese canônica consiste na transcrição
mediada pela RNA polimerase II de transcritos primários de miRNA (pri-miRNA; ~200 nt) do DNA, que são clivados por Drosha e
DGCR8 para produzir miRNAs precursores (pré-miRNA; ~70 nt). Pré-miRNA
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, São Paulo,
Brasil. 2 Departamento de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga,
São Paulo, Brasil. 3 Alta Genética do Brasil, Uberaba, Minas Gerais, Brasil. 4 Departamento de Obstetrícia, Ginecologia e Reprodução,
Université Laval, Quebec, Quebec, Canadá.
Correspondências e solicitações de materiais devem ser endereçadas ao ECCC (e-mail: celeghin@usp.br)
Relatórios Científicos | (2019) 9:10358 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-46775-8 1

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é transportado do núcleo para o citoplasma pela Exportina 5, onde sofre clivagem por Dicer e pela proteína de ligação ao RNA TRBP para
formar um miRNA duplex de ~22 nt. Apenas uma fita se liga a um complexo de proteínas Argonauta para formar o complexo RISC (complexo
de silenciamento induzido por RNA), cuja atividade é dependente da ligação do miRNA à região 3' não traduzida (3' UTR) de seu gene alvo: a
ligação perfeita induz degradação do mRNA alvo; enquanto a ligação imperfeita impede a tradução do mRNA11 alvo. Os miRNAs são
atualmente conhecidos por seus papéis na espermatogênese12, maturação espermática13 e desenvolvimento embrionário14. Os miRNAs de
células espermáticas humanas foram descritos pela primeira vez por Ostermeier et al. (2005)15,16 e apresentam diferentes perfis de acordo
com o estado de fertilidade17,18.
MiRNAs específicos “transmitidos por esperma”, como miR-34c e miR-449b, são importantes para a primeira clivagem em embriões de
camundongos e bovinos, respectivamente10,19,20.
Com base em (1) a dependência dos atributos morfológicos, funcionais e moleculares do esperma para o sucesso da fertilidade masculina
e, (2) o potencial dos miRNAs transmitidos pelo esperma para desempenhar um papel na fertilidade regulando o desenvolvimento do embrião,
hipotetizamos que as etapas iniciais do desenvolvimento do embrião estão sob o controle de miRNAs específicos entregues por células
espermáticas. Assim, os objetivos deste estudo foram: (1) determinar os perfis SQA e miRNA de amostras de sêmen de touros de alta e baixa
fertilidade; (2) investigar os níveis relativos de miRNAs espermáticos e genes-alvo em embriões de amostras de esperma de alta e baixa
fertilidade; (3) investigar como alterações nos miRNAs podem regular o desenvolvimento do embrião; e (4) demonstrar que as células
espermáticas são capazes de entregar miRNAs ao zigoto.
Resultados
Experiência 1: Um nível mais baixo de miR-216b em espermatozóides e zigotos está associado a um alto nível de
K-RAS em embriões de duas células e um aumento na taxa de primeira clivagem e no número de células do
blastocisto. As amostras de sêmen HF e LF apresentam similaridade em relação aos atributos de qualidade do esperma.
A caracterização da qualidade do esperma foi realizada primeiro em três lotes de sêmen comercial de cada touro para dar um total de 1
Os resultados mostraram que a maioria das características avaliadas foram semelhantes para os dois grupos diferentes de amostras - consulte
a Tabela Suplementar S1. A seleção do melhor lote de sêmen de cada touro foi realizada de acordo com a Tabela Suplementar S2 para dar
um total de três lotes de touros HF (Alta Fertilidade; n=3) e três lotes de touros LF (Baixa Fertilidade; n=3). Nesse sentido, foi utilizada a
seguinte fórmula:
(1 × + PROG) [3 ( × ÿ 100 MAJ)] [ + ×2 (100 ÿ + MIN)] (3 P × IAIH),

onde PROG era motilidade progressiva, MAJ eram defeitos maiores, MIN eram defeitos menores e PIAIH era esperma com plasma e
integridade da membrana acrossômica e alto potencial de membrana mitocondrial. As características individuais de cada lote estão descritas
nas Tabelas Suplementares S3 e S4. As análises morfológicas e funcionais dos lotes selecionados mostraram que os espermatozoides dos
touros HF e LF foram semelhantes quanto à motilidade espermática, anormalidades, cinética, integridade plasmática e da membrana
acrossomal, função mitocondrial, produção de ERO, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA de acordo com dados apresentados nas
Tabelas 1 e 2.
Nove miRNAs estão presentes em um nível relativo diferente entre as células espermáticas de HF e LF. Um painel de 380 miRNAs foi avaliado
em espermatozoides de lotes selecionados. Destes, 24 miRNAs foram detectados exclusivamente em espermatozóides de touros HF, 32
miRNAs foram detectados exclusivamente em espermatozóides de touros LF e 242 miRNAs foram detectados em ambos os grupos, conforme
Tabela Suplementar S5 e Fig. 1A. Nove dos 242 miRNAs mostraram diferentes níveis relativos entre as amostras de esperma HF e LF com
um valor P de 0,10 (Fig. 1B). Níveis relativos diferentes de bta-miR-205, -505 e -532 apresentaram significância estatística de P<0,05; bta-
miR-33b, -126-5p, -216b, -339a, -500 e -542-5p apresentaram valor de P entre 0,05 e 0,10. Bta-miR-205, -505, -532, -33b, -126-5p, -500 e
-542-5p foram encontrados em maior abundância em espermatozoides de touros HF, enquanto bta-miR-216b e -339a foram encontrados em
maior abundância em espermatozóides de touros LF (Fig. 1B).
Maior taxa de primeira clivagem é detectada em embriões HF. Após avaliação da qualidade do esperma e perfil de miRNA, esperma de lotes
de sêmen HF e LF selecionados (características descritas nas Tabelas 1 e 2) foram usados para produzir embriões FIV; embriões
partenogenéticos também foram produzidos e usados como controles. Em cada repetição de produção de embriões, pools de 20 a 25 ovócitos
foram previamente divididos em gotas destinadas especificamente para avaliação e coleta de zigotos, embriões bicelulares e blastocistos em
um intervalo de tempo específico. Os zigotos fertilizados foram classificados e coletados de acordo com a taxa de extrusão do segundo
corpúsculo polar avaliado 16 a 18 horas pós-inseminação (hpi); esta taxa foi semelhante entre zigotos HF e LF, conforme mostrado na Tabela
3. No entanto, a taxa de primeira clivagem, avaliada 28 a 30 hpi em HF e LF, e 20 a 22 horas pós-ativação em embriões partenogenéticos, foi
maior em embriões de touros HF e partenogênese do que em embriões de touros LF (Tabela 3). As taxas de clivagem e blastocisto foram
avaliadas no mesmo grupo de oócitos/embriões. A taxa de clivagem avaliada no dia 4 de desenvolvimento foi semelhante entre os três grupos.
A taxa de blastocisto avaliada no dia 7 mostrou uma porcentagem maior no grupo de embriões partenogenéticos em comparação com HF e
LF, conforme mostrado na Tabela 3.
Níveis mais baixos de miR-216b e níveis mais altos de seu gene alvo K-RAS são detectados em zigotos HF e embriões de duas células,
respectivamente. Os níveis relativos de nove miRNAs (Fig. 1B) que eram diferentes entre as amostras de esperma HF e LF foram investigados
em zigotos e embriões de duas células produzidos a partir de touros HF e LF. Embriões partenogenéticos e oócitos maduros foram usados
como controles para esta análise. Entre os miRNAs avaliados, observou-se que o nível relativo de miR-216b foi menor em zigotos e oócitos
HF (Fig. 1C). Em embriões de duas células, nenhum dos miRNAs, incluindo miR-216b, mostrou uma diferença nos níveis relativos entre
embriões HF e LF (Fig. 1D). Os níveis relativos dos nove miRNAs investigados em embriões estão listados nas Tabelas Suplementares S6 e
S7. Após estabelecer que o miR-216b apresentou o mesmo padrão diferencial em espermatozoides e zigotos dos grupos HF e LF, os níveis
relativos dos genes-alvo do miR-216b foram investigados em embriões. Para determinar os genes-alvo do miR 216b, primeiro realizamos uma
análise de homologia do bta-miR-216b com o hsa-miR-216b-5p, que mostrou

Grupos de fertilidade
Análises de qualidade de esperma dos lotes selecionados HFa (n=3) LFb (n=3)
Motilidade, concentração e anormalidades espermáticas
Volume de palha (mL) 0,25 0,25
Motilidade subjetiva (%) 68,3±0,8 60,8±3,6
Vigor (1–5) 3,5±0,1 3,3±0,2
Concentração de esperma (×106 esperma/mL) 90,0±11,3 88,3±11,6
Principais defeitos (%) 16,5±3,9 24,3±1,5
Pequenos defeitos (%) 6,5±1,8 4,3±0,8
Total de defeitos (%) 23,0±5,7 28,6±2,3
Total de esperma/palha (×106 ) 22,5±2,8 22,1±2,9
Total de motilidade esperma/palha (×106 ) 15,3±1,9 13,5±2,4
Cinética do esperma
Motilidade total (%) 82,2±1,4 73,9±5,3
Motilidade progressiva (%) 57,2±5,7 58,5±4,4
Células rápidas (%) 75,6±0,2 69,3±4,6
Velocidade curvilínea (VCL; µm/s) 144,7±8,0 172,0±10,7
Velocidade progressiva (VSL; µm/s) 75,7±6,7 87,4±3,4
Velocidade do caminho (VAP; µm/s) 95,0±4,3 104,7±5,6
Linearidade (LIN; %) 52,5±4,9 51,0±2,1
Retidão (STR; %) 79,3±4,2 83,5±1,3
Oscilação (WOB; %) 65,9±2,7 61,1±2,1
Deslocamento lateral da cabeça (ALH; µm) 2,6±0,1 3,3±0,3
Frequência cruzada de batimento (BCF; Hz) 21,8±0,7 24,2±1,1
Tabela 1. Média e SEM dos atributos de qualidade do esperma (motilidade espermática, concentração, anormalidades e cinética)
avaliados nos lotes de sêmen comercial selecionados. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. a Alta
fertilidade; bBaixa fertilidade. SEM: erro padrão da média.
que os miRNAs compartilhavam a mesma sequência de nucleotídeos (aaaucucugcaggcaaauguga), revelando 100% de homologia.
Os genes-alvo de hsa-miR-216b foram então investigados e selecionados de acordo com dois critérios: (1) forte interação validada de
mRNA-miR216b (de acordo com a plataforma miRTarBase); e (2) genes que desempenham um papel relevante no desenvolvimento
do embrião. Assim, os genes-alvo K-RAS, BECN1 e JUN foram selecionados21–24. Além disso, o 3' UTR foi conservado entre as
sequências K-RAS, BECN1 e JUN de humanos e bovinos. Os níveis do gene alvo foram investigados em oócitos maduros, bem como
em zigotos e embriões de duas células dos grupos HF, LF e partenogenéticos, conforme mostrado na Fig. 2. Os níveis relativos de K-
RAS, BECN1 e JUN não mostraram diferença entre zigotos e oócitos. No entanto, o gene K-RAS estava presente em um nível relativo
mais alto em embriões de duas células do grupo HF, conforme mostrado na Fig. 2. O gene BECN1 estava presente em um nível
relativo mais baixo em oócitos maduros, mas mostrou o mesmo nível relativo em embriões dos grupos HF e LF.
Os embriões HF exibem um maior número de células em blastocistos e um maior número de divisões celulares até o estágio de
blastocisto do dia 7. Como a expressão do gene K-RAS está associada à proliferação celular, a qualidade do embrião foi investigada
com relação à proliferação, diâmetro, estágio e número de células do blastocisto, bem como o número de divisões celulares até o
estágio de blastocisto do dia 7. A imunocoloração foi realizada com Ki-67 para investigar a taxa de proliferação de embriões de
blastocisto. Isso revelou que os blastocistos HF e LF proliferaram em uma taxa semelhante (Fig. 3A,B).
De maneira semelhante, os diâmetros dos blastocistos dos grupos HF (235,4±18,3 µm) e LF (218,4±16,7 µm) foram semelhantes.
Além disso, a porcentagem de blastocistos precoces (HF: 3,3±2,0%; LF: 6,8±3,5%), blastocistos (HF: 28,3±5,1%; LF: 25,2±5,7%),
blastocistos expandidos (HF: 51,7±5,9%; LF: 43,7±3,9%) e blastocistos eclodidos (HF: 16,7±5,7%; LF: 24,3±5,1%) não apresentaram
diferença entre os grupos. No entanto, o número de células e o número de divisões celulares foram maiores nos blastocistos HF do
que nos blastocistos LF (Fig. 3C,D). Nos blastocistos HF o número de células e o número de divisões celulares foram 182,4±22,4 e
7,4±0,2, respectivamente; nos blastocistos LF foram 119,3±15,5 e 6,8±0,2, respectivamente. Além disso, parâmetros cinéticos de
desenvolvimento foram investigados em embriões produzidos por fertilização in vitro realizada por 8 horas, em vez das 18 horas
realizadas anteriormente, a fim de investigar a possibilidade de atraso na fertilização com espermatozóides LF. Embora as taxas de
clivagem para embriões de quatro células (HF: 25,4±4,2%; LF: 26,8±3,2%) tenham sido semelhantes neste estudo, HF (35,1±6,8%)
mostrou uma tendência (P=0,07) para produzir uma porcentagem maior de embriões de duas células do que LF (28,5±6,7%) conforme
mostrado na Tabela Suplementar S8.
Experimento 2: Nível mais alto de miR-216b está associado a zigotos polispérmicos. A concentração de espermatozoides de
8×106 espermatozóides/mL por gota de fertilização in vitro é eficiente para aumentar a taxa de zigotos polispérmicos. Para investigar
se as células espermáticas são capazes de entregar o miR-216b aos zigotos, propusemos um novo modelo baseado em embriões
polispérmicos. Nossa intenção com este modelo foi mostrar que, ao aumentar o número de células espermáticas por oócito, o nível
de miR-216b transmitido pelo esperma em zigotos pode ser aumentado. Com este objetivo, primeiro realizamos um estudo para
determinar a concentração de espermatozoides que poderia aumentar a formação de zigotos polispérmicos. Estudos anteriores realizados em noss

Grupos de fertilidade
Análises de qualidade de esperma dos lotes selecionados HFa (n=3) LFb (n=3)
Integridade das membranas espermáticas, função da membrana mitocondrial e produção de ROS por microscopia de fuorescência
PIAIHc (%) 48,9±4,7 45,2±6,1
Integridade da membrana plasmática (%) 51,5±5,1 48,5±6,4
Integridade da membrana acrossomal (%) 60,7±3,6 59,4±4,1
Alto potencial de membrana mitocondrial (%) 62,6±7,9 54,7±7,2
ROSd (%) 5,2±0,9 10,7±4,9
Integridade das membranas espermáticas, função da membrana mitocondrial, produção de ROS, peroxidação lipídica e
fragmentação do DNA por citometria de fluxo
Integridade da membrana plasmática (%) 49,5±0,3 45,6±8,2
Integridade da membrana acrossomal (%) 83,9±2,3 78,3±3,7
Plasma e integridade da membrana acrossomal (%) 49,3±0,3 45,4±8,3
Integridade da membrana plasmática e alto potencial de membrana mitocondrial (%) 24,4±2,1 26,3±2,9
Integridade da membrana plasmática e ROS positivo mitocondrial (%) 5,3±1,6 4,1±1,0
ROS positivo mitocondrial (ua) 621,0±76,2 678,3±23,5
Peroxidação lipídica (ua) 2.502,0±395,6 2.764,9±921,8
Fragmentação de DNA (%) 5,8±0,1 5,7±0,1
Tabela 2. Média e SEM dos atributos de qualidade do esperma (integridade e função das membranas espermáticas, produção de
ROS, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA) avaliados nos lotes de sêmen comercial selecionados.
b
As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. a Alta fertilidade; Baixa fertilidade; c Esperma com plasma e
integridade da membrana acrossomal e alto potencial mitocondrial; dProdução de ROS (espécies reativas de oxigênio).
SEM: erro padrão da média.
o laboratório mostrou que uma concentração de espermatozóides de 8 × 106 espermatozoides/mL por queda de fertilização in vitro resulta
em indução aprimorada de polispermia de maneira fisiológica e consistente em comparação com 4 × 106 espermatozóides/mL e 16 × 106
espermatozoides/mL (consulte a Fig. Suplementar S1 ). Assim, para verificar as taxas de indução de polispermia, uma concentração de
espermatozóides de 1 × 106 espermatozoides/mL por queda de fertilização in vitro foi considerada o controle e uma concentração de 8 × 106
espermatozoides/mL foi considerada induzida por polispermia. As concentrações de esperma induzidas por polispermia e controle foram
avaliadas em relação à taxa de formação de zigotos polispérmicos (Fig. 4A-D). A porcentagem de embriões polispermicos aumentou 3,8
vezes pela concentração de esperma induzida por polispermia, conforme mostrado na Fig. 4E. A taxa de polispermia foi de 7,9±4,7% para o
grupo controle e 29,8±5,9% para o grupo induzido por polispermia. A porcentagem de zigotos polispérmicos apresentando exatamente três
pronúcleos no grupo polispermia (17,5±4,6%) foi 2,9 vezes maior do que no grupo controle (6,1±4,7%). Além disso, a taxa de zigotos
polispérmicos apresentando quatro ou mais pronúcleos foi acentuadamente menor no grupo controle (1,8±0,4%), enquanto no grupo induzido
por polispermia foi 6,8 vezes maior (12,2±3,1%).
O MiR-216b está presente em níveis mais elevados em embriões polispérmicos. Como nossos dados sugerem que os níveis de miR 216b
podem ser modulados por células espermáticas em zigotos, esperávamos que embriões polispérmicos tivessem um nível mais alto de
miR-216b. Assim, após verificar a indução de polispermia, o nível relativo de miR-216b foi investigado em embriões polispérmicos e controles
produzidos com amostras selecionadas de sêmen HF e LF. Os resultados mostraram que a polispermia aumentou o nível relativo de
miR-216b (efeito de concentração de esperma: P=0,004) conforme mostrado na Fig. 4F.
Além disso, a comparação entre os controles revelou que o nível relativo de miR-216b foi maior no grupo LF do que no grupo HF, conforme
mostrado anteriormente.
Discussão O
sucesso da fertilidade depende de muitos fatores, incluindo influências femininas, masculinas e ambientais. Dentre os fatores masculinos, a
presença de espermatozoides saudáveis é determinante para a fertilidade2 . Os atributos de qualidade do esperma (SQA; atributos
morfológicos e funcionais) e os aspectos moleculares do esperma estão diretamente relacionados à determinação do esperma saudável.
Os atributos de qualidade do esperma geralmente estão altamente correlacionados com o potencial de fertilização masculina e são
frequentemente um preditor útil deste último4,25,26. No entanto, algumas amostras de sêmen exibem SQA satisfatório juntamente com baixa
fertilidade inesperada27. Assim, as características moleculares dos espermatozoides têm sido estudadas para melhor compreender essas instâncias.
Uma característica molecular particular do esperma que foi descrita diz respeito aos miRNAs do esperma. De fato, os miRNAs são importantes
para a espermatogênese12,28, maturação do esperma13,29,30 e também para o desenvolvimento do embrião10,14,20. Além disso,
sabemos agora, além de fornecer DNA aos embriões, as células espermáticas também são capazes de fornecer RNAs e miR
NAs2,10,13,20,31,32. Portanto, no presente estudo, investigamos o SQA de amostras de sêmen obtidas de touros HF e LF, bem como o
efeito da contribuição dos miRNAs espermáticos para o desenvolvimento embrionário pré-implantação. O interessante é que diferenças entre
SQA em amostras de sêmen de HF e LF podem não explicar a diferença nas taxas de fertilidade. Além disso, demonstramos que o nível de
miR-216b em zigotos está relacionado com o nível no esperma, e que isso pode estar relacionado às mudanças transcricionais nos níveis
relativos do gene K-RAS encontrados em embriões de duas células. Além disso, o nível reduzido do gene K-RAS em embriões de duas
células LF pode estar associado à redução na taxa de primeira clivagem de LF. É digno de nota que, embora as taxas de blastocisto não
tenham sido afetadas, detectamos um número menor de células em blastocistos derivados do grupo LF, sugerindo uma redução no número
de ciclos celulares até o estágio de blastocisto de 7 dias. Além disso, observamos que os zigotos polispermáticos apresentaram um maior
nível de

Figura 1. Análise de miRNA em espermatozóides e em embriões produzidos in vitro. (A) Diagrama de Venn de 298 miRNAs
detectados em espermatozóides de touros de alta fertilidade (HF) ou baixa fertilidade (LF) de um perfil de 380 miRNAs. (B)
Níveis relativos de miRNAs diferencialmente abundantes (P<0,10) entre espermatozoides de touros de alta e baixa fertilidade. (C)
Nível relativo de MiR-216b em zigotos dos grupos de alta fertilidade (HF), baixa fertilidade (LF), partenogenética (PA) e oócito maduro
(OO). (D) nível relativo de miR-216b em embriões de duas células de grupos de alta fertilidade (HF), baixa fertilidade (LF),
partenogenética (PA) e oócito maduro (OO). Asteriscos (*) indicam diferença entre os grupos com nível de significância de
P<0,10. a,bLetras diferentes indicam diferença estatística (P<0,05) entre os grupos. Todos os dados quantitativos são
apresentados como médias e SEM.
Clivagem e blastocistosc
2º PBa 1º decoteb Decote Blastocistos
Fertilidade
Grupos Oócitos N Média±SEM Oócitos N Média±SEM Ovócitos N Média±SEM N Média±SEM
HFd 329 160 48,6±2,1 273 75 27,5±3,8a 335 251 74,9±3,6 111 33,1±2,9b
LFe 322 139 43,2±4,2 278 52 18,7±3,7b 375 290 77,3±2,9 115 30,7±4,1b
PAf— _ —— 227 70 30,8±3,7a 300 228 76,0±2,9 126 42,0±2,9a
Tabela 3. Taxas de desenvolvimento pré-implantação de embriões bovinos produzidos in vitro. a Segundo corpo polar b
(PB; avaliada 16 a 18 hpi), dia 4 e blastocistosprimeira clivagem (avaliada 28 a 30 hpi ou 20 a 22 hpa), c clivagem na extrusão
no dia 7 foram avaliados em embriões produzidos in vitro usando amostras de sêmen de alta e baixa fertilidade e embriões
produzidos in vitro por partenogênese. a,bDiferentes letras na mesma coluna indicam diferença estatística (P<0,05) entre os
f
grupos. dAlta fertilidade; e Baixa fertilidade; Partenogenética. Hpi: horas pós-inseminação. Hpa: horas após a ativação. Média e SEM
são apresentados como porcentagens. SEM: erro padrão da média.
miR-216b. Assim, nossos resultados fornecem, pela primeira vez, uma provável regulação do desenvolvimento embrionário inicial pelo
miR-216b transmitido pelo esperma e revelam a modulação de seus níveis pela produção de embriões polispérmicos.
Diferentes fenótipos de fertilidade já foram associados a perfis específicos de miRNA espermático em bovinos18,33 e
humanos17,34. No presente estudo, foram utilizadas amostras comerciais de sêmen congelado de touros que apresentaram
diferentes taxas de prenhez em testes de campo e características morfológicas e funcionais de espermatozoides semelhantes. Embora
a taxa de blastocisto para produção de embriões in vitro tenha sido semelhante entre os grupos HF e LF de acordo com nossos
resultados anteriores, um estudo prospectivo paralelo foi realizado usando os mesmos lotes usados no presente estudo e revelou uma
diferença de ~ 13% na taxa de prenhez entre amostras de sêmen HF e LF35. O objetivo deste estudo prospectivo foi melhorar o uso
de amostras de sêmen de baixa fertilidade em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Nesse sentido, 522 vacas
lactantes de três diferentes rebanhos foram submetidas à IATF. Foi hipotetizado que o atraso no tempo de inseminação artificial na
IATF melhoraria as taxas de prenhez de amostras de sêmen de LF, mas isso não foi confirmado. Portanto, os resultados mostraram
que as taxas de gravidez não foram afetadas pelo protocolo de IATF

Figura 2. Análises dos genes-alvo do miR-216b em oócitos maduros e em embriões produzidos in vitro. Níveis relativos de K-RAS,
BECN1 e JUN em zigotos e embriões bicelulares dos grupos de alta fertilidade (HF), baixa fertilidade (LF), partenogenética (PA) e
oócito maduro (OO). a,b,cLetras diferentes indicam diferença estatística (P<0,05) entre os grupos. Todos os dados quantitativos
são apresentados como médias e SEM.
modificações. Além disso, nossos resultados revelaram que as taxas de blastocisto foram semelhantes entre os grupos de fertilidade.
Assim, levantamos a hipótese de que as diferenças nas taxas de fertilidade foram provavelmente devidas a características funcionais
relacionadas ao desenvolvimento embrionário inicial que poderiam envolver, entre outros fatores, componentes moleculares/miRNAs
entregues por células espermáticas HF e LF.
No presente estudo, detectamos nove miRNAs que apresentaram diferença em seus níveis relativos de expressão entre LF e HF com
significância estatística de 10%. De interesse é que um grande número de outros miR NAs mostraram diferenças na abundância relativa
entre touros de alta e baixa fertilidade, por exemplo, miR-19b-3p, -27a-5p, -34c-3p, -148b-3p, -320a -502-5p e -124918. A investigação dos
perfis de nove miRNAs espermáticos revelou que um miRNA (miR-216b) estava presente em um nível relativo mais alto nas células
espermáticas e também em zigotos de LF em comparação com HF. No entanto, os embriões de duas células HF e LF apresentaram níveis
relativos semelhantes deste miRNA. Embora hsa-miR-216b-5p seja descrito na plataforma SpermBase (http://spermbase.org/), até onde
sabemos, nosso estudo é o primeiro a relatar a importância do miR-216b para a fertilidade masculina e o desenvolvimento inicial do embrião.
No entanto, em diferentes tipos de tumores cancerígenos, o papel do miR-216b na inibição do crescimento e proliferação celular é bem
descrito36,37.
O MiR-216b tem um número limitado de genes-alvo que foram identificados de forma conclusiva. K-RAS, BECN1 e JUN foram
selecionados dentre estes para o presente estudo devido à sua importância no desenvolvimento embrionário21–24.
Apenas K-RAS mostrou altos níveis relativos em embriões de duas células HF em comparação com embriões LF. O K-RAS é um membro
da família do proto-oncogene ras e desempenha um papel na proliferação e diferenciação celular38. É o único membro da família ras com
importante papel no desenvolvimento embrionário22,23. A depleção de K-RAS em camundongos resulta em deficiência no desenvolvimento
embrionário e aumento da mortalidade embrionária22,23. No entanto, faltam informações sobre a importância do K-RAS para o
desenvolvimento embrionário em bovinos. De interesse é que o 3' UTR de K-RAS

Figura 3. Análise qualitativa do blastocisto. (A) Fotomicrografias confocais representativas da imunocoloração

de Ki-67 em blastocistos de grupos de alta e baixa fertilidade e controle negativo. Barra de escala: 50 ÿm. (B) Porcentagem
de células em blastocistos de alta fertilidade (HF) e baixa fertilidade (LF) que foram marcadas com anticorpo Ki-67. (C)
Números de células em blastocistos de alta fertilidade (HF) e baixa fertilidade (LF) corados com Hoechst 33342.
(D) Número de divisões celulares em blastocistos de alta fertilidade (HF) e baixa fertilidade (LF). Asteriscos (*) indicam diferença
entre os grupos com nível de significância de P<0,05. Todos os dados quantitativos são apresentados como médias e SEM.
Figura 4. Validação de embriões polispérmicos e análise do nível relativo de miR-216b. (A–D) Fotomicrografias
representativas de microscopia de fuorescência de pró-núcleos de zigotos de grupos controle e polispérmicos.
Barra de escala: 100 ÿm. Em (A,B), zigotos com dois pronúcleos. Em (C,D), zigotos com mais de três pronúcleos.
(E) Avaliação do pronúcleo (PN) e taxa de polispermia em zigotos bovinos produzidos in vitro com FIV controle (concentração
espermática de 1×106 espermatozóides /mL) ou FIV polispermia (concentração espermática de 8×106 espermatozóides/mL).
1
2 PN: dois pró-núcleos; 2ÿ3 PN: mais de três pró-núcleos. (F) Nível relativo de MiR-216b em zigotos produzidos in vitro com
FIV controle (concentração espermática de 1 × 106 espermatozóides /mL) ou FIV polispermia (concentração espermática de
8 × 106 espermatozóides /mL) usando amostras de sêmen de alta (HF) e touros de baixa (LF) fertilidade. Letras maiúsculas
indicam diferença (P<0,05) entre os grupos (HF vs. LF) com o mesmo tratamento (Controle). O asterisco (*) indica diferença
(P<0,05) entre os tratamentos (controle vs. polispermia) no mesmo grupo. Todos os dados quantitativos são apresentados
como médias e SEM.
é completamente conservada entre bovinos, humanos e camundongos. Além disso, está bem descrito que o miR-216b tem como
alvo K-RAS em muitos tipos de células. Tem sido documentado em tumores pancreáticos39,40, nasofaríngeos41 e renais42 que
a diminuição da abundância do gene K-RAS leva, consequentemente, a uma baixa proliferação e diferenciação celular.

Assim, propomos que níveis mais baixos de K-RAS em embriões de duas células LF é um efeito temporal resultante do nível mais alto
de miR-216b em zigotos LF fornecidos por células espermáticas LF. De fato, mostramos aqui que os espermatozóides de touros LF
exibiram um nível mais alto de miR-216b do que os espermatozoides de touros HF. Além disso, mostramos que o nível de miR-216b foi
maior quando mais de um espermatozoide fertilizou o oócito para produzir embriões polispérmicos.
Uma vez que o K-RAS está relacionado à proliferação celular, investigamos as taxas de primeira clivagem, clivagem no dia 4,
estágio de blastocisto no dia 7, proliferação de blastocisto, número de células de blastocisto e número de divisões celulares durante o
desenvolvimento inicial. Também avaliamos as taxas de duas e quatro células usando um modelo cinético de desenvolvimento. Nossa
hipótese é que os embriões com HF mostrariam mais proliferação. De fato, com relação a esses parâmetros, a taxa de primeira
clivagem, o número de células do blastocisto e o número de divisões celulares do blastocisto foram maiores em embriões HF em comparação com LF.
De interesse é que os embriões HF passaram por um ciclo celular adicional em comparação com os embriões LF (ver Fig. 3D). O maior
número de células e o maior número de divisões celulares nos blastocistos HF podem indicar algum efeito benéfico para o
estabelecimento da prenhez. Em humanos, um maior número de células em embriões transferidos está altamente associado ao
sucesso da gravidez43. De fato, os blastocistos são capazes de produzir e secretar fatores, denominados embriotropinas44, envolvidos
na modulação de transcritos endometriais mediados por interferon-tau, metabolismo de prostaglandinas e canais de aquaporinas45.
Diante disso, propomos que embriões com alta taxa de primeira clivagem e alto número de células possam liberar uma quantidade
aumentada de embriotropinas44 que são capazes de modular e sinalizar a presença do embrião ao endométrio45, influenciando assim
o sucesso da fertilidade in vivo . No entanto, essa hipótese ainda não foi confirmada e mais estudos são necessários para confirmar
essa associação.
Além da importância do miR-216b para o desenvolvimento do embrião, mostramos, usando um modelo de indução de polispermia,
que podemos modular o nível de miR-216b em zigotos aumentando a concentração de células espermáticas por queda de fertilização
in vitro. De fato, revelamos que o aumento da entrada de espermatozóides nos oócitos na fertilização é capaz de aumentar os níveis de
miR-216b nos zigotos. Produzimos zigotos polispérmicos aumentando o número de espermatozóides por gota de fertilização in vitro,
mantendo a fisiologia do oócito o mais intacta possível para verificar se a alteração foi causada pelo aumento do número de
espermatozóides que entram em cada oócito. Os zigotos foram avaliados quanto ao nível relativo de miR-216b. Em embriões
polispérmicos, o miR-216b apresentou níveis relativos aumentados, demonstrando que as células espermáticas podem modular os
níveis de miR-216b no embrião. No entanto, os níveis relativos de miR-216b em embriões de polispermia HF e LF foram inesperadamente
semelhantes. Isso pode ser atribuído ao fato de que não fomos capazes de separar os embriões polispérmicos antes da PCR, e também
não fomos capazes de controlar o número de pronúcleos gerados nesses embriões. Além disso, o nível de miR-216b pode ser modulado
por fatores relacionados ao esperma que estimulam a transcrição do miR-216b em embriões LF ou que a inibem em embriões HF; esta
hipótese poderia justificar os níveis semelhantes de miR-216b em embriões de polispermia HF e LF, uma vez que o processo de
transcrição pode atingir uma taxa máxima. No entanto, mais estudos são necessários para verificar esse provável novo mecanismo de
modulação transmitida pelo esperma.
Em conclusão, nossos resultados lançam luz sobre um provável mecanismo pelo qual as células espermáticas são capazes de
contribuir com miR-216b para os zigotos, modulando assim o desenvolvimento inicial do embrião. Em resumo, nossos dados mostraram
que miR 216b estava presente em um nível mais baixo em espermatozoides de touros HF. Isso foi associado a um nível relativo mais
baixo de miR-216b em zigotos de HF e a um nível relativo mais alto de seu gene alvo, K-RAS, em embriões de duas células com HF,
implicando um aumento na taxa de primeira clivagem e no número de células do blastocisto (Fig. . 5). Finalmente, nossos dados
fornecem uma melhor compreensão de como as contribuições paternas podem modular o desenvolvimento inicial do embrião. O
presente estudo pode abrir novos caminhos para as implicações dos miRNAs espermáticos na regulação da fertilidade e no
estabelecimento de uma gestação saudável em bovinos.
Métodos
Declaração de ética. Todos os procedimentos realizados durante este estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas de
pesquisa e cuidados com animais e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Escola de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo (CEUA/FMVZ) sob protocolo número 1912050516. Também adotamos os Princípios
Orientadores Internacionais para Pesquisas Biomédicas Envolvendo Animais (Society for the Study of Reproduction). Todas as imagens
esquemáticas foram feitas pelos autores ou obtidas na plataforma Mind the Graph (https://mindthegraph.com/).
Reagentes e produtos químicos. Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e produtos químicos utilizados foram adquiridos
da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). As sondas fluorescentes usadas foram: Hoechst 33342 (Hoechst; número de referência H1399),
5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina iodeto (JC-1; T3168), CellROXTM Deep Red (CellROX Red; C10422),
SYTO™ 59 Red (Syto59; S11341), MitoSOXTM Red (MitoSOX, M36008), YO-PROTM-1 iodeto (YoPro, Y3603), C11-BODIPYTM
581/591 (Bodipy, D3861) e Acridine Orange (AO; A1301) adquirido de Termo Fisher Scientifc (Waltham, Massachusetts, EUA); e iodeto
de propídio (PI; P4170), aglutinina Pisum sativum conjugada com isotiocianato de fuoresceína (FITC-PSA; L0770) e Arachis hypogaea
conjugada com isotiocianato de fuoresceína (FITC-PNA, L7381) adquiridos da Sigma-Aldrich.
Experimento 1: O nível mais baixo de miR-216b em espermatozóides e zigotos está associado a um alto nível de K-
RAS em embriões de duas células e um aumento na taxa de primeira clivagem e no número de células do
blastocisto. Design experimental. Foram utilizados seis lotes comerciais de sêmen congelado-descongelado de touros
Aberdeen Angus (Bos taurus) de alta fertilidade (HF; n=3; 54,3±1% taxa de prenhez) e baixa fertilidade (LF; n=3; 41,5±2,3%).
As taxas de fertilidade no talhão de touros foram diferentes (P=0,007) e determinadas pelo programa Concept Plus®
desenvolvido pela Alta Genetics® (Uberaba, MG, Brasil). Touros de alta e baixa fertilidade foram avaliados respectivamente
em 396 rebanhos e 52.259 serviços e em 22 rebanhos e 3.405 serviços. Primeiro, todas as amostras do lote foram avaliadas
quanto à qualidade do esperma. Dez, um lote de cada touro foi selecionado, analisado quanto à qualidade espermática e
quanto ao perfl de 380 miRNAs, e então utilizado para produção in vitro de embriões.

Figura 5. Modelo esquemático hipotético. Figura esquemática demonstrando que espermatozoides de touros de alta fertilidade
(HF) podem entregar um nível mais baixo de miR-216b aos zigotos do que espermatozoides de touros de baixa fertilidade (LF).
Assim, zigotos de HF podem exibir um nível mais baixo de miR-216b do que zigotos de LF e seu gene alvo, K-RAS, pode exibir
um nível mais alto em embriões de duas células de HF do que de LF. Além disso, isso pode resultar em uma taxa de primeira
clivagem mais alta em embriões com HF. Essas mudanças são provavelmente refletidas no maior número de células de
blastocisto HF, o que pode ser benéfico para o desenvolvimento in vivo e, portanto, pode aumentar as taxas de prenhez em bovinos.
Avaliação da qualidade do esperma e seleção do lote de sêmen. Todas as análises de qualidade do esperma foram realizadas em
duplicata pelo mesmo técnico. Duas palhetas de sêmen (0,25mL) do mesmo lote foram descongeladas (37 °C/30 segundos) e o
volume total (~500µL) foi colocado em um tubo pré-aquecido e homogeneizado antes de prosseguir com a avaliação da qualidade do
esperma. A avaliação do sêmen foi realizada assim que o sêmen foi descongelado e homogeneizado.
Avaliação da motilidade, concentração e anormalidades espermáticas. Microscopia de fase de contraste (aumento de 100x) foi usada
para avaliar (Nikon, modelo 80i, Tóquio, Japão) a motilidade (%) e o vigor (1 a 5) espermáticos subjetivos, em que 1 corresponde a
espermatozoides imóveis e 5 corresponde a espermatozóides com movimento progressivo e rápido). A concentração espermática foi
avaliada diluindo o sêmen em formaldeído 4% (1:100) usando uma câmara de Neubauer sob aumento de 400×. A porcentagem de
anormalidades foi avaliada fixando a amostra de sêmen em formaldeído a 4% e classificando 200 espermatozoides como tendo
defeitos maiores, menores e totais (maiores mais menores)46 (Tabela Suplementar S9) usando microscopia de contraste de
interferência diferencial (Nikon, modelo 80i , Tóquio, Japão) com ampliação de 1.000×.
Avaliação da cinética espermática. Os parâmetros cinéticos do esperma foram avaliados pelo analisador de esperma assistido por
computador (CASA) usando o software Sperm Class Analyzer (SCA, Microptics, Barcelona, Espanha). A configuração foi ajustada
para esperma bovino (Tabela Suplementar S10). A concentração de esperma foi ajustada para 10×106 esperma/mL em meio de
albumina lactato piruvato de Tyrode (TALP esperma: 4,2mg/mL cloreto de sódio, 1,87mg/mL cloreto de potássio, 2,1mg/mL bicarbonato
de sódio, 50 µg/mL fosfato de sódio, 290 µg/mL cloreto de cálcio monohidratado, 80 µg/mL cloreto de magnésio hexahidratado e
6,5mg/mL Hepes, suplementado com 10mg/mL albumina de soro bovino min - pH ajustado para 7,4 com NaOH 1N). Dez, 10 µL de
sêmen diluído foram colocados em uma câmara Makler® (Self-Medical Instruments, Haifa, Israel) e avaliados quanto à motilidade total
(%), motilidade progressiva (%), células rápidas (%), velocidade curvilínea (VCL, ÿm/s), velocidade de trajetória (VAP, ÿm/s),
velocidade progressiva (VSL, ÿm/s), linearidade (LIN, %), retilinidade (STR, %), oscilação (WOB, %), deslocamento lateral da cabeça
( ALH, ÿm) e frequência cruzada do batimento (BCF, Hz).
Avaliação das membranas espermáticas e produção de espécies reativas de oxigênio. Microscopia de epifuorescência (Nikon, modelo
80i, Tóquio, Japão) em ampliação de 1.000 × usando um filtro triplo (D/F/R, C58420) com UV-2E/C (excitação 340–380 nm/emissão
435–485 nm), B-2E/C (excitação 465–495 nm/emissão 515–555 nm) e G-2E/C (excitação 540–525 nm/emissão 605–655 nm) foi
usado para análises de plasma e integridade da membrana acrossomal e potencial da membrana mitocondrial , e produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS). Para avaliação do plasma espermático e integridade da membrana acrossomal e potencial da
membrana mitocondrial47, 2 µL de Hoechst 0,5 mg/mL, 2 µL de PI 0,5 mg/mL, 6 µL de JC-1 153 µM e 20 µL de FITC-PSA 100 µg/ mL
foram adicionados a 150 µL de sêmen diluído para 10 × 106 esperma/mL em esperma TALP. A incubação foi realizada a 37 °C/8
minutos. Duzentos espermatozóides foram então classificados (porcentagem) de acordo com PIAIH (espermatozóides com integridade
de plasma e membrana acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial), integridade de membrana plasmática, integridade de
membrana acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. A produção de ROS48 foi avaliada pela adição de 1,2µL de
CellROX Red 2,5mM e 2µL de Hoechst 0,5mg/mL a 150 µL de sêmen diluído (10×106 espermatozóides/mL). A incubação foi realizada
a 37 °C/30 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 600 g por 5 minutos e ressuspensas em esperma TALP. Duzentos
espermatozóides foram então classificados (porcentagem) como positivos ou negativos para a produção de ROS.
Seleção de lote de sêmen. A seleção de um lote de sêmen por touro foi realizada de acordo com o maior valor obtido pela fórmula:
(1 × + PROG) [3 ( × ÿ 100 MAJ)] [ + ×2 (100 ÿ + MIN)] (3 P × IAIH),

onde PROG era motilidade progressiva, MAJ eram defeitos maiores, MIN eram defeitos menores e PIAIH era esperma com plasma e
integridade da membrana acrossômica e alto potencial de membrana mitocondrial.

Avaliação da qualidade do esperma de lotes de sêmen selecionados. Os lotes de sêmen selecionados foram avaliados por
todas as análises descritas anteriormente e também por citometria de fluxo usando o BD Accuri C6TM (Becton-Dickinson, San
Jose, CA, EUA) equipado com laser de argônio (488 nm) e laser vermelho (635 nm ) ambos usados para excitar as amostras.
Os seguintes quatro filtros foram usados nas análises: 533/30 nm, 585 nm/40 nm, 675/25 nm e >670 nm. Partículas e detritos
celulares foram excluídos da aquisição usando propriedades de tamanho e dispersão e também por coloração de amostras
de esperma com 2 µL do corante nuclear Syto59 750mM. A análise de compensação manual foi realizada adicionando
controles: amostras de esperma foram submetidas a congelamento rápido para controles de plasma, acrossoma e membrana
mitocondrial47; para controles de geração de esperma superóxido, as amostras de esperma foram incubadas com Antimicina
A (20µM) e DPI (cloreto de difenilenoiodônio; 10 µM) a 37 °C por 1 hora49; para os controles de peroxidação lipídica, as
amostras de esperma foram incubadas com sistema gerador de ROS (sulfato de ferro 4mM, ascorbato de sódio 20mM e
peróxido de hidrogênio 4mM) a 37 °C por 30 minutos48; por fim, para os controles de fragmentação do DNA, as amostras de
esperma foram expostas ao peróxido de hidrogênio 10mM por 1h50.
A taxa de aquisição foi de aproximadamente 600 a 1.000 eventos/segundo, totalizando 5.000 a 10.000 células por análise.
A concentração de esperma foi ajustada para 5 × 106 espermatozoides/mL com espermatozóides TALP para a incubação e
ajustada para 2,5 × 106 espermatozóides/mL para análise de citometria de fluxo. Para plasma espermático e integridade da
membrana acrossômica, 2 µL de Syto59 750 mM, 1 µL de PI 0,5 mg/mL e 1 µL de FITC-PNA 37,5 µg/mL foram adicionados a
150 µL de sêmen diluído e incubados a 37 °C/10 minutos. Para avaliação do potencial de membrana mitocondrial, 2 µL de
Syto59 750 mM, 1 µL de PI 0,5 mg/mL e 1 µL de JC-1 153 µM foram adicionados a 150 µL de sêmen diluído e incubados a 37
°C/10 minutos. Para produção de ânion superóxido pela mitocôndria, 1,5 µL de MitoSOX 2 µM foi adicionado a 150 µL de
sêmen diluído e incubado a 37 °C/30 minutos. Após 10 minutos de incubação, foi adicionado 1 µL de YoPro 7,5 µM; e aos 20
minutos, 1,5 µL de Syto59 750mM foi adicionado. Para análise da peroxidação lipídica, 1 µL de BODIPY 2mM foi adicionado
a 150 µL de sêmen diluído e incubado a 37 °C/30 minutos. Aos 20 minutos, foram adicionados 1 µL de PI 0,5mg/mL e 2 µL de
Syto59 750mM. Para a fragmentação do DNA foi utilizado AO conforme protocolo descrito por Simões et al. 51.
Níveis de miRNA no esperma. Duas palhetas de sêmen (0,25 mL) do mesmo lote foram descongeladas (37 °C/30 segundos)
e cada amostra de 200µL foi colocada em gradiente Percoll (45% e 90%) e centrifugada a 3.600 g por 7 minutos. O pellet foi
ressuspenso em PBS (10 mg/mL cloreto de sódio, 0,2 mg/mL cloreto de potássio, 1,44 mg/mL fosfato de sódio dibásico e 0,24
mg/mL fosfato de potássio) e centrifugado duas vezes a 520 g por 5 minutos. A extração e purificação do RNA foram realizadas
com miRNeasy Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e a pureza
do RNA foram determinadas pelo espectrofotômetro NanoDrop™ 1000 (Termo Scientifc, Massachusetts, EUA). O DNA
complementar (cDNA) foi gerado usando o miScript RT Kit® (Qiagen, Hilden, Alemanha) adicionando um volume de
aproximadamente 100 ng de RNA total ao tampão HiFlex, 10 × mistura de ácido nucleico, enzima transcriptase reversa e água
livre de RNAse/DNAse seguido de incubação a 37 °C/1 hora e 95 °C/5 minutos. Em seguida, a abundância de um painel
personalizado de 380 miRNAs específicos de bovinos (Tabela Suplementar S11) foi avaliada por qPCR. As sequências de
primers foram obtidas do banco de dados miRBase (www.mirbase.org). Bta-miR-99b e -425-5p, consistentemente detectados
entre os grupos de acordo com a plataforma NormFinder18,52,53, foram usados para gerar os níveis relativos. A mistura de
PCR foi preparada usando SYBR Green® (Qiagen, Hilden, Germany). Uma placa de 384 poços foi utilizada para PCR e a
reação foi realizada em QuantStudioTM 6 Flex (Termo Fisher Scientifc) com as seguintes condições de ciclo: uma incubação
inicial de 95 °C/15 minutos e 45 ciclos de 94 °C/15 segundos, 55 °C/30 segundos e 70 °C/30 segundos. A curva de fusão foi
usada para confirmar a amplificação de um único produto.
Produção in vitro de embriões. Os lotes selecionados HF (n = 3) e LF (n = 3) foram usados para produzir embriões. A produção
de embriões in vitro foi realizada em triplicado para cada touro para dar um total de nove réplicas HF e LF.
Embriões partenogenéticos e oócitos maduros foram produzidos em todas as repetições. As condições da incubadora para
ovócitos, espermatozóides e embriões foram mantidas a 38,5 °C durante todas as etapas sob 5% de CO2, ar (20% de
oxigênio) com umidade saturada. Para a produção de embriões, ovários bovinos foram coletados em matadouro local e
transportados a 35 °C em garrafas térmicas contendo soro fisiológico 0,9% estéril. Em laboratório, os folículos ovarianos (3 a
6mm) foram aspirados com agulhas 18G. A avaliação dos complexos cumulus-oócitos (COCs) foi realizada em
estereomicroscópio (modelo SMZ 745T, Nikon, Tóquio, Japão). Dez COCs foram lavados em meio de cultura de tecidos 199
(TCM 199, Gibco, Termo Scientifc) suplementado com 10% de soro fetal bovino com depleção de vesícula extracelular (FBS
sem EV; a depleção de vesícula extracelular foi realizada por ultracentrifugação a 120.000 g por 16 horas) , 22µg/mL de
piruvato de sódio e 50µg/mL de gentamicina. Apenas COCs de grau I e grau II54 foram selecionados e lavados em meio de
maturação [TCM 199 suplementado com bicarbonato de sódio 26mM, FBS 10% livre de EV, 22 µg/mL de piruvato de sódio,
50 µg/mL de gentamicina, 0,5 µg/mL de folículo-estimulante (FSH; FolltropinTM, Bioniche Animal Health, Belleville, Canadá) e
5 U/mL de gonadotrofina coriônica humana (hCG; VetecorTM, Hertape Calier, Londres, Inglaterra)]. Um total de 20 a 25 COCs
foram colocados em 90 µL de meio de maturação coberto com óleo mineral por 22 horas. Após um período de maturação in
vitro (MIV), os ovócitos foram divididos em três grupos: embriões partenogenéticos (controle, sem espermatozóides) e
embriões fertilizados in vitro com sêmen de touros de alta e baixa fertilidade; também, pools de cinco oócitos maduros foram
coletados de cada repetição. Para embriões partenogênicos, ovócitos presumivelmente maduros foram completamente
desnudados com 0,2% de hialuronidase em PBS e foram avaliados quanto à extrusão do primeiro corpúsculo polar. Apenas
oócitos maduros (oócitos que apresentam extrusão do primeiro corpúsculo polar) foram submetidos à ativação partenogenética
(26 horas pós-IVM) por incubação em ionomicina 5 µM em TCM-199 tamponado com HEPES por 5 minutos e 6-
dimetilaminopurina (6-DMAP) 2mM diluído em fluido de oviduto sintético modificado (SOF) por 3 horas55. Para a fertilização
in vitro (FIV), os ovócitos presumivelmente maduros foram incubados por 18 horas em meio de FIV composto por estoque de
lactato de Tyrode suplementado com 50 µg/mL de gentamicina,

22µg/mL de piruvato de sódio, 40µg/mL de PHE (2mM D-penicilamina, 1mM de hipotaurina e 245µM de epinefrina), 5,5 UI/mL
de heparina e 6mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e espermatozoides de sêmen congelado-descongelado de cada touro
com alta ou baixa fertilidade. Cada lote foi processado em um gradiente de Percoll (45% e 90%) para obter células espermáticas
na concentração de 1 × 106 espermatozoides/mL. Os presumíveis zigotos de cada grupo foram divididos em gotas para
avaliação e coleta de zigotos, embriões bicelulares e blastocistos. Os presumíveis zigotos foram completamente desnudados
com uma pipeta e cultivados em líquido ovidutal sintético com aminoácidos, taxa de citrato de sódio e inositol (SOF)
suplementado com 5mg/mL de BSA, 22 µg/mL de piruvato de sódio, 50 µg/mL de gentamicina e 2,5% EV -free FBS. Os zigotos
foram avaliados e coletados 14 a 16 horas após a ativação (hpa) ou 16 a 18 horas após a inseminação (hpi; avaliação da
segunda extrusão do corpo polar); embriões de duas células foram avaliados e coletados 20 a 22 hpa ou 28 a 30 hpi. As taxas
de clivagem foram avaliadas no dia 4 de desenvolvimento e os blastocistos foram avaliados e coletados no dia 7. As amostras
foram armazenadas a -80 °C para análises de miRNA e mRNA ou fixadas em deído paraformal 4% em PBS com 0,1% de PVP
(PBS+PVP) para análise de imagem.
Níveis de mRNA e miRNA do embrião. Antes do congelamento rápido, a zona pelúcida de zigotos e embriões de duas células
foi removida por digestão enzimática com pronase 0,5% (Protease de Streptomyces griseus). Nove pools de cinco embriões e
três pools de cinco oócitos foram congelados em PBS+ PVP e usados para avaliar os níveis de miRNA e mRNA. A extração e
purificação do RNA foram realizadas usando miRNeasy Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do
fabricante; concentração e pureza foram determinadas pelo espectrofotômetro NanoDrop™ 1000 (Termo Scientifc,
Massachusetts, EUA). Para análises de miRNA, o cDNA foi gerado usando o miScript RT Kit® (Qiagen, Hilden, Alemanha)
conforme descrito anteriormente. Apenas miRNAs diferencialmente abundantes entre espermatozoides de touros HF e LF foram
avaliados por qPCR. Os snoRNAs Bta-miR-99b e RNU43 foram consistentemente detectados entre os grupos e foram usados
para avaliar os níveis relativos desses miRNAs. A reação de qPCR foi realizada nas mesmas condições detalhadas anteriormente.
Para as análises de mRNA, o cDNA foi gerado usando o High-Capacity Kit® (Applied Biosystem, Foster City, Califórnia, EUA)
de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, os níveis de genes-alvo de miRNA que eram diferentes em
espermatozóides e zigotos foram analisados por qPCR. Os genes-alvo foram determinados avaliando primeiro a homologia
entre miRNAs bovinos e miRNAs humanos usando a plataforma miRBase (http://www.mirbase.org/). Genes tar get fortemente
validados de miRNAs humanos foram então pesquisados na plataforma miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/
index.php). A conservação da região 3' não traduzida (UTR) do gene alvo também foi investigada usando a plataforma
TargetScanHuman (http://www.targetscan.org/vert_72/). As sequências do primer do gene alvo (Tabela Suplementar S12)
foram projetadas com base no GenBank e a especificidade da sequência foi verificada pelo Nucleotide Blast da plataforma NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). A ÿ-actina foi usada como um gene de limpeza. A qPCR foi realizada com 8,5 ng de RNA por
reação seguindo as instruções do fabricante para o kit Power Sybr® (Applied Biosystem, Foster City, Califórnia, EUA). A reação
de PCR foi realizada em um QuantStudioTM 6 Flex (Termo Fisher Scientifc) com as seguintes condições de ciclo: uma
incubação inicial de 95°C/10 minutos e 40 ciclos de 95°C/15 segundos e 60°C/60 segundos. A curva de fusão foi usada para
confirmar a amplificação de um único produto.
Análise qualitativa do blastocisto. No dia 7 após a fertilização in vitro ou ativação, os blastocistos foram avaliados de acordo
com o estágio (blastocisto inicial, blastocisto, expandido e eclodido). Blastocistos também foram coletados e fixados para
avaliação da proliferação por imunofluorescência: oito blastocistos do grupo HF e 10 blastocistos do grupo LF foram fixados por
12 minutos em PFA 4% em PBS+PVP. Em seguida, os blastocistos foram permeabilizados com 1% de Triton X-100 por 20
minutos e bloqueados com 5% de BSA e 22mg/mL de glicina por 1 hora em temperatura ambiente. Eles foram então incubados
durante a noite a 4°C com um anticorpo primário de coelho anti-Ki-67 (1:100, 5500134, Sigma-Aldrich). O anticorpo primário foi
detectado com anti-coelho IgG AlexaFluor 488 (1:500, A11008, Termo Fisher Scientific). Finalmente, os embriões foram corados
com 10 µL/mL de Hoechst/15 minutos. As lâminas de blastocisto foram montadas com Prolong Antifade® (Termo Fisher
Scientifc). As imagens foram capturadas por microscopia confocal SP5 (Leica, Wetzlar, Alemanha) usando laser de argônio
(488 nm) e diodo (405 nm) sob ampliação de 400×. Um controle negativo foi realizado para cada conjunto de análises. O
diâmetro do blastocisto, o número de células coradas com Hoechst 33342 e coradas com anti-Ki-67 foram analisados usando o
projeto Z no ImageJ® (NIH, https://imagej.nih.gov/ij/). A porcentagem de proliferação foi determinada calculando-se o número
de células coradas com Ki-67 dividido pelo total de células coradas com Hoechst. O número de células foi determinado por
contagem de células coradas com Hoechst. O número de divisão celular (n) foi calculado pela fórmula: Log2(n)=número de
células.
Avaliação cinética do embrião. A cinética embrionária inicial dos lotes selecionados de HF (n=3) e LF (n=3) foi avaliada
submetendo amostras de sêmen para produção de embriões in vitro, conforme descrito anteriormente, com duração de
fertilização in vitro de 8 horas. Os embriões foram avaliados em relação às taxas de duas células e quatro células 28 a 30 hpi e
40 a 42 hpi, respectivamente.
Experimento 2: Nível mais alto de miR-216b está associado a zigotos polispérmicos. Amostras de sêmen e
planejamento experimental. Para este experimento, a fim de selecionar amostras de sêmen que apresentam a maior
diferença nos níveis relativos de miR-216b, sêmen congelado-descongelado de dois touros (uma amostra de sêmen de
um touro HF e uma amostra de sêmen de um touro LF) foram selecionados com base em os resultados do experimento 1.
Para validação da indução de polispermia, as amostras de sêmen HF e LF selecionadas foram agrupadas e testadas para
dar um total de sete réplicas. Posteriormente, um total de cinco réplicas de sêmen HF e LF foram avaliados individualmente
para determinar os níveis relativos de miR-216b em embriões polispérmicos.

Validação da indução e avaliação da polispermia. Para verificar as taxas de indução de polispermia, uma concentração de
espermatozóides de 1 × 106 espermatozoides/mL por queda de fertilização in vitro foi considerada o controle e uma concentração
de 8 × 106 espermatozoides/mL foi considerada induzida por polispermia. Ambas as concentrações foram testadas em sete
réplicas usando pools dos lotes de sêmen selecionados de touros HF e LF. A MIV e a FIV foram realizadas conforme descrito
anteriormente, com a exceção de que a concentração de espermatozoides na FIV caiu variando de acordo com o grupo. Embriões
de segundo corpo polar positivo foram coletados e fixados em 12 hpi. A fixação do embrião foi realizada com 4% de PFA em
PBS+PVP e os embriões foram corados com 10 µL/mL de Hoechst/15 minutos. Lâminas com embriões foram montadas com
Prolong Antifade® e o número de pró-núcleos foi avaliado por microscopia de epifuorescência (Nikon, modelo 80i, Tóquio, Japão)
em ampliação de 600× usando filtro UV-2E/C (excitação 340–380nm emissão 435–485nm) .
Nível relativo de MiR-216b em embriões polispérmicos. Amostras de sêmen HF e LF selecionadas de acordo com o nível relativo
de miR-216b foram usadas para realizar cinco réplicas de fertilização in vitro com concentrações de esperma ajustadas para
controle (1 × 106 espermatozoides/ mL) e indução de polispermia (8 × 106 espermatozóides/mL). Os embriões foram coletados de
16 a 18 hpi e armazenados a -80 °C para avaliar a abundância de miR-216b. Cinco pools de 15 embriões foram submetidos à
extração de RNA e os níveis relativos de miR-216b foram verifcados por qPCR seguindo os protocolos descritos anteriormente.
Análise estatística. O software Statistical Analysis System (SAS Institute Inc, 9.3) foi usado para todas as análises
estatísticas. Shapiro-Wilk foi realizado para avaliar a normalidade dos dados. Quando necessário, os dados foram
transformados ou os outliers removidos. O nível de significância foi P<0,05 exceto para miRNAs em células espermáticas onde Pÿ0,10
A análise de variância (ANOVA) usando o procedimento misto foi realizada para avaliar as características do esperma, os níveis
relativos de miRNA e mRNA e as características de qualidade do blastocisto. O teste de Tukey foi utilizado quando os grupos de
oócitos partenogênicos e/ou maduros foram adicionados. O teste de frequência qui-quadrado foi realizado para avaliar o
desenvolvimento embrionário e as taxas de polispermia. A análise de variância (ANOVA) usando o procedimento misto respeitando
o planejamento fatorial foi realizada para avaliar o nível relativo de miR-216b em embriões polispérmicos (Experimento 2). Para
análise molecular, ÿCT foi considerado para análise estatística e os dados de nível relativo foram apresentados como 2ÿÿCT
conforme mostrado nos gráficos, tabelas e Diagrama de Venn (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). A detecção exclusiva de
miRNA foi baseada na detecção de miRNA em pelo menos duas amostras de sêmen. A não detecção foi considerada quando
apareceu em apenas uma ou nenhuma das amostras.
Disponibilidade de
dados Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente
mediante solicitação razoável.
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Agradecimentos O
presente estudo foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (MBRA foi
concedido pela FAPESP 2015/09154-6 e 2016/23243-4; ECCC foi concedido pela FAPESP 2016/05395-1). Os
financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou
preparação do manuscrito. Os autores agradecem a AFC Andrade e MA Torres do Laboratório de Andrologia e
Tecnologia de Embriões Suínos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
pela assistência técnica durante a análise de citometria de fluxo; Matadouro Olhos D'Água para fornecimento de
ovários; e à Alta Genetics por fornecer amostras de sêmen e dados de fertilidade de campo dos touros usados no presente estu
Contribuições dos Autores

MBRA, RPA, THCDB, JCS, FP e ECCC conceberam o estudo; MBRA e SAFR realizaram análises de sêmen;
MBRA e THCDB realizaram produção embrionária, coleta das amostras e análise por imunofluorescência; MBRA
realizou análises moleculares e de imagens; MBRA, JCS, FP e ECCC analisaram os dados; MFSF avaliou os
dados de fertilidade dos touros; MBRA escreveu o manuscrito; MBRA, THCDB, CB, FVM, JCS, FP e ECCC
discutiram os resultados. Todos os autores revisaram o manuscrito.

Informações adicionais
Informações complementares acompanham este documento em https://doi.org/10.1038/s41598-019-46775-8.
Interesses concorrentes: MFSF é empregado da Alta Genetics; MBRA, RPA, THCDB, SAFR, CB, FVM, JCS,
FP e ECCC nada têm a declarar.
Nota do editor: A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados
e afiliações institucionais.
Acesso Aberto Este artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional,
que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato,
desde que você dê o devido crédito ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, forneça um link para a licença Creative
Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outro material de terceiros neste artigo estão incluídos
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Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for permitido pela
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direitos autorais. Para ver uma cópia desta licença, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© Te Autor(es) 2019

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Relatórios Científicos | (2019) 9:10358 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-46775-8 1

(1 × + PROG) [3 ( × ÿ 100 MAJ)] [ + ×2 (100 ÿ + MIN)] (3 P × IAIH),

Relatórios Científicos | (2019) 9:10358 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-46775-8 2

Motilidade, concentração e anormalidades espermáticas

Volume de palha (mL) 0,25 0,25

Motilidade subjetiva (%) 68,3±0,8 60,8±3,6

Vigor (1–5) 3,5±0,1 3,3±0,2

Concentração de esperma (×106 esperma/mL) 90,0±11,3 88,3±11,6

Principais defeitos (%) 16,5±3,9 24,3±1,5

Pequenos defeitos (%) 6,5±1,8 4,3±0,8

Total de defeitos (%) 23,0±5,7 28,6±2,3

Total de esperma/palha (×106 ) 22,5±2,8 22,1±2,9

Total de motilidade esperma/palha (×106 ) 15,3±1,9 13,5±2,4

Motilidade total (%) 82,2±1,4 73,9±5,3

Motilidade progressiva (%) 57,2±5,7 58,5±4,4

Células rápidas (%) 75,6±0,2 69,3±4,6

Velocidade curvilínea (VCL; µm/s) 144,7±8,0 172,0±10,7

Velocidade progressiva (VSL; µm/s) 75,7±6,7 87,4±3,4

Velocidade do caminho (VAP; µm/s) 95,0±4,3 104,7±5,6

Linearidade (LIN; %) 52,5±4,9 51,0±2,1

Retidão (STR; %) 79,3±4,2 83,5±1,3

Oscilação (WOB; %) 65,9±2,7 61,1±2,1

Deslocamento lateral da cabeça (ALH; µm) 2,6±0,1 3,3±0,3

Frequência cruzada de batimento (BCF; Hz) 21,8±0,7 24,2±1,1

Relatórios Científicos | (2019) 9:10358 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-46775-8 3

PIAIHc (%) 48,9±4,7 45,2±6,1

Integridade da membrana plasmática (%) 51,5±5,1 48,5±6,4

Integridade da membrana acrossomal (%) 60,7±3,6 59,4±4,1

Alto potencial de membrana mitocondrial (%) 62,6±7,9 54,7±7,2

ROSd (%) 5,2±0,9 10,7±4,9

Integridade da membrana plasmática (%) 49,5±0,3 45,6±8,2

Integridade da membrana acrossomal (%) 83,9±2,3 78,3±3,7

Plasma e integridade da membrana acrossomal (%) 49,3±0,3 45,4±8,3

Integridade da membrana plasmática e ROS positivo mitocondrial (%) 5,3±1,6 4,1±1,0

ROS positivo mitocondrial (ua) 621,0±76,2 678,3±23,5

Peroxidação lipídica (ua) 2.502,0±395,6 2.764,9±921,8

Fragmentação de DNA (%) 5,8±0,1 5,7±0,1

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PAf— _ —— 227 70 30,8±3,7a 300 228 76,0±2,9 126 42,0±2,9a

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Figura 3. Análise qualitativa do blastocisto. (A) Fotomicrografias confocais representativas da imunocoloração

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(1 × + PROG) [3 ( × ÿ 100 MAJ)] [ + ×2 (100 ÿ + MIN)] (3 P × IAIH),

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